JP2004261004A - 二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ - Google Patents
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Abstract
【課題】二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したアレイを用いて、オリゴヌクレオチドと生体分子またはその集合体との相互作用を適切に測定するための手段を提供すること。
【解決手段】金属基板上に二本鎖オリゴヌクレオチド配列が複数固定化されたアレイであり、二本鎖オリゴヌクレオチドにおける第一の一本鎖オリゴヌクレオチドは基板上に結合しており、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと全体的あるいは部分的に相補的に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【選択図】図４
【解決手段】金属基板上に二本鎖オリゴヌクレオチド配列が複数固定化されたアレイであり、二本鎖オリゴヌクレオチドにおける第一の一本鎖オリゴヌクレオチドは基板上に結合しており、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと全体的あるいは部分的に相補的に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【選択図】図４
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイ及び該アレイを用いて相互作用解析を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から遺伝子を検出する方法としてＤＮＡアレイの技術が用いられてきた。ＤＮＡアレイは、一本鎖ＤＮＡを基板上に固定化しておき、そのＤＮＡに相補的な核酸がハイブリダイゼーションしたかどうかを蛍光ラベルや化学発光などを用いて検出するのが一般的である。
【０００３】
近年、核酸同士の相互作用だけでなく、ＤＮＡ−タンパク質相互作用などの異なる生体分子相互作用の観察が注目をあびてきている。その理由として核酸配列に特異的なタンパク質の存在が広く知られるようになったことが挙げられる。中でも結合・解離の相互作用が重要視されている。
【０００４】
従来、ＤＮＡ−タンパク質の結合・解離の相互作用評価として一般的な方法はゲルシフト法であり、ＤＮＡ−タンパク質を相互作用させた状態で、ゲル内の移動速度を観察する方法が行われてきた。しかし、ゲルシフト法はスループットが低く、多量のサンプルを扱うのは非常に困難である。また、平衡状態を測定するため、結合・解離速度の評価は不可能である。
【０００５】
そこで、ＤＮＡアレイの技術を応用して、二本鎖ＤＮＡのアレイを作製し、タンパク質との相互作用を解析する方法が探索されてきた。例えば同一のプライマー部分を有する一本鎖ＤＮＡをアレイ状に固相に固定化しておき、プライマーをハイブリダイゼーションさせた上で、表面上でのポリメラーゼ操作によって二本鎖とする方法が知られている（例えば特許文献１参照）。この方法は同一のプライマー部分を有する長い一本鎖ＤＮＡを固定化している場合は効果がある。しかし、基板上でのＤＮＡポリメラーゼの反応条件の最適化、反応操作は煩雑である。また、特許文献１では二本鎖ＤＮＡは緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）などによってラベル化されたタンパク質との相互作用が観察されているが、ラベル操作はタンパク質の機能や特性を変える可能性が指摘されており、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を普遍的に測定できる方法とは言えない。
【０００６】
一方、基板上で酵素処理を行わず、二本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせてから、電極基板上に固定化し、酵素との相互作用を観察する方法も報告されている（例えば非特許文献１参照）。ここでは金基板に結合性をもつチオール基をＤＮＡ分子に導入しておき、金基板に直接固定化する方法をとっている。しかし、この方法は電極全体に二本鎖ＤＮＡを固定化するもので、アレイの概念は示されていない。また、この方法では、ＤＮＡ分子は金表面に横たわる形でも存在することが知られており（例えば非特許文献２参照）、ＤＮＡ分子が基板に近すぎてＤＮＡ分子のモビリティが十分に確保できないことから、タンパク質との相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を正確に測定することは困難となる。また、ＤＮＡ分子だけで金表面に自己組織化によって固定化すると密に充填できないため、メルカプトヘキサノールでブロッキングする必要が生じる。メルカプトヘキサノールの方が自己組織化能は強く、先に金に固定化したＤＮＡ分子とメルカプトヘキサノールの交換反応がおこるため、表面に残るＤＮＡ分子の密度は極めて低くなり、タンパク質との相互作用によって得られる信号は非常に小さくなる。
【０００７】
また、アレイ上でＤＮＡ−タンパク質相互作用を観察する報告もされている（例えば非特許文献３参照）。ここでは二種類の一本鎖ＤＮＡを固定化しておき、片方に相補的なＤＮＡをアレイ全体に曝し、片方のみをハイブリダーゼーションさせた後、一本鎖結合型蛋白（ＳＳＢ）との相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング法によって観察している。しかし、この方法では、配列の近いＤＮＡが固定化される場合、ミスマッチでもハイブリダイゼーションしてしまい、配列が似かよった二本鎖ＤＮＡアレイを作成することは困難である。またチップ全体に相補的ＤＮＡを曝すことにも限界がある。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許６３２６４８９
【０００９】
【非特許文献１】
Ｂｏｏｎら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２００２）２８２−２８６．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｔｏｎｙａら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１９（１９９７）８９１６−８９２０．
【００１１】
【非特許文献３】
Ｂｒｏｃｋｍａｎら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２１（１９９９）８０４４−８０５１．
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したアレイ並びに該アレイを用いて生体分子の相互作用を適切に測定する方法を提供することを主な課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として、鋭意検討を重ねた。その結果、金属基板上に二本鎖オリゴヌクレオチド配列が複数固定化されたアレイであって、二本鎖オリゴヌクレオチドにおける第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に固定化されており、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと全体的あるいは部分的に相補的に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いることにより、適切な測定が行い得ることを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、次の事項に関する。
【００１５】
１．金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【００１６】
２．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している項１に記載のアレイ。
【００１７】
３．金属基板が、表層に金薄層が形成された透明基板である項１又は２に記載のアレイ。
【００１８】
４．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、金属基板上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合することによって基板上に結合している項３に記載のアレイ。
【００１９】
５．（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法。
【００２０】
６．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させる項５に記載の方法。
【００２１】
７．金属基板が表層に金薄層が形成された透明基板である項５又は６に記載の方法。
【００２２】
８．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を、金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合させて、金属基板上に結合させる項７に記載の方法。
【００２３】
９．項５〜８のいずれかに記載の方法により作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【００２４】
１０．項１〜５又は９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに固定化されたオリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を測定する工程を有する生体分子相互作用測定方法。
【００２５】
１１．オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法を用いて測定する項１０に記載の方法。
【００２６】
１２．オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する項１０又は１１に記載の方法。
【００２７】
１３．生体分子がタンパク質である項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【００２８】
１４．タンパク質が転写因子である項１３に記載の方法。
【００２９】
本発明は、好ましくは、金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに係る。
【００３０】
より好ましくは、表層に金薄層を有する透明基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが該官能基あるいは結合グループを介して金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合して基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに係る。
【００３１】
また、本発明は、好ましくは、（１）５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法に係る。
【００３２】
より好ましくは、（１）５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合して、表層に金薄層を有する透明基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法に係る。
【００３３】
更に、本発明は、好ましくは、（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む方法で作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法または表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する生体分子相互作用測定方法に関する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ
本発明において、二本鎖オリゴヌクレオチドとは二本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの二重らせん分子のことをいい、本発明においては、アレイ上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化される。本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとが、全体的あるいは部分的に相補的に結合して形成されている。部分的とはどちらかのオリゴヌクレオチドの一部分が一本鎖である状態や、ミスマッチを含む塩基対である状態をいう。
【００３６】
本発明のアレイにおいては、二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する一方の一本鎖オリゴヌクレオチド（第一のオリゴヌクレオチド）のみが、金属基板上に結合しており、もう一方の一本鎖オリゴヌクレオチド（第二のオリゴヌクレオチド）は、第一のオリゴヌクレオチドと相補的にワトソン−クリック対を形成することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの形で、基板上に固定化されている。
【００３７】
相補結合をしている第一と第二のオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）は、測定温度よりも高いように設定する。ＴｍはオリゴヌクレオチドにおけるＧとＣが含まれるパーセンテージにも依存するが、一般的な測定温度（２５〜３７℃）で、少なくとも９塩基以上の相補的結合が必要である。また、５０塩基以上の長い塩基対は合成が困難であったり、自己相補的塩基対を生じたり、目的の部位と異なる部位でハイブリダイゼーションしたりして、目的の二本鎖オリゴヌクレオチドが得られない危険性が生じる。従って、二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、相補的結合をしている長さは、９塩基以上５０塩基以下が好ましい。より好ましくは、１１塩基以上３０塩基以下である。相補結合している塩基は連続していることが好ましい。相補結合していれば、相補的結合部分に一部ミスマッチを有するものも含まれる。
【００３８】
生体分子との相互作用を観察するためには、生体分子が、オリゴヌクレオチドを認識できる状態が必要である。そのためには、二本鎖オリゴヌクレオチド分子が基板上に横たわらないよう、オリゴヌクレオチドの中央部分ではなく、末端で結合させることが重要である。オリゴヌクレオチドを末端で結合するための方法としては、例えば、第一のオリゴヌクレオチドの末端に官能基を導入し、固体表面に存在する官能基もしくは固体表面に導入した官能基と直接、もしくは架橋剤などを用いて間接的に結合する方法などが挙げられる。このように末端で固定化することで、生体分子がオリゴヌクレオチドを適切に認識でき、正しい評価値を得ることができる。
【００３９】
二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法は、特に限定されないが、第一と第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、二本鎖オリゴヌクレオチドとした上で、第一のオリゴヌクレオチドの末端を基板上にアレイ状に固定化する方法が好ましい。
【００４０】
より具体的には、（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む方法が好ましい。
【００４１】
第一のオリゴヌクレオチドを、先に固定化した後で、第二のオリゴヌクレオチドを配置させる場合には、アレイの同一場所にスポットする必要があり、スポット操作が二回必要となるなど、工程が煩雑となる。そのため、第一と第二のオリゴヌクレオチドは基板に配置される前に、ハイブリダイゼーションを行って、二本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好ましい。
【００４２】
第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｘ５ＳＳＣ溶液などの塩濃度の高い溶液に、５’チオール末端ＤＮＡと相補的ＤＮＡがモル比１：１〜１：１０の範囲で混合し、沸騰浴中にて３−１５分、０℃に急冷し５−６０分、その後３７℃で１−２４時間インキュベートするなどのように行う。
【００４３】
第一のオリゴヌクレオチドを金属基板に結合する方法としては、第一のオリゴヌクレオチドの末端に官能基あるいは結合グループが導入し、該官能基あるいは結合グループを介して、基板上に直接的あるいは、介在物質を介して間接的に結合する方法が好ましい。官能基や結合グループの種類は特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、ビオチンなどが挙げられる。
【００４４】
金属基板としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、クロム等を用いた基板が挙げられる。このうち、特に表層に金薄層が形成された透明基板が好ましい。表層に金薄層が形成されている場合には、特定の物質を基板上に密に充填して金表面に官能基を導入し、第一のオリゴヌクレオチドの末端を該物質の官能基に直接的あるいは間接的に結合させて、オリゴヌクレオチドを基板上に密に固定化することが可能である。
【００４５】
金表面に官能基を導入する方法としては、一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される二官能基型アルカン（ここでＸ’は金表面と結合する官能基、Ｙ’は第一オリゴヌクレオチドと結合する官能基を表す。Ｒ’は有機基を表す。）を基板上に密に充填する方法が好ましい。官能基Ｘ’としては、例えば、チオール基、スルフィド基またはジスルフィド基などが挙げられる。Ｙ’としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、エポキシ基、カルボニルジイミダゾール基、イソシアネート基などが挙げられる。またＲ’としては、アルキレン基などが挙げられる。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が５以上１８以下であることが好ましい。炭素数が４未満であると、アルカン鎖同士の疎水結合が十分でなく、自己組織化表面の安定性に欠ける。また１９以上であると、アルカン鎖の疎水性が強く、親水性物質の反応・固定化が困難となるだけでなく、センサー表面として疎水性が強いために測定中の非特異的吸着が懸念される。
【００４６】
一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される化合物としては、具体的には、Ｙ’がアミノ基となる８−アミノ−１−オクタンチオール（８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）、Ｙ’がカルボキシル基となる７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ）などが挙げられる。
【００４７】
生体分子相互作用の測定方法
本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドアレイは、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用の測定に、好適に用いることができる。相互作用測定の手段としては、ラベルフリーかつリアルタイム測定が可能な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が好ましい。さらにＳＰＲ法においては、ＳＰＲイメージング法が好ましい。
【００４８】
生体分子の中にはラベル操作によって機能・活性に変化が生じるものがあり、特にタンパク質は、ラベル操作によって、構造が変化したり、活性を失う可能性が高い。ＳＰＲ法は生体分子を標識化（ラベル）する必要のない相互作用解析方法であるため、生体分子の機能や活性を維持したまま適切な測定を行うことができる。また該方法により、リアルタイムな測定が可能であり、平衡状態だけではなく、結合と解離の速度を解析することが可能となるため、これらの結果から生体分子の機能を知るための貴重な情報を得ることができる。
【００４９】
ＳＰＲイメージング法はアレイ全体に偏光平行光を照射し、その反射光をＣＣＤカメラで撮影するため、アレイのある地点における表面プラズモン共鳴角変位を、反射光強度の変化によって知ることが可能である。よって、複数の配列を固定化した二本鎖オリゴヌクレオチドアレイと生体分子の相互作用をラベルフリーかつリアルタイムに測定乃至解析することが可能であり、特に複数の生体分子を固定化したアレイを用いた生体分子相互作用の解析に好適に用いることができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの相互作用の対象となる生体分子は、特に限定されることはないが、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖などが挙げられる。またヘテロ二量体などの生体分子の集合体にも適用できる。中でも、本発明はタンパク質の測定に好適に用いることができる。特に、タンパク質の中でも、二本鎖ＤＮＡと相互作用することが知られている転写因子の測定に好適に用いることができる。転写因子の種類は特に限定されず、例えば、ＮＦ１ファミリー、Ｍａｆファミリー、ＧＡＴＡファミリーなどを適用することができる。Ｍａｆファミリーはホモ二量体だけではなく、ヘテロ二量体を形成することが知られているが、本発明の方法により、さまざまなヘテロ二量体の組み合わせによる結合挙動の違いの評価や、変異の入った二本鎖ＤＮＡと転写因子の相互作用を解析することなどができ、本発明により、生体機能に関する有用な種々の情報を得ることができる。
【００５１】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５２】
実施例１
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００５３】
得られた表面にＧｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社のＨａｎｄ ｓｐｏｔｔｅｒを用いて５’チオール末端のＤＮＡの二種類、ハイブリダーゼーションさせてからスポッティングした。ＤＮＡの配列はＭａｆ認識配列（ＭＡＲＥ２５）と、Ｍａｆ非認識配列（ＭＡＲＥ２３）であり、詳細な配列は図１に示す。５’チオール末端からチミン１５塩基スペーサーを介した後、目的の配列が入るように設計されている。
【００５４】
Ｘ５ＳＳＣ溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に５’チオール末端ＤＮＡが２５μＭ、その相補的ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、沸騰浴中にて５分、０℃に急冷し１５分、その後３７℃で三時間インキュベートし、ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションした二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をスポッティングし、１５時間反応させてｄｓＤＮＡを表面に固定化した。
【００５５】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン、ｐＨ７．９の転写因子測定用緩衝液をフローセル内に流した。
【００５６】
ＳＰＲイメージングによって得られる像を図３に示す。ｄｓＤＮＡを固定化した楕円形の部分は、屈折率の変化のために白く見えている。このようにｄｓＤＮＡを表面に固定化したアレイが形成されている。
【００５７】
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、転写因子ＭａｆＧのホモ二量体を１μｇ／ｍｌの濃度で上記転写因子測定用緩衝液に溶解してセル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、さらに転写因子を含まない緩衝液を流し、結合と解離のＳＰＲシグナルの変化を観察した。
【００５８】
観察はＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３の固定化部位と何もＤＮＡが固定化されていない部分（バックグラウンド部位）の三点で実施した。ＳＰＲシグナルの変化を示すグラフを図４に示す。ＭＡＲＥ２５配列のみにＭａｆＧホモ二量体が結合し、ＭＡＲＥ２３、バックグラウンド部位にはほとんど結合しないのが観察でき、結合速度定数２．２２×１０５（Ｍ−１ｓ−１）、解離速度定数８．８０×１０−４（ｓ−１）、結合平衡定数２．５２×１０８（Ｍ−１）を得た。
【００５９】
参考例１
実施例１と同様に、金蒸着透明基板上に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型親水性高分子ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを固定化した。
【００６０】
次に５’末端にチオールを有するＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３配列の一本鎖ＤＮＡを１ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、アレイ状にスポッティングし１５時間反応させることで基板上に固定化した。
【００６１】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器にセットし、フローセル内を塩濃度の転写因子測定用緩衝液で満たした。次にＭＡＲＥ２５に相補的なＤＮＡを１μＭの濃度で注入し、２０分間放置し、ＭＡＲＥ２５をハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、ＭＡＲＥ２３に相補的なＤＮＡを１μＭの濃度で注入し、２０分間放置し、ＭＡＲＥ２３をハイブリダイゼーションさせた。
【００６２】
実施例と同様の方法でＭａｆＧホモ二量体の相互作用を観察したが、ＭＡＲＥ２５、ＭＡＲＥ２３の両方に吸着し、転写因子ＭａｆＧの特異性は観察できなかった（図５）。ＭＡＲＥ２５の相補的ＤＮＡがＭＡＲＥ２３にも結合しているため、目的の二本鎖ＤＮＡアレイを形成できなかったためと考えられる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いることによって、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を適切に解析することが可能となる。
【００６４】
また、本発明により、生体分子相互作用の観察に適した二本鎖オリゴヌクレオチドを、効率よく、かつ適切に作成することができる。
【００６５】
本発明は、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用の測定において有用性の高い優れた手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＲＥ２５の塩基配列を示す図面である。
【図２】図２は、ＭＡＲＥ２３の塩基配列を示す図面である。
【図３】図３は、ｄｓＤＮＡアレイのＳＰＲ像を示す図面である。
【図４】図４は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（実施例）を示す図面である。
【図５】図５は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（参考例）を示す図面である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイ及び該アレイを用いて相互作用解析を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から遺伝子を検出する方法としてＤＮＡアレイの技術が用いられてきた。ＤＮＡアレイは、一本鎖ＤＮＡを基板上に固定化しておき、そのＤＮＡに相補的な核酸がハイブリダイゼーションしたかどうかを蛍光ラベルや化学発光などを用いて検出するのが一般的である。
【０００３】
近年、核酸同士の相互作用だけでなく、ＤＮＡ−タンパク質相互作用などの異なる生体分子相互作用の観察が注目をあびてきている。その理由として核酸配列に特異的なタンパク質の存在が広く知られるようになったことが挙げられる。中でも結合・解離の相互作用が重要視されている。
【０００４】
従来、ＤＮＡ−タンパク質の結合・解離の相互作用評価として一般的な方法はゲルシフト法であり、ＤＮＡ−タンパク質を相互作用させた状態で、ゲル内の移動速度を観察する方法が行われてきた。しかし、ゲルシフト法はスループットが低く、多量のサンプルを扱うのは非常に困難である。また、平衡状態を測定するため、結合・解離速度の評価は不可能である。
【０００５】
そこで、ＤＮＡアレイの技術を応用して、二本鎖ＤＮＡのアレイを作製し、タンパク質との相互作用を解析する方法が探索されてきた。例えば同一のプライマー部分を有する一本鎖ＤＮＡをアレイ状に固相に固定化しておき、プライマーをハイブリダイゼーションさせた上で、表面上でのポリメラーゼ操作によって二本鎖とする方法が知られている（例えば特許文献１参照）。この方法は同一のプライマー部分を有する長い一本鎖ＤＮＡを固定化している場合は効果がある。しかし、基板上でのＤＮＡポリメラーゼの反応条件の最適化、反応操作は煩雑である。また、特許文献１では二本鎖ＤＮＡは緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）などによってラベル化されたタンパク質との相互作用が観察されているが、ラベル操作はタンパク質の機能や特性を変える可能性が指摘されており、ＤＮＡ−タンパク質相互作用を普遍的に測定できる方法とは言えない。
【０００６】
一方、基板上で酵素処理を行わず、二本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせてから、電極基板上に固定化し、酵素との相互作用を観察する方法も報告されている（例えば非特許文献１参照）。ここでは金基板に結合性をもつチオール基をＤＮＡ分子に導入しておき、金基板に直接固定化する方法をとっている。しかし、この方法は電極全体に二本鎖ＤＮＡを固定化するもので、アレイの概念は示されていない。また、この方法では、ＤＮＡ分子は金表面に横たわる形でも存在することが知られており（例えば非特許文献２参照）、ＤＮＡ分子が基板に近すぎてＤＮＡ分子のモビリティが十分に確保できないことから、タンパク質との相互作用キネティクス（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を正確に測定することは困難となる。また、ＤＮＡ分子だけで金表面に自己組織化によって固定化すると密に充填できないため、メルカプトヘキサノールでブロッキングする必要が生じる。メルカプトヘキサノールの方が自己組織化能は強く、先に金に固定化したＤＮＡ分子とメルカプトヘキサノールの交換反応がおこるため、表面に残るＤＮＡ分子の密度は極めて低くなり、タンパク質との相互作用によって得られる信号は非常に小さくなる。
【０００７】
また、アレイ上でＤＮＡ−タンパク質相互作用を観察する報告もされている（例えば非特許文献３参照）。ここでは二種類の一本鎖ＤＮＡを固定化しておき、片方に相補的なＤＮＡをアレイ全体に曝し、片方のみをハイブリダーゼーションさせた後、一本鎖結合型蛋白（ＳＳＢ）との相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング法によって観察している。しかし、この方法では、配列の近いＤＮＡが固定化される場合、ミスマッチでもハイブリダイゼーションしてしまい、配列が似かよった二本鎖ＤＮＡアレイを作成することは困難である。またチップ全体に相補的ＤＮＡを曝すことにも限界がある。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許６３２６４８９
【０００９】
【非特許文献１】
Ｂｏｏｎら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２００２）２８２−２８６．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｔｏｎｙａら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１９（１９９７）８９１６−８９２０．
【００１１】
【非特許文献３】
Ｂｒｏｃｋｍａｎら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２１（１９９９）８０４４−８０５１．
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化したアレイ並びに該アレイを用いて生体分子の相互作用を適切に測定する方法を提供することを主な課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として、鋭意検討を重ねた。その結果、金属基板上に二本鎖オリゴヌクレオチド配列が複数固定化されたアレイであって、二本鎖オリゴヌクレオチドにおける第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に固定化されており、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドと全体的あるいは部分的に相補的に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いることにより、適切な測定が行い得ることを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、次の事項に関する。
【００１５】
１．金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【００１６】
２．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している項１に記載のアレイ。
【００１７】
３．金属基板が、表層に金薄層が形成された透明基板である項１又は２に記載のアレイ。
【００１８】
４．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、金属基板上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合することによって基板上に結合している項３に記載のアレイ。
【００１９】
５．（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法。
【００２０】
６．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させる項５に記載の方法。
【００２１】
７．金属基板が表層に金薄層が形成された透明基板である項５又は６に記載の方法。
【００２２】
８．第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を、金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合させて、金属基板上に結合させる項７に記載の方法。
【００２３】
９．項５〜８のいずれかに記載の方法により作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
【００２４】
１０．項１〜５又は９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに固定化されたオリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を測定する工程を有する生体分子相互作用測定方法。
【００２５】
１１．オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法を用いて測定する項１０に記載の方法。
【００２６】
１２．オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する項１０又は１１に記載の方法。
【００２７】
１３．生体分子がタンパク質である項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【００２８】
１４．タンパク質が転写因子である項１３に記載の方法。
【００２９】
本発明は、好ましくは、金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに係る。
【００３０】
より好ましくは、表層に金薄層を有する透明基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが該官能基あるいは結合グループを介して金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合して基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに係る。
【００３１】
また、本発明は、好ましくは、（１）５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法に係る。
【００３２】
より好ましくは、（１）５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有する第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合して、表層に金薄層を有する透明基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法に係る。
【００３３】
更に、本発明は、好ましくは、（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む方法で作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法または表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する生体分子相互作用測定方法に関する。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ
本発明において、二本鎖オリゴヌクレオチドとは二本鎖ＤＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの二重らせん分子のことをいい、本発明においては、アレイ上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化される。本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとが、全体的あるいは部分的に相補的に結合して形成されている。部分的とはどちらかのオリゴヌクレオチドの一部分が一本鎖である状態や、ミスマッチを含む塩基対である状態をいう。
【００３６】
本発明のアレイにおいては、二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する一方の一本鎖オリゴヌクレオチド（第一のオリゴヌクレオチド）のみが、金属基板上に結合しており、もう一方の一本鎖オリゴヌクレオチド（第二のオリゴヌクレオチド）は、第一のオリゴヌクレオチドと相補的にワトソン−クリック対を形成することによって、二本鎖オリゴヌクレオチドの形で、基板上に固定化されている。
【００３７】
相補結合をしている第一と第二のオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）は、測定温度よりも高いように設定する。ＴｍはオリゴヌクレオチドにおけるＧとＣが含まれるパーセンテージにも依存するが、一般的な測定温度（２５〜３７℃）で、少なくとも９塩基以上の相補的結合が必要である。また、５０塩基以上の長い塩基対は合成が困難であったり、自己相補的塩基対を生じたり、目的の部位と異なる部位でハイブリダイゼーションしたりして、目的の二本鎖オリゴヌクレオチドが得られない危険性が生じる。従って、二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、相補的結合をしている長さは、９塩基以上５０塩基以下が好ましい。より好ましくは、１１塩基以上３０塩基以下である。相補結合している塩基は連続していることが好ましい。相補結合していれば、相補的結合部分に一部ミスマッチを有するものも含まれる。
【００３８】
生体分子との相互作用を観察するためには、生体分子が、オリゴヌクレオチドを認識できる状態が必要である。そのためには、二本鎖オリゴヌクレオチド分子が基板上に横たわらないよう、オリゴヌクレオチドの中央部分ではなく、末端で結合させることが重要である。オリゴヌクレオチドを末端で結合するための方法としては、例えば、第一のオリゴヌクレオチドの末端に官能基を導入し、固体表面に存在する官能基もしくは固体表面に導入した官能基と直接、もしくは架橋剤などを用いて間接的に結合する方法などが挙げられる。このように末端で固定化することで、生体分子がオリゴヌクレオチドを適切に認識でき、正しい評価値を得ることができる。
【００３９】
二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法は、特に限定されないが、第一と第二のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、二本鎖オリゴヌクレオチドとした上で、第一のオリゴヌクレオチドの末端を基板上にアレイ状に固定化する方法が好ましい。
【００４０】
より具体的には、（１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む方法が好ましい。
【００４１】
第一のオリゴヌクレオチドを、先に固定化した後で、第二のオリゴヌクレオチドを配置させる場合には、アレイの同一場所にスポットする必要があり、スポット操作が二回必要となるなど、工程が煩雑となる。そのため、第一と第二のオリゴヌクレオチドは基板に配置される前に、ハイブリダイゼーションを行って、二本鎖オリゴヌクレオチドとすることが好ましい。
【００４２】
第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｘ５ＳＳＣ溶液などの塩濃度の高い溶液に、５’チオール末端ＤＮＡと相補的ＤＮＡがモル比１：１〜１：１０の範囲で混合し、沸騰浴中にて３−１５分、０℃に急冷し５−６０分、その後３７℃で１−２４時間インキュベートするなどのように行う。
【００４３】
第一のオリゴヌクレオチドを金属基板に結合する方法としては、第一のオリゴヌクレオチドの末端に官能基あるいは結合グループが導入し、該官能基あるいは結合グループを介して、基板上に直接的あるいは、介在物質を介して間接的に結合する方法が好ましい。官能基や結合グループの種類は特に限定されるものではないが、例えば、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、ビオチンなどが挙げられる。
【００４４】
金属基板としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、クロム等を用いた基板が挙げられる。このうち、特に表層に金薄層が形成された透明基板が好ましい。表層に金薄層が形成されている場合には、特定の物質を基板上に密に充填して金表面に官能基を導入し、第一のオリゴヌクレオチドの末端を該物質の官能基に直接的あるいは間接的に結合させて、オリゴヌクレオチドを基板上に密に固定化することが可能である。
【００４５】
金表面に官能基を導入する方法としては、一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される二官能基型アルカン（ここでＸ’は金表面と結合する官能基、Ｙ’は第一オリゴヌクレオチドと結合する官能基を表す。Ｒ’は有機基を表す。）を基板上に密に充填する方法が好ましい。官能基Ｘ’としては、例えば、チオール基、スルフィド基またはジスルフィド基などが挙げられる。Ｙ’としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、エポキシ基、カルボニルジイミダゾール基、イソシアネート基などが挙げられる。またＲ’としては、アルキレン基などが挙げられる。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、炭素数が５以上１８以下であることが好ましい。炭素数が４未満であると、アルカン鎖同士の疎水結合が十分でなく、自己組織化表面の安定性に欠ける。また１９以上であると、アルカン鎖の疎水性が強く、親水性物質の反応・固定化が困難となるだけでなく、センサー表面として疎水性が強いために測定中の非特異的吸着が懸念される。
【００４６】
一般式Ｘ’−Ｒ’−Ｙ’で表される化合物としては、具体的には、Ｙ’がアミノ基となる８−アミノ−１−オクタンチオール（８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ）、Ｙ’がカルボキシル基となる７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール（７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ）などが挙げられる。
【００４７】
生体分子相互作用の測定方法
本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドアレイは、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用の測定に、好適に用いることができる。相互作用測定の手段としては、ラベルフリーかつリアルタイム測定が可能な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が好ましい。さらにＳＰＲ法においては、ＳＰＲイメージング法が好ましい。
【００４８】
生体分子の中にはラベル操作によって機能・活性に変化が生じるものがあり、特にタンパク質は、ラベル操作によって、構造が変化したり、活性を失う可能性が高い。ＳＰＲ法は生体分子を標識化（ラベル）する必要のない相互作用解析方法であるため、生体分子の機能や活性を維持したまま適切な測定を行うことができる。また該方法により、リアルタイムな測定が可能であり、平衡状態だけではなく、結合と解離の速度を解析することが可能となるため、これらの結果から生体分子の機能を知るための貴重な情報を得ることができる。
【００４９】
ＳＰＲイメージング法はアレイ全体に偏光平行光を照射し、その反射光をＣＣＤカメラで撮影するため、アレイのある地点における表面プラズモン共鳴角変位を、反射光強度の変化によって知ることが可能である。よって、複数の配列を固定化した二本鎖オリゴヌクレオチドアレイと生体分子の相互作用をラベルフリーかつリアルタイムに測定乃至解析することが可能であり、特に複数の生体分子を固定化したアレイを用いた生体分子相互作用の解析に好適に用いることができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの相互作用の対象となる生体分子は、特に限定されることはないが、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖などが挙げられる。またヘテロ二量体などの生体分子の集合体にも適用できる。中でも、本発明はタンパク質の測定に好適に用いることができる。特に、タンパク質の中でも、二本鎖ＤＮＡと相互作用することが知られている転写因子の測定に好適に用いることができる。転写因子の種類は特に限定されず、例えば、ＮＦ１ファミリー、Ｍａｆファミリー、ＧＡＴＡファミリーなどを適用することができる。Ｍａｆファミリーはホモ二量体だけではなく、ヘテロ二量体を形成することが知られているが、本発明の方法により、さまざまなヘテロ二量体の組み合わせによる結合挙動の違いの評価や、変異の入った二本鎖ＤＮＡと転写因子の相互作用を解析することなどができ、本発明により、生体機能に関する有用な種々の情報を得ることができる。
【００５１】
【実施例】
以下に実施例及び参考例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５２】
実施例１
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００５３】
得られた表面にＧｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社のＨａｎｄ ｓｐｏｔｔｅｒを用いて５’チオール末端のＤＮＡの二種類、ハイブリダーゼーションさせてからスポッティングした。ＤＮＡの配列はＭａｆ認識配列（ＭＡＲＥ２５）と、Ｍａｆ非認識配列（ＭＡＲＥ２３）であり、詳細な配列は図１に示す。５’チオール末端からチミン１５塩基スペーサーを介した後、目的の配列が入るように設計されている。
【００５４】
Ｘ５ＳＳＣ溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に５’チオール末端ＤＮＡが２５μＭ、その相補的ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、沸騰浴中にて５分、０℃に急冷し１５分、その後３７℃で三時間インキュベートし、ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションした二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をスポッティングし、１５時間反応させてｄｓＤＮＡを表面に固定化した。
【００５５】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器（ＳＰＲＩｍａｇｅｒ：ＧＷＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン、ｐＨ７．９の転写因子測定用緩衝液をフローセル内に流した。
【００５６】
ＳＰＲイメージングによって得られる像を図３に示す。ｄｓＤＮＡを固定化した楕円形の部分は、屈折率の変化のために白く見えている。このようにｄｓＤＮＡを表面に固定化したアレイが形成されている。
【００５７】
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、転写因子ＭａｆＧのホモ二量体を１μｇ／ｍｌの濃度で上記転写因子測定用緩衝液に溶解してセル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、さらに転写因子を含まない緩衝液を流し、結合と解離のＳＰＲシグナルの変化を観察した。
【００５８】
観察はＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３の固定化部位と何もＤＮＡが固定化されていない部分（バックグラウンド部位）の三点で実施した。ＳＰＲシグナルの変化を示すグラフを図４に示す。ＭＡＲＥ２５配列のみにＭａｆＧホモ二量体が結合し、ＭＡＲＥ２３、バックグラウンド部位にはほとんど結合しないのが観察でき、結合速度定数２．２２×１０５（Ｍ−１ｓ−１）、解離速度定数８．８０×１０−４（ｓ−１）、結合平衡定数２．５２×１０８（Ｍ−１）を得た。
【００５９】
参考例１
実施例１と同様に、金蒸着透明基板上に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させ、スクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型親水性高分子ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを固定化した。
【００６０】
次に５’末端にチオールを有するＭＡＲＥ２５とＭＡＲＥ２３配列の一本鎖ＤＮＡを１ｍＭのリン酸緩衝液に溶解し、アレイ状にスポッティングし１５時間反応させることで基板上に固定化した。
【００６１】
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、ＳＰＲイメージング機器にセットし、フローセル内を塩濃度の転写因子測定用緩衝液で満たした。次にＭＡＲＥ２５に相補的なＤＮＡを１μＭの濃度で注入し、２０分間放置し、ＭＡＲＥ２５をハイブリダイゼーションさせた。洗浄後、ＭＡＲＥ２３に相補的なＤＮＡを１μＭの濃度で注入し、２０分間放置し、ＭＡＲＥ２３をハイブリダイゼーションさせた。
【００６２】
実施例と同様の方法でＭａｆＧホモ二量体の相互作用を観察したが、ＭＡＲＥ２５、ＭＡＲＥ２３の両方に吸着し、転写因子ＭａｆＧの特異性は観察できなかった（図５）。ＭＡＲＥ２５の相補的ＤＮＡがＭＡＲＥ２３にも結合しているため、目的の二本鎖ＤＮＡアレイを形成できなかったためと考えられる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いることによって、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を適切に解析することが可能となる。
【００６４】
また、本発明により、生体分子相互作用の観察に適した二本鎖オリゴヌクレオチドを、効率よく、かつ適切に作成することができる。
【００６５】
本発明は、オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用の測定において有用性の高い優れた手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＡＲＥ２５の塩基配列を示す図面である。
【図２】図２は、ＭＡＲＥ２３の塩基配列を示す図面である。
【図３】図３は、ｄｓＤＮＡアレイのＳＰＲ像を示す図面である。
【図４】図４は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（実施例）を示す図面である。
【図５】図５は、ＭａｆＧホモ二量体の結合解離曲線（参考例）を示す図面である。
Claims (14)
- 金属基板上に複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化されたアレイであり、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとが全体的あるいは部分的に相補的に結合して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成しており、該二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて第一の一本鎖オリゴヌクレオチドのみが基板上に結合している二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
- 第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して基板上に結合している請求項１に記載のアレイ。
- 金属基板が、表層に金薄層が形成された透明基板である請求項１又は２に記載のアレイ。
- 第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが、金属基板上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合することによって基板上に結合している請求項３に記載のアレイ。
- （１）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダーゼーションさせて、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドが全体的あるいは部分的に相補的に結合した二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程、次いで、（２）第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させて、金属基板上に（１）で形成した二本鎖オリゴヌクレオチドを固定化する工程を含む二本鎖オリゴヌクレオチドアレイの作成方法。
- 第一の一本鎖オリゴヌクレオチドが５’末端あるいは３’末端側に官能基あるいは結合グループを有し、該官能基あるいは結合グループを介して第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を金属基板上に結合させる請求項５に記載の方法。
- 金属基板が表層に金薄層が形成された透明基板である請求項５又は６に記載の方法。
- 第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を、金薄層上に密に充填された二官能基型アルカンに直接的或いは間接的に結合させて、金属基板上に結合させる請求項７に記載の方法。
- 請求項５〜８のいずれかに記載の方法により作成された二本鎖オリゴヌクレオチドアレイ。
- 請求項１〜５又は９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドアレイを用いて、二本鎖オリゴヌクレオチドアレイに固定化されたオリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を測定する工程を有する生体分子相互作用測定方法。
- オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴法を用いて測定する請求項１０に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドと生体分子又はその集合体との相互作用を、表面プラズモン共鳴イメージング法を用いて測定する請求項１０又は１１に記載の方法。
- 生体分子がタンパク質である請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
- タンパク質が転写因子である請求項１３に記載の方法。
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