JPH11332595A - プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法 - Google Patents
プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法Info
- Publication number
- JPH11332595A JPH11332595A JP10141433A JP14143398A JPH11332595A JP H11332595 A JPH11332595 A JP H11332595A JP 10141433 A JP10141433 A JP 10141433A JP 14143398 A JP14143398 A JP 14143398A JP H11332595 A JPH11332595 A JP H11332595A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- probe
- pna
- detected
- biosensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 目的とするＤＮＡの一部又は全部の塩基
配列と相補的な塩基配列を有するＰＮＡをプローブとし
て、目的とするＤＮＡを検出することを特徴とするＤＮ
Ａの検出方法。 【効果】 簡易かつ高感度のＤＮＡの検出方法を提供す
る。
配列と相補的な塩基配列を有するＰＮＡをプローブとし
て、目的とするＤＮＡを検出することを特徴とするＤＮ
Ａの検出方法。 【効果】 簡易かつ高感度のＤＮＡの検出方法を提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＰＮＡ（peptide
nucleic acid）をプローブとするＤＮＡの検出方法に関
する。
nucleic acid）をプローブとするＤＮＡの検出方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】あるＤＮＡを検出するにあたり、そのＤ
ＮＡの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮ
Ａを用いることは従来から広く行われてきた。このよう
な特定のＤＮＡを検出するために用いる相補的なＤＮＡ
は、「プローブＤＮＡ」又は単に「プローブ」と呼ばれ
る。プローブＤＮＡを用いたＤＮＡの検出方法は、病原
菌の検出や遺伝子のクローニングなどに広く利用されて
おり、非常に有効な方法である。しかしながら、幾つか
未解決な問題があり、ＤＮＡ相互間の電気的反発力の問
題もそのひとつである。
ＮＡの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮ
Ａを用いることは従来から広く行われてきた。このよう
な特定のＤＮＡを検出するために用いる相補的なＤＮＡ
は、「プローブＤＮＡ」又は単に「プローブ」と呼ばれ
る。プローブＤＮＡを用いたＤＮＡの検出方法は、病原
菌の検出や遺伝子のクローニングなどに広く利用されて
おり、非常に有効な方法である。しかしながら、幾つか
未解決な問題があり、ＤＮＡ相互間の電気的反発力の問
題もそのひとつである。
【０００３】ＤＮＡは、分子中のリン原子等のため負に
荷電している場合が多い。このようにＤＮＡが荷電する
と、プローブＤＮＡと目的のＤＮＡとの間に電気的反発
力が生じ、両ＤＮＡのハイブリダイゼーションが妨げら
れ、その結果、検出感度が低下することになる。このよ
うなＤＮＡの荷電は塩濃度が低い場合に顕著となるた
め、通常、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションは一定
濃度の塩が存在する緩衝液中で行う。しかし、一般にこ
のような緩衝液の調製は煩雑な操作を伴う場合が多く、
これがこの検出方法の簡便化を妨げる一つの原因となっ
ていた。
荷電している場合が多い。このようにＤＮＡが荷電する
と、プローブＤＮＡと目的のＤＮＡとの間に電気的反発
力が生じ、両ＤＮＡのハイブリダイゼーションが妨げら
れ、その結果、検出感度が低下することになる。このよ
うなＤＮＡの荷電は塩濃度が低い場合に顕著となるた
め、通常、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションは一定
濃度の塩が存在する緩衝液中で行う。しかし、一般にこ
のような緩衝液の調製は煩雑な操作を伴う場合が多く、
これがこの検出方法の簡便化を妨げる一つの原因となっ
ていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、プローブを
用いたＤＮＡの検出方法におけるＤＮＡ相互間の電気的
反発力に関する問題を解決することをその目的とするも
のである。
用いたＤＮＡの検出方法におけるＤＮＡ相互間の電気的
反発力に関する問題を解決することをその目的とするも
のである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、プローブＤＮＡ
の代わりにプローブＰＮＡを用いることにより、前記し
た電気的反発力に関する問題を解決できることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、目的とするＤ
ＮＡの一部又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有
するＰＮＡをプローブとして、目的とするＤＮＡを検出
することを特徴とするＤＮＡの検出方法である。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、プローブＤＮＡ
の代わりにプローブＰＮＡを用いることにより、前記し
た電気的反発力に関する問題を解決できることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、目的とするＤ
ＮＡの一部又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有
するＰＮＡをプローブとして、目的とするＤＮＡを検出
することを特徴とするＤＮＡの検出方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡの検出方法は、目的とするＤＮＡの一部
又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＰＮＡ
をプローブとすることを特徴とする。ＰＮＡは、ＤＮＡ
の模倣物質であり、ＤＮＡと同様にその分子中にアデニ
ン、グアニン、シトシン、チミンといった核酸塩基を有
し、相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等と特異的にハイ
ブリダイズする。このようにＰＮＡは機能的にはＤＮＡ
とほとんど変わりないが、その構造は全く異なる。ＰＮ
Ａは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンを単位とする
ポリアミドを基本骨格としており（図１）、分子中に糖
やリン原子を含まない。このため、電気的に中性であ
り、塩の存在しない条件下でも荷電することはない。な
お、核酸塩基は、ポリアミド骨格にメチレンカルボニル
を介して結合している（図１）。
本発明のＤＮＡの検出方法は、目的とするＤＮＡの一部
又は全部の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＰＮＡ
をプローブとすることを特徴とする。ＰＮＡは、ＤＮＡ
の模倣物質であり、ＤＮＡと同様にその分子中にアデニ
ン、グアニン、シトシン、チミンといった核酸塩基を有
し、相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等と特異的にハイ
ブリダイズする。このようにＰＮＡは機能的にはＤＮＡ
とほとんど変わりないが、その構造は全く異なる。ＰＮ
Ａは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンを単位とする
ポリアミドを基本骨格としており（図１）、分子中に糖
やリン原子を含まない。このため、電気的に中性であ
り、塩の存在しない条件下でも荷電することはない。な
お、核酸塩基は、ポリアミド骨格にメチレンカルボニル
を介して結合している（図１）。
【０００７】ＰＮＡは、ペプチドと同様にFmoc型ペプチ
ド固相合成法およびtBoc型ペプチド固相合成法などによ
り合成することができ、また、市販（委託合成）されて
いる。本発明の検出方法により検出できるＤＮＡは、配
列の少なくとも一部が知られているものであれば特に制
限はない。具体的には、病原性大腸菌のベロ毒素をコー
ドするＤＮＡ、ＨＩＶの外殻タンパク質gp120 をコード
するＤＮＡ、各種微生物の 16SｒＲＮＡの特異的塩基配
列部分（ｃＤＮＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲ
ＳＡ）の抗生物質結合タンパク質をコードするＤＮＡな
どの微生物由来のＤＮＡのほか、ヒトの遺伝病に関係す
るＤＮＡなども例示することができる。また、これらの
ＤＮＡは、夾雑物を含んだ状態にあってもよく、例え
ば、ベロ毒素をコードするＤＮＡを検出する場合、病原
性大腸菌の加熱処理物をそのまま検出試料とすることも
可能である。
ド固相合成法およびtBoc型ペプチド固相合成法などによ
り合成することができ、また、市販（委託合成）されて
いる。本発明の検出方法により検出できるＤＮＡは、配
列の少なくとも一部が知られているものであれば特に制
限はない。具体的には、病原性大腸菌のベロ毒素をコー
ドするＤＮＡ、ＨＩＶの外殻タンパク質gp120 をコード
するＤＮＡ、各種微生物の 16SｒＲＮＡの特異的塩基配
列部分（ｃＤＮＡ）、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲ
ＳＡ）の抗生物質結合タンパク質をコードするＤＮＡな
どの微生物由来のＤＮＡのほか、ヒトの遺伝病に関係す
るＤＮＡなども例示することができる。また、これらの
ＤＮＡは、夾雑物を含んだ状態にあってもよく、例え
ば、ベロ毒素をコードするＤＮＡを検出する場合、病原
性大腸菌の加熱処理物をそのまま検出試料とすることも
可能である。
【０００８】後述する表面プラズモン共鳴バイオセンサ
ーによりＤＮＡを検出する場合には、検出に先立ち、目
的とするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に
より増幅させておくのが望ましい。ＰＣＲの条件は特に
限定されないが、試料中のＤＮＡ濃度が低すぎる場合に
は十分な共鳴シグナルを検出することができず、また、
試料中のＤＮＡ濃度が高すぎる場合にもＤＮＡ同士の相
互作用により検出される共鳴シグナルが低下する。この
ため、ＰＣＲのサイクルは20〜25とするのが好ましい。
ーによりＤＮＡを検出する場合には、検出に先立ち、目
的とするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に
より増幅させておくのが望ましい。ＰＣＲの条件は特に
限定されないが、試料中のＤＮＡ濃度が低すぎる場合に
は十分な共鳴シグナルを検出することができず、また、
試料中のＤＮＡ濃度が高すぎる場合にもＤＮＡ同士の相
互作用により検出される共鳴シグナルが低下する。この
ため、ＰＣＲのサイクルは20〜25とするのが好ましい。
【０００９】本発明のＤＮＡの検出方法は、プローブＰ
ＮＡと目的とするＤＮＡのハイブリダイゼーションを利
用する限りどのような態様をもとり得るが、好ましい態
様としては、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用い
た検出方法を例示することができる。以下、本発明のＤ
ＮＡ検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセン
サー及びそれに用いる測定チップについて説明する。
ＮＡと目的とするＤＮＡのハイブリダイゼーションを利
用する限りどのような態様をもとり得るが、好ましい態
様としては、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用い
た検出方法を例示することができる。以下、本発明のＤ
ＮＡ検出方法に使用する表面プラズモン共鳴バイオセン
サー及びそれに用いる測定チップについて説明する。
【００１０】本発明に使用する表面プラズモン共鳴バイ
オセンサーの一例を図２に示す。この表面プラズモン共
鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源
８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上
にプローブＰＮＡを固定した測定チップ10を設置して使
用する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設け
られており、この凹部と上記測定チップ10とで測定セル
71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカー
トリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路
72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後
流路73を通じて外部に排出される。
オセンサーの一例を図２に示す。この表面プラズモン共
鳴バイオセンサーは、カートリッジブロック７と、光源
８と、検出器９とを有し、カートリッジブロック７の上
にプローブＰＮＡを固定した測定チップ10を設置して使
用する。カートリッジブロック７の上面には凹部が設け
られており、この凹部と上記測定チップ10とで測定セル
71が構成される。測定セル71は、流路72、73によりカー
トリッジブロック７の外部に連通しており、試料は流路
72を通じて測定セル71中に流れ込み、測定に供された後
流路73を通じて外部に排出される。
【００１１】光源８からは、測定チップ10の透明基板に
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。上記のような構造によって、あ
る入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得ら
れる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共
鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透明基
板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネ
ッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも
表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの
表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギ
ーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、
反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波
数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響
を受けるため、検出しようとするＤＮＡとプローブＰＮ
Ａとの相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面
プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、
反射光強度曲線の谷のずれによって、検出しようとする
ＤＮＡの濃度の変化を検知することができる。入射角θ
の変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RU
として表す。
向かって単色光が照射され（入射光80）、測定チップ10
の裏面に設けられた金属膜で反射したその反射光90が、
検出器９に入光する。検出器９では、反射光90の強度を
検出することができる。上記のような構造によって、あ
る入射角θに対して谷を形成する反射光強度曲線が得ら
れる。反射光強度曲線における谷は、表面プラズモン共
鳴によるものである。即ち、光が測定チップ10の透明基
板と外との界面で全反射するときに、その界面にエバネ
ッセント波といわれる表面波が生じ、一方、金属膜にも
表面プラズモンといわれる表面波が生じる。この２つの
表面波の波数が一致すると共鳴が起こり、光のエネルギ
ーの一部が表面プラズモンを励起するために使用され、
反射光の強度が低下する。ここで、表面プラズモンの波
数は、金属膜表面のごく近くにある媒質の屈折率の影響
を受けるため、検出しようとするＤＮＡとプローブＰＮ
Ａとの相互作用により媒質の屈折率が変化すると、表面
プラズモン共鳴が生じる入射角θが変化する。従って、
反射光強度曲線の谷のずれによって、検出しようとする
ＤＮＡの濃度の変化を検知することができる。入射角θ
の変化量は共鳴シグナルといわれ、10-4°の変化を１RU
として表す。
【００１２】測定チップ10は、表面プラズモン共鳴に必
要な透明基板及び金属膜を有し、プローブＰＮＡを金属
膜上に固定できるものであればどのようなものでもよ
く、市販の測定チップ（例えば、ファルマシアバイオセ
ンサー社製、BIAcore2000 用測定チップ ）を使用する
こともできるが、図３に示すような構造を有する測定チ
ップを使用することが好ましい。この測定チップは、透
明基板１上に金属膜２、有機物質層３が形成されおり、
その上にアビジン４が固定されており、このアビジンに
ビオチン５で標識されたプローブＰＮＡ６が固定され
る。
要な透明基板及び金属膜を有し、プローブＰＮＡを金属
膜上に固定できるものであればどのようなものでもよ
く、市販の測定チップ（例えば、ファルマシアバイオセ
ンサー社製、BIAcore2000 用測定チップ ）を使用する
こともできるが、図３に示すような構造を有する測定チ
ップを使用することが好ましい。この測定チップは、透
明基板１上に金属膜２、有機物質層３が形成されおり、
その上にアビジン４が固定されており、このアビジンに
ビオチン５で標識されたプローブＰＮＡ６が固定され
る。
【００１３】透明基板１としては、通常表面プラズモン
共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるもので
あればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレ
ーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、
偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が
望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
共鳴バイオセンサー用の測定チップに使用されるもので
あればどのようなものでもよく、一般的にはガラス、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリカーボネートなどのレ
ーザー光に対して透明な材料からなるものが使用でき、
偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が
望ましく、その厚さは0.1 〜20mm程度である。
【００１４】金属膜２としては、表面プラズモン共鳴が
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜に使用することのできる金属の種類としては、金、
銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単
独で又は組み合わせて使用することができる。また、上
記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、
銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設け
てもよい。金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが
好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000
Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出す
ることができない。また、クロム等からなる介在層を設
ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好
ましい。
生じ得るようなものであれば特に限定されない。この金
属膜に使用することのできる金属の種類としては、金、
銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単
独で又は組み合わせて使用することができる。また、上
記透明基板１への付着性を考慮して、透明基板１と金、
銀等からなる層との間にクロム等からなる介在層を設け
てもよい。金属膜２の膜厚は、100 〜2000Åであるのが
好ましく、特に200 〜600 Åであるのが好ましい。3000
Åを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出す
ることができない。また、クロム等からなる介在層を設
ける場合、その介在層の厚さは、５〜50Åであるのが好
ましい。
【００１５】金属膜２の形成は常法によって行えばよ
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。有機物質層３は、金属原子とアビジン分
子の両者と結合することができる物質からなる層であ
る。有機物質層３の厚さは、10〜200 Åであるのが好ま
しく、特に10〜50Åであるのが好ましい。
く、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティン
グ法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うこ
とができる。これらの方法の中でもスパッタ法を用いる
のが好ましい。有機物質層３は、金属原子とアビジン分
子の両者と結合することができる物質からなる層であ
る。有機物質層３の厚さは、10〜200 Åであるのが好ま
しく、特に10〜50Åであるのが好ましい。
【００１６】有機物質層３は、シランカップリング剤、
メルカプト基と他の有機官能基を有する化合物（以下、
単に「チオール化合物」という）用いて形成させること
ができ、また、ＬＢ（ラングミュア・ブロジェット）法
によっても形成させることができる。ＬＢ法によって成
膜した場合、シランカップリング剤やチオール化合物に
よって成膜した場合に比べ、金属膜との結合能が弱いと
いう短所があるが、広範な物質に適用でき、また、凝集
膜を形成できるので単位面積当たりに結合させるアビジ
ン４の数を増加させることができるという長所もある。
メルカプト基と他の有機官能基を有する化合物（以下、
単に「チオール化合物」という）用いて形成させること
ができ、また、ＬＢ（ラングミュア・ブロジェット）法
によっても形成させることができる。ＬＢ法によって成
膜した場合、シランカップリング剤やチオール化合物に
よって成膜した場合に比べ、金属膜との結合能が弱いと
いう短所があるが、広範な物質に適用でき、また、凝集
膜を形成できるので単位面積当たりに結合させるアビジ
ン４の数を増加させることができるという長所もある。
【００１７】有機物質層形成に使用できるシランカップ
リング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシ
ラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−ア
ミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミ
ノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−
（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチル
シラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、
ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなど
が挙げられる。また、チオール化合物としては、メルカ
プトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタ
ン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカ
プト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２
−メルカプトエタン、メルカプト酢酸、２−メルカプト
プロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉
草酸、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパ
ンなどが挙げられ、これらの中でも多官能物質であり、
アビジンとの結合部位が多い１，１，１−トリアミノ−
２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−
メルカプトプロパンなどを用いるのが好ましい。ＬＢ法
に適用できる物質としては、２１−アミノドコサン酸、
ステアリルアミン、ポリリジンなどを例示することがで
きる。
リング剤としては、３−アミノプロピルトリエトキシシ
ラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−ア
ミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミ
ノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−
（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチル
シラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、
ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなど
が挙げられる。また、チオール化合物としては、メルカ
プトアミノメタン、２−メルカプト−１−アミノエタ
ン、３−メルカプト−１−アミノプロパン、４−メルカ
プト−１−アミノブタン、１，１，１−トリアミノ−２
−メルカプトエタン、メルカプト酢酸、２−メルカプト
プロピオン酸、３−メルカプト酪酸、４−メルカプト吉
草酸、１，１，１−トリアミノ−３−メルカプトプロパ
ンなどが挙げられ、これらの中でも多官能物質であり、
アビジンとの結合部位が多い１，１，１−トリアミノ−
２−メルカプトエタン、１，１，１−トリアミノ−３−
メルカプトプロパンなどを用いるのが好ましい。ＬＢ法
に適用できる物質としては、２１−アミノドコサン酸、
ステアリルアミン、ポリリジンなどを例示することがで
きる。
【００１８】シランカップリング剤を用いて有機物質層
を形成する方法としては、シランカップリング剤の飽和
蒸気中に金属膜を一定時間暴露する方法（飽和蒸気
法）、シランカップリング剤を含む溶液中に金属膜を一
定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる
方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用い
る方法（グラビア法）などを用いることができ、チオー
ル化合物を用いて有機物質層３を形成する方法として
は、飽和蒸気法、浸漬法、スピンコーティング法、グラ
ビア法などを用いることができる。
を形成する方法としては、シランカップリング剤の飽和
蒸気中に金属膜を一定時間暴露する方法（飽和蒸気
法）、シランカップリング剤を含む溶液中に金属膜を一
定時間浸漬する方法（浸漬法）、スピンコータを用いる
方法（スピンコーティング法）、グラビア印刷機を用い
る方法（グラビア法）などを用いることができ、チオー
ル化合物を用いて有機物質層３を形成する方法として
は、飽和蒸気法、浸漬法、スピンコーティング法、グラ
ビア法などを用いることができる。
【００１９】有機物質層３にアビジン４を固定すること
は、所定量のアビジン４を有機物質層３に所定時間接触
させることにより達成される。具体的な方法としては、
フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに有
機物質層３を形成させた透明基板１を設置して一定流量
のアビジン４を所定時間（所定量）流す方法を例示でき
る。
は、所定量のアビジン４を有機物質層３に所定時間接触
させることにより達成される。具体的な方法としては、
フローセル型の表面プラズモン共鳴バイオセンサーに有
機物質層３を形成させた透明基板１を設置して一定流量
のアビジン４を所定時間（所定量）流す方法を例示でき
る。
【００２０】アビジン４に、ビオチン５で標識したプロ
ーブＰＮＡ６に固定化する方法としては、インクジエッ
ト法、マイクロディスペンサー法などを例示することが
できる。インクジェット法は、極めて狭い領域に精度よ
くプローブＰＮＡ６を含む液滴を発射できるので、固定
化するプローブＰＮＡ６を有効利用できるという点で有
利である。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バ
イオセンサーに測定チップを設置して一定流量のプロー
ブＰＮＡ６を所定時間（所定量）流すことによっても固
定化できる。この固定化方法によれば、アビジン４及び
プローブＰＮＡ６の固定を一連の操作で行うことができ
るという点で有利である。プローブＰＮＡ６をビオチン
５で標識する方法としては、ビオチンにペプチド固相合
成法によりＰＮＡ鎖を延長している方法を例示すること
ができる。なお、プローブＰＮＡを固定化する方法は、
上記のアビジン−ビオチン結合を用いる以外にもエステ
ル結合やアミド結合等の共有結合を利用してプローブＰ
ＮＡを有機物質層３に固定化することも可能である。
ーブＰＮＡ６に固定化する方法としては、インクジエッ
ト法、マイクロディスペンサー法などを例示することが
できる。インクジェット法は、極めて狭い領域に精度よ
くプローブＰＮＡ６を含む液滴を発射できるので、固定
化するプローブＰＮＡ６を有効利用できるという点で有
利である。また、フローセル型の表面プラズモン共鳴バ
イオセンサーに測定チップを設置して一定流量のプロー
ブＰＮＡ６を所定時間（所定量）流すことによっても固
定化できる。この固定化方法によれば、アビジン４及び
プローブＰＮＡ６の固定を一連の操作で行うことができ
るという点で有利である。プローブＰＮＡ６をビオチン
５で標識する方法としては、ビオチンにペプチド固相合
成法によりＰＮＡ鎖を延長している方法を例示すること
ができる。なお、プローブＰＮＡを固定化する方法は、
上記のアビジン−ビオチン結合を用いる以外にもエステ
ル結合やアミド結合等の共有結合を利用してプローブＰ
ＮＡを有機物質層３に固定化することも可能である。
【００２１】表面プラズモン共鳴バイオセンサーによる
ＤＮＡの検出は、目的とするＤＮＡを含む試料を該セン
サーの測定セル中に流し込むことにより行う。このと
き、試料中のＤＮＡ濃度は0.1 〜１μM とするのが好ま
しい。また、本検出方法では、試料中に全く塩が存在し
ない条件下でもＤＮＡの検出を行うことができるが、よ
り高感度でＤＮＡを検出するためには塩濃度を150 〜30
0 mMとするのが好ましい。
ＤＮＡの検出は、目的とするＤＮＡを含む試料を該セン
サーの測定セル中に流し込むことにより行う。このと
き、試料中のＤＮＡ濃度は0.1 〜１μM とするのが好ま
しい。また、本検出方法では、試料中に全く塩が存在し
ない条件下でもＤＮＡの検出を行うことができるが、よ
り高感度でＤＮＡを検出するためには塩濃度を150 〜30
0 mMとするのが好ましい。
【００２２】検出するＤＮＡは１種類だけでなく、２種
類以上であってもよい。２種類以上のＤＮＡを検出する
には、一つのチップに複数のＰＮＡを固定するか、セン
サーに複数のチップを固定することにより行い得る。こ
のように２種類以上のＤＮＡを検出することにより、検
出の精度を向上させることができる。例えば、ある微生
物の持つ特異的なＤＮＡと相補的なＰＮＡを二つ以上チ
ップに固定することにより、その微生物に由来するＤＮ
Ａが試料中に含まれているかどうかをより高い精度で判
別することができる。また、固定化するＤＮＡの中に目
的のＤＮＡとは結合しないＰＮＡ（陰性プローブ）を含
ませておくことによっても精度を向上させることができ
る。さらに、固定化するＰＮＡの選択を適切に行えば、
例えば、試料中にベロ毒素が含まれるかどうかというこ
とだけでなく、そのベロ毒素がＩ型なのかII型なのかと
いうようなことまで判別できる。
類以上であってもよい。２種類以上のＤＮＡを検出する
には、一つのチップに複数のＰＮＡを固定するか、セン
サーに複数のチップを固定することにより行い得る。こ
のように２種類以上のＤＮＡを検出することにより、検
出の精度を向上させることができる。例えば、ある微生
物の持つ特異的なＤＮＡと相補的なＰＮＡを二つ以上チ
ップに固定することにより、その微生物に由来するＤＮ
Ａが試料中に含まれているかどうかをより高い精度で判
別することができる。また、固定化するＤＮＡの中に目
的のＤＮＡとは結合しないＰＮＡ（陰性プローブ）を含
ませておくことによっても精度を向上させることができ
る。さらに、固定化するＰＮＡの選択を適切に行えば、
例えば、試料中にベロ毒素が含まれるかどうかというこ
とだけでなく、そのベロ毒素がＩ型なのかII型なのかと
いうようなことまで判別できる。
【００２３】２種類以上のＰＮＡを固定する場合、使用
する表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、測定チップ
を水平方向に自由に移動可能なタイプのものが好まし
い。このようなセンサーを使用すれば、光学系を固定し
たままチップ上の複数の試料のシグナルを測定できる。
する表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、測定チップ
を水平方向に自由に移動可能なタイプのものが好まし
い。このようなセンサーを使用すれば、光学系を固定し
たままチップ上の複数の試料のシグナルを測定できる。
【００２４】
【実施例】〔実施例１〕市販の表面プラズモン共鳴バイ
オセンサー（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcor
e2000 ）の測定セルに５％アビジン溶液を流速５μl/分
で７分間流し込み、測定チップにアビジンを固定した。
一方、２型ベロ毒素をコードするＤＮＡ（図４）の一部
と相補的であり、かつ5'末端にビオチンを結合させた下
記のＰＮＡを合成し（日本パーセプティブ株式会社に合
成を委託）、プローブＰＮＡとした。 TGCAGAGTGGTATAACTG （図４に示すＤＮＡの402 〜419 番目の塩基と相補的で
ある）
オセンサー（ファルマシアバイオセンサー社製、BIAcor
e2000 ）の測定セルに５％アビジン溶液を流速５μl/分
で７分間流し込み、測定チップにアビジンを固定した。
一方、２型ベロ毒素をコードするＤＮＡ（図４）の一部
と相補的であり、かつ5'末端にビオチンを結合させた下
記のＰＮＡを合成し（日本パーセプティブ株式会社に合
成を委託）、プローブＰＮＡとした。 TGCAGAGTGGTATAACTG （図４に示すＤＮＡの402 〜419 番目の塩基と相補的で
ある）
【００２５】このプローブＰＮＡを含む溶液（10μM ）
を前記バイオセンサーの測定セルに流速１μl/分で50分
間流し込み、プローブＰＮＡをアビジンを介して測定チ
ップ上に固定した。その後、50mMのＮａＯＨを測定セル
に流し込み、洗浄した。次に、プローブＰＮＡと相補的
な下記の一本鎖ＤＮＡを合成した。 CAGTTATACCACTCTGCAACG （図４に示すＤＮＡの402 〜422 番目の塩基と同一であ
る） このＤＮＡを含み、塩濃度が異なる下記の組成の溶液を
調製した。
を前記バイオセンサーの測定セルに流速１μl/分で50分
間流し込み、プローブＰＮＡをアビジンを介して測定チ
ップ上に固定した。その後、50mMのＮａＯＨを測定セル
に流し込み、洗浄した。次に、プローブＰＮＡと相補的
な下記の一本鎖ＤＮＡを合成した。 CAGTTATACCACTCTGCAACG （図４に示すＤＮＡの402 〜422 番目の塩基と同一であ
る） このＤＮＡを含み、塩濃度が異なる下記の組成の溶液を
調製した。
【００２６】
【表１】
【００２７】塩濃度の異なるこれらの溶液を測定セルに
流速５ml/ 分で10分間流し込み、それぞれの共鳴シグナ
ルを測定した。この結果を表２に示す。
流速５ml/ 分で10分間流し込み、それぞれの共鳴シグナ
ルを測定した。この結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】表２に示すように、ＤＮＡをプローブとし
た場合、塩濃度が０mMのときには全く共鳴シグナルを検
出できなかったが、ＰＮＡをプローブとした場合には共
鳴シグナルを検出することができた。この結果からＰＮ
Ａをプローブとした場合にはＤＮＡをプローブとした場
合ほど、検出感度が塩濃度の影響を受けないことが示さ
れた。従って、ＰＮＡをプローブとして用いればＰＣＲ
生成物を脱塩するだけで目的とするＤＮＡの検出が可能
であると考えられる。
た場合、塩濃度が０mMのときには全く共鳴シグナルを検
出できなかったが、ＰＮＡをプローブとした場合には共
鳴シグナルを検出することができた。この結果からＰＮ
Ａをプローブとした場合にはＤＮＡをプローブとした場
合ほど、検出感度が塩濃度の影響を受けないことが示さ
れた。従って、ＰＮＡをプローブとして用いればＰＣＲ
生成物を脱塩するだけで目的とするＤＮＡの検出が可能
であると考えられる。
【００３０】〔実施例２〕図４に示す病原性大腸菌Ｏ−
１５７のゲノムＤＮＡを基に以下の２種類のセンスプラ
イマーと１種類のアンチセンスプライマーを合成した。 センスプライマー１：GCCGGGTTCGTTAATACGGCA （図４に示すＤＮＡの301 〜321 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー５：CTGTGCCTGTTACTGGGTTTT （図４に示すＤＮＡの28〜48番目の塩基と同一である） アンチセンスプライマー：GAACGTTCCAGCGCTGCGACA （図４に示すＤＮＡの423 〜443 番目の塩基と相補的で
ある） これらのプライマー及び鋳型として用いる病原性大腸菌
Ｏ−１５７のゲノムＤＮＡを含む以下の組成のＰＣＲ用
溶液を調製した。
１５７のゲノムＤＮＡを基に以下の２種類のセンスプラ
イマーと１種類のアンチセンスプライマーを合成した。 センスプライマー１：GCCGGGTTCGTTAATACGGCA （図４に示すＤＮＡの301 〜321 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー５：CTGTGCCTGTTACTGGGTTTT （図４に示すＤＮＡの28〜48番目の塩基と同一である） アンチセンスプライマー：GAACGTTCCAGCGCTGCGACA （図４に示すＤＮＡの423 〜443 番目の塩基と相補的で
ある） これらのプライマー及び鋳型として用いる病原性大腸菌
Ｏ−１５７のゲノムＤＮＡを含む以下の組成のＰＣＲ用
溶液を調製した。
【００３１】
【表３】
【００３２】ＰＣＲは、初期変性（95℃３分）を行った
後、変性（61℃１分）、アニーリング（72℃１分）、伸
長（94℃１分）を40サイクル行った。このＰＣＲにより
143 bp又は416 bpの二本鎖ＤＮＡを含む２種類の増幅産
物を得た。各々の増幅産物30μl にホルムアミド10μl
を加え、95℃で10分間加熱した。この熱変性させた増幅
産物を、実施例１と同様の方法でプローブＰＮＡを固定
した測定セルに流速５μl/分で10分間流し込み、それぞ
れの共鳴シグナルを測定した。また、対照としてＰＣＲ
産物30μl の代わりにトリス緩衝液（pH 7.4）30μl を
用いて、共鳴シグナルを測定した。この結果を表４に示
す。
後、変性（61℃１分）、アニーリング（72℃１分）、伸
長（94℃１分）を40サイクル行った。このＰＣＲにより
143 bp又は416 bpの二本鎖ＤＮＡを含む２種類の増幅産
物を得た。各々の増幅産物30μl にホルムアミド10μl
を加え、95℃で10分間加熱した。この熱変性させた増幅
産物を、実施例１と同様の方法でプローブＰＮＡを固定
した測定セルに流速５μl/分で10分間流し込み、それぞ
れの共鳴シグナルを測定した。また、対照としてＰＣＲ
産物30μl の代わりにトリス緩衝液（pH 7.4）30μl を
用いて、共鳴シグナルを測定した。この結果を表４に示
す。
【００３３】
【表４】
【００３４】表４に示すように、このＰＣＲの条件でも
ＰＮＡをプローブとした場合には十分な共鳴シグナルを
検出できたが、ＤＮＡプローブとした場合にはほとんど
共鳴シグナルを検出できなかった。この結果から、プロ
ーブＰＮＡはプローブＤＮＡよりも試料ＤＮＡにハイブ
リダイズしやすいことが示された。
ＰＮＡをプローブとした場合には十分な共鳴シグナルを
検出できたが、ＤＮＡプローブとした場合にはほとんど
共鳴シグナルを検出できなかった。この結果から、プロ
ーブＰＮＡはプローブＤＮＡよりも試料ＤＮＡにハイブ
リダイズしやすいことが示された。
【００３５】なお、試料ＤＮＡの鎖長が416 bpの方が14
3 bpよりもより大きな共鳴シグナルが検出されている。
しかし、共鳴シグナルは、プローブと結合する物質の分
子量が大きくなるほど、それに従って大きくなるので、
その点を考慮すると、この共鳴シグナルの値は予想され
る値ほど大きくない。つまり、鎖長416 bpのＤＮＡは、
鎖長143 bpのＤＮＡよりもプローブＰＮＡへのハイブリ
ダイズの効率がよくないと言える。これは、鎖長が長く
なることにより、立体的にプローブとハイブリダイズで
きないような形状（例えば、球状）になる確率が高くな
ったためと考えられる。
3 bpよりもより大きな共鳴シグナルが検出されている。
しかし、共鳴シグナルは、プローブと結合する物質の分
子量が大きくなるほど、それに従って大きくなるので、
その点を考慮すると、この共鳴シグナルの値は予想され
る値ほど大きくない。つまり、鎖長416 bpのＤＮＡは、
鎖長143 bpのＤＮＡよりもプローブＰＮＡへのハイブリ
ダイズの効率がよくないと言える。これは、鎖長が長く
なることにより、立体的にプローブとハイブリダイズで
きないような形状（例えば、球状）になる確率が高くな
ったためと考えられる。
【００３６】〔実施例３〕図４に示す病原性大腸菌Ｏ−
１５７のゲノムＤＮＡを基に以下の４種類のセンスプラ
イマーと１種類のアンチセンスプライマーを合成した。 センスプライマー１：GCCGGGTTCGTTAATACGGCA （図４に示すＤＮＡの301 〜321 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー２：TTAACCACACCCCACCGGGCA （図４に示すＤＮＡの188 〜208 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー３：TCTCAGGGGACCACATCGGTG （図４に示すＤＮＡの160 〜180 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー４：CGGTATCCTATTCCCGGGAGT （図４に示すＤＮＡの 53 〜73番目の塩基と同一であ
る） アンチセンスプライマー：GAACGTTCCAGCGCTGCGACA （図４に示すＤＮＡの423 〜443 番目の塩基と相補的で
ある） これらのプライマー及び鋳型として用いる病原性大腸菌
Ｏ−１５７のゲノムＤＮＡを含む以下の組成のＰＣＲ用
溶液を調製した。
１５７のゲノムＤＮＡを基に以下の４種類のセンスプラ
イマーと１種類のアンチセンスプライマーを合成した。 センスプライマー１：GCCGGGTTCGTTAATACGGCA （図４に示すＤＮＡの301 〜321 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー２：TTAACCACACCCCACCGGGCA （図４に示すＤＮＡの188 〜208 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー３：TCTCAGGGGACCACATCGGTG （図４に示すＤＮＡの160 〜180 番目の塩基と同一であ
る） センスプライマー４：CGGTATCCTATTCCCGGGAGT （図４に示すＤＮＡの 53 〜73番目の塩基と同一であ
る） アンチセンスプライマー：GAACGTTCCAGCGCTGCGACA （図４に示すＤＮＡの423 〜443 番目の塩基と相補的で
ある） これらのプライマー及び鋳型として用いる病原性大腸菌
Ｏ−１５７のゲノムＤＮＡを含む以下の組成のＰＣＲ用
溶液を調製した。
【００３７】
【表５】
【００３８】ＰＣＲは、初期変性（95℃３分）を行った
後、変性（61℃１分）、アニーリング（72℃１分）、伸
長（94℃１分）のサイクルを10〜40の範囲で変化させて
行った。このＰＣＲにより143 bp、256 bp、284 bp、又
は391 bpの二本鎖ＤＮＡを含む４種類の増幅産物を得
た。各々の増幅産物10μl 、20μl 、30μl 、40μl 、
60μl 、80μl にホルムアミド10μl を加え、95℃で10
分間加熱した。この熱変性させた増幅産物を、実施例１
と同様の方法でプローブＰＮＡを固定した測定セルに流
速５ml/ 分で流し込み、10分後の共鳴シグナルを測定し
た。この結果を図５、図６、図７及び図８に示す。図中
の●が10サイクル、▲が20サイクル、■が25サイクル、
○が30サイクル、△が40サイクルのＰＣＲを行った場合
を示す。
後、変性（61℃１分）、アニーリング（72℃１分）、伸
長（94℃１分）のサイクルを10〜40の範囲で変化させて
行った。このＰＣＲにより143 bp、256 bp、284 bp、又
は391 bpの二本鎖ＤＮＡを含む４種類の増幅産物を得
た。各々の増幅産物10μl 、20μl 、30μl 、40μl 、
60μl 、80μl にホルムアミド10μl を加え、95℃で10
分間加熱した。この熱変性させた増幅産物を、実施例１
と同様の方法でプローブＰＮＡを固定した測定セルに流
速５ml/ 分で流し込み、10分後の共鳴シグナルを測定し
た。この結果を図５、図６、図７及び図８に示す。図中
の●が10サイクル、▲が20サイクル、■が25サイクル、
○が30サイクル、△が40サイクルのＰＣＲを行った場合
を示す。
【００３９】図５は、試料ＤＮＡの鎖長を143 bpとした
場合のＰＣＲ産物の量と共鳴シグナルの関係を示す。こ
の図に示すように、サイクル数が多いほど大きな共鳴シ
グナルが検出されている。但し、サイクル数が多い場合
にはＰＣＲ産物の量が30μｌを超えると共鳴シグナルが
低下しはじめる。 図６は、試料ＤＮＡの鎖長を256 bpとした場合のＰＣＲ
産物の量と共鳴シグナルの関係を示す。この図に示すよ
うに、図５とは異なり、サイクル数が25の場合において
最も大きな共鳴シグナルが検出される。
場合のＰＣＲ産物の量と共鳴シグナルの関係を示す。こ
の図に示すように、サイクル数が多いほど大きな共鳴シ
グナルが検出されている。但し、サイクル数が多い場合
にはＰＣＲ産物の量が30μｌを超えると共鳴シグナルが
低下しはじめる。 図６は、試料ＤＮＡの鎖長を256 bpとした場合のＰＣＲ
産物の量と共鳴シグナルの関係を示す。この図に示すよ
うに、図５とは異なり、サイクル数が25の場合において
最も大きな共鳴シグナルが検出される。
【００４０】図７は、試料ＤＮＡの鎖長を284 bpとした
場合のＰＣＲ産物の量と共鳴シグナルの関係を示す。こ
の図に示すように、共鳴シグナルの検出パターンは、図
６とほぼ同様である。図８は、試料ＤＮＡの鎖長を391
bpとした場合のＰＣＲ産物の量と共鳴シグナルの関係を
示す。この図に示すように、共鳴シグナルの検出パター
ンは、図６とほぼ同様である。
場合のＰＣＲ産物の量と共鳴シグナルの関係を示す。こ
の図に示すように、共鳴シグナルの検出パターンは、図
６とほぼ同様である。図８は、試料ＤＮＡの鎖長を391
bpとした場合のＰＣＲ産物の量と共鳴シグナルの関係を
示す。この図に示すように、共鳴シグナルの検出パター
ンは、図６とほぼ同様である。
【００４１】上記図５〜８からＤＮＡの鎖長の長さと共
鳴シグナルの関係を調べた。共鳴シグナルは、ＰＣＲ産
物の量が40μl の場合の値である。この結果を図９に示
す。図中の記号は図５〜８と同様である。一般にプロー
ブと結合する物質の分子量（ＤＮＡの鎖長）が大きくな
れば、それだけ共鳴シグナルも大きくなる。しかし、図
９では、必ずしもＤＮＡの鎖長の長さに対応して共鳴シ
グナルも増加していない。これは、前記したように、鎖
長が長くなることにより、立体的にプローブとハイブリ
ダイズできないような形状になる確率が高くなったため
と考えられる。
鳴シグナルの関係を調べた。共鳴シグナルは、ＰＣＲ産
物の量が40μl の場合の値である。この結果を図９に示
す。図中の記号は図５〜８と同様である。一般にプロー
ブと結合する物質の分子量（ＤＮＡの鎖長）が大きくな
れば、それだけ共鳴シグナルも大きくなる。しかし、図
９では、必ずしもＤＮＡの鎖長の長さに対応して共鳴シ
グナルも増加していない。これは、前記したように、鎖
長が長くなることにより、立体的にプローブとハイブリ
ダイズできないような形状になる確率が高くなったため
と考えられる。
【００４２】〔実施例４〕13mm X 18mm 、厚さ0.3mm の
青板ガラス（松浪硝子工業社製）上にスパッタリングに
よりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し、
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを作
製した。スパッタリングは、クロムについては100W、30
秒間、金については100W、150 秒間行った。得られたク
ロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åであ
った。この測定チップを11- メルカプトウンデカン酸の
１mMエタノ−ル溶液に24時間浸漬し、金属層上に有機薄
膜層を形成させた。次いで、50μl の５％アビジン溶液
を同一チップ上の３箇所に滴下し、アビジン分子と有機
薄膜層上の分子との間にアミド結合を形成させ、アビジ
ン分子を固定化した。
青板ガラス（松浪硝子工業社製）上にスパッタリングに
よりクロムからなる層、次いで金からなる層を形成し、
表面プラズモン共鳴バイオセンサー用の測定チップを作
製した。スパッタリングは、クロムについては100W、30
秒間、金については100W、150 秒間行った。得られたク
ロム層の厚さは32.2Åであり、金層の厚さは474 Åであ
った。この測定チップを11- メルカプトウンデカン酸の
１mMエタノ−ル溶液に24時間浸漬し、金属層上に有機薄
膜層を形成させた。次いで、50μl の５％アビジン溶液
を同一チップ上の３箇所に滴下し、アビジン分子と有機
薄膜層上の分子との間にアミド結合を形成させ、アビジ
ン分子を固定化した。
【００４３】次に、５’末端にビオチンを結合させた下
記の３種類のＰＮＡを合成した（日本パーセプティブ社
に合成を委託）。これらのＰＮＡは、毒素産生菌Vibrio
parahaemolyticus（腸炎ビブリオ）の毒性の要因とな
るtdh1、tdh2、trh2の３種類の遺伝子の一部と相補的な
配列を持つ。 配列１（tdh1）：AAGTTATTAATCAAT 配列２（tdh2）：TTTTTATTATATCCG 配列３（trh2）：CCCAGTTAAGGCAAT 上記ＰＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジン溶液を滴下
した位置に30μl 滴下し、ＰＮＡをアビジン・ビオチン
結合を介して測定チップ上に固定化した。
記の３種類のＰＮＡを合成した（日本パーセプティブ社
に合成を委託）。これらのＰＮＡは、毒素産生菌Vibrio
parahaemolyticus（腸炎ビブリオ）の毒性の要因とな
るtdh1、tdh2、trh2の３種類の遺伝子の一部と相補的な
配列を持つ。 配列１（tdh1）：AAGTTATTAATCAAT 配列２（tdh2）：TTTTTATTATATCCG 配列３（trh2）：CCCAGTTAAGGCAAT 上記ＰＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジン溶液を滴下
した位置に30μl 滴下し、ＰＮＡをアビジン・ビオチン
結合を介して測定チップ上に固定化した。
【００４４】ＰＮＡを固定化した測定チップを表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー（電気化学計器社製のＳＰＲ
−２０型のセンサーヘッド、給排液液を改造したもの）
に設置した（図１０）。このバイオセンサーでは、測定
チップを水平方向に自由に移動させることができるの
で、光学系を固定したままチップ上に存在する複数の試
料の共鳴シグナルを測定することが可能である。被検出
物であるＤＮＡは、ＰＣＲ（２５サイクル）で３００ｂ
ｐ程度の断片に増幅させた。増幅させたＤＮＡを含む溶
液を、バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量１０
μl における共鳴シグナルを測定した。結果を表６に示
す。
ズモン共鳴バイオセンサー（電気化学計器社製のＳＰＲ
−２０型のセンサーヘッド、給排液液を改造したもの）
に設置した（図１０）。このバイオセンサーでは、測定
チップを水平方向に自由に移動させることができるの
で、光学系を固定したままチップ上に存在する複数の試
料の共鳴シグナルを測定することが可能である。被検出
物であるＤＮＡは、ＰＣＲ（２５サイクル）で３００ｂ
ｐ程度の断片に増幅させた。増幅させたＤＮＡを含む溶
液を、バイオセンサーの測定セルに流し込み、流量１０
μl における共鳴シグナルを測定した。結果を表６に示
す。
【００４５】
【表６】
【００４６】表６に示すよう配列１〜３のいずれも３０
０ＲＵ（換算値）前後のシグナルを得ており、ＤＮＡの
結合がない場合（陰性）のシグナルが１０〜２０ＲＵ
（換算値）であることを考慮すると、固定した３種類の
ＰＮＡにＤＮＡが結合したもの（陽性）と考えられる。
０ＲＵ（換算値）前後のシグナルを得ており、ＤＮＡの
結合がない場合（陰性）のシグナルが１０〜２０ＲＵ
（換算値）であることを考慮すると、固定した３種類の
ＰＮＡにＤＮＡが結合したもの（陽性）と考えられる。
【００４７】〔実施例５〕実施例４と同様に青板ガラス
上に金属層、有機薄膜層を形成させ、４枚の測定チップ
を作製した。次いで、50μl の５％アビジン溶液を４枚
のチップ上の２箇所に滴下し（合計８箇所）、アビジン
分子を固定化した。次に、５’末端にビオチンを結合さ
せた下記の８種類のＰＮＡを合成した（日本パーセプテ
ィブ社に合成を委託）。配列１〜３は、Vibrio parahae
molyticusのtdh1、tdh2、trh2遺伝子のそれぞれの一部
と相補的な配列を持つＰＮＡであり、配列４はSalmonel
la enteritidis（サルモネラ）の18S rRNA、配列５はBo
rderella pertussis（百日咳菌）の百日咳毒素、配列６
はVibrio chorera（コレラ）のコレラ毒素、配列７はEs
cherichia coli 0157 （病原性大腸菌O157）のベロ毒素
１、配列８はEscherichia coli 0157 のベロ毒素２と相
補的な配列を持つＰＮＡである。つ。
上に金属層、有機薄膜層を形成させ、４枚の測定チップ
を作製した。次いで、50μl の５％アビジン溶液を４枚
のチップ上の２箇所に滴下し（合計８箇所）、アビジン
分子を固定化した。次に、５’末端にビオチンを結合さ
せた下記の８種類のＰＮＡを合成した（日本パーセプテ
ィブ社に合成を委託）。配列１〜３は、Vibrio parahae
molyticusのtdh1、tdh2、trh2遺伝子のそれぞれの一部
と相補的な配列を持つＰＮＡであり、配列４はSalmonel
la enteritidis（サルモネラ）の18S rRNA、配列５はBo
rderella pertussis（百日咳菌）の百日咳毒素、配列６
はVibrio chorera（コレラ）のコレラ毒素、配列７はEs
cherichia coli 0157 （病原性大腸菌O157）のベロ毒素
１、配列８はEscherichia coli 0157 のベロ毒素２と相
補的な配列を持つＰＮＡである。つ。
【００４８】 配列１：AAGTTATTAATCAAT 配列２：TTTTTATTATATCCG 配列３：CCCAGTTAAGGCAAT 配列４：GGCAAACCGTATTAC 配列５：CCAAAGTATTTCCCT 配列６：AATTCGGGTTAATTG 配列７：GGGCGTTATGCCGTA 配列８：TGCAGAGTGGTATAA
【００４９】上記ＰＮＡを含む溶液（10μl ）をアビジ
ン溶液を滴下した位置に30μl 滴下し、ＰＮＡをアビジ
ン・ビオチン結合を介して測定チップ上に固定化した。
ＰＮＡを固定化した測定チップを実施例４で使用した表
面プラズモン共鳴バイオセンサーに設置した。被検出物
であるＤＮＡは、実施例４と同様にＰＣＲで増幅させ
た。ＤＮＡは、大腸菌O157、腸炎ビブリオ、サルモネラ
のそれぞれから調製したＤＮＡと、大腸菌O157から調製
したＤＮＡとサルモネラから調製したＤＮＡの混合物の
４種類使用した。増幅させたＤＮＡを含む溶液を、バイ
オセンサーの測定セルに流し込み、流量１０μl におけ
る共鳴シグナルを測定した。結果を表７に示す。
ン溶液を滴下した位置に30μl 滴下し、ＰＮＡをアビジ
ン・ビオチン結合を介して測定チップ上に固定化した。
ＰＮＡを固定化した測定チップを実施例４で使用した表
面プラズモン共鳴バイオセンサーに設置した。被検出物
であるＤＮＡは、実施例４と同様にＰＣＲで増幅させ
た。ＤＮＡは、大腸菌O157、腸炎ビブリオ、サルモネラ
のそれぞれから調製したＤＮＡと、大腸菌O157から調製
したＤＮＡとサルモネラから調製したＤＮＡの混合物の
４種類使用した。増幅させたＤＮＡを含む溶液を、バイ
オセンサーの測定セルに流し込み、流量１０μl におけ
る共鳴シグナルを測定した。結果を表７に示す。
【００５０】
【表７】
【００５１】表７に示すように、各種微生物に対して陽
性の場合３００ＲＵ程度、陰性の場合３０ＲＵ以下のシ
グナルが得られた。
性の場合３００ＲＵ程度、陰性の場合３０ＲＵ以下のシ
グナルが得られた。
【００５２】
【発明の効果】本発明は、ＤＮＡの新規な検出方法を提
供する。この方法は、電気的に中性であるＰＮＡをプロ
ーブとして用いるので、ＤＮＡをプローブとした場合で
は検出できないような低濃度のＤＮＡも検出することが
でき、また、塩濃度の低い条件下でも高い感度でＤＮＡ
を検出することができる。
供する。この方法は、電気的に中性であるＰＮＡをプロ
ーブとして用いるので、ＤＮＡをプローブとした場合で
は検出できないような低濃度のＤＮＡも検出することが
でき、また、塩濃度の低い条件下でも高い感度でＤＮＡ
を検出することができる。
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの化学構造を示す図である。
【図２】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共
鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
【図３】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン共
鳴バイオセンサー用測定チップの一実施例を示す図であ
る。
鳴バイオセンサー用測定チップの一実施例を示す図であ
る。
【図４】病原性大腸菌Ｏ−１５７の二型ベロ毒素をコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す図である。
ドするＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図５】試料ＤＮＡの鎖長を143 bpとした場合の増幅産
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
【図６】試料ＤＮＡの鎖長を256 bpとした場合の増幅産
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
【図７】試料ＤＮＡの鎖長を284 bpとした場合の増幅産
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
【図８】試料ＤＮＡの鎖長を391 bpとした場合の増幅産
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
物の量と共鳴シグナルの関係を示す図である。
【図９】試料ＤＮＡの鎖長の長さと共鳴シグナルの関係
を示す図である。
を示す図である。
【図１０】本発明の検出方法に使用する表面プラズモン
共鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
共鳴バイオセンサーの一実施例を示す図である。
１…透明基板 ２…金属膜 ３…有機物質層 ４…アビジン ５…ビオチン ６…プローブＰＮＡ ７…カートリッジブロック 71…測定セル 72，73…流路 ８…光源 80…入射光 ９…検出器 90…反射光 10…測定チップ
フロントページの続き (72)発明者 永田 良平 東京都新宿区市谷加賀町一丁目１番１号 大日本印刷株式会社内
Claims (4)
- 【請求項１】 目的とするＤＮＡの一部又は全部の塩基
配列と相補的な塩基配列を有するＰＮＡをプローブとし
て、目的とするＤＮＡを検出することを特徴とするＤＮ
Ａの検出方法。 - 【請求項２】 目的とするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反
応により増幅した後に目的とするＤＮＡを検出すること
を特徴とする請求項１記載のＤＮＡの検出方法。 - 【請求項３】 プローブとして用いるＰＮＡを表面プラ
ズモン共鳴バイオセンサー用測定チップに固定し、該バ
イオセンサーにより目的とするＤＮＡを検出することを
特徴とする請求項１又は請求項２記載のＤＮＡの検出方
法。 - 【請求項４】 二種類以上のＤＮＡを検出することを特
徴とする請求項３記載のＤＮＡの検出方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10141433A JPH11332595A (ja) | 1997-07-09 | 1998-05-22 | プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法 |
| EP98931022A EP0950718A4 (en) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | METHOD FOR DETECTION OF DNA USING A PNA PROBE |
| PCT/JP1998/003077 WO1999002730A1 (fr) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Procede de detection d'adn au moyen d'une sonde de pna |
| US10/334,831 US20030165953A1 (en) | 1997-07-09 | 2003-01-02 | Method for detecting DNA with probe PNA |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-183710 | 1997-07-09 | ||
| JP18371097 | 1997-07-09 | ||
| JP10-75350 | 1997-07-09 | ||
| JP7535098 | 1998-03-24 | ||
| JP10141433A JPH11332595A (ja) | 1997-07-09 | 1998-05-22 | プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11332595A true JPH11332595A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=27301783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10141433A Pending JPH11332595A (ja) | 1997-07-09 | 1998-05-22 | プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0950718A4 (ja) |
| JP (1) | JPH11332595A (ja) |
| WO (1) | WO1999002730A1 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002056012A1 (fr) * | 2001-01-12 | 2002-07-18 | Japan Science And Technology Corporation | Element d'analyse par fluorescence au moyen d'un nanopuits metallique et procede de production de cet element |
| JP2006162585A (ja) * | 2004-11-11 | 2006-06-22 | Horiba Biotechnology Co Ltd | バイオセンサ、マルチバイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システム |
| US7674529B2 (en) | 2004-12-22 | 2010-03-09 | Fujifilm Corporation | Functional group-introduced polyamide solid phase |
| JP2012018159A (ja) * | 2010-06-09 | 2012-01-26 | Konica Minolta Holdings Inc | マイクロチップ送液システム |
| US8133984B2 (en) | 2006-03-16 | 2012-03-13 | Pentabase Aps | Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids |
| US9284393B2 (en) | 2012-06-22 | 2016-03-15 | Kyushu University | Biomolecule-compatible, highly branched polymer and biomolecular-recognition surface |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE432994T1 (de) * | 2000-09-26 | 2009-06-15 | Boston Probes Inc | Sonden, sondensätzen,verfahren und kits zur nachweis, identifizierung und/oder die zählung von bakterien |
| NL1027031C2 (nl) * | 2004-09-13 | 2006-03-14 | Univ Delft Tech | Titerplaat. |
| CN102586466B (zh) * | 2012-03-23 | 2014-02-26 | 浙江省检验检疫科学技术研究院 | 肽核酸原位荧光杂交技术检测沙门氏菌的方法及pna探针 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8919411D0 (en) * | 1989-08-25 | 1989-10-11 | Amersham Int Plc | Assay method |
| DK51092D0 (da) * | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
| PT804456E (pt) * | 1994-10-06 | 2003-01-31 | Peter Eigil Nielsen | Conjugados de acidos nucleicos dos peptidos |
| SE9502608D0 (sv) * | 1995-07-14 | 1995-07-14 | Pharmacia Biosensor Ab | Method for nucleic acid senquencing |
-
1998
- 1998-05-22 JP JP10141433A patent/JPH11332595A/ja active Pending
- 1998-07-09 WO PCT/JP1998/003077 patent/WO1999002730A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1998-07-09 EP EP98931022A patent/EP0950718A4/en not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002056012A1 (fr) * | 2001-01-12 | 2002-07-18 | Japan Science And Technology Corporation | Element d'analyse par fluorescence au moyen d'un nanopuits metallique et procede de production de cet element |
| JP2006162585A (ja) * | 2004-11-11 | 2006-06-22 | Horiba Biotechnology Co Ltd | バイオセンサ、マルチバイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システム |
| JP4744910B2 (ja) * | 2004-11-11 | 2011-08-10 | 株式会社堀場製作所 | バイオセンサ、マルチバイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システム |
| US7674529B2 (en) | 2004-12-22 | 2010-03-09 | Fujifilm Corporation | Functional group-introduced polyamide solid phase |
| US8133984B2 (en) | 2006-03-16 | 2012-03-13 | Pentabase Aps | Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids |
| JP2012018159A (ja) * | 2010-06-09 | 2012-01-26 | Konica Minolta Holdings Inc | マイクロチップ送液システム |
| US9983201B2 (en) | 2010-06-09 | 2018-05-29 | Konica Minolta Holdings, Inc. | Microchip solution sending system |
| US9284393B2 (en) | 2012-06-22 | 2016-03-15 | Kyushu University | Biomolecule-compatible, highly branched polymer and biomolecular-recognition surface |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999002730A1 (fr) | 1999-01-21 |
| EP0950718A4 (en) | 2002-05-22 |
| EP0950718A1 (en) | 1999-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6391546B1 (en) | Method for detecting target nucleotide sequence | |
| US7122303B2 (en) | Arrays comprising background features that provide for a measure of a non-specific binding and methods for using the same | |
| KR101059896B1 (ko) | 표면증강 라만산란을 이용한 생화학 물질의 검출 방법 | |
| US20030211478A1 (en) | Transcription factor profiling on a solid surface | |
| WO2005108609A1 (en) | Method for identification and analysis of certain molecules using the dual function of single strand nucleic acid | |
| JPWO2004102194A1 (ja) | 選択結合性物質固定化担体 | |
| JPH11332595A (ja) | プローブｐｎａによるｄｎａの検出方法 | |
| WO2001071039A2 (en) | Combined polynucleotide sequences as discrete assay endpoints | |
| US6448013B1 (en) | Duplex probes for hybridization reactions | |
| US7964344B2 (en) | Stable hybrid | |
| US6495328B2 (en) | Substrate for detecting base sequences, method of manufacturing the substrate, and method of detecting base sequences using the substrate | |
| US6878523B2 (en) | Molecular interaction assays on a solid surface | |
| US20040191815A1 (en) | Array having oligonucleotides on a metal substrate | |
| US20030054378A1 (en) | Method for detecting target nucleotide sequence | |
| US20030165953A1 (en) | Method for detecting DNA with probe PNA | |
| US20040009516A1 (en) | Arrayed SPR prism | |
| US20040241666A1 (en) | Ligand array assays that include an organic fluid wash step and compositions for practicing the same | |
| US20090171052A1 (en) | Polyelectrolyte Monolayers and Multilayers for Optical Signal Transducers | |
| US20040241668A1 (en) | Ligand array assays that include a low surface tension fluid wash step and compositions for practicing the same | |
| Duman et al. | Detection of Mycobacterium tuberculosis complex using surface plasmon resonance based sensors carrying self-assembled nano-overlayers of probe oligonucleotide | |
| JP4087472B2 (ja) | 表面プラズモン共鳴バイオセンサー用測定チップ及びその製造方法 | |
| Liu et al. | DNA and RNA sensor | |
| JP2004261004A (ja) | 二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ | |
| JP2004003913A (ja) | 核酸固定化担体 | |
| Henke | Measurement of the refractive index of covalently immobilised oligonucleotide films on fused silica optical fibres for optimisation of a nucleic acid biosensor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050425 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070821 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071022 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071120 |