JP3524390B2 - 生化学センサおよびこれを利用する生化学検出装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、複数の抗体、抗
原、一本鎖ＤＮＡ、レセプタ、リガンド、酵素などの生
化学的試薬で修飾された領域を有する生化学センサチッ
プに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来の技術としては、ＤＮＡチップが挙
げられる。図２に示す様に、シリコン、ガラスなどの基
板３０の上に、光リソグラフィーと光化学反応の技術を
利用することにより、多数の複数領域に異なる数１０ｍ
ｅｒのＤＮＡが結合されている。例えば、第１の領域３
１には第１のＤＮＡ３２が結合され、また第２の領域３
３には第２のＤＮＡ３４が結合されている。検出にあた
っては、被検体である遺伝子を数１０ｍｅｒの短い断片
にし、それぞれを蛍光色素で修飾してから、被検体の試
料をＤＮＡチップの表面に加える。ＤＮＡチップ上に合
成されているＤＮＡと相補的関係にあるＤＮＡ断片が試
料のなかに存在すると、それらの断片が結合される。例
えば、ＤＮＡ３４に相補的関係にあるＤＮＡ断片３５
は、ＤＮＡ３４に結合する。結合しない他のＤＮＡ断片
を洗い流した後、共焦点顕微鏡３６などの高感度光検出
方法によりＤＮＡチップを観測すると、特定領域に結合
したＤＮＡ断片３５に結合されている蛍光色素３７から
の蛍光信号３８が検出される。領域ごとに結合されてい
るＤＮＡはあらかじめ決められているため、信号が検出
された領域からＤＮＡの断片が同定される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術において
は、膨大な種類のＤＮＡを迅速に検出するのに非常に有
利な方法である半面、抗体、抗原、レセプタ、リガンド
などの他の生体分子の検出には容易に利用できない。

【０００４】また、試料中のＤＮＡ断片を蛍光色素で修
飾し、信号を検出するのに共焦点顕微鏡など比較的複雑
な光学系が必要であるため、安価な装置とはなり難い。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、センサチップの作成は、前記生体分子で修飾された
ポリスチレン微粒子を金基板の上に表面化学的なパター
ニング方法を利用するものである。

【０００６】また検出方法については、発明者らが最近
発見した金薄膜と金微粒子の表面プラズモンの相互作用
に由来すると考えられる発色現象を利用するものであ
る。

【０００７】

【発明の実施の形態】ＤＮＡ、抗体、抗原、レセプタ、
リガンド、酵素などの生体分子で既に修飾された高分子
微小球または金微粒子を、基板の上に配置することを提
案する。基本原理としては、ポリスチレン微粒子に関し
ては最近発見された次の現象を用いる。１から５０ｍＭ
のカルボジイミド液に懸濁された粒径５ｎｍから１０
０μｍのポリスチレン微小球を前記金薄膜に加えると、
１層以下の微粒子が金薄膜表面に形成される。したがっ
て、ポリスチレン微小球のパターンニングを行うには、
基板の上に形成された金パターンの上に微粒子を選択的
に吸着させたり、または均一な金薄膜上にチオール分子
のパターンをリソグラフィーの技術により形成し、ポリ
スチレン微粒子を前記パターンの上に吸着させたり、も
しくは前記パターンの上による吸着を阻止することによ
り、ポリスチレンの微粒子を基板の上に配置することが
可能となる。チオール分子のパターニングに関しては、
光照射を利用した方法（ラングミューア10(1984年)第62
6頁から628頁(Langmuir 10(1984)pp626-628）)、または
ゴムのスタンプを利用した方法（サイエンス264(1994
年)第696頁から698頁(Science 264(1994)pp696-698)）
が知られている。パターン化されたポリスチレン微粒子
の一例を、図３の走査型電子顕微鏡写真で示す。一辺が
４００ｎｍの六角形の穴が規則正しく形成された金属メ
ッシュをポリスチレン基板の上に置き、金を厚さ２０ｎ
ｍ蒸着することにより、六角形の金パターンを形成し
た。１から５０ｍＭのカルボジイミド液に懸濁された粒
径１１０ｎｍの微粒子を金パターンに加えることによ
り、金パターンの上のみにポリスチレン微粒子が吸着
し、図３では白く見える。

【０００８】貴金属微粒子を吸着するにあたっては次の
方法を利用する。基板の上に金薄膜を蒸着により形成す
る。アミノ基を有するアルカンチオール分子の懸濁液を
金薄膜表面に添加すると、金薄膜表面にアルカンチオー
ル分子の単分子層が形成される。次にカルボキシル基を
有するアルカンチオール分子の懸濁液に１から５０ｍＭ
のカルボジイミド液を加え、前記金薄膜表面に添加する
ことにより、スルフヒドリル基で修飾された金薄膜を得
ることができる（ラングミューア13(1997年)第1865頁か
ら1868頁(Langmuir 13(1997)pp1865-1868)）。前記スル
フヒドリル基は貴金属微粒子を容易に吸着する。したが
って、貴金属微小球のパターニングを行うには、基板の
上に形成された金パターンを上記の方法によりスルフヒ
ドリル基で修飾後、貴金属微粒子を選択的に吸着させた
り、または均一な金薄膜上にチオール分子のパターンを
上記のリソグラフィーの技術により形成し、貴金属微小
球を前記パターンの上に吸着することによっても可能と
なる。金薄膜上に金コロイドを吸着したサンプルを図４
に示す。粒径５ミクロンのポリスチレン微粒子を、ポリ
スチレン基板の上に規則正しくならべ、上から金を蒸着
すると、一辺が２ミクロンの三角形の金パターンが形成
された。この金パターンを上記の方法によりスルフヒド
リル基で修飾してから、粒径１００ｎｍの金コロイド液
を加えると、金コロイドが金パターンの上に選択的に吸
着したことが分かる。

【０００９】また、生体分子の吸着を簡便に検出するた
めに、金属薄膜上に形成された金属微粒子の光学特性に
関して、最近発見された次の現象を用いる。基板の上に
固相化されたポリスチレン微粒子の上に、金を厚さ５ｎ
ｍから５００ｎｍ蒸着すると、ポリスチレン微粒子の上
に帽子状の金微粒子が形成される（特願平９―１４８９
３５）。金微粒子が形成されたことにより、基板が顕著
な発色を示す様になる（特願平９―１４８９４１）。こ
の発色現象は、白色光が基板に対して一定角度で照射さ
れ基板表面において反射される際に、一部の波長帯域の
光が吸収されることにより生じる半面、透過光に対して
は波長依存性がないため発色特性は観察されない。ま
た、反射スペクトルの吸収極大波長は、金微粒子表面上
の１００ｎｍ以下の領域内の屈折率に依存してシフトす
ることから、敏感なセンサとして用いることができる。

【００１０】この発色現象は、金薄膜と金微粒子の表面
プラズモンの相互作用に由来すると考えられる。通常の
真球状金微粒子を白色光で照射すると、微粒子中の自由
電子の集団的振動である表面プラズモンが励起される。
金薄膜における表面プラズモンとは異なる分散関係を有
し、伝播しないことから局所的表面プラズモンと呼ばれ
る。共鳴波長は、微粒子の粒径と形状に依存し（サーフ
ェイス・サイエンス156(1985年)第678頁から700頁 (Sur
face Science 156(1985)pp 678-700)）、さらに金微粒
子を金薄膜の近傍に形成すると、薄膜の表面プラズモン
と微粒子の局所的表面プラズモンが相互作用を及ぼすこ
ととなり、金微粒子と金薄膜の複合体として新たな吸収
特性を有することになる。平行化された白色光を一定角
度で照射し、反射光を測定することにより得られた反射
スペクトルは紫外、可視光、赤外波長の範囲において顕
著な吸収ピークを有し、前記吸収ピークの波長は、基板
上の金属の種類と厚さ、ポリスチレン微小球の粒径と吸
着密度、ポリスチレン微小球の上に蒸着される金属の種
類と厚さに顕著に依存する。例えば、粒径が５５，１１
０，１５２，２０９ｎｍのポリスチレン微粒子に対し
て、金を厚さ２０ｎｍ蒸着すると、図５に示す反射スペ
クトルを有する試料が得られる。

【００１１】孤立した微粒子の吸収スペクトルが、界面
から粒径の数分の一以内の領域における誘電率に依存す
ることは公知である。さて本特許においては金微粒子が
金薄膜上に固相化されていて、金微粒子の局所的表面プ
ラズモンと金薄膜の表面プラズモンが相互作用すること
から、微粒子と薄膜の間に入射光に比べて数桁強力な電
場が存在する。増大電場中において誘電率が変化するこ
とにより、吸収スペクトルが大きく変化する。一例とし
て、空気中におけるスペクトルと水中におけるスペクト
ルを図６に示す。粒径２０９ｎｍのポリスチレン微小球
に、厚さ２０ｎｍに金を蒸着した試料において、空気と
は異なる誘電率を有する水で表面領域を置換することに
より、吸収極大値が波長８００ｎｍから８７０ｎｍに移
動するのが分かる。ちなみに、スペクトルの変化は迅速
および可逆的であり、表面から数ｎｍから数１００ｎｍ
における領域における誘電率の変化に依存する。

【００１２】したがって、基板の表面上を複数の領域に
分割し、それぞれの領域に異なった抗体、抗原、一本鎖
ＤＮＡ、レセプタ、リガンドなどの生体分子を吸着させ
ると、結合が生じた領域においてのみある特定波長にお
ける反射率が変化するため、蛍光色素を用いることなく
吸着を検出することが可能になる。

【００１３】実施例１ 本発明の生化学センサの一実施例を図１に示す。基板１
が複数の領域に分割されており、それぞれの領域では異
なる生体分子で修飾されているポリスチレン微粒子が一
層吸着されている。例えば領域２に吸着しているポリス
チレン微粒子３は抗体４で修飾されており、領域５に吸
着しているポリスチレン微粒子６は抗体７で修飾されて
いる。

【００１４】被検体を検出するには、サンプル中に存在
する被検体を予め蛍光色素で修飾しておく。サンプルを
基板１に加えると抗体４に対して特異的結合能を有する
被検体である蛋白質８がポリスチレン微粒子３に吸着
し、蛍光色素９が領域２に結合する。もしくは、抗体７
に対して特異的結合能を有する被検体である抗原１０
が、前記抗体７との結合によりポリスチレン微粒子６に
結合した際、蛍光色素１１により修飾されてかつ前記抗
原に対する結合能を有する二次抗体１２を加えることに
より、蛍光色素１１が領域５に結合する。

【００１５】被検体の結合終了後、基板１を光源１３か
らの励起光１４を光学系１５により照射する。この照射
により、前記蛍光色素９もしくは前記蛍光色素１１が励
起され、蛍光信号を発するから、これを光学系１６によ
り集光し、カメラ１７でモニタする。蛍光の波長、もし
くは蛍光を発する領域を判別することにより、前記サン
プル中の被検体の存在を判別できる。

【００１６】基板１への微粒子の吸着の方法の一例を図
７に示す。表面に金薄膜が蒸着により形成されている基
板１を用意する（ａ）。次にこの基板１の上に複数の仕
切りが形成されたテンプレート４０を置く（ｂ）。次い
で、それぞれの仕切りの中に、濃度１から１００ｍＭの
カルボジイミド液に懸濁されたポリスチレン微粒子を流
し込む（ｃ）。このとき、テンプレート４０の基板１と
接する面の隙間から懸濁液が流出する様子を図7（ｃ）
の右側に示す。かくして、領域ごとに異なるポリスチレ
ン微粒子を一層吸着した基板を形成することができる
（ｄ）。

【００１７】実施例２ 本発明の他の実施例を示す。ポリスチレン微粒子をフォ
トリソグラフィーによりパターニングする方法の原理を
図８で示す。基板５０の表面に形成されている金薄膜５
１に、アルカンチオール分子の溶液を加えることによ
り、前記金薄膜５１の表面にアルカンチオール分子５２
が自己組織化してアルカンチオール分子の単層膜５３が
形成される様子を図８（ａ）で示す。アルカンチオール
分子の単層膜５３は一部を拡大して示すように、末端部
位Ｙ５５を持つアルキル鎖Ｘ５４が並列したものとなる
が、金薄膜の表面特性は、アルカンチオール分子５２の
アルキル鎖Ｘ５４の長さ、および末端部位Ｙ５５の電
荷、親疎水性により大きく影響を受ける。

【００１８】自己組織化したアルカンチオールは紫外線
の照射により、金表面から剥離することが知られてい
る。そこで、図８（ｂ）に示す様に、アルカンチオール
分子の単層膜５３を部分的に紫外線５６で照射すること
により、単層膜５３を除去して、金薄膜５１を部分的に
露出できる。次に図８（ｃ）に示す様に、濃度１から５
０ｍＭのカルボジイミド液に懸濁されたポリスチレン微
粒子５７を金基板に加えることにより、図８（ｄ）に示
される様に金薄膜が露出された領域のみに、ポリスチレ
ン微粒子の単層５８が形成される。

【００１９】さて、上記の吸着原理に基づくポリスチレ
ン微粒子のパターニング方法を図９に示す。金薄膜６０
が表面に形成されている基板５９を用意する。次いで、
金薄膜６０の表面へのポリスチレン微粒子の吸着を阻止
するため、前記金薄膜６０表面をアルカンチオール分子
６１で修飾する（ａ）。次に、基板６０の特定領域のみ
においてポリスチレン微粒子を吸着するために、光源６
２から照射される紫外線６３を光学系６４、マスク６５
および光学系６６を介して表面をアルカンチオール分子
で修飾された基板５９の表面に照射する。紫外線照射さ
れた領域６７からはアルカンチオール分子が剥離するた
め、金薄膜の表面が露出され、カルボジイミド溶液に懸
濁されたポリスチレン微粒子６８がマスク６５のパター
ン状に吸着する（ｂ）。また、次の段階においては別な
マスク６９を用いて照射することにより、別な領域７０
において異なるポリスチレン微粒子７１を吸着する
（ｃ）。この手順を繰り返し基板６０の表面のすべてに
所定のポリスチレン微粒子を吸着した基板を形成でき
る。

【００２０】実施例３ 本発明の他の実施例を示す。 本発明の他の実施例を図
１０により説明する。平坦なシリコン基板８０の上に、
まず蒸着により厚さ５ｎｍから１０００ｎｍの金薄膜８
１を形成した。金薄膜の表面を親水性にするために、チ
オグリコール酸ナトリウムの様にカルボキシル基、また
は２―アミノエタンチオールの様にアミノ基を有するア
ルカンチオール溶液（濃度０．０１ｍＭから１Ｍ）で金
薄膜８１を１分以上処理して、アルカンチオール分子層
で化学修飾した。次に、濃度１から１Ｍのカルボジイミ
ド溶液に懸濁された粒径５ｎｍから１００μｍのポリス
チレン微小球８２を表面に添加することにより、金薄膜
表面にポリスチレン微粒子の層を一層形成した（ａ）。
次に、吸着させたポリスチレン微粒子に金を厚さ５ｎｍ
から１００ｎｍ蒸着して金微粒子８３を形成した
（ｂ）。金微粒子８３が表面に形成されたシリコン基板
８０は表面プラズモンに由来する現象のため、顕著な発
色特性を示す。金微粒子８３の表面における屈折率が変
化すると、吸収スペクトルはシフトとする。前記の屈折
率変化を生じさせるために、次の方法により金微粒子８
３の表面近傍に任意の抗原を吸着させる。

【００２１】まず金微粒子８３の表面を親水性にするた
めに、再びチオグリコール酸ナトリウムの様にカルボキ
シル基、または２―アミノエタンチオールの様にアミノ
基を有するアルカンチオール溶液（濃度０．０１ｍＭか
ら１Ｍ）で金微粒子８３を１分処理して、チオール分子
層で化学修飾した。次に抗体８４で修飾されたポリスチ
レン微粒子８５を１から５０ｍＭのカルボジイミド溶液
に懸濁し加えることにより、ポリスチレン微粒子８５を
金微粒子８３の表面に吸着した（ｃ）。この吸着により
金微粒子８３の吸収スペクトルはシフトする。さらに抗
体８４に抗原８６が結合すると吸収スペクトルがよりシ
フトするため、後者のシフトにより、抗体８４と抗原８
６の結合反応を検出することができる。

【００２２】本実施例においても、実施例１または実施
例２のパターニング方法を利用することにより、シリコ
ン基板８０の上に、異なる抗体で修飾されたポリスチレ
ン微粒子を領域ごとに吸着することができ、図１の方法
に準じて、シリコン基板８０全体を白色光で照射する。
各領域から正反射する光のスペクトルを測定することに
より、領域ごとに抗原と抗体の吸着を判別することがで
きる。

【００２３】実施例４ 本発明の他の実施例を示す。フレーム９０に保持された
ポリエチレンシート９１の上に金薄膜９２を形成する。
前記ポリエチレンシート９１の異なる領域に異なるＤＮ
Ａで修飾されたポリスチレン微粒子を結合させるために
次の方法を利用する。図１１（ａ）に示す様に、強磁性
微粒子９３を光ピンセット９４で捕獲し、ポリエチレン
シート９１の下に移動する。次に、ＤＮＡで修飾された
常磁性ポリスチレン微粒子９５をポリエチレンシート９
１の上から加えると、強磁性微粒子９３に引かれ集ま
る。１から５０ｍＭのカルボジイミド溶液を加えること
により、常磁性ポリスチレン微粒子９５は金薄膜９２の
表面に吸着する（ｂ）。次に、強磁性微粒子９３を光ピ
ンセットにより異なる領域に移動させ、別なＤＮＡで修
飾された常磁性ポリスチレン微粒子９６を加えることに
より前記強磁性ポリスチレン微粒子９４の周辺に集ま
る。再び１から５０ｍＭのカルボジイミド溶液を加える
ことにより、前記常磁性ポリスチレン微粒子９６をポリ
エチレンシート９１の別の領域における金薄膜に吸着す
ることができる（ｃ）。

【００２４】この実施例では、磁性粒子毎に常磁性ポリ
スチレン微粒子を修飾するＤＮＡを独立に制御できるか
ら、狭い領域に多くの被検体対応の修飾領域を形成する
のに有利である。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、被検体の有無を多数、同
時に高感度で検出できる簡便なセンサおよび検出装置を
提供できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】アレー化された微粒子表面における生化学反応
を検出する方法を示す図。

【図２】ＤＮＡチップにおける検出方法を示す図。

【図３】六角形状の金パターンの上に結合されたポリス
チレン微粒子を示す図。

【図４】三角形状の金パターンの上に結合された金微粒
子を示す図。

【図５】金微粒子の反射スペクトル。

【図６】誘電率により吸収極大値が変化するスペクトル
を示す図。

【図７】テンプレートを利用して、ポリスチレン微粒子
をパターン化する方法を示す図。

【図８】フォトリソグラフィーによるパターニング原理
を示す図。

【図９】基板の上に微粒子をパターニングする手順を示
す図。

【図１０】金微粒子の近傍に結合された微粒子を示す
図。

【図１１】光ピンセットで操作された強磁性微粒子によ
り、修飾された微粒子をパターニングする方法を示す
図。

【符号の説明】

１：基板、２：領域、３：ポリスチレン微粒子、４：抗
体、５：領域、６：ポリスチレン微粒子、７：抗体、
８：蛋白質、９：蛍光色素、１０：抗原、１１：蛍光色
素、１２：二次抗体、１３：光源、１４：励起光、１
５：光学系、１６：光学系、１７：カメラ、３０：基
板、３１：領域、３２：ＤＮＡ、３３：領域、３４：Ｄ
ＮＡ、３５：ＤＮＡ断片、３６：共焦点顕微鏡、３７：
蛍光色素、３８：蛍光信号、４０：テンプレート、５
０：基板、５１：金薄膜、５２：アルカンチオール分
子、５３：単層膜、５４：アルキル鎖、５５：末端部
位、５６：紫外線、５７：ポリスチレン微粒子、５８：
単層、５９：基板、６０：金薄膜、６１：アルカンチオ
ール分子、６２：紫外線の光源、６３：紫外線、６４：
光学系、６５：マスク、６６：光学系、６７：領域、６
８：ポリスチレン微粒子、６９：マスク、７０：領域、
７１：ポリスチレン微粒子、８０：シリコン基板、８
１：金薄膜、８２：ポリスチレン微粒子、８３：金微粒
子、８４：抗体、８５：ポリスチレン微粒子、８６：抗
原、９０：フレーム、９１：ポリエチレンシート、９
２：強磁性微粒子、９３：光ピンセット、９４：常磁性
ポリスチレン微粒子、９５：強磁性微粒子、９６：常磁
性ポリスチレン微粒子。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒径５ｎｍから１００μｍの高分子の微粒
   子が平坦な基板上の区分された領域に固相化され、前記
   高分子の微粒子の基板表面と離れた側にある表面に施さ
   れた自由電子金属薄膜が抗体、抗原、一本鎖ＤＮＡ、レ
   セプタ、リガンド、及び酵素の少なくとも１つを含む試
   薬で修飾されていることを特徴とする生化学センサ。
2. 【請求項２】前記高分子の微粒子が基板表面に施された
   金、銀、銅、白金、アルミなどの金属薄膜を介して基板
   上に固相化された請求項１記載の生化学センサ。
3. 【請求項３】 前記自由電子金属薄膜は、少なくとも金、
   銀、銅、白金、アルミのいずれか１つであることを特徴
   とする請求項１または２記載の生化学センサ。
4. 【請求項４】平行化白色光を照射する光学系、 前記平行化白色光を所定の角度で照射される生化学セン
   サ、 該生化学センサから反射される光を検出する光学系およ
   び検出された光のスペクトルを測定する計測手段よりな
   り、 前記生化学センサにおいて粒径５ｎｍから１００μｍの
   高分子の微粒子が平坦な基板上の区分された領域に固相
   化され、前記高分子の微粒子の基板表面と離れた側にあ
   る表面に施された少なくとも金、銀、銅、白金のいずれ
   か１つのの自由電子金属の薄膜が抗体、抗原、一本鎖Ｄ
   ＮＡ、レセプタ、リガンド、および酵素の少なくとも一
   つを含む試薬で修飾されたものであることを特徴とする
   生化学検出装置。
5. 【請求項５】平行化単色光を照射する光学系、 前記平行化単色光を所定の角度で照射される生化学セン
   サ、 該生化学センサから反射される光を検出する光学系およ
   び検出された光の強度を測定する計測手段よりなり、 前記生化学センサにおいて粒径５ｎｍから１００μｍの
   高分子の微粒子が平坦な基板上の区分された領域に固相
   化され、前記高分子の微粒子の基板表面と離れた側にあ
   る表面に施された金、銀、銅、または白金の自由電子金
   属の薄膜が抗体、抗原、一本鎖ＤＮＡ、レセプタ、リガ
   ンド、および酵素の少なくとも一つを含む試薬で修飾さ
   れたものであることを特徴とする生化学検出装置。
6. 【請求項６】固相化されている高分子の微粒子の材質と
   粒径、自由電子金属薄膜の厚さが領域ごとに異なり、そ
   れぞれの前記領域によって修飾されている前記抗体、抗
   原、一本鎖ＤＮＡ、レセプタ、リガンド、および酵素の
   少なくとも一つを含む試薬が異なる請求項１ないし３の
   いずれかに記載の生化学センサ。