JP5066110B2 - 蛍光分析装置、及び蛍光分析方法 - Google Patents
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
Description
図1は、本実施例における蛍光分析方法を使ったDNA検査装置の構成図である。装置は顕微鏡に類似する装置の構成であり、基板8に捕捉するDNA分子の伸長状態を蛍光検出にて測定する。
段階的伸長反応の工程を以下に示す。反応工程は“Proc. Natl. Acad. Sci. USA、vol.100、pp3960、2003(非特許文献2)”、及び“Proc. Natl. Acad. Sci. USA、vol.102、pp5932、2005(非特許文献4)”を参考に行った。ストレプトアビジンを加えたバッファを導入口12よりチャンバに導入し、ストレプトアビジンを金属構造体に固定されているビオチンに結合させ、ビオチン−アビジン複合体を形成させる。ビオチン修飾したターゲットである一本鎖鋳型DNAにプライマをハイブリさせ、前記鋳型DNA−プライマ複合体と大過剰のビオチンを加えたバッファをチャンバへ導入し、ビオチン−アビジン結合を介して、単分子の前記鋳型DNA−プライマ複合体を格子点に配置された金属構造体に固定する。固定反応後に、余剰な鋳型DNA−プライマ複合体、及びビオチンを洗浄用バッファにてチャンバより洗い流す。次に、それぞれ異なる4種の蛍光体で標識された3′末端がアリル基で修飾された4種のdNTP(3′−O−allyl−dGTP−PC−Bodipy−FL−510,3′−O−allyl−dTTP−PC−R6G,3′−O−allyl−dATP−PC−ROX,3′−O−allyl−dCTP−PC−Bodipy−650)、及びThermo Sequenaseポリメラーゼを加えたThermo Sequenase Reactionバッファを導入口12よりチャンバへ導入し、伸長反応を行う。鋳型DNA−プライマ複合体に取込まれたdNTPは、3′末端がアリル基で修飾されているため、前記鋳型DNA−プライマ複合体に1塩基以上取込まれることはない。伸長反応後、未反応の各種dNTP、及びポリメラーゼを洗浄用バッファで洗い流し、Arレーザ光源101a,He−Neレーザ光源101bのそれぞれの光源から発振するレーザ光を同時にチップに照射する。レーザ照射により、鋳型DNA−プライマ複合体に取込まれたdNTPを標識する蛍光体を励起し、そこから発する蛍光を検出する。鋳型DNA−プライマ複合体に取込まれたdNTPを標識する蛍光体の蛍光波長を特定することにより、前記dNTPの塩基種を特定できる。尚、エバネッセント照射であり、反応領域表面近傍のみが励起光照射領域となるため、前記表面以外の領域に存在する蛍光体を励起することは無く、背景光の少ない測定ができる。そのため、上記では、伸長反応後洗浄しているが、蛍光標識dNTP濃度が小さい場合、洗浄不要で測定が可能になる場合もある。
図3は、基板の蛍光を波長分散して検出する方式の説明図である。図3(A)は、基板8の表面の一部の概略図であり、DNAが固定されるべき複数の領域8ij(格子点)が形成されている。CCDカメラへの結像倍率を37倍とし、dx=1umの距離を5分割してCCD画素で検出する。格子点の最も近接する間隔は1umであり、その方向に分光させると、1画素あたり40nmの分散になり、500nm−700nmの範囲にある4種の蛍光体からの蛍光を識別することは難しい。
7 プリズム
8,60 基板
8a,60a 反応領域
8ij DNAが固定される領域(dx,dyは領域8ijの間隔の寸法)
9 フローチャンバ
10 廃液チューブ
11 廃液容器
12 導入口
13 蛍光
14 集光レンズ(対物レンズ)
15 フィルタユニット
16 透過光観察用鏡筒
17a,17b 波長分散プリズム
18a,18b 結像レンズ
19a,19b 2次元センサカメラ
20a,20b 2次元センサカメラコントローラ
21 制御PC
22,24 モニタ
23 TVカメラ
25 分注ユニット
26 分注ノズル
27 試薬保管ユニット
27a 試料液容器
27b,27c,27d,27e dNTP誘導体溶液容器
27f 洗浄液容器
28 チップボックス
29 自動ピントあわせ装置
30,31,61,62,63 位置きめマーカ
32,103,104a ダイクロイックミラー
60b マスク
60ij DNAが固定される反応領域
100,101a,101b,101c,101d レーザ光源
102a,102b,102c,102d λ/4波長板
200 測定基板
201 PDMS樹脂
202 窪み
203 ホルダ
204 フローチャンバ
205 基板保持具
206 貫通孔
207 開口部
208 流路
209 XYステージ
210 プリズムホルダ
Claims (19)
- 生体関連分子が固定される基板を備え、当該基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を分光し、2次元センサに測定する蛍光分析装置であって、
前記基板において、前記生体関連分子が固定されうる複数の領域が、格子構造の格子点位置に設けられ、ある格子点から発する蛍光像を、隣接する最短の格子点に向かう方向以外の方向に波長分散させる装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
ある格子点から発する蛍光像を、当該格子点から隣接する最短の格子点に向かう角度に対して+10度〜+170度、又は、−10度〜−170度の範囲の方向に波長分散することを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
ある格子点から発する蛍光像を、当該格子点からの距離が2番目以降の任意の格子点に向かう方向に波長分散することを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記格子構造が、2次元の長方格子構造であることを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記格子構造が、三角格子構造であることを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記格子構造の格子点位置に金属の微小な構造物が設けられていることを特徴とする装置。 - 請求項6記載の蛍光分析装置において、
前記金属の微小な構造物が、金,クロム,銀、又はアルミの微粒子であることを特徴する装置。 - 請求項6記載の蛍光分析装置において、
前記金属の微小な構造物が、一部に微細な突起を有する構造体であることを特徴する装置。 - 請求項6記載の蛍光分析装置において、
前記金属の微小な構造物が、励起光の波長以下の大きさの金属構造体であることを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、該格子構造の格子点位置に微小開口を有し、光学的に不透明な材質の薄膜で構成された基板を使用することを特徴とする蛍光分析装置。
- 請求項6記載の蛍光分析装置において、
前記生体関連分子を金属構造体表面、又は開口部底部に固定することを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記基板にプリズムが光学接着されているか、又は、前記基板の一部がプリズム形状であり、当該プリズムを介して蛍光測定用の光を照射し、前記基板の表面にて全反射させ、エバネッセント場を形成することを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記基板とプリズムとの間に光学的に透明で弾性のある材料を挟むことにより前記基板と前記プリズムとを光学的に接着し、前記基板の表面で蛍光測定用の光を全反射させ、エバネッセント場を形成することを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記格子点の間隔が、100nmから10000nmであることを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
前記生体関連分子が固定されうる領域の大きさが100nm径以下であることを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
蛍光を500nmから700nmの範囲で分光することを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
蛍光を少なくとも2つの波長帯に分け、それぞれを個別に波長分散させることを特徴とする装置。 - 請求項1記載の蛍光分析装置において、
蛍光を2つの波長帯にわけ、それぞれを個別に最大100nmの範囲で波長分散させ、それぞれを2個の2次元センサにて検出することを特徴とする装置。 - 生体関連分子が固定される基板に蛍光測定用の光を照射し、生じる蛍光を分光し、2次元センサに測定する蛍光分析方法であって、
前記基板において、前記生体関連分子が固定されうる複数の領域が、格子構造の格子点位置に設けられ、ある格子点から発する蛍光像を、隣接する最短の格子点に向かう方向以外の方向に波長分散させる方法。
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