JP2010004781A - 核酸増幅装置およびそれを用いた核酸分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】核酸を含む反応溶液を流路内に流しながらリアルタイムPCR法によりDNA検査を行う検査装置において、検査中の蛍光標識の退色などの劣化を低減させる。
【解決手段】増幅を行う領域内に流路方向に励起光の励起光を照射しない領域を持つ、または励起光の強度分布を持たせる。
【選択図】図６

Description

本発明は検体から抽出したDNAを含む反応溶液を流しながらPCR増幅しその量を蛍光量として検出するリアルタイムPCR法によりDNA検査を行う上で好適に利用できる核酸増幅装置およびそれを用いた核酸分析装置に関する。

PCR増幅法によるDNA増幅は生物学の分野では基本的な技術であり、PCR増幅中のDNA量をリアルタイムに測定しそれを解析して検体から抽出したDNAを定量する方法としてリアルタイムPCR法がある。リアルタイムPCR法においてPCRを行う方法として、反応溶液をウエルの中に入れでヒートサイクルを加えて増幅を行う方法と、特許文献１で開示されているように反応溶液を流路の中を流しながらヒートサイクルを加えて増幅を行う方法がある。同様に反応溶液を流しながら検査を行う他の方法として、非特許文献１には、増幅領域全体の温度を上下させ反応溶液が増幅領域にとどまっている間に増幅とDNA量の検出を行う方式開示されている。
特開2005-253466号公報 Jill Bakerら, 2003, Micro TAS, p1335~1338

しかしながら上記従来例のようにPCR増幅を行う領域を増幅サイクルすべて励起照明していると蛍光標識が退色してしまうと言う問題がある。少ない増幅DNA量でも検出できるように強い励起照明をあてるほど蛍光標識の退色は多くなる。そこで、本発明の目的は、少ない蛍光標識量を用いる分析においても効率良く蛍光標識の能力を利用することのできる核酸増幅装置及びそれを用いた核酸分析装置を提供することにある。

本発明にかかる核酸増幅装置の第一の態様は、核酸試料を増幅させて蛍光標識を有する増幅物を得るための流路と、該流路の起点から終点へ増幅用反応溶液を流すための反応溶液移動手段と、該流路中の増幅領域に増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与手段と、該流路に前記蛍光標識の励起光を定期的に照射するための励起光の光源と、該流路内からの蛍光量を測定するための蛍光量測定手段と、を有する核酸増幅装置において、
前記増幅領域の起点からその下流部に設けた蛍光量測定開始位置までを前記励起光の非照射領域とするための照射位置制御手段を有する
ことを特徴とする核酸増幅装置である。

本発明にかかる核酸増幅装置の第二の態様は、核酸試料を増幅させて蛍光標識を有する増幅物を得るための流路と、該流路の起点から終点へ増幅用反応溶液を流すための反応溶液移動手段と、該流路中の増幅領域に増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与手段と、該流路に前記蛍光標識の励起光を定期的に照射するための励起光の光源と、該流路内からの蛍光量を測定するための蛍光量測定手段と、を有する核酸増幅装置において、
前記増幅領域内の前記反応溶液の流れ方向において前記光源からの励起光の強度分布を形成するための励起光強度制御手段を設けた
ことを特徴とする核酸増幅装置である。

本発明にかかる核酸増幅装置の第三の態様は、核酸試料を増幅させて蛍光標識を有する増幅物を得るための流路と、該流路の起点から終点へ増幅用反応溶液を流すための反応溶液移動手段と、該流路中の増幅領域に増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与手段と、該流路に前記蛍光標識の励起光を定期的に照射するための励起光の光源と、該流路内からの蛍光量を測定するための蛍光量測定手段と、を有する核酸増幅装置において、
前記増幅領域の起点からその下流部に設けた蛍光量測定開始位置までを前記励起光の非照射領域とするための照射位置制御手段と、
前記蛍光量測定領域の前記反応溶液の流れ方向において前記光源からの励起光の強度分布を形成するための励起光強度制御手段と、
を設けたことを特徴とする核酸増幅装置である。

本発明にかかる核酸分析装置は、上記のいずれかの構成を有する核酸増幅装置と、該核酸増幅装置の蛍光量測定手段により測定された蛍光量に基づいて反応溶液中の核酸試料の分析またはその初期濃度を定量するための分析手段と、を有することを特徴とする核酸分析装置である。

本発明によればリアルタイムPCR法のための励起照明による蛍光標識の退色などの劣化を減少させることができる。

本発明にかかる核酸増幅装置はリアルタイムPCR法用として好適な構造及び機能を有する。本発明にかかる核酸増幅装置は、核酸試料の増幅用の流路を有する。流路には、核酸試料を含む増幅用の反応溶液がその起点に導入され終点方向への流れが、反応溶液移動手段により形成される。反応溶液の流路中の流れは、反応溶液の前後に緩衝液などの液体を供給して移動させることで形成できる。移動手段としては、後述する実施例に記載される流路の終点側から吸引する吸引ポンプの他に、流路の起点側から圧力を付加するポンプ、あるいはこれらの組合せなどを用いることができる。

流路へ供給する反応溶液は、別途調製してから装置に供給してもよいし、後述する実施例に示すように装置内に混合領域を設けて核酸試料と増幅反応に必要な試薬を混合して調製するようにしてもよい。

本発明にかかる核酸増幅装置で用いられる反応溶液はPCRでの増幅物に蛍光標識が取り込まれるように調製される。核酸に取り込まれた蛍光標識のみ励起光により励起されると蛍光を発光する。この蛍光の強度を測定することによりその時の核酸の量を測定できる。少量分析におけるPCRでは、反応開始からしばらくの間の初期増幅率が低い場合が一般的であり、目的とする増幅率を得らまでの準備時間（ラグタイム）が必要となる。反応開始から反応終了までの全工程に対して励起光の照射を行うと、蛍光標識に対して励起光の過剰照射量が起き、蛍光標識の劣化が生じ、正確な分析ができなくなる場合がある。そこで、本発明にかかる核酸増幅装置では、このような過剰照射を防止し、蛍光標識を効率よく利用し、かつ正確な分析を可能とするために、以下の（１）及び（２）の少なくとも一方の構成を有する。
（１）増幅領域内の起点からその下流部に設けた蛍光量測定開始位置までを前記励起光の非照射領域とするための照射位置制御手段を設けた構成。
（２）増幅領域内での反応溶液の流れ方向に励起光の強度分布を形成するための励起光強度制御手段を設けた構成。

上記（１）の構成によれば、流路の一部として設けられたPCR増幅のための増幅領域は、起点と蛍光量測定開始位置までの蛍光量非測定領域と、蛍光量測定開始位置から蛍光量測定終了位置までの蛍光量測定領域とに少なくとも区分される。蛍光量非測定領域には照射位置制御手段により励起光は照射されず、反応溶液が蛍光量測定開始位置に到達した時点から予め決められた間隔（インターバル）で定期的に励起光が流路の蛍光量測定開始位置より下流の部分に照射される。

蛍光量非測定領域の長さは、上述のとおり、目的とする分析に必要とされる増幅率が得られるまでの増殖率の上昇の割合と、反応溶液の流路内での移動速度、温度サイクルの条件などにより決定できる。なお、流路内で目的とする増幅量に達した増幅物を、蛍光標識を利用して別の分析（例えば、後述する実施例におけるメルティング解析）に用いる場合は、蛍光標識の劣化を避けるために、蛍光量測定領域をできるだけ短く設定して、その下流部を励起光非照射領域としてもよい。従って、蛍光量測定領域の長さは、目的とする測定に必要な温度サイクルを印加できるように、蛍光量測定開始位置での予測される増幅率（あるいは増幅量）、反応溶液の移動速度などに応じて設定できる。

上記（２）の構成によれば、反応溶液の流れ方向に励起光強度の分布を形成することができる。目的とする分析に必要な増幅率が得られていない初期には励起光の強度を低くしておき、目的とする分析に必要な増幅率が得られた段階では、必要とされる強度に上げ、増幅物量が多くなった段階では強度を低くすることで、蛍光標識への過剰照射を防止できる。

上記の（１）及び（２）の両方の構成を有する場合は、蛍光量測定領域中における反応溶液の流れの方向に励起光の強度分布を付与する構成とする。

上記構成の核酸増幅装置は、リアルタイムPCR法での核酸（DNA）の定量や増幅物を用いた塩基配列の特定や一塩基多型（SNP）分析などにおけるPCR増幅器として好適に利用できる。

リアルタイムPCR法によるDNAの定量装置とする場合は、上記構成の核酸増幅装置の蛍光量測定手段からのデータに基づいて定量分析を行うための分析装置を一体化あるいは着脱自在に接続すればよい。SNP分析を行う場合は、後述の実施例に示すように、SNP分析のためのメルティング解析装置をPCR用の流路の下流部に組み込む構成とすることができる。

このように、目的に応じた核酸の分析のための機器を流路の下流に一体化あるいは着脱自在に接続することで、PCR増幅された増幅物を利用する種々の分析機器とすることができる。

以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。

（実施例１）
図１は本発明を適用できるＳＮＰの解析を行うＤＮＡ検査装置の構成を示す図である。図１において、１は測定を行う検体から抽出したＤＮＡを含む反応溶液である。２は反応溶液を流しながら増幅を行う流路を形成してあるカセットである。３はＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う増幅領域である。４はＤＮＡ増幅に必要な温度をカセット２に加えるペルチェ素子である。５はペルチェ素子の反対側に発生する熱を空気中に放熱するヒートシンク。これらを有して温度サイクル付与手段が構成されている。６は蛍光標識を励起するための励起光の光源としての励起用レーザである。７はレーザ６から出た光でカセット２の増幅領域３を励起照明するための照明光学系である。８はカセット２の増幅領域３を励起照明する範囲を限定するためのマスクである。これらを有して照射位置制御手段が構成されている。９は増幅領域３の蛍光標識から出た蛍光を集光する検出光学系である。１０は励起光の波長を阻止し蛍光標識からの蛍光波長を透過するフィルタである。１１は蛍光標識からの蛍光を受光して電気信号に変換するＣＣＤなどの撮像装置である。これらを有して蛍光量測定手段が構成されている。

１２はＤＮＡのメルティング温度の解析をするためのメルティング解析領域である。１３はＤＮＡのメルティング解析をするための温度をカセット２に加えるペルチェ素子である。１４はペルチェ素子の反対側に発生する熱を空気中に放熱するヒートシンクである。１５は蛍光標識を励起するための励起用レーザである。１６はレーザ１５から出た光でカセット２のメルティング解析領域１２を励起照明するための照明光学系である。１７はメルティング解析領域１２の蛍光標識から出た蛍光を集光する検出光学系である。１８は励起光の波長を阻止し蛍光標識からの蛍光波長を透過するフィルタである。１９は蛍光標識からの蛍光を受光して電気信号に変換するＣＣＤなどの撮像装置である。

２０は反応溶液１をカセット２中に流す圧力を発生させるポンプであり、反応溶液移動手段を構成している。

２１は１１，１９の撮像装置からの画像信号を取り込むためのＡ／Ｄ変換器である。２２は取り込んだ画像を一時的に記憶しておく画像メモリである。２３は画像メモリ２２の画像データの数値化などの演算を行う演算手段である。２４は処理のためのデータを蓄積しておく蓄積メモリである。２５はアクチュエータ類を制御するための制御手段である。

図２は図１で示したカセット２を上方から見た図で、３１は検体から抽出したＤＮＡを含む反応溶液１を注入する注入口である。３２は反応溶液１に増幅と検出に必要な試薬を混合し分配する混合分配領域である。３３は試薬と混合された反応溶液１が流れる流路である。３４はポンプ２０と結合する吸引口である。カセット２は、樹脂、ガラス、金属あるいはこれらの複合材料などから構成され、混合分配領域３２、流路３３はカセットに内包された状態で形成されており、励起光の照射及び蛍光の取り出しが可能となるように光透過性の材料からなる部分を設けてある。

次に、図１及び図２で示した構成のＤＮＡ検査装置の動作説明を行う。

検査を行う血液などの検体から抽出したＤＮＡを含む反応溶液１をカセット２の注入口３１から注入する。ポンプ２０が動作し吸引口３４が負圧になることにより反応溶液１はカセット２の中を移動し混合分配領域３２に達する。混合分配領域３２には不図示の増幅のためのプライマーや酵素、ＤＮＡを検出するための蛍光標識などの試薬が貯蔵されていて、その試薬と反応溶液１が混合され流路３３の中を流れて増幅領域３に移動する。図２の例では８本の流路３３があり注入された増幅用の反応溶液１を８つに分配し８種類の違う試薬を混合し８種類の検査を同時に行う。

反応溶液１が増幅領域３を流れていく間に制御手段２５によって制御されたペルチェ素子４によって増幅領域３には例えば図３のような温度サイクルが加えられＤＮＡの増幅が行われる。１温度サイクルごとに励起用レーザ６からの励起光で増幅領域３が励起照明され、増幅されたＤＮＡの蛍光標識から発生した蛍光を検出光学系９で集光しフィルタ１０で励起光を取り除き撮像装置１１で画像として取り込み電気信号に変換しＡ／Ｄ変換器２１でデジタル化され画像メモリ２２に保存される。演算手段２３は画像メモリ２２に保存された画像を処理し蛍光量を求めその値を蓄積メモリ２４に保存する。反応溶液１は流路中を流れながら増幅領域３を通過する間に数十回の温度サイクル、例えば４０回の温度サイクルが加えられ４０回蛍光量の測定が行われる。４０回の蛍光量の測定値が蓄積メモリ２４に保存されその変化から演算手段２３は反応溶液中の検体の初期のＤＮＡ量（初期濃度）の定量化を行う。図４で示すように増幅、検出を行いたい配列のＤＮＡの初期量が多いと温度サイクルの回数が少ないうちに蛍光量が増加し始め、初期量が少ないと温度サイクルの回数が多くならないと蛍光量が増加し始めない。

増幅された反応溶液１はメルティング解析領域１２に移動する。励起用レーザ１５によりメルティング解析領域１２が励起照明されＤＮＡの蛍光標識から発生した蛍光を撮像装置１９で電気信号に変換する。図５のようにペルチェ素子１３によって温度をゆっくり変化させる、温度の上昇によりＤＮＡの２本鎖が乖離すると蛍光標識が発光しなくなる。この乖離する温度と蛍光の光量の変化によりＳＮＰの解析を行う。

以上の検査装置において検査を行う検体が血液の場合、抽出され検査に投入されるＤＮＡ量は概略予想でき、ＰＣＲ増幅により増幅されたＤＮＡの標識からの蛍光が検出し始める増幅サイクル回数も予想できる。

ＤＮＡの増幅がまだ少なく蛍光が測定できない増幅サイクルで励起照明を行うのは蛍光標識を劣化させてしまうだけで何の結果も得られない。図６において増幅は反応溶液１が増幅領域３を左端（起点）から右端（終点）に流れる間に行われ、増幅領域３の右側に達した時増幅サイクルが４０回になる。図１の検査装置構成のマスク８により増幅領域３の照明領域３５の右端（蛍光測定開始位置）に反応液が達した段階で、照明領域３５のみに励起光が照射されるようにする。増幅されたＤＮＡの標識からの蛍光が検出可能な範囲の励起照明範囲３５のみを励起照明することにより蛍光標識の劣化を押さえて検査を行うことができる。

（実施例２）
図１で示したＳＮＰの解析を行うＤＮＡ検査装置ではリアルタイムＰＣＲ増幅ののちにメルティング解析も行うがこのときもＤＮＡの蛍光標識に励起照明を行い蛍光量の検出を行う。そのためリアルタイムＰＣＲの蛍光検出で蛍光標識に照射する励起照明の強度と時間を少なくし蛍光標識の退色があまり起こらないようにする必要がある。

図４で示したようにＰＣＲ増幅サイクルの初期ではＤＮＡ量が少なくＤＮＡの蛍光標識の蛍光を検出できない、またＰＣＲ増幅サイクルの終了付近ではＤＮＡ量が多く励起光を弱くしても蛍光は十分検出できる。

図１で示したＳＮＰの解析を行うＤＮＡ検査装置のマスク８を廃止し励起照明するための照明光学系７により図７（ｂ）で示すような流路方向に励起照明の強度分布を作る。本実施例の場合、励起光強度制御手段は照明光学系７を有して構成されている。励起光の利用効率から照明光学系7は一般なレーザから出た励起光が全ての方向で均一になるようなホモジナイザの代りに、図７（ｂ）のような励起照明の強度分布を作る、例えばレンズの一部がシンドリカルレンズにより構成されたホモジナイザを用いるのが望ましい。又は照明光学系７はレーザから出た励起光を全ての方向で均一化したあと透過率が流路方向に変化するフィルタを通し図７（ｂ）のような励起照明の強度分布を作る構成でも良い。ＰＣＲ増幅サイクル中のＤＮＡ量は図７（ｃ）のように変化するので結果として検出される蛍光量は図７（ｄ）のようになる。検出された蛍光量からＰＣＲ増幅サイクル中のＤＮＡ量を演算する時図７（ｂ）の励起照明の強度分布を用いて補正を行う。

以上によりＰＣＲ増幅サイクル中にＤＮＡが増えて蛍光強度が増え始める時には十分な励起照明強度で感度良く測定でき、その他感度を必要としない領域では励起照明強度を弱くすることにより蛍光標識の退色などの劣化を押さえることができる。

流路方向に励起照明の強度分布を作るには励起照明するための照明光学系７とマスク８を組み合わせても良い、マスクにより図７（ｂ）の増幅サイクル初期の励起照明をなくすことによりさらに蛍光標識の劣化を低減すことができる。

本実施形態に係わるDNA検査装置の概要を示す構成図である。 カセット2を上方から見た時の構成を表す図である。 DNA増幅時に加える温度サイクルの例を示す図である。 蛍光量の測定値から検体の初期のDNA量の算出を行う説明図である。 メルティング解析法の概要を表す図である。 励起光を流路方向にマスクし、測定を行う様子を示した図である。 励起光を流路方向に強度分布を持たせ測定を行う様子を示した図である。

符号の説明

1、反応溶液
2、カセット
3、増幅領域
4、ペルチェ素子
5、ヒートシンク
6、励起用レーザ
7、照明光学系
8、マスク
9、検出光学系
10フィルタ
11、撮像装置
12、メルティング解析領域
13、ペルチェ素子
14、ヒートシンク
15、励起用レーザ
16、照明光学系
17、検出光学系
18、フィルタ
19、撮像装置
20、ポンプ
21、A/D変換機
22、画像メモリ
23、演算手段
24、蓄積メモリ
25、制御手段
31、注入口
32、混合分配領域
33、流路
34、吸引口

Claims (4)

1. 核酸試料を増幅させて蛍光標識を有する増幅物を得るための流路と、該流路の起点から終点へ増幅用の反応溶液を流すための反応溶液移動手段と、該流路中の増幅領域に増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与手段と、該流路に前記蛍光標識の励起光を定期的に照射するための励起光の光源と、該流路内からの蛍光量を測定するための蛍光量測定手段と、を有する核酸増幅装置において、
   前記増幅領域の起点からその下流部に設けた蛍光量測定開始位置までを前記励起光の非照射領域とするための照射位置制御手段を有する
   ことを特徴とする核酸増幅装置。
2. 核酸試料を増幅させて蛍光標識を有する増幅物を得るための流路と、該流路の起点から終点へ増幅用の反応溶液を流すための反応溶液移動手段と、該流路中の増幅領域に増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与手段と、該流路に前記蛍光標識の励起光を定期的に照射するための励起光の光源と、該流路内からの蛍光量を測定するための蛍光量測定手段と、を有する核酸増幅装置において、
   前記増幅領域内の反応溶液の流れ方向において前記光源からの励起光の強度分布を形成するための励起光強度制御手段を設けた
   ことを特徴とする核酸増幅装置。
3. 核酸試料を増幅させて蛍光標識を有する増幅物を得るための流路と、該流路の起点から終点へ増幅用の反応溶液を流すための反応溶液移動手段と、該流路中の増幅領域に増幅用の温度サイクルを与えるための温度サイクル付与手段と、該流路に前記蛍光標識の励起光を定期的に照射するための励起光の光源と、該流路内からの蛍光量を測定するための蛍光量測定手段と、を有する核酸増幅装置において、
   前記増幅領域の起点からその下流部に設けた蛍光量測定開始位置までを前記励起光の非照射領域とするための照射位置制御手段と、
   前記蛍光量測定領域の前記反応溶液の流れ方向において前記光源からの励起光の強度分布を形成するための励起光強度制御手段と、
   を設けたことを特徴とする核酸増幅装置。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅装置と、該核酸増幅装置の蛍光量測定手段により測定された蛍光量に基づいて反応溶液中の核酸試料の分析またはその初期濃度を定量するための分析手段と、を有することを特徴とする核酸分析装置。

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