JP2008502325A - 単分子増幅及びdna長の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本願の技術の一部はNIST−ATP助成番号70NANB8H4000の下に開発された。政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
本発明は例えば疾患診断、病原体、環境汚染物質等の検出のために例えば複雑な混合物から単分子を増幅することによる単分子検出の分野に関する。高スループットシステム(例えばマイクロフルイディックシステム)で増幅を実施すると、低コピー数反応混合物に分画される複雑なサンプル中の希少分子を検出することができ、例えば複雑なサンプルの多数のアリコートを増幅することにより、対象希少コピー核酸を検出することができる。本発明の方法とシステムは個々の対象核酸が所与長をもつか否かを判定することができる。
本発明は特定装置又は生物系、又は増幅方法に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、場合により複数形も含む。従って、例えば「マイクロフルイディックデバイス」とは場合により1、2又はそれ以上の装置の組合せを含む。
本発明の方法で検出すべき対象核酸は原則的に任意核酸とすることができる。(逆翻訳により核酸配列を誘導することができる)多数の核酸及びアミノ酸の配列が入手可能である。本発明の方法では数十万種の公知アミノ酸を識別しようとせずに、これらのアミノ酸の任意のものを検出することができる。公知核酸の一般的な配列寄託機関としてはGenBank、EMBL、DDBJ及びNCBIが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。核酸はRNA(例えば増幅がRT−PCR又はLCRを含む場合)又はDNA(例えば増幅がPCR又はLCRを含む場合)、又はそのアナログ(例えば合成核酸又はそのアナログの検出)とすることができる。例えば突然変異、一塩基多型(SNP)、対立遺伝子、アイソタイプ、フラグメント、全長核酸、アンプリコン等の任意核酸変異を検出することができる。更に、本発明は定量的であるため、発現レベル、フラグメント化、又は遺伝子コピー数の変動を本発明の方法により検出することができる。
サンプルは標準又はマイクロフルイディック流体操作アプローチ(又はその組合せ)を使用して分画及び/又は希釈することができる。希釈/分画のための標準流体操作アプローチとしては、例えば適切な容量のサンプルをマイクロタイタートレイにピペッティングする方法や、適切な希釈剤を添加する方法が挙げられる。これらの操作は手動で実施してもよいし、例えばマイクロタイタートレイで系列希釈溶液を使用するように構成されたもの等の入手可能な高スループット流体ハンドラーを使用して実施してもよい。本発明では対象サンプルの多数のアリコートの作成及び使用を意図しているので、(例えば自動ピペッターとロボットマイクロタイタートレイ操作を組込んだ)高スループット装置が好ましい。
本発明の方法はサンプル又はアリコートからの対象核酸の1個以上の配列と、場合により、1個以上の付加核酸を増幅する段階を含む。一般に、核酸長の解釈を可能にするように対象核酸の2個以上の配列を別個の位置で増幅する。利用可能な任意増幅法を使用することができ、PCR、RT−PCR、LCR、及び/又は各種RNA増幅法の任意のものが挙げられる。本発明の方法で対象核酸を増幅するのに好ましい増幅法はPCR、RT−PCR及びLCRである。増幅した核酸の検出を容易にするために(例えばTaqMan(登録商標)プローブ又は分子ビーコンプローブによる)リアルタイムPCR及び/又はRT−PCRを使用することもできる。
1側面では、例えば分子ビーコン又はTaqMan(登録商標)プローブを使用して本明細書に記載の各種アリコート又は反応混合物でリアルタイムPCRを実施する。分子ビーコン(MB)は適切なハイブリダイゼーション条件下でステム及びループ構造と自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はPNAである。MBはオリゴヌクレオチド又はPNAの末端にラベルとクエンチャーをもつので、分子内ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でラベルは一般にクエンチャーによりクエンチされる(又は少なくともその蛍光が変化する)。MBが分子内ハイブリダイゼーションを示さない条件下(例えば増幅中にターゲット核酸、例えばアンプリコンの領域と結合している場合)では、MBラベルはクエンチされない。
本発明によると、二重標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブ、通称「TaqMan(登録商標)プローブ」を使用するPCR定量を実施することができる。これらのプローブは2種の異なる蛍光色素で標識された短い(例えば20〜25塩基)オリゴデオキシヌクレオチドから構成される。各プローブの5’末端にはレポーター色素が配置され、各プローブの3’末端にはクエンチ色素が配置される。オリゴヌクレオチドプローブ配列はPCRアンプリコンに存在する内部ターゲット配列と相補的にすることができる。プローブが無傷の場合には、2種のフルオロフォア間でエネルギー移動が生じ、レポーターからの発光がクエンチャーによりクエンチされる(蛍光共鳴エネルギー移動ないしFRET)。PCRの伸長段階中に、プローブは反応で使用されるポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性により開裂し、オリゴヌクレオチド−クエンチャーからレポーターが放出され、レポーター発光強度が増加する。
一般に、プローブ、分子ビーコン、PNA、LNA(ロックト核酸)等のオリゴヌクレオチドを作製するための合成方法は周知である。例えば、オリゴヌクレオチドは例えばNeedham−VanDevanterら(1984)Nucleic Acids Res.,12:6159−6168に記載されているように例えば市販自動合成器を使用してBeaucage and Caruthers(1981),Tetrahedron Letts.,22(20):1859−1862に記載の固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成することができる。修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドも当業者に公知の各種メーカーに注文することができる。多数のオリゴ合成サービス業者があるので、これは広く利用可能な技術である。The Midland Certified Reagent Company(mcrc@oligos.com)、The Great American Gene Company(www.genco.com)、ExpressGen Inc.(www.expressgen.com)、Operon Technologies Inc.(Alameda,CA)及び他の多くのメーカー等の任意メーカーに任意核酸を注文することができる。同様に、PNAもPeptidoGenic(pkim@ccnet.com)、HTI Bio−products,inc.(www.htibio.com)、BMA Biomedicals Ltd(U.K.)、Bio−Synthesis,Inc.及び他の多くのメーカー等の任意メーカーに注文することができる。
PCR及び他の増幅反応を実施する多数の高スループットアプローチが開発されており、例えばマイクロフルイディックデバイスでの増幅反応や、前記デバイス内又はデバイス上で増幅核酸を検出及び分析する方法が挙げられる。このような技術に関する詳細は例えば技術及び特許文献に記載されており、例えばKoppら(1998)“Chemical Amplification:Continuous Flow PCR on a Chip”Science,280(5366):1046;USP6,444,461(Knappら)(2002年9月3日)MICROFLUIDIC DEVICES AND METHODS FOR SEPARATION;USP6,406,893(Knappら)(2002年6月18日)MICROFLUIDIC METHODS FOR NON−THERMAL NUCLEIC ACID MANIPULATIONS;USP6,391,622(Knappら)(2002年5月21日)CLOSED−LOOP BIOCHEMICAL ANALYZERS;USP6,303,343(Kopf−Sill)(2001年10月16日)INEFFICIENT FAST PCR;USP6,171,850(Nagleら)(2001年1月9日)INTEGRATED DEVICES AND SYSTEMS FOR PERFORMING TEMPERATURE CONTROLLED REACTIONS AND ANALYSES;USP5,939,291(Loewyら)(1999年8月17日)MICROFLUIDIC METHOD FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION;USP5,955,029(Wildingら)(1999年9月21日)MESOSCALE POLYNUCLEOTIDE AMPLIFICATION DEVICE AND METHOD;USP5,965,410(Chowら)(1999年10月12日)ELECTRICAL CURRENT FOR CONTROLLING FLUID PARAMETERS IN MICROCHANNELS;Service(1998)“Microchips Arrays Put DNA on the Spot”Science 282:396−399),Zhangら(1999)“Automated and Integrated System for High−Throughput DNA Genotyping Directly from Blood”Anal.Chem.71:1138−1145及び他の多くの文献が挙げられる。
代替態様では、標準流体処理アプローチをマイクロフルイディックアプローチに代用又は併用する。本発明に関連する希釈又は他の操作と同様に標準反応容器(例えばマイクロタイタープレート)でPCRを実施することができる。マイクロフルイディック以外の流体操作アプローチ用として各種高スループットシステムが入手可能である(一般に数個の反応チャンバーを含むプレート、例えば96ウェル、384ウェル又は1536ウェルマイクロタイタープレートを要する)。これらのアプローチは流体処理操作を実施するために従来のロボットを使用することができ、増幅反応を実施するために従来の市販サーモサイクラーを使用することができる。自動流体操作システムについては上記参照。
本発明では増幅した核酸を検出するために利用可能な任意方法を使用することができる。一般的なアプローチとしては分子ビーコン又はTaqMan(登録商標)プローブによるリアルタイム増幅検出、インターカレーション型色素(臭化エチジウム又はサイバーグリーン)の検出、例えば取込まれなかったラベルから増幅産物の電気泳動分離後に増幅プローブ又は増幅した核酸自体に取込まれたラベルの検出、及び/又は核酸と結合する二次試薬の検出が挙げられる。これらの一般アプローチの詳細は本明細書に引用する文献、例えばSambrook(2000)、Ausubel(2002)、及びリアルタイムPCR検出に関連する本明細書のセクションで引用する文献に記載されている。核酸を標識するための付加標識ストラテジー及び対応する検出ストラテジーは例えばHaugland(1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第6版,Molecular Probes,Inc.(Eugene OR);又はHaugland(2001)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第8版,Molecular Probes,Inc.(Eugene OR)(CD ROM版)に記載されている。
本発明の1つの特徴はサンプル中の希少(及び他の)核酸を確実に定量できることである。この確実な定量によりサンプルの統計的又は確率論的分析が可能になる。例えば、ポアソン分析、モンテカルロ分析、遺伝子アルゴリズムの適用、ニューラルネットワークトレーニング、マルコフモデリング、隠れマルコフモデリング、多次元スケーリング、部分最小二乗(PLS)分析、又は主成分分析(PCA)をいずれも本発明により作成したデータに適用することができる。これらの統計評価を使用し、例えばサンプル中の所与核酸の濃度、存在度、又は核酸長比率を決定し、存在度又は比率を関連する診断又は予後に相関させることができる。
本発明の1つの特徴は再現性の高いピークパラメーター、例えば増幅反応からのシグナルの振幅、幅、面積、及び/又は形状特徴を反応の出発コピー数に相関させることができ、及び/又はバックグラウンド変動から対象シグナルを識別するために使用できるという発見である。この相関は熱拡散率とTaylor Aris拡散を考慮して理論レベルで実施することもできるし、標準との比較(例えば出発材料の既知コピー数をもつ増幅反応のピーク形状、例えば高さ、幅、又は一般形状プロフィルとの比較)により実施することもできる。核酸長の判定において2個以上のプローブの検出器シグナルの解釈で同一又は異なるピークパラメーターを評価することができる。
本発明のシステムはマイクロフルイディックデバイス、反応混合物、検出器、サンプル保存エレメント(マイクロタイタープレート、成分の乾燥アレイ等)、フローコントローラー、増幅装置又はマイクロフルイディックモジュール、コンピューター及び/又は同等物を含むことができる。これらのシステムは対象核酸を分画、増幅及び分析するために使用することができる。システムのマイクロフルイディックデバイス、増幅コンポーネント、検出器及び保存エレメントについては上記にある程度詳細に記載した。以下、適切なコントローラーとコンピューターについて記載するが、多数の構成が利用可能であり、当業者はそれらの使用について熟知していると予想され、本発明への適用方法も理解されると思われる。
本発明のマイクロフルイディックデバイスの内側の流体及び/又は材料の輸送と誘導を例えば圧力又は動電型制御により制御するために本明細書に記載するマイクロフルイディックデバイスと各種制御機器を場合により併用する。
上記のように、コントローラーシステム及び/又は検出システムの一方又は両方は予めプログラムしてあるか又はユーザーが入力した命令に従ってこれらの機器の操作を命令し、これらの機器からデータ及び情報を受信し、この情報を解釈し、操作し、ユーザーに報告するように機能する適切にプログラムされたプロセッサー又はコンピューター(論理装置)に連結することができる。従って、コンピューターは一般に(例えば必要に応じてアナログ−デジタル又はデジタル−アナログコンバーターを含む)これらの機器の一方又は両方に適宜連結される。
図6及び7は本発明のモデルシステムの模式図である。図6に示すように、システム600はマイクロフルイディックデバイス601を含む。デバイス601はデバイス内に形成された主チャネル604を含む。例えば主チャネル604を通して真空源608(及び/又は下記レザバー又はウェルのいずれか)に真空を印加することにより、例えばレザバー606から増幅成分を流出させる。ウェル610又は612から主チャネル604に増幅成分を流入し、例えば反応混合物を形成することもできる。材料をウェル606又は608から流出させてもよいし、例えば廃液ウェルとして使用する場合や、真空源に連結する場合には、これらのウェルに材料を流入してもよい。ウェル614、612、610、606、又は608からの流出は流体圧を調節するか、又は動電型アプローチにより実施することができる。図6及び7に示すチャネル構成の代わりに図1のデバイス等の構成を使用することもできる。他の適切な各種マイクロフルイディック構成が本明細書に引用する文献に記載されている。
本発明は本明細書に記載する方法を実施するためのキットも提供する。特に、これらのキットは一般に本明細書に記載するシステムコンポーネントと、調査者が本発明の方法を実施し易くするための付加コンポーネントを含む。
(緒言)
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNAの所望領域の増幅は分子生物学分野に革命をもたらした。増幅中に高値マイクロリットルの流体を使用する従来のPCRフォーマットでは、出発DNAコピー数は一般に少なくとも数百から数万分子である。マイクロフルイディクスの最近の進歩により、PCRを千分の1にし、ナノリットルの反応容量範囲まで縮小できることが明らかになった。サンプル濃度が一定に維持される場合、このような小容量の出発DNA鋳型数は用途によっては統計的に許容できないとみなされるカットオフコピー数を下回る可能性がある。例えば、一塩基多型(SNP)分析では、出発コピー数が少な過ぎる(約数十コピー未満)場合には、ヘテロ接合サンプルからの2個の異なる対立遺伝子は統計変動により均等量で増幅することができず、このサンプルの正しいSNP識別に不確実性を生じる可能性がある。
図1のチップデザイン模式図に示すようなマイクロフルイディックシッパーチップを使用し、分配チャネル105への圧力勾配を使用してシッパーを介してDNAサンプル(例えばゲノムDNA)をチップ100に導入した。アセンブリ−ライン方式の連続フロー下でオンチップ試薬レザバーから共通試薬チャネル106を通して供給した共通試薬とサンプルをまず混合した後、8個のアリコートに等分して8個の独立した分析チャネル110−118に導入した。チャネル毎に専用のチップレザバーから供給した遺伝子座特異的試薬と各アリコートを混合して反応混合物を形成した後、チップ100の制御加熱領域構成するように増幅マイクロチャネル110−118の近位に金属トレースを含む加熱領域130に通した。チャネル110−118へのチャネル固有試薬の試薬添加はオンチップ「ホットスタート」を行うエレガントなマイクロフルイディック方法であり、全試薬を増幅直前に分析チャネルに添加する。前記領域の温度は加熱領域130におけるチャネル内のPCR条件に合わせて適宜周期的に変化させた(温度設定点と各滞留時間を制御)。加熱チャネル長と流体速度は合計PCRサイクルが所望数、通常は25〜40サイクルとなるように選択する(但し、サイクル時間が短く、サイクル数の多い非効率的なPCRアプローチも使用できる;USP6,303,343(Kopf−Sill)(2001年10月16日)発明の名称INEFFICIENT FAST PCRも参照されたい)。8チャネル検出領域135はチャネル110−118でPCRアンプリコンを検出するのに適した検出器を含む。
本発明者らは単分子PCR増幅を連続フローフォーマットで実験的に立証するために、図1に示すPCRシッパーチップを使用した。サンプルをシッパーに供給するマイクロタイタープレートで濃度が1分子/nL未満になるまで希釈度を増したDNAサンプルを調製した(代替態様ではオンチップ希釈を実施することもできる)。チャネル当たり1分子未満の非常に低濃度のDNAをサンプリングする場合の統計変動により、チャネルによって増幅シグナルを示すものと示さないものがあると予想される。増幅が観察される試験フラクションはポアソン統計により最良に表される。
本実施例はTaqManプローブ開裂により発生した蛍光を測定することによりオンチップPCR増幅をモニターするための実験に関する。図5はチャネル当たりの入力コピー数計算値に対する1/2最大値のピーク幅を示す(オンチップ)。
癌研究では、突然変異遺伝子が通常はサンプル中に野生型よりも著しく低濃度で出現するため、癌遺伝子の検出は非常に困難である。単一クローンを一度に試験することは現在可能であるので、単分子から増幅を検出できるならば、バックグラウンド中の高濃度の野生型と共に低濃度の突然変異遺伝子を検出する問題を解決できよう。所与サンプル中に存在する癌の原因となる少数の突然変異遺伝子を検出するには多数回のPCRを実施するのが有用であるが、マイクロフルイディックシッパーチップフォーマットをチップ上の平行PCRと併用すると、このような点まで単一クローンを一度に試験する速度が増加する。図4はチャネル当たり平均1コピー未満までの非常に少ない出発コピー数でのSNP分析の原蛍光強度測定値を示す。これらのデータは単分子PCR条件でSNPを検出できることを示す。
図13はTaqManプローブを使用してオンチップで実施した癌検出に関連する2個の突然変異部位の検出例を示す。本発明のシステムが癌診断に適していることを立証するために、本発明のシステムを使用し、TaqManプローブを使用して多数の癌(例えば結腸直腸癌)マーカーを試験した。これらのアッセイの2例を図13に示し、一方はK−RAS遺伝子であり、他方はp53遺伝子であり、いずれも結腸癌等の各種癌の診断マーカーである。データトレースは1本のマイクロフルイディックチャネルで時間に対する2種の波長の蛍光を示す。正常対立遺伝子に特異的なものと突然変異対立遺伝子に特異的なものとの2個のTaqManプローブを設計し、このオンチップアッセイフォーマットで試験した。正常DNAの存在は野生型プローブで検出され(上部データトレースに白黒表示で示す「赤」シグナル)、突然変異体DNA分子は突然変異体プローブで検出される(下部データトレースに白黒表示で示す「青」シグナル)。「赤」の上部蛍光シグナルが強く、「青」の下部蛍光シグナルが弱いことからサンプルスラグ中のDNA分子の大半(約500)は正常である。このシグナルは正常ゲノムDNA分子の増幅産物の周囲の対立遺伝子特異的(赤、上部)及びバックグラウンド(青、下部)TaqManプローブ開裂により発生される。突然変異体分子(適切な点突然変異をもつ合成DNA鋳型)がシステムを通過する場合には、(赤(上部)バックグラウンドピークに対して)大きな青(下部)ピークとして増幅及び認識される。
連続フローPCRシステムはマイクロフルイディック処理環境で個々の低コピー、シングルコピー、及びゼロコピー増幅反応混合物の空間的分離を可能にする。一般に、空間的分離は出発鋳型濃度が両親からの対立遺伝子の表示を正確に確保するに十分高い場合に異なる反応を分離するために使用される(例えば約50個のゲノム等価物を使用することが多い)。本発明では、各分子の増幅及び検出産物を流体分離するように個々の鋳型分子を分離するのに十分にDNAを希釈することにより同一作業を実施する。検出産物が対立遺伝子特異的である場合には、2個の対立遺伝子の一方のみのシグナルが検出される。対立遺伝子毎に結果をカウントすると、ゲノタイプが非常に正確に得られる。この方法によるゲノタイプの欠点はスループットが低下し、1個のゲノタイプを得るために1回だけでなく多数の反応が必要になるという点である。2対立遺伝子システム中の出発濃度は通常約50/50(又は少なくとも同一桁)であり、ゲノタイプ生化学のシグナルノイズ比は良好であるので、ゲノタイプは一般に1回の反応で実施される。
ウイルス検出に望ましい感度(例えば約50−100コピー/ml)を考慮すると、チップ上の処理容量と初期サンプル容量のミスマッチによりマイクロフルイディックプラットフォームを使用する検出に応用するのは困難である。しかし、本願で立証されたマイクロフルイディックデバイスにおけるPCRの特徴の1つは核酸のシングルコピーを定量できるという点である。従って、生物学的に妥当な細胞又はウイルス粒子濃度で対象サンプル中の感染細胞又はウイルス粒子数をカウントすることができる。本実施例では、10マイクロリットルのオーダーの出発容量からの定量的単分子PCRについて記載する(〜1mlから約10ulのサンプルを取得する初期プレ濃縮段階は標準技術、例えば免疫沈降又は磁気ビーズへのハイブリダイゼーション捕獲により実施することができる)。
本発明の単分子増幅技術は反応混合物中の対象ヌクレオチドが例えばプローブ間でフラグメント化しているか又は所与長をもつかを明確に判定するために使用することができる。例えば、シングルコピー反応混合物中の対象核酸の両端にハイブリダイズした2個以上の異なるプローブから同時シグナルは核酸がフラグメント化していないことを高レベルの信頼度で表すことができる。複数のターゲット核酸コピーとのドットブロットハイブリダイゼーション等の従来方法では、対象核酸の両端にハイブリダイズしたプローブの同時検出は全長対象核酸の存在及び/又は1対以上の非関連フラグメント化対象核酸の存在を表すので対照的である。
反応混合物中に平均約1個の個々の対象核酸(シングルコピー)を含む反応容量を提供するために十分小さい容量に対象核酸を含むサンプルを希釈及び/又は含有させることができる。対象核酸シングルコピー上の別個の配列に相補的な2個のプローブにシングルコピー対象核酸をハイブリダイズさせる場合に反応混合物中に2個のハイブリダイズしたプローブが同時に検出されたならば、核酸は別個のプローブターゲット配列間でフラグメント化していないと判断する。他方、核酸がターゲット配列間でフラグメント化している場合には、シングルコピー反応混合物はフラグメントを1個しか含まず、ハイブリダイズしたプローブは1個しか検出されない。サンプルをこのようなシングルコピー反応混合物に希釈及び/又は細分することにより、1個以上の対象核酸が特定プローブに相補的な配列とプローブ間の核酸を含む少なくとも一定の長さ(所与長)を含むか否かを高い信頼度で判定することができる。
本発明の方法及びシステムは対象核酸を定量するための各種フォーマットで使用することができる。定量アッセイは所望品質の出力結果を提供するように構成することができる。例えば、特定アッセイのデザインによりアッセイパラメーター(例えば感度、確度、精度、及び偽陽性又は偽陰性率)を変化させることができる。アッセイの反復により精度を増すことができる。定量アッセイは例えば所望範囲、感度及び/又は確度で有効な結果を提供するのに最適なシグナルピークパラメーターを評価することにより改善することができる。
本発明のシステムはサンプル中の対象核酸長の高感度識別に好適な効率的な処理用ハードウェアを提供することができる。核酸長の識別システムは原則的に単分子増幅について本明細書に記載する通りとすることができるが、例えば多重プローブの増幅、検出、解釈、及び/又は相関には付加エレメントを加える。核酸長を識別するためのコアシステムは例えばマイクロチャネル又はマイクロチャンバーに低及びシングルコピー反応混合物を収容することが可能なマイクロフルイディックデバイスと、均質反応混合物から1個以上のシグナルを識別することが可能な検出器と、単一又は同時に検出されたシグナルを解釈し、サンプルからの個々の核酸長を決定するように構成されたソフトウェアシステムを含む。付加サブシステムとしては単分子増幅システム一般について上述したようなサンプル保存モジュール、抽出モジュール、希釈モジュール、及びコンピューターが挙げられる。
Claims (69)
- サンプル中の対象核酸が少なくとも所与長を含むか否かを判定する方法であって、
検出可能なマーカーを各々含む2個以上の異なるプローブと反応混合物中の対象核酸を接触させる段階と;
対象核酸を検出領域に流入させる段階と;
1個以上の検出可能なマーカーをプローブから検出する段階を含み;
2個以上の異なるプローブからシグナルが同時に検出された場合には対象核酸がプローブ間でフラグメント化していないと判断し、サンプル中の対象核酸が少なくとも所与長をもつと判定する前記方法。 - 反応混合物が対象核酸のシングルコピーを含む請求項1に記載の方法。
- 異なるプローブの1個のみからシグナルが検出された場合には対象核酸がフラグメント化していると判断する請求項1に記載の方法。
- 所与長の判定が対象核酸の完全性を判定することを含む請求項1に記載の方法。
- 2個以上のプローブが各々異なるシグナルをもつ検出可能なマーカーを含む請求項1に記載の方法。
- プローブの少なくとも1個が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)検出可能なマーカー又は分子ビーコン(MB)マーカーを含む請求項1に記載の方法。
- 疾患状態に関連する長さの比又は定量的閾値を識別することにより1種以上の対象核酸の1個以上の長さを疾患状態に相関させる段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- 対象核酸を第1のプライマー対と接触させる段階と;
第1のプライマー対により規定される配列の外側の対象核酸の配列に相補的な少なくとも1個のプライマー又はその相補配列を含む第2のプライマー対と対象核酸を接触させる段階と;
プライマーでプライマー伸長を開始してマイクロチャネル又はマイクロチャンバーに収容された反応混合物中の対象核酸を増幅し、第1のプライマー対により規定される第1のアンプリコン又は第2のプライマー対により規定される第2のアンプリコンを生成する段階を更に含み;
少なくとも第1のプローブが第1のアンプリコンの配列に相補的であり、少なくとも第2のプローブが第2のアンプリコンの配列に相補的であり;
それによって前記検出の感度を増加する請求項1に記載の方法。 - 1個のプライマー対が100塩基対長以下のアンプリコンを規定する対照プライマーを含み、別のプライマー対が約100塩基対〜約3000塩基対長のより長いアンプリコンを規定する試験プライマーを含む請求項8に記載の方法。
- 第1のプライマー対により規定される対象核酸の領域が第2のプライマー対により規定される対象核酸の領域とオーバーラップしない請求項8に記載の方法。
- プローブの少なくとも1個が1個のプライマー対により規定されるアンプリコン配列に相補的であるが、別のプライマー対により規定されるアンプリコン配列には非相補的である請求項8に記載の方法。
- 第1のプライマー対又は第2のプライマー対により規定される配列の外側の対象核酸の配列に相補的な少なくとも1個のプライマー又はその相補配列を含む1個以上の付加プライマー対と対象核酸を接触させる段階を更に含み;
それによって1個以上の付加アンプリコンを生成し、1個以上の付加アンプリコンに特異的なプローブと第1又は第2のプローブからシグナルが同時に検出された場合には対象核酸がシグナルを発生するプローブに相補的な配列間でフラグメント化していないと判断する請求項8に記載の方法。 - 前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR(RT−PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Q−βレプリカーゼ又はRNA/転写技術を含む請求項8に記載の方法。
- 対象核酸各2コピー以下を含む少なくとも25個の反応混合物にサンプルを分画する段階と;
サンプルアリコートで個々に接触及び検出を実施する段階と;
1個のプローブからシグナルが検出されるアリコート数を個々にカウントするか又は2個以上のプローブからシグナルが検出されるアリコート数を個々にカウントする段階を更に含む請求項1に記載の方法。 - 少なくとも25個の反応混合物が対象核酸のシングルコピーを含む1個以上の反応混合物を含む請求項14に記載の方法。
- 少なくとも25個の反応混合物が対象核酸のコピーを含まない1個以上の反応混合物を含む請求項14に記載の方法。
- 1プローブシグナルと2プローブシグナルの数を評価し、異なる長さをもつ対象核酸の比率を決定する段階を更に含む請求項14に記載の方法。
- 疾患状態を前記比率に相関させる段階を更に含む請求項17に記載の方法。
- 対象核酸を定量する段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- 前記定量が異なるプローブの1個以上からのシグナル数をカウントすることを含む請求項19に記載の方法。
- 前記定量が1個以上のシグナルの体積、幅、高さ、長さ、面積、形状、又は比を検出することを含む請求項19に記載の方法。
- 前記定量がプローブ検出可能なマーカーシグナルと内部標準シグナルの比較を含む請求項19に記載の方法。
- 前記定量が異なる増幅度を含む2個以上の反応混合物からのシグナルの比較を含む請求項19に記載の方法。
- 異なる流速でサーモサイクラーに流すか、サーモサイクラーに異なる距離で流入させるか、サーモサイクラーに異なる時間保持するか、又は異なる増幅サイクル数に付すことにより、2個以上の反応混合物が異なる増幅度を含む請求項23に記載の方法。
- 対象核酸のシングルコピーを含む1個以上の反応混合物を得るようにサンプルを希釈する段階を更に含む請求項1に記載の方法。
- 対象核酸を約1分子/ナノリットル以下の濃度まで希釈する請求項25に記載の方法。
- サンプルが全血、血清、血漿、大便、尿、膣分泌液、射精液、子宮頸管スワブ、滑液、生検、脳髄液、羊水、痰、唾液、リンパ液、涙液、汗、及び尿から構成される群から選択されるサンプルを含む請求項1に記載の方法。
- サンプル中の対象核酸長の識別方法であって、
対象核酸を第1のプライマー対と接触させる段階と;
第1のプライマー対により規定される配列の外側の対象核酸の配列に相補的な少なくとも1個のプライマー又はその相補配列を含む第2のプライマー対と対象核酸を接触させる段階と;
対象核酸のシングルコピーを含む反応混合物中の対象核酸を増幅し、第1のプライマー対により規定される第1のアンプリコン又は第2のプライマー対により規定される第2のアンプリコンを生成する段階と;
各々検出可能なマーカーからのシグナルを含み、第1のアンプリコンの配列に相補的な第1のプローブ又は第2のアンプリコンの配列に相補的な第2のプローブと反応混合物を接触させる段階と;
シグナルの1個以上を検出する段階を含み;
プローブの一方のみからシグナルが検出された場合には対象核酸がフラグメント化していると判断し、両方のプローブからシグナルが検出された場合には所与長をもつ核酸であると判断することにより、対象核酸長を識別する前記方法。 - 反応混合物がマイクロチャネル又はマイクロチャンバーに収容されている請求項28に記載の方法。
- サンプル中の対象核酸長の識別方法であって、
対象核酸を第1のプライマー対と接触させる段階と;
第1のプライマー対により規定される配列の外側の対象核酸の配列に相補的な少なくとも1個のプライマー又はその相補配列を含む第2のプライマー対と対象核酸を接触させる段階と;
プライマーでプライマー伸長を開始してマイクロチャネル又はマイクロチャンバーに収容された反応混合物中の対象核酸を増幅し、第1のプライマー対により規定される第1のアンプリコン又は第2のプライマー対により規定される第2のアンプリコンを生成する段階と;
各々検出可能なマーカーからのシグナルを含み、第1のアンプリコンの配列に相補的な第1のプローブ又は第2のアンプリコンの配列に相補的な第2のプローブと反応混合物を接触させる段階と;
シグナルの1個以上を検出する段階を含み;
プローブの一方のみからシグナルが検出された場合には対象核酸がフラグメント化していると判断し、両方のプローブからシグナルが検出された場合には所与長をもつ核酸であると判断することにより、対象核酸長を識別する前記方法。 - 反応混合物が対象核酸のシングルコピーを含む請求項1に記載の方法。
- サンプル中の対象核酸の定量方法であって、
複数の増幅サイクルにより対象核酸を増幅する段階と;
2回以上の増幅サイクルで生成されたアンプリコンに関連するシグナルを検出する段階と;
増幅サイクル数に対するシグナルパラメーターのサンプル曲線を作成する段階と;
サンプル曲線からの1個以上の識別可能点を濃度に対する識別可能点の標準曲線と比較することにより、対象核酸を定量する段階を含む前記方法。 - 識別可能点が変曲点、所定傾きをもつ点、所定絶対シグナル振幅をもつ点、又は最大シグナル振幅の所定フラクションをもつ点を含む請求項32に記載の方法。
- サンプル中の対象核酸の定量方法であって、
対象核酸の2個以上の異なるアンプリコンを規定する反応混合物中で複数の増幅サイクルにより対象核酸を増幅する段階と;
複数の増幅サイクルの少なくとも2サイクル後に異なるアンプリコンの各々に関連する異なるシグナルを均質反応混合物から検出する段階と;
増幅サイクル数に対する異なるシグナルのサンプル曲線を作成する段階と;
サンプル曲線からの1個以上の識別可能点を核酸濃度に対する識別可能点の1個以上の標準曲線と比較することにより、アンプリコンの1個以上に関連する対象核酸の1個以上の配列を定量する段階を含む前記方法。 - 前記検出が低コピー又はシングルコピー反応混合物から1個以上のシグナルを検出することを含む請求項34に記載の方法。
- 2個以上の異なるシグナルが同時に検出された場合には所与長の核酸であると判断し、異なるシグナルが1個だけ検出された場合にはフラグメント化核酸であると判断する請求項35に記載の方法。
- 識別可能点が変曲点、所定傾きをもつ点、所定絶対シグナル振幅をもつ点、又は最大シグナル振幅の所定フラクションをもつ点を含む請求項34に記載の方法。
- 増幅反応混合物を異なる流速でサーモサイクラーに流すか、増幅反応混合物をサーモサイクラーに異なる距離で流入させるか、増幅反応混合物をサーモサイクラーに異なる時間保持するか、又は増幅反応混合物を異なる増幅サイクル数に付すことにより増幅サイクル数を制御する請求項34に記載の方法。
- サンプル中の対象核酸の定量方法であって、
複数の対象核酸標準材料を所定増幅サイクル数で増幅する段階と;
異なる既知核酸濃度をもつ標準材料で生成された標準アンプリコンに関連するシグナルを検出する段階と;
対象サンプル核酸を前記増幅サイクル数で増幅する段階と;
対象サンプル核酸で生成されたサンプルアンプリコンに関連するシグナルを検出する段階と;
1個以上の標準アンプリコンシグナルをサンプルアンプリコンシグナルと比較し、サンプル中の対象核酸の濃度値を決定することにより、対象核酸を定量する段階を含む前記方法。 - 前記比較がシグナルピークの形状、シグナルピーク上の変曲点、シグナルピークの傾き、シグナルピーク振幅、シグナルピーク面積、及び高さの2分の1のシグナルピーク幅から構成される群から選択されるシグナルパラメーターの比較を含む請求項39に記載の方法。
- 増幅サイクル数を変えて前記増幅、検出、及び比較段階を1回以上繰返すことにより、対象サンプル核酸の付加濃度値を決定する段階と;
濃度値を統計的に評価することにより、より高精度又は高確度でサンプル中の対象核酸の濃度値結果を提供する段階を更に含む請求項39に記載の方法。 - サンプル中の対象核酸長の識別システムであって、
対象核酸の1個以上のアンプリコンを提供する条件下で反応混合物を収容する増幅マイクロチャネル又はマイクロチャンバーを含むマイクロフルイディックデバイスと;
マイクロフルイディックデバイスと一体的であるか又は近接して配置され、均質混合物から1個以上のシグナルとしてアンプリコンを検出するように構成された検出器と;
1個以上の個々の対象核酸分子の長さを表すものとして1個以上の同時に検出されたシグナルを解釈することにより、対象核酸長を識別するソフトウェアシステムを含む前記システム。 - サンプルが一塩基多型(SNP)をもつ核酸、癌関連核酸、感染性物質に由来する核酸、全血、血清、血漿、大便、尿、膣分泌液、子宮頸管スワブ、射精液、滑液、生検、脳脊髄液、羊水、又は法医学用核酸を含む請求項42に記載のシステム。
- 反応混合物が対象核酸と、第1のプライマー対と、第1のプライマー対により規定される配列の外側の対象核酸配列に相補的な少なくとも1個のプライマーを含む第2のプライマー対と、第1のプライマー対により規定されるアンプリコンを合成することができるポリメラーゼを含む請求項42に記載のシステム。
- 1個のプライマー対が100塩基対長以下のアンプリコンを規定する対照プライマーを含み、別のプライマー対が約100塩基対〜約3000塩基対長のより長いアンプリコンを規定する試験プライマーを含む請求項44に記載のシステム。
- 第1のプライマー対により規定される対象核酸の領域が第2のプライマー対により規定される対象核酸の領域とオーバーラップしない請求項44に記載のシステム。
- 増幅マイクロチャネル又はマイクロチャンバーがマイクロチャネルに加熱電流を印加するための電極、抵抗加熱エレメント、ジュール−トンプソンデバイス、又はペルチエデバイスを含む請求項42に記載のシステム。
- 増幅マイクロチャネル又はマイクロチャンバーがサンプル中の他の対象核酸分子又はサンプル中の付加核酸から単一対象核酸分子の増幅産物を実質的に分離するために十分小さい容量の対象核酸のアンプリコンを生成するように反応混合物を熱サイクルに付すように構成されている請求項42に記載のシステム。
- サイズ選択的媒体又はアフィニティー媒体中で分離せずにアンプリコンを検出する請求項42に記載のシステム。
- システムソフトウェアがサンプル中の対象核酸のコピー数、所与長をもつ対象核酸数、又は異なる長さをもつ対象核酸の比率を表すものとして検出器により検出されたシグナルの体積、幅、高さ、長さ、面積、形状、又は比を解釈する請求項42に記載のシステム。
- 1個以上の検出可能なマーカーとアンプリコンの1個以上に相補的な配列を含む1個以上の核酸プローブを更に含み、検出可能なマーカーが検出器により検出可能なシグナルを発生する請求項42に記載のシステム。
- 検出器が蛍光光度計、電荷結合デバイス、レーザー、酵素もしくは酵素基質、光電子増倍管、分光光度計、走査型検出器、顕微鏡、又はガルボスキャナーを含む請求項51に記載のシステム。
- 蛍光光度計が2個以上の周波数の発光を同時に検出することができる請求項52に記載のシステム。
- 検出器が異なるシグナルをもつ2個以上の検出可能なマーカーからのシグナルを独立して検出することができる請求項51に記載のシステム。
- プローブの少なくとも1個が1個のプライマー対により規定されるアンプリコン配列に相補的であるが、別のプライマー対により規定されるアンプリコン配列には非相補的である請求項51に記載のシステム。
- プローブの少なくとも1個が第1のアンプリコン配列と第2のアンプリコン配列に相補的である請求項51に記載のシステム。
- 2個以上のプローブが各々異なるシグナルを含む請求項51に記載のシステム。
- 異なるシグナルが異なる蛍光発光を含む請求項57に記載のシステム。
- プローブの少なくとも1個が蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)検出可能なマーカー又は分子ビーコン(MB)マーカーを含む請求項51に記載のシステム。
- FRET検出可能なマーカーがヌクレアーゼ活性によりFRETプローブから除去可能なクエンチャーを含む請求項59に記載のシステム。
- システムが高スループットシステムである請求項42に記載のシステム。
- 更に希釈モジュールを含む請求項42に記載のシステム。
- 希釈モジュールが増幅マイクロチャネル又はマイクロチャンバーで対象核酸に1個以上のシングルコピー反応混合物を提供する濃度までサンプルを希釈するように構成されている請求項62に記載のシステム。
- 希釈モジュールが系列マルチウェルプレート希釈又はマイクロフルイディックデバイスの希釈チャネルを含む請求項62に記載のシステム。
- 対象核酸コピーを含まない複数のゼロコピーアリコートと、対象核酸のシングルコピーを含む1個以上のシングルコピーアリコートを含む複数のアリコートにサンプルを分画するように希釈モジュールに指示するシステム命令を更に含む請求項62に記載のシステム。
- 検出器と接続するコンピューターを更に含む請求項42に記載のシステム。
- マイクロフルイディックデバイスが更に複数の増幅チャネルを含む請求項42に記載のシステム。
- 反応混合物の調製前にサンプルを保存するサンプル保存モジュール、又は反応混合物の調製前に保存モジュールからサンプルを抽出するサンプル抽出モジュールを更に含む請求項42に記載のシステム。
- 反応混合物の調製前又は調製中に対象ヌクレオチドを捕獲するため又は検出用にアンプリコンを捕獲するために固体支持体に結合した捕獲用オリゴヌクレオチドを更に含む請求項42に記載のシステム。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010004781A (ja) * | 2008-06-25 | 2010-01-14 | Canon Inc | 核酸増幅装置およびそれを用いた核酸分析装置 |
JP2010503841A (ja) * | 2006-09-15 | 2010-02-04 | サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク(セエヌエールエス) | キャピラリー電気泳動による分離に続いて行われるテイラー分散の分析による、混合物の成分の流体力学的半径の決定 |
JP2014138611A (ja) * | 2006-01-11 | 2014-07-31 | Raindance Technologies Inc | ナノリアクターの形成および制御において使用するマイクロ流体デバイスおよび方法 |
JP2016039819A (ja) * | 2009-06-15 | 2016-03-24 | ネットバイオ・インコーポレーテッドNetBio, Inc. | 法医学的dnaの定量化のための改善された方法 |
Families Citing this family (140)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6048734A (en) | 1995-09-15 | 2000-04-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Thermal microvalves in a fluid flow method |
US6696022B1 (en) * | 1999-08-13 | 2004-02-24 | U.S. Genomics, Inc. | Methods and apparatuses for stretching polymers |
US8900811B2 (en) * | 2000-11-16 | 2014-12-02 | Caliper Life Sciences, Inc. | Method and apparatus for generating thermal melting curves in a microfluidic device |
US6692700B2 (en) | 2001-02-14 | 2004-02-17 | Handylab, Inc. | Heat-reduction methods and systems related to microfluidic devices |
US7323140B2 (en) | 2001-03-28 | 2008-01-29 | Handylab, Inc. | Moving microdroplets in a microfluidic device |
US8895311B1 (en) | 2001-03-28 | 2014-11-25 | Handylab, Inc. | Methods and systems for control of general purpose microfluidic devices |
US7010391B2 (en) | 2001-03-28 | 2006-03-07 | Handylab, Inc. | Methods and systems for control of microfluidic devices |
US7829025B2 (en) | 2001-03-28 | 2010-11-09 | Venture Lending & Leasing Iv, Inc. | Systems and methods for thermal actuation of microfluidic devices |
US6852287B2 (en) | 2001-09-12 | 2005-02-08 | Handylab, Inc. | Microfluidic devices having a reduced number of input and output connections |
US7041481B2 (en) | 2003-03-14 | 2006-05-09 | The Regents Of The University Of California | Chemical amplification based on fluid partitioning |
WO2005011867A2 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-10 | Handylab, Inc. | Processing particle-containing samples |
US8852862B2 (en) | 2004-05-03 | 2014-10-07 | Handylab, Inc. | Method for processing polynucleotide-containing samples |
CA2994321C (en) * | 2004-05-03 | 2023-08-08 | Handylab, Inc. | A microfluidic device and methods for processing polynucleotide-containing samples |
EP1786932A4 (en) * | 2004-08-23 | 2010-10-27 | Us Genomics Inc | SYSTEMS AND METHOD FOR THE DETECTION AND ANALYSIS OF POLYMERS |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
WO2007044917A2 (en) * | 2005-10-11 | 2007-04-19 | Handylab, Inc. | Polynucleotide sample preparation device |
US20070154895A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-07-05 | Caliper Life Sciences, Inc. | Multi-assay microfluidic chips |
US20070161868A1 (en) * | 2006-01-10 | 2007-07-12 | Biosignia, Inc. | Method and system for determining whether additional laboratory tests will yield values beyond a threshold level |
US20070207272A1 (en) * | 2006-03-03 | 2007-09-06 | Puri Ishwar K | Method and apparatus for magnetic mixing in micron size droplets |
DK3088083T3 (en) | 2006-03-24 | 2018-11-26 | Handylab Inc | Method of carrying out PCR down a multi-track cartridge |
US7998708B2 (en) * | 2006-03-24 | 2011-08-16 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
US8883490B2 (en) | 2006-03-24 | 2014-11-11 | Handylab, Inc. | Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system |
US11806718B2 (en) | 2006-03-24 | 2023-11-07 | Handylab, Inc. | Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system |
US10900066B2 (en) | 2006-03-24 | 2021-01-26 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
EP2530168B1 (en) | 2006-05-11 | 2015-09-16 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic Devices |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
DE102006027675B4 (de) | 2006-06-14 | 2011-05-12 | Siemens Ag | Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren |
WO2007147063A2 (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-21 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for the amplification, detection and quantification of nucleic acid from a sample |
US20080003585A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc., A Corporation Of The State Of Delaware | Purification and amplification of nucleic acids in a microfluidic device |
US7629124B2 (en) * | 2006-06-30 | 2009-12-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Real-time PCR in micro-channels |
EP2091647A2 (en) | 2006-11-14 | 2009-08-26 | Handylab, Inc. | Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel |
WO2008066869A2 (en) | 2006-11-30 | 2008-06-05 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Systems and methods for monitoring the amplification and dissociation behavior of dna molecules |
DE112008000363B4 (de) * | 2007-02-05 | 2021-12-02 | Qiagen Sciences, LLC (n.d.Ges.d. Staates Delaware) | Vorrichtung zur Detektion und ihre Verwendung |
US8772046B2 (en) | 2007-02-06 | 2014-07-08 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
WO2008118988A1 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Sequenom, Inc. | Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection |
CA2682734C (en) * | 2007-04-04 | 2017-11-07 | Network Biosystems, Inc. | Plastic microfluidic separation and detection platforms |
WO2008130623A1 (en) | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
US20100294665A1 (en) * | 2007-07-12 | 2010-11-25 | Richard Allen | Method and system for transferring and/or concentrating a sample |
US20090136385A1 (en) | 2007-07-13 | 2009-05-28 | Handylab, Inc. | Reagent Tube |
US9618139B2 (en) | 2007-07-13 | 2017-04-11 | Handylab, Inc. | Integrated heater and magnetic separator |
USD621060S1 (en) | 2008-07-14 | 2010-08-03 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge |
US8133671B2 (en) * | 2007-07-13 | 2012-03-13 | Handylab, Inc. | Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples |
US8182763B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-05-22 | Handylab, Inc. | Rack for sample tubes and reagent holders |
US8287820B2 (en) * | 2007-07-13 | 2012-10-16 | Handylab, Inc. | Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system |
US8324372B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-12-04 | Handylab, Inc. | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
US8105783B2 (en) | 2007-07-13 | 2012-01-31 | Handylab, Inc. | Microfluidic cartridge |
US9186677B2 (en) | 2007-07-13 | 2015-11-17 | Handylab, Inc. | Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples |
US20090053719A1 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-26 | The Chinese University Of Hong Kong | Analysis of nucleic acids by digital pcr |
US8380457B2 (en) * | 2007-08-29 | 2013-02-19 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic devices with integrated resistive heater electrodes including systems and methods for controlling and measuring the temperatures of such heater electrodes |
US9221056B2 (en) * | 2007-08-29 | 2015-12-29 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic devices with integrated resistive heater electrodes including systems and methods for controlling and measuring the temperatures of such heater electrodes |
US8306773B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-11-06 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic devices with integrated resistive heater electrodes including systems and methods for controlling and measuring the temperatures of such heater electrodes |
US20090130746A1 (en) * | 2007-10-25 | 2009-05-21 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microchannel surface coating |
US8145433B2 (en) * | 2007-10-25 | 2012-03-27 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | High-resolution melting analysis |
US9114397B2 (en) * | 2007-10-25 | 2015-08-25 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method of reducing cross-contamination in continuous amplification reactions in a channel |
US8189186B2 (en) * | 2007-12-27 | 2012-05-29 | Lawrence Livermore National Security, Llc. | Signal enhancement using a switchable magnetic trap |
US8815576B2 (en) * | 2007-12-27 | 2014-08-26 | Lawrence Livermore National Security, Llc. | Chip-based sequencing nucleic acids |
US8367976B2 (en) * | 2008-03-21 | 2013-02-05 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Laser heating of aqueous samples on a micro-optical-electro-mechanical system |
AU2009228312B2 (en) | 2008-03-26 | 2015-05-21 | Sequenom, Inc. | Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection |
US9664619B2 (en) * | 2008-04-28 | 2017-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic device for storage and well-defined arrangement of droplets |
US9393566B2 (en) * | 2008-06-23 | 2016-07-19 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | System and method for temperature referencing for melt curve data collection |
US9724695B2 (en) * | 2008-06-23 | 2017-08-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Systems and methods for amplifying nucleic acids |
USD618820S1 (en) | 2008-07-11 | 2010-06-29 | Handylab, Inc. | Reagent holder |
USD787087S1 (en) | 2008-07-14 | 2017-05-16 | Handylab, Inc. | Housing |
WO2010009365A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet libraries |
US8304185B2 (en) | 2009-07-17 | 2012-11-06 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Methods and systems for DNA isolation on a microfluidic device |
JP5795255B2 (ja) | 2008-07-18 | 2015-10-14 | キヤノン ユー.エス. ライフ サイエンシズ, インコーポレイテッドCanon U.S. Life Sciences, Inc. | 微小流体dna試料調製のための方法およびシステム |
EP2148198A1 (en) * | 2008-07-21 | 2010-01-27 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Determination of the hydrodynamic radii and/or content of constituents of a mixture by analysis of the Taylor dispersion of the mixture in a capillary tube |
US10123380B2 (en) | 2008-08-08 | 2018-11-06 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Instantaneous in-line heating of samples on a monolithic microwave integrated circuit microfluidic device |
US8633015B2 (en) * | 2008-09-23 | 2014-01-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler |
US8663920B2 (en) | 2011-07-29 | 2014-03-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Library characterization by digital assay |
US9598725B2 (en) | 2010-03-02 | 2017-03-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Emulsion chemistry for encapsulated droplets |
US10512910B2 (en) | 2008-09-23 | 2019-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based analysis method |
US8951939B2 (en) | 2011-07-12 | 2015-02-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel |
US9764322B2 (en) | 2008-09-23 | 2017-09-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for generating droplets with pressure monitoring |
US11130128B2 (en) | 2008-09-23 | 2021-09-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection method for a target nucleic acid |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US9492797B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-11-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US9399215B2 (en) | 2012-04-13 | 2016-07-26 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sample holder with a well having a wicking promoter |
US8709762B2 (en) | 2010-03-02 | 2014-04-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for hot-start amplification via a multiple emulsion |
US9132394B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US9417190B2 (en) | 2008-09-23 | 2016-08-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Calibrations and controls for droplet-based assays |
US9404152B2 (en) | 2009-01-26 | 2016-08-02 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic flow monitoring |
US10066977B2 (en) | 2009-01-26 | 2018-09-04 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic flow monitoring |
US9542526B2 (en) * | 2009-03-10 | 2017-01-10 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method and system for temperature correction in thermal melt analysis |
US9447461B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes |
US10196700B2 (en) | 2009-03-24 | 2019-02-05 | University Of Chicago | Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes |
EP2412020B1 (en) * | 2009-03-24 | 2020-09-30 | University Of Chicago | Slip chip device and methods |
US9630158B2 (en) | 2009-04-10 | 2017-04-25 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Method of delivering PCR solution to microfluidic PCR chamber |
JP5709840B2 (ja) * | 2009-04-13 | 2015-04-30 | キヤノン ユー.エス. ライフ サイエンシズ, インコーポレイテッドCanon U.S. Life Sciences, Inc. | 動的シグナルの相関分析による、パターン認識、機械学習、および自動遺伝子型分類の迅速な方法 |
US8337082B2 (en) * | 2009-05-08 | 2012-12-25 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Systems and methods for auto-calibration of resistive temperature sensors |
US8329117B2 (en) | 2009-05-14 | 2012-12-11 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic chip features for optical and thermal isolation |
US9061278B2 (en) * | 2009-06-29 | 2015-06-23 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Microfluidic systems and methods for thermal control |
JP5815518B2 (ja) | 2009-07-17 | 2015-11-17 | キヤノン ユー.エス. ライフ サイエンシズ, インコーポレイテッドCanon U.S. Life Sciences, Inc. | マイクロ流体装置においてdnaを単離する方法及びシステム |
SG178960A1 (en) * | 2009-09-02 | 2012-04-27 | Accugen Pty Ltd | Improved nucleic acid quantitation method |
EP2940153B1 (en) | 2009-09-02 | 2020-05-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions |
JP5934657B2 (ja) | 2010-02-12 | 2016-06-15 | レインダンス テクノロジーズ, インコーポレイテッド | デジタル検体分析 |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
US9310359B2 (en) | 2010-03-01 | 2016-04-12 | Fida-Tech Aps | Analyte quantification using flow induced dispersion analysis |
JP6155419B2 (ja) | 2010-03-25 | 2017-07-05 | バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | 検出用の液滴輸送システム |
EP2550528B1 (en) | 2010-03-25 | 2019-09-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet generation for droplet-based assays |
JP2013524169A (ja) | 2010-03-25 | 2013-06-17 | クァンタライフ・インコーポレーテッド | 液滴によるアッセイ用の検出システム |
US20110312676A1 (en) * | 2010-06-17 | 2011-12-22 | Geneasys Pty Ltd | Loc device with integral driver for excitation of electrochemiluminescent luminophores |
EP2588859B1 (en) | 2010-06-29 | 2019-05-22 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | System and method for genotype analysis |
CN103003450B (zh) * | 2010-07-23 | 2014-06-11 | 株式会社百奥尼 | 样本内装微腔板及分析用微腔板的制造方法、分析用微腔板及样本内装微腔板制造装置套件 |
WO2012030999A1 (en) | 2010-08-31 | 2012-03-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Air cooling systems and methods for microfluidic devices |
EP2612132A4 (en) | 2010-08-31 | 2014-03-12 | Canon Us Life Sciences Inc | HIGH RESOLUTION FUSION DETECTION OPTICAL SYSTEM |
US9061279B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-06-23 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Composition and method for in-system priming microfluidic devices |
EP3447155A1 (en) | 2010-09-30 | 2019-02-27 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
SG190074A1 (en) | 2010-11-01 | 2013-06-28 | Bio Rad Laboratories | System for forming emulsions |
WO2012109600A2 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Raindance Technologies, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
EP2675819B1 (en) | 2011-02-18 | 2020-04-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
WO2012129187A1 (en) | 2011-03-18 | 2012-09-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals |
WO2012135667A1 (en) | 2011-04-01 | 2012-10-04 | Life Technologies Corporation | System and method for determining copies-per-unit-volume using pcr and flow control of droplets |
BR112013026451B1 (pt) | 2011-04-15 | 2021-02-09 | Becton, Dickinson And Company | sistema e método para realizar ensaios de diagnóstico molecular em várias amostras em paralelo e simultaneamente amplificação em tempo real em pluralidade de câmaras de reação de amplificação |
WO2012149042A2 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
EP2714970B1 (en) | 2011-06-02 | 2017-04-19 | Raindance Technologies, Inc. | Enzyme quantification |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
US8599009B2 (en) | 2011-08-16 | 2013-12-03 | Elwha Llc | Systematic distillation of status data relating to regimen compliance |
JP6117217B2 (ja) | 2011-09-30 | 2017-04-19 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーBecton, Dickinson And Company | ユニット化された試薬ストリップ |
USD692162S1 (en) | 2011-09-30 | 2013-10-22 | Becton, Dickinson And Company | Single piece reagent holder |
EP2773892B1 (en) | 2011-11-04 | 2020-10-07 | Handylab, Inc. | Polynucleotide sample preparation device |
US8911949B2 (en) * | 2011-11-11 | 2014-12-16 | Icubate, Inc. | Systems and methods for performing amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction (PCR) |
US9447458B2 (en) | 2011-11-16 | 2016-09-20 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Detection of neighboring variants |
US10822644B2 (en) | 2012-02-03 | 2020-11-03 | Becton, Dickinson And Company | External files for distribution of molecular diagnostic tests and determination of compatibility between tests |
US9028776B2 (en) | 2012-04-18 | 2015-05-12 | Toxic Report Llc | Device for stretching a polymer in a fluid sample |
US8956815B2 (en) | 2012-04-18 | 2015-02-17 | Toxic Report Llc | Intercalation methods and devices |
US9422602B2 (en) | 2012-08-15 | 2016-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for determining nucleic acid degradation |
JP6427753B2 (ja) | 2013-09-11 | 2018-11-28 | 国立大学法人大阪大学 | 熱対流生成用チップ、熱対流生成装置、及び熱対流生成方法 |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
US10957421B2 (en) | 2014-12-03 | 2021-03-23 | Syracuse University | System and method for inter-species DNA mixture interpretation |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
US10479128B2 (en) | 2017-10-27 | 2019-11-19 | Assa Abloy Ab | Security feature |
JP2022511168A (ja) * | 2018-11-13 | 2022-01-31 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | マイクロ流体デバイスを備える分析システムとマイクロ流体デバイスと関連方法 |
DE102019200929A1 (de) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zum optischen Erfassen einer Länge eines Makromoleküls |
EP4001433A1 (en) * | 2020-11-20 | 2022-05-25 | Université de Paris | A method for determining the level of dna integrity |
CN114717330B (zh) * | 2022-04-13 | 2023-09-22 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 与绵羊单胎产羔数相关的snp分子标记、引物组、试剂盒及检测方法和应用 |
WO2023235392A1 (en) * | 2022-06-02 | 2023-12-07 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | Electrophoresis-mediated characterization of dna content of adeno-associated virus capsids |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6444461B1 (en) * | 1997-04-04 | 2002-09-03 | Caliper Technologies Corp. | Microfluidic devices and methods for separation |
US6586177B1 (en) * | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5277556A (en) * | 1990-07-10 | 1994-01-11 | Westonbridge International Limited | Valve and micropump incorporating said valve |
ES2075459T3 (es) * | 1990-08-31 | 1995-10-01 | Westonbridge Int Ltd | Valvula equipada con detector de posicion y microbomba que incorpora dicha valvula. |
US5498392A (en) * | 1992-05-01 | 1996-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale polynucleotide amplification device and method |
DE4220077A1 (de) * | 1992-06-19 | 1993-12-23 | Bosch Gmbh Robert | Mikropumpe |
US5639423A (en) | 1992-08-31 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of Calfornia | Microfabricated reactor |
US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
US5601982A (en) * | 1995-02-07 | 1997-02-11 | Sargent; Jeannine P. | Method and apparatus for determining the sequence of polynucleotides |
US5856174A (en) | 1995-06-29 | 1999-01-05 | Affymetrix, Inc. | Integrated nucleic acid diagnostic device |
PT912766E (pt) * | 1996-06-04 | 2009-07-16 | Univ Utah Res Found | Monitorização da hibridização durante a pcr |
US5939291A (en) * | 1996-06-14 | 1999-08-17 | Sarnoff Corporation | Microfluidic method for nucleic acid amplification |
BR9710054A (pt) | 1996-06-28 | 2000-01-11 | Caliper Techn Corp | Aparelhos para separar compostos de teste para um efeito sobre um sistema bioquìmico e para detectar ummefeito de um composto de teste sobre um sistema bioquìmico, processos de determinação de se uma amostra contém um composto capaz de afetar um sistema bioquìmico, de separação de uma pluralidade de compostos de teste para um efeito sobre um sistema bioquìmico e usos de um sistema microfluido e de um substrato de ensaio. |
WO1998000705A1 (en) * | 1996-06-28 | 1998-01-08 | Caliper Technologies Corporation | Electropipettor and compensation means for electrophoretic bias |
US6235471B1 (en) * | 1997-04-04 | 2001-05-22 | Caliper Technologies Corp. | Closed-loop biochemical analyzers |
US5869004A (en) * | 1997-06-09 | 1999-02-09 | Caliper Technologies Corp. | Methods and apparatus for in situ concentration and/or dilution of materials in microfluidic systems |
US5965410A (en) * | 1997-09-02 | 1999-10-12 | Caliper Technologies Corp. | Electrical current for controlling fluid parameters in microchannels |
US6174675B1 (en) * | 1997-11-25 | 2001-01-16 | Caliper Technologies Corp. | Electrical current for controlling fluid parameters in microchannels |
US6037130A (en) * | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
US6503718B2 (en) * | 1999-01-10 | 2003-01-07 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease |
US6171850B1 (en) * | 1999-03-08 | 2001-01-09 | Caliper Technologies Corp. | Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses |
US6303305B1 (en) * | 1999-03-30 | 2001-10-16 | Roche Diagnostics, Gmbh | Method for quantification of an analyte |
US6303343B1 (en) * | 1999-04-06 | 2001-10-16 | Caliper Technologies Corp. | Inefficient fast PCR |
AU6068300A (en) * | 1999-07-06 | 2001-01-22 | Caliper Technologies Corporation | Microfluidic systems and methods for determining modulator kinetics |
US6440706B1 (en) * | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
US6828098B2 (en) | 2000-05-20 | 2004-12-07 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing a DNA library using positional amplification based on the use of adaptors and nick translation |
AUPR221400A0 (en) * | 2000-12-20 | 2001-01-25 | Murdoch Childrens Research Institute, The | Diagnostic assay |
US7081339B2 (en) * | 2002-04-12 | 2006-07-25 | Primera Biosystems, Inc. | Methods for variation detection |
US20050069904A1 (en) * | 2003-09-29 | 2005-03-31 | Stuart Peirson | Analysis of real-time PCR data |
-
2004
- 2004-05-14 US US10/845,996 patent/US20050042639A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-05-16 EP EP05749873A patent/EP1755785A1/en not_active Withdrawn
- 2005-05-16 WO PCT/US2005/017065 patent/WO2005113148A1/en active Application Filing
- 2005-05-16 JP JP2007513461A patent/JP4740237B2/ja active Active
- 2005-05-16 CA CA002566698A patent/CA2566698A1/en not_active Abandoned
- 2005-05-16 AU AU2005245448A patent/AU2005245448A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-04 US US11/867,626 patent/US7645581B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6444461B1 (en) * | 1997-04-04 | 2002-09-03 | Caliper Technologies Corp. | Microfluidic devices and methods for separation |
US6586177B1 (en) * | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014138611A (ja) * | 2006-01-11 | 2014-07-31 | Raindance Technologies Inc | ナノリアクターの形成および制御において使用するマイクロ流体デバイスおよび方法 |
JP2010503841A (ja) * | 2006-09-15 | 2010-02-04 | サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク(セエヌエールエス) | キャピラリー電気泳動による分離に続いて行われるテイラー分散の分析による、混合物の成分の流体力学的半径の決定 |
JP2010004781A (ja) * | 2008-06-25 | 2010-01-14 | Canon Inc | 核酸増幅装置およびそれを用いた核酸分析装置 |
JP2016039819A (ja) * | 2009-06-15 | 2016-03-24 | ネットバイオ・インコーポレーテッドNetBio, Inc. | 法医学的dnaの定量化のための改善された方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1755785A1 (en) | 2007-02-28 |
JP4740237B2 (ja) | 2011-08-03 |
US20080085521A1 (en) | 2008-04-10 |
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WO2005113148A1 (en) | 2005-12-01 |
AU2005245448A1 (en) | 2005-12-01 |
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