JP3525142B2 - 金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子及びその製造方法 - Google Patents

金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子及びその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生化学，臨床用，環境
分析等に使用される蛍光分析用素子及びその製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫分析や遺伝子分析では、抗原と抗体
又は相補性のあるＤＮＡ相互の強力な結合性相互作用を
利用し、標的とする抗原やＤＮＡを検出又は定量してい
る。なかでも、両者の結合を蛍光によって検出する蛍光
分析は、容易に高感度が得られるため生化学研究から臨
床分析までの広範囲で応用されている。
【０００３】蛍光分析として種々の方法が知られている
が、次の手順で蛍光分析することが最も基本的な方法で
ある。 （1）検出・定量の標的である抗原やＤＮＡと強く結合
する抗体又はＤＮＡを化学修飾により基板表面に予め固
定したプレートを作製する。 （2）標的である抗原やＤＮＡを含む検体試料に蛍光標
識試薬を添加し、標的を蛍光修飾する。 （3）プレートを検体試料に浸漬して両者を結合させた
後、プレート表面を十分洗浄することにより未結合成分
を除去する。 （4）光励起によりプレートに結合した標的の蛍光信号
を検出し、蛍光強度から標的濃度を定量する。
【０００４】（1）〜（2）の手順を経る方法は最も単純
な方法であり、複雑な手順を採用することにより感度を
向上させることが通常である。感度向上を目的として、
いくつかの有力な手順がこれまで確立されている。ま
た、分析用基板として通常96〜1536ウェルのマルチウェ
ルプレートが用いられ、ウェル内における一連の処理か
ら定量までが完全自動化され、分析操作をハイスループ
ット化している。特に遺伝子分析に関しては、ＤＮＡを
２００μｍ程度のスポット状にして基板上に集積固定化
したＤＮＡチップが使用され始め、優れたハイスループ
ットが達成される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、基礎科学では
研究の急速な発展・拡大，臨床分析では各種のウィルス
疾患やアレルギ疾患等の著しい増加に伴って検体数が増
加する一方である。1536ウェルの実用化等、マルチウェ
ルプレートの高密度化は進んでいるものの、目視可能な
サイズでは近い将来に対応困難な事態に至ることが容易
に予想される。高感度化を可能にしたＤＮＡチップにし
ても、最小でもスポットサイズが１５０μｍ程度に過ぎ
ず、チップ全体では数センチ角のサイズになることもあ
る。遺伝子分析検体数の指数関数的な増加を考慮する
と、従来の集積密度では極めて不充分であり、サイズが
数μｍ以下のナノウェルを集積させたマイクロチップを
用いた分析の実現が望まれている。
【０００６】ところが、試料体積が減少すると、励起分
子数が減少するばかりでなく、外乱因子の影響が指数関
数的に増加し、結果として蛍光強度が著しく低下する。
また、蛍光分析の最大のネックである蛍光試薬を褪色さ
せる原因ともなる。この点、ナノウェルを用いた蛍光分
析の実用化には次の要求を満足させることが重要である
が、（ａ）〜（ｃ）の要求事項は互いに強く相関してい
るので個別解決が極めて困難である。 （ａ）極力閉鎖された微小空間に検出用試薬や試料を効
果的に固定化・封入することにより、蛍光試薬と酸素等
の褪色促進物質の相互作用を抑制する。 （ｂ）励起光のエネルギを蛍光性分子に効率よく伝達さ
せる。 （ｃ）発生した蛍光を検出器に効率よく導入する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような問
題を解消すべく案出されたものであり、数百ｎｍ〜数μ
ｍの金属薄膜に形成した直径数百ｎｍの穴をナノウェル
として使用することにより、前掲（ａ）〜（ｃ）の要求
事項を同時に満足させ、高性能の蛍光分析用素子を提供
することを目的とする。
【０００８】本発明の蛍光分析用素子は、その目的を達
成するため、基板表面に形成された金属薄膜と、金属薄
膜に形成されたナノウェルと、ナノウェルの底面に修飾
固定化された活性基又は検出用ＤＮＡとを備え、活性基
に結合した抗原又は検出用ＤＮＡにハイブリダイゼーシ
ョンした標的ＤＮＡに結合した蛍光試薬を光励起により
蛍光発色させることを特徴とする。
【０００９】この蛍光分析用素子は、シランカップリン
グ試薬で処理した基板に金属薄膜を堆積させ、金属薄膜
のナノウェルの底面に活性基又は検出用ＤＮＡを修飾固
定することにより製造される。ナノウェルは、プロジェ
クション法でＡｕ，Ａｇ等を蒸着させる方法や、電子ビ
ームリソグラフィ，フォトリソグラフィ，レーザによる
直接描画等で形成できる。
【００１０】
【作用】本発明に従った蛍光分析用素子は、石英，ガラ
ス，サファイア，表面酸化したシリコン，ダイヤモンド
薄膜，金属板等の基板表面に数百ｎｍ〜数μｍの金属薄
膜を形成し、金属薄膜中にある直径数百ｎｍの穴をナノ
ウェルに使用している。金属薄膜としては、各種の蛋白
や核酸を容易に表面修飾できることからＡｕ，Ａｇ等の
薄膜が好ましい。Ａｕ，Ａｇ等の薄膜は、免疫・遺伝子
分析の場としても好適であり、金属薄膜に生じているナ
ノウェル（以下、「金属ナノウェル」という）によって
検出用試薬や試料が極めて効果的に固定される。
【００１１】金属ナノウェルは、薄膜表面に接触した液
滴をナノウェル内部に吸い込む毛管力をもつ。そのた
め、検出用試薬や試料が金属ナノウェルに容易に固定さ
れ、しかも金属ナノウェルの微小空間に検出用試薬や試
料が保持されるため空気との接触面積が大幅に減少し、
蛍光褪色が防止される。薄膜表面にある金属ナノウェル
は、蛍光試薬を効率よく蛍光発色させる点でも有効であ
る。基板の透明度及び光源の強度を極力高めることによ
り励起効率を向上させる従来の蛍光分析では、試料体積
の減少に応じて適用可能性に問題が生じる。他方、本発
明では、光透過率の低いＡｕ，Ａｇ等の金属薄膜を基板
表面に形成することにより、従来の蛍光分析とは異なる
原理で励起効率が向上する。金属薄膜は、次のメカニズ
ムで励起効率を向上させるものと推察される。
【００１２】平滑な表面をもつＡｕ，Ａｇ等の金属薄膜
を光照射すると、照射光の大半が反射又は透過によって
損失してしまう。他方、励起光の波長に近い直径の金属
ナノウェルをもつ金属薄膜を光照射すると、照射光のエ
ネルギは、その数百倍の電場強度をもつ表面プラズモン
電場に変換・増強され、金属ナノウェルの内側に強く局
在化する。表面プラズモン電場は、光に似た性質をも
ち、蛍光性試料を励起する作用を呈する。この点、金属
ナノウェルは、励起光のエネルギを内部に集中させるア
ンテナとして機能するといえる。ナノウェル内部に封入
された試料は、増強されたプラズモン電場に曝されるた
め、エネルギを受けて励起される。その結果、試料を直
接的に光照射する従来の励起法に比較し、格段に高い効
率で蛍光性試料が励起される。
【００１３】金属ナノウェルは、検出効率を向上させる
上でも有効である。検出用試薬及び試料は何れも屈折率
が水とほぼ等しい液体であり、金属ナノウェルの直径と
金属薄膜の膜厚との比（アスペクト比）を大きくする
と、金属ナノウェルが導波路として機能する。したがっ
て、ナノウェル内部にある試料から発生した蛍光が効果
的に集光され、金属ナノウェルの開口部から効率よく検
出器に到達する。このように、金属ナノウェルを使用す
ることにより、分析密度が飛躍的に向上するばかりでな
く、高効率励起と高効率検出が両立する。そのため、一
定の蛍光信号を得ようとする際、従来の蛍光分析に比較
して励起光の強度を大幅に低下でき、蛍光褪色が抑制さ
れ、分析精度及び感度が更に向上する。
【００１４】
【実施例１】免疫分析に適用した例によって、本発明を
具体的に説明する。金属ナノウェルの作製 金属薄膜に穴を開け、金属ナノウェルを作製する方法と
して、プロジェクション法を採用したが、電子ビームリ
ソグラフィ，フォトリソグラフィ，レーザを用いた直接
描画等によっても金属ナノウェルを形成できる。プロジ
ェクション法では、蒸着源と基板との間に物体を配置さ
せ、物体の形状が投影された金属薄膜が形成される。
【００１５】末端にチオール基をもつシランカップリン
グ試薬で石英基板１の表面を処理することにより、石英
表面のＯＨ基とチオール基とを置換反応させ、チオール
基をもつ単分子膜を石英基板１の表面に形成した（図１
ａ）。シランカップリング試薬としてメルカプトプロピ
ルトリエトキシシランを使用したが、本発明はこれに拘
束されるものではなく、末端にチオール基をもつ限り使
用可能なシランカップリング試薬に制約が加わることは
ない。チオール基をもつ単分子膜は、後工程の蒸着で形
成される金属薄膜を強固に石英基板１に固定すると共
に、金属ナノウェルの底面を分子修飾する際の活性部位
として機能する。
【００１６】表面処理した石英基板１の上に直径４８０
ｎｍのポリスチレンラテックス球を含む希釈液を塗布
し、希釈液の溶媒を徐々に蒸発させた。溶媒の蒸発によ
って、ポリスチレンラテックス球が分散状態で石英基板
１の表面に残留した。この石英基板１にＡｕを蒸着し、
膜厚７０ｎｍの金属薄膜２を形成した。本実施例ではＡ
ｕ薄膜を形成したが、表面プラズモン共鳴が誘起される
金属である限り、Ａｇ，Ｃｕ，Ａｌ等も薄膜材料として
使用できる
【００１７】金属薄膜２が形成された石英基板１を有機
溶媒に浸漬し、石英基板１表面からポリスチレンラテッ
クス球を溶解除去した。金属薄膜２には、ポリスチレン
ラテックス球の痕跡が金属ナノウェル３として残った。
金属ナノウェル３の底面では、石英基板１に表面修飾さ
れたチオール基をもつ単分子膜が露出している（図１
ｂ）。ポリスチレンラテックス球の直径に対応する内径
の金属ナノウェルが形成されることから、励起光の波
長，試料の性状，検出系の配置等に応じて最適の直径を
もつポリスチレンラテックス球が使用される。金属薄膜
の膜厚も、同様に励起光の波長，試料の性状，検出系の
配置等に応じた最適値に設定される。
【００１８】金属ナノウェル底面の分子修飾 金属ナノウェル３中での蛍光免疫分析を実証するため、
次の手順で金属ナノウェル３の底面を分子修飾した。ま
ず、スクシンイミジル-6-マレイミジルヘキサノエート
溶液に石英基板１全体を浸漬した後、十分に洗浄し、金
属ナノウェル３底面にあるチオール基とスクシンイミジ
ル-6-マレイミジルヘキサノエートを反応させ、金属ナ
ノウェル３の底面にスクシンイミド基を修飾した（図２
ａ）。次いで、抗ローダミン抗体の溶液に石英基板１を
浸漬し、金属ナノウェル３底面のスクシンイミド基と抗
ローダミン抗体表面にあるアミノ基とを反応させ、抗ロ
ーダミン抗体を金属ナノウェル３底面に修飾固定化した
（図２ｂ）。
【００１９】抗体及び抗体の修飾固定化に使用する試薬
は、スクシンイミジル-6-マレイミジルヘキサノエート
や抗ローダミン抗体に限らず、種々の抗体及び試薬を使
用できる。たとえば、感度向上のために二重抗体を使用
できる。また、抗体の修飾固定化法として、溶液に石英
基板１を浸漬し、全ての金属ナノウェル３を同一の抗体
で修飾する方法を採用したが、マイクロピペットによる
液滴のハンドリングやインクジェットプリンタによる液
滴のパターニング等を採用すると、多数の金属ナノウェ
ル３に対し多種類の抗体をそれぞれ個別に修飾固定化す
ることも可能である。
【００２０】抗原・抗体反応 金属ナノウェル３で抗ローダミン抗体を固定化した金属
薄膜２にローダミン６Ｇの１μＭ溶液を滴下し、１５分
経過した時点で金属薄膜２を洗浄することにより、抗ロ
ーダミン抗体にローダミンを取り込ませた。
【００２１】表面プラズモン電場の発生及び蛍光観測 以上の処理を施した金属ナノウェル３を落射蛍光顕微鏡
のステージ上に固定し、Ａｒレーザの４８８ｎｍ光を照
射して表面プラズモン電場を発生させ、金属ナノウェル
３内部から発せられるローダミンの蛍光を蛍光顕微鏡で
観測した。観測に際し、ピンホールを用いて視野を絞る
ことにより、一つの金属ナノウェル３のみからの蛍光を
液体窒素冷却ＣＣＤ検出器に導いて検出した。調査結果
であるスペクトルを図３（ａ）に、抗原であるローダミ
ンの濃度と蛍光強度との関係を図３（ｂ）に示す。図３
は、ナノメータ領域からの蛍光が明瞭に観測され、抗原
濃度と蛍光強度との間に良好な直線関係があることを示
している。この結果から、金属ナノウェル３中における
免疫分析が実証される。
【００２２】
【実施例２】実施例２では、分子修飾した金属ナノウェ
ルを遺伝子分析に用いた。金属ナノウェルの作製 実施例１と同様にチオール基が底面に修飾された金属ナ
ノウェル３に対してスクシンイミジル-6-マレイミジル
ヘキサノエートを反応させることにより、底面にスクシ
ンイミド基を修飾した金属ナノウェル３を作製した（図
４ａ）。
【００２３】金属ナノウェル底面の分子修飾 金属ナノウェル３をアビジン溶液に浸漬し、アビジン表
面のアミノ基を金属ナノウェル３底面のスクシンイミド
基に反応させ、金属ナノウェル３の底面にアビジンを修
飾した（図４ｂ）。ハイブリダイゼーションを検出する
標的ＤＮＡとしてTSオリゴヌクレオチドを使用した。検
出用ＤＮＡとしては、TSオリゴヌクレオチドと１２塩基
が相補関係にある１３量体のオリゴヌクレオチドを用
い、予め5'末端をアミノ化した上で、ビオチン化試薬で
あるビオチンスクシンイミジルエステルと反応させ、5'
末端をビオチン化した（図５ａ）。
【００２４】勿論、標的ＤＮＡはＴＳオリゴヌクレオチ
ドに限定されるものではなく、あらゆるＤＮＡのハイブ
リダイゼーションを検出可能である。ＤＮＡのビオチン
化試薬も、ビオチンスクシンイミジルエステルに限られ
るものではない。検出用ＤＮＡの鎖長も１２塩基に限定
されるものではなく、標的ＤＮＡに応じて適宜選択され
る。アビジンとビオチンは非常に強く相互反応する物質
であり、アビジンを修飾した金属ナノウェル３をビオチ
ン化した検出用ＤＮＡの５ｎｇ／ｍｌ溶液に３分間浸漬
することにより、検出用ＤＮＡを金属ナノウェル３の底
面に修飾できた（図５ｂ）。本実施例ではアビジン／ビ
オチン結合を検出用ＤＮＡの修飾に利用したが、ＤＮＡ
をチオール基に直接結合させることも可能である。
【００２５】ハイブリダイゼーション 検出用ＤＮＡを底面に修飾した金属ナノウェル３をもつ
石英基板１を２枚用意した。一方の石英基板１をTSオリ
ゴヌクレオチドの３０ｎｇ／ｍｌ溶液に、他方の石英基
板１を検出用ＤＮＡと全く相補性のない対照オリゴヌク
レオチドの３０ｎｇ／ｍｌ溶液にそれぞれ３０分間浸漬
した。検出用ＤＮＡに対する適合性のある標的ＤＮＡは
ハイブリダイゼーションして金属ナノウェル３に取り込
まれるが、適合性のない標的ＤＮＡはハイブリダイゼー
ションを起こさなかった（図６）。
【００２６】次いで、二重鎖ＤＮＡに対して特異的に結
合する蛍光試薬であるYOYO‐1の５ｎｇ／ｍｌ溶液に１
０分間浸漬した。標的ＤＮＡがハイブリダイゼーション
した金属ナノウェル３ではYOYO‐1が標的ＤＮＡに結合
したが、ハイブリダイゼーションのない金属ナノウェル
３ではYOYO‐1の結合が生じなかった。ＤＮＡの標識に
用いられる蛍光試薬は、YOYO‐1に限定されるものでは
なく、二重鎖ＤＮＡに特異的に結合する限り種々の蛍光
試薬を使用できる。また、標的ＤＮＡを直接蛍光標識す
ることも可能である。
【００２７】表面プラズモン電場の発生及び蛍光観測 以上の処理が施された金属ナノウェル３を落射蛍光顕微
鏡のステージ上に固定し、Ａｒレーザの４８８ｎｍ光を
照射して表面プラズモン電場を発生させ、金属ナノウェ
ル３内部から発せられるYOYO−1の蛍光を蛍光顕微鏡で
観測した。その結果、図７のスペクトルにみられるよう
に、検出用ＤＮＡと相補関係にあるTSオリゴヌクレオチ
ドに浸漬した金属ナノウェル３からは強い蛍光が発せら
れたが、相補関係にない対照オリゴヌクレオチドに浸漬
した金属ナノウェル３から発せられる蛍光は非常に弱か
った。この対比から、ハイブリダイゼーションが明瞭に
観測され、金属ナノウェル３中における遺伝子分析が実
証された。
【００２８】
【発明の効果】以上に説明したように、本発明の蛍光分
析用素子は、金属薄膜に生じている金属ナノウェルの底
面に修飾固定化した抗体や検出用ＤＮＡを用いて、抗原
・抗体反応や標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを
生起させ、表面プラズモン電場を加えることにより発生
する蛍光を検出測定している。金属ナノウェルに表面プ
ラズモン電場をかけて蛍光発色させることから、蛍光褪
色を招くことなく検出用試薬や試料の固定，高効率励
起，高効率検出が可能となり、従来の蛍光分析に比較し
極めて高感度で測定結果が得られる。そのため、生化
学，臨床分析，環境分析等、広範な分野における機能素
子として使用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 基板上の金属薄膜に金属ナノウェルを作製す
るフロー図
【図２】 金属ナノウェル底面に抗体を修飾固定化する
フロー図
【図３】 抗ローダミン抗体に結合したローダミン6Gの
蛍光スペクトル（ａ）及び蛍光強度に及ぼすローダミン
6Gの影響を表したグラフ（ｂ）
【図４】 金属ナノウェルにアビジンを修飾固定化する
フロー図
【図５】 検出用ＤＮＡをビオジン化（ａ）し、金属ナ
ノウェルのアビジンに結合（ｂ）させるフロー
【図６】 ＤＮＡのハイブリダイゼーションによる遺伝
子分析の説明図
【図７】 ハイブリダイゼーションしたＤＮＡを蛍光試
薬で修飾し、光励起によって生じた蛍光スペクトル
【符号の説明】 １：石英基板 ２：金属薄膜 ３：金属ナノウェル
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ０１Ｎ 21/64 Ｇ 33/543 ５９５ 33/543 ５９５ 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/00 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/566 G01N 33/483 G01N 33/543 G01N 33/553 G01N 37/00 G01N 21/64

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基板表面に形成された金属薄膜と、金属
    薄膜に形成されたナノウェルと、ナノウェルの底面に修
    飾固定化された活性基又は検出用ＤＮＡとを備え、活性
    基に結合した抗原又は検出用ＤＮＡにハイブリダイゼー
    ションした標的ＤＮＡに結合した蛍光試薬を光励起して
    蛍光発色させることを特徴とする金属ナノウェルを用い
    た蛍光分析用素子。
  2. 【請求項２】 シランカップリング試薬で処理した基板
    に金属薄膜を堆積させ、金属薄膜内に生じているナノウ
    ェル又は金属薄膜に開けたナノウェルの底面に活性基又
    は検出用ＤＮＡを修飾固定することを特徴とする蛍光分
    析用素子の製造方法。
JP2001005041A 2001-01-12 2001-01-12 金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子及びその製造方法 Expired - Fee Related JP3525142B2 (ja)

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