JP4640797B2 - 生体分子相互作用測定装置及び測定方法 - Google Patents

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Description

本発明は、生体分子の相互作用を測定する測定装置及び測定方法に係り、特に医療診断や食品検査等に好適な生体分子の分子相互作用を測定する測定装置および測定方法に関する。
生体分子の相互作用を測定する原理が、非特許文献1に記載されている。この文献では、表面プラズモン共鳴法(SPR法)を用いて免疫センサやガスセンサを作成するために、金属薄膜と誘電体の界面で、この界面を伝播する自由電子の疎密波を共鳴させている。
生体分子の相互作用を測定する他の例が、特許文献1に記載されている。この公報に記載の生体分子検出方法では、液体中における生体分子結合を簡便に測定するために、貴金属微粒子が固相された基板に特定角度から光を照射し、正反射光の吸収極大波長を求めている。
特開2002−365210号公報
永田和宏・半田宏著「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、頁13〜26、シュプリンガー・フェアラーク東京
上記非特許文献1に記載のSPR法を用いた測定方法では、金属薄膜を形成したプリズムを用いて共鳴入射角度を測定している。しかしながら、共鳴入射角度を高精度に測定するためには、照射光の光源や金属薄膜、光検出器の位置関係を精度良く保持および駆動しなければならない。またSPR法は、温度に敏感であり、測定試料や装置全体の温度を高精度に制御するか温度補正する必要がある。また、上記特許文献1に記載の生体分子検出方法では、かなりの程度簡便さが進められているものの、分光光度計等の高価な装置を必要とし、さらなる低廉化が求められている。
本発明は上記従来技術の不具合に鑑みなされたものであり、その目的は、生体分子の相互作用を、小型で簡易な構成の装置で測定することにある。本発明の他の目的は、低コストで生体分子の相互作用を測定することにある。
上記目的を達成する本発明の特徴は、表面に物質が吸着すると表面の光学的特性が変化するオプティカルバイオセンサと、このオプティカルバイオセンサの表面の光学特性を測定する光学測定装置とを有することにある。
そしてこの特徴において、光学測定装置は、予め定めた波長帯域の強度を測定可能であるのが好ましく、光学測定装置は、前記オプティカルバイオセンサからの出力光の中の極大吸収波長を含む第2の帯域と、この極大吸収波長よりも長波長側に位置する第1の帯域と、極大吸収波長よりも短波長側に位置する第3の帯域の強度を測定可能であることがさらに好ましい。
また、オプティカルバイオセンサに光を照射するための光源を設け、前記光学装置に特定の波長帯域光のみを通過させるフィルタを設けてもよく、光源は、特定の波長帯域の発光特性を有するものであってもよい。さらに、光源は複数個設けられており、各光源はそれぞれ異なる波長帯域で発光する特性を有しており、これら複数の光源の発光時間と前記光学測定装置の測定時間とを同期させる制御装置とを設けるようにしてもよい。
上記目的を達成する本発明の他の特徴は、貴金属微粒子に生体を固定し、この貴金属微粒子に光源から光を照射し、この照射光の貴金属微粒子からの反射光を光検出手段に導く生体分子相互作用測定方法において、前記光検出手段に入力される光における極大吸収波長を含む第2の帯域と、この第2の帯域よりも長波長側に位置する第1の波長帯域と、この第2の波長帯域よりも短波長側に位置する第3の波長帯域の光の強度を測定するものである。
そしてこの特徴において、光源から照射される光が白色光であり、前記第1の帯域が赤色域であり、前記第2の帯域が緑色域であり、前記第3の帯域が青色域であるのがよく、光源からの照射光を光ファイバでセンサウェル中のランニングバッファに浸漬した貴金属微粒子に導き、貴金属微粒子からの反射光を照射光に用いたものとは異なる光ファイバでフォトダイオードおよびフィルタを備えた光検出手段に導くようにしてもよい。
本発明によれば、金属微粒子を用いて吸収波長の反射光強度の変化を測定し、その計測波長中の特定波長に着目してその変化を測定したので、簡単な装置で分光光度計を用いたときと同様の計測が可能になる。また、測定装置を小型化し、コストを低減出来る。
以下、本発明に係る生体分子の相互作用を測定する装置の実施例を、図面を用いて説明する。図1に、生体分子結合量の測定装置100の一実施例を、模式図で示す。測定用試料3を収容する容器であるセンサウェル1は、生化学分析に用いるサンプルプレートと同様の容器である。このセンサウェル1の底面には、特許文献1である特開2000−55920号公報に記載のものと同様の貴金属微粒子センサ2が形成されている。この貴金属微粒子センサ2の表面には、測定目的に応じて、化学修飾されるか、抗原等のアナライト物質が固定されている。本実施例では測定試料3として、リン酸緩衝液などのランニングバッファ3を用いている。
センサウェル1には測定プローブ4が挿入されており、測定プローブ4の先端はランニングバッファ3の中まで挿入されている。測定プローブ4の内部には、照射用光ファイバ5と測定用光ファイバ6が保持されている。これら照射用光ファイバ5と測定用光ファイバ6とは、貴金属微粒子センサ2に対向して配置されている。
照射用光ファイバ5の一端は、ランニングバッファ3に漬けられており、照射用光ファイバ5の他端部は測定プローブ4外に延在してLEDホルダ7に接続されている。LEDホルダ7内には、発光回路8が駆動する白色LED9が搭載されている。発光回路8により駆動される白色光は、測定プローブ4を介して貴金属微粒子センサ2の表面に照射される。
測定用光ファイバ6も一端部が測定プローブ4から延在しており、その端部は光センサホルダ10に接続されている。光センサホルダ10の内部には、異なる波長フィルタを備えた複数個のフォトダイオード11a〜11cが保持されている。白色LED9で発光し、貴金属微粒子センサ2の表面で反射した光は、測定用光ファイバ6を介してこれらのフォトダイオード11a〜11に導かれる。フォトダイオード11a〜11cは、それぞれが備えるフィルタでフィルタリングされた波長帯域の光を受光し、受光強度に応じた電流を発生する。発生した電流は、アンプ回路12で電圧に変換されるとともに増幅される。そして、インターフェース回路13を経由して、データ処理装置14に入力される。
このように構成した本実施例の生体分子相互作用測定装置の動作を、以下に説明する。図2に、LEDホルダ7内に保持する白色LED9の波長特性を、図3に金属微粒子センサ2からの反射光の吸光度スペクトル特性を示す。白色LED9は、いわゆる青色LEDに黄色蛍光体を加えることにより構成できる。本実施例で用いる白色LED9は、波長帯域が約400〜800nmで発光する。この光を、粒子径約110nmの貴金属微粒子センサ2に照射すると、図3に示すように、波長550nm付近に吸収ピークを有する反射光の吸光度スペクトルが得られる。
そこで、光センサフォルダ10に収容するフォトダイオード11a〜11cに適用する波長フィルタを、図3に示す吸光度スペクトルに基づいて選定する。すなわち、図2に示した白色LED9のピーク波長に対応して、そのピーク波長よりも長波長域の第1のフィルタと、ピーク波長を含む波長域の第2のフィルタと、ピーク波長よりも短波長側の第3のフィルタを選定する。具体的には、図4に示す分光感度特性401〜403を有するフィルタであり、第1のフィルタは620nm付近に、第2のフィルタは550nm付近に、第3のフィルタは460nm付近に設定する。これらの波長帯域は、光の3原色である赤、緑および青の波長とほぼ同じであるので、一般に用いられるRGBカラーフィルタを、利用する。
データ処理装置14は、フォトダイオード11a〜11cが受光した反射光の強度から、(式1)により、各波長帯域での吸光度A(λ)を算出する。
A(λ)=−log[L(λ)/{(R(λ)−d(λ))} ……(式1)
ここで、λは波長帯域であり、第1〜第3のフィルタの波長帯域であるλ1、λ2、λ3である。R(λ)は、反射量が既知の標準反射板を用いて予め測定した測定強度、d(λ)は、予め測定した光量無しでの測定強度、L(λ)はフォトダイオード11a〜11cを用いて測定した測定強度である。
(式1)から算出した吸光度A(λ)の変化量をΔA(λ)として、この変化量ΔA(λ)の時間変化を、図5のグラフに示す。初期状態では、センサウェル1内にランニングバッファ3が十分な量だけ保持されている。この初期状態では、第3のフィルタを装着したフォトダイオード11cの吸光度変量501と、第1のフィルタを装着したフォトダイオード11aの吸光度変化量502は、ほとんど変動しない。
所定時間経過した時間503において、図示しない抗原をランニングバッファ3中に投入する。貴金属微粒子センサ2の表面に抗原が吸着し始める。それに伴い、貴金属微粒子センサ2の吸収ピーク波長が長波長側に移動する。このとき、短波長側のフォトダイオード11cの吸光度変化量502が減少し、長波長側のフォトダイオード11aの吸光度変化量501が増加する。この増減量は抗原物質の吸着量に依存する。
抗原を含む溶液をランニングバッファ3で置換した後、時間504において抗原物質と結合する抗体物質をランニングバッファ3中に添加する。貴金属微粒子センサ2表面上に吸着した抗原物質に、抗体物質が結合する。このとき、抗原物質と抗体物質との結合量に応じて、短波長側のフォトダイオード11cの吸光度変化量502が減少し、長波長側のフォトダイオード11aの吸光度変化量501が増加する。
ところで、図5の期間505では、生体分子の結合に無関係な変動が生じている。これは、溶液の混合または置換、光源の変動、その他の要因による変動である。この期間505では、吸光ピーク波長がほとんど変動していない。また、全体の吸光度が変動している。短波長側のフォトダイオード11cの吸光度変化量502と、長波長側のフォトダイオード11aの吸光度変化量501は、ともに減少またはともに増加する。
このようなノイズ成分を除去するため、短波長側のフォトダイオード11cの吸光度変化量502と、長波長側のフォトダイオード11aの吸光度変化量501との差を求める。その際、ピーク波長変化量に対する短波長側および長波長側のダイオード11c、11aの吸光度変化量502、501は、ピーク波長の吸光度の大きさにより変化するから、ピーク波長であるフォトダイオード11bの吸光度を用いて、これを規準化する。この結果、結合シグナルUは、例えば(式2)のように求められる。
U=ΔA(λ3)/(A(λ2)−A(λ3))
−ΔA(λ1)/(A(λ2)−A(λ1)) ……(式2)
算出した結合シグナルUを、図5中にデータ506で示す。期間505で生じていたノイズが打ち消され、良好なシグナルが得られる。
本実施例によれば、貴金属微粒子センサ2表面での生体分子の結合量を、波長の異なるフィルタを有する複数の検出器を用いて測定するので、ピーク吸光度の大きさや外乱による変動の影響を排除することが可能になる。なお、貴金属微粒子センサ2の品質が均一で、ピーク吸光度をほぼ一定とすることができれば、ピーク吸光度の大きさの影響を無視でき、結合シグナルUは、(式3)から求められる。
U=ΔA(λ3)−KΔA(λ1) ……(式3)
ここで、Kはピーク吸光度の変動量ΔA(λ)を規準化する為の定数である。
ピーク吸光度がほぼ一定であるから、フォトダイオード11bは不要である。したがって、生体分子相互作用測定装置をさらに簡略化および小型化できる。また、溶液の注入方法を適切に選定すれば、結合シグナル以外のノイズも抑制可能である。その場合、2個の波長帯域の差を求めて補正する必要が無くなり、短波長側または長波長側のフォトダイオード11a、11cのいずれか一方を用いて、結合シグナルUを求めることができる。
なお、本実施例では特許文献1に記載の方法で作成した貴金属微粒子を用いて生体分子相互作用を測定するためのセンサとしているが、センサはこれに限るものではない。たとえば、金コロイドや基板上にパターニングされた微小スリット加工された金属膜などで形成されたバイオセンサは、可視光波長よりも微小な凹凸形状を持つ金属体を利用しており、貴金属微粒子同様の光学的性質を有している。したがって、これらのバイオセンサも生体分子相互作用の検出用センサに用いることができる。
本発明に係る生体分子相互作用測定装置の他の実施例の模式図を、図6に示す。本実施例の生体分子相互作用測定装置101は、上記実施例とは以下の点で相違する。LEDホルダ7内に、発光波長特性の異なる3個のLEDを収容している。すなわち、図7に示す発光波長特性701を有する青色LED601a、発光波長特性702を有する緑色LED601b、発光波長特性703を有する赤色LED601cが、LEDホルダ7内に保持されている。
これらのLED601a〜601cの波長特性は、上記実施例に示したフォトダイオード11a〜11cの波長フィルタの特性にほぼ一致する。青色LED601aおよび緑色LED601b、赤色LED601cは、発光回路602および同期回路603によって個別に制御される。そしてこれら3個のLED601a〜601cは、一定間隔で順番に発光する。
光センサホルダ10内には、青色LED601aおよび緑色LED601b、赤色LED601cの発光波長帯域をカバーする広帯域なフォトダイオード604が搭載されている。フォトダイオード604の受光シグナルは、アンプ回路12で増幅されて同期インターフェース回路605に入力される。同期インターフェース回路605では、同期回路603から送信された同期信号に基づいて、フォトダイオード604が検出した測定データを、3つの波長帯域に振り分けてデータ処理装置14に送信する。3個のLED601a〜601cの発光間隔を十分に短くすれば、図1に示した実施例とほぼ同じ3個の波長帯域の受光強度データが得られる。
フォトダイオード604の感度は、受光面積に依存する。本実施例では、フォトダイオード604が有する受光面積を、どの波長帯域の測定においてもフルに活用できるので、感度が向上する。本実施例においても、データ処理装置14が処理するデータ処理方法は同じであるが、測定対象および測定内容に応じて、適宜LEDの個数を増減できる。LEDを減らした場合には、装置構成が簡略化する。
本発明に係る生体分子相互作用測定装置のさらに他の実施例を、図8に模式図で示す。本実施例の生体分子相互作用測定装置102は、上記各実施例とは、貴金属微粒子からの反射光を測定する手段が相違している。上記各実施例では、フォトダイオードで反射光の強度等を検出していたが、本実施例ではカラーCCDカメラ801を検出手段に用いている。カラーCCDカメラ801では、光の3原色(RGB)の各波長の強度を測定するCCD素子を、二次元アレイ状に配置している。個々のCCD素子が貴金属微粒子からの反射光を測定できるので、センサウェルの代わりに、センサアレイプレート802を使用する。
センサアレイプレート802では、平面上に貴金属微粒子センサスポット803が二次元配置されている。
センサアレイプレート802上には、貴金属微粒子センサスポット803が多点形成されている。すなわち、各センサスポット803がセンサウェルの働きをする。測定の事前準備として、ピペットやスポッティングマシン等を用いて、各貴金属微粒子センサスポット803に、それぞれ異なる種類の結合性を確認する化学物質や生体高分子を固定化する。その後、固定化された化学物質や生体高分子との結合性を調べる生体分子試料を、センサアレイプレート802の上面に塗布する。あるいは、図示しない試料溶液にセンサアレイプレート802を侵漬する。
センサアレイプレート802の状態を、カラーCCDカメラ801を用いて測定する。センサアレイプレート802上の全貴金属微粒子センサスポット803のイメージを撮像し、インターフェースボード804を介して、データ処理装置805に送信する。データ処理装置805は、各貴金属微粒子センサスポット803のRGB値を画像処理する。これにより、図4や図7に示した各波長帯域における受光強度と同様の信号を、センサアレイプレート802上のすべての貴金属微粒子センサスポット803について得る。
本実施例によれば、アレイプレートやマイクロ流路中にマトリクス状に形成した貴金属微粒子センサを用いているので、効率よく同時多点計測することができる。なお本実施例では、カラーCCDカメラがセンサアレイプレート上のすべての貴金属微粒子センサスポットを測定しているが、測定回数を増して、分割処理してもよいことはいうまでもない。
本発明に係る生体分子相互作用測定装置の一実施例の模式図である。 図1に示した生体分子相互作用測定装置が有する白色LEDの波長特性を説明する図である。 図1に示した生体分子相互作用測定装置に用いる貴金属微粒子センサの吸収波長特性を説明する図である。 図1に示した生体分子相互作用測定装置が有するフォトセンサの感度特性を説明する図である。 図1に示した生体分子相互作用測定装置における測定例を示すグラフである。 本発明に係る生体分子相互作用測定装置の他の実施例の模式図である。 図1に示した生体分子相互作用測定装置が有する各色のLEDの波長特性を説明する図である。 本発明に係る生体分子相互作用測定装置のさらに他の実施例の模式図である。
符号の説明
1…センサウェル、2…貴金属微粒子センサ(オプティカルバイオセンサ)、3…ランニングバッファ、4…測定プローブ、5…照射用光ファイバ、6…測定用光ファイバ、7…LEDホルダ、8…発光回路、9…白色LED、10…光センサホルダ、11a〜11c…フォトダイオード、12…アンプ回路、13…インターフェース回路、14…データ処理装置、401〜502…フォトダイオードの分光感度特性、503、504…抗原添加時刻、505…ノイズ発生時刻、506…結合シグナル算出値U、601a…青色LED、601b…緑色LED、601c…赤色LED、602…発光回路、603…同期回路、604…フォトダイオード、605…同期インターフェース回路、701…青色LEDの発光波長特性、702…緑色LEDの発光波長特性、703…赤色LEDの発光波長特性、801…カラーCCDカメラ、802…センサアレイプレート、803…貴金属微粒子センサスポット、804…インターフェースボード、805…データ処理装置。

Claims (9)

  1. 表面に物質が吸着すると表面の光学的特性が変化するオプティカルバイオセンサと、
    前記オプティカルバイオセンサからの出力光の中の極大吸収波長を含む第2の帯域の光の強度を検出する第2の光検出手段と、
    前記オプティカルバイオセンサからの出力光の中の前記極大吸収波長よりも長波長側に位置する第1の帯域の光の強度を検出する第1の光検出手段と、
    前記オプティカルバイオセンサからの出力光の中の前記極大吸収波長よりも短波長側に位置する第3の帯域の光の強度を検出する第3の光検出手段と、
    前記第1の光検出手段が検出した第1の帯域の光の強度、前記第2の光検出手段が検出した第2の帯域の光の強度、及び前記第3の光検出手段が検出した第3の帯域の光の強度から、それぞれの帯域における吸光度を算出し、算出した吸光度の時間変化量を算出するデータ処理手段と、
    を備え、前記算出した吸光度の時間変化量に基づいて、生体分子の相互作用を測定することを特徴とする生体分子相互作用測定装置。
  2. 前記オプティカルバイオセンサに光を照射するための光源を設け、前記第1の光検出手段と、前記第2の光検出手段と、前記第3の光検出手段とは、それぞれ特定の波長帯域光のみを通過させるフィルタを設けたことを特徴とする請求項1に記載の生体分子相互作用測定装置。
  3. 前記光源は、特定の波長帯域の発光特性を有することを特徴とする請求項に記載の生体分子相互作用測定装置。
  4. 前記データ処理手段は、波長をλ、測定した光強度をL(λ)、標準測定強度をR(λ)、光量なしで測定した光強度をd(λ)とすると、次式で求められる吸光度A(λ)を前記帯域毎に算出し、
    A(λ)=−log[L(λ)/{(R(λ)−d(λ))}]、
    前記第1の帯域の吸光度をA(λ1)、前記第2の帯域の吸光度をA(λ2)、前記第3の帯域の吸光度をA(λ3)、前記第1帯域の吸光度の変化量をΔA(λ1)、前記第3帯域の吸光度の変化量をΔA(λ3)としたとき、次式で求められる結合シグナルUを算出し、
    U=ΔA(λ3)/(A(λ2)−A(λ3))−ΔA(λ1)/(A(λ2)−A(λ1))、
    算出した結合シグナルに基づいて、生体分子の相互作用を測定することを特徴とする請求項1に記載の生体分子相互作用測定装置。
  5. 表面に物質が吸着すると表面の光学的特性が変化するオプティカルバイオセンサと、
    発光波長帯域が互いに異なる複数の波長帯域の光を、前記オプティカルバイオセンサに照射する複数の光源と、
    前記オプティカルバイオセンサからの出力光の強度を検出する光検出手段と、
    前記複数の光源を一定間隔で順番に発光させる同期回路と、
    前記同期回路からの同期信号に従って、前記光検出手段が検出した光の強度を前記複数の波長帯域のそれぞれに分ける同期インターフェース回路と、
    前記同期インターフェース回路が分けた、それぞれの波長帯域の光の強度から、それぞれの帯域における吸光度を算出し、算出した吸光度の時間変化量を算出するデータ処理手段と、
    を備え、前記算出した吸光度の時間変化量に基づいて、生体分子の相互作用を測定する生体分子相互作用測定装置。
  6. 貴金属微粒子に生体を固定し、この貴金属微粒子に光源から光を照射し、この照射光の貴金属微粒子からの反射光を複数の光検出手段に導く生体分子相互作用測定方法において、
    前記光検出手段に入力される光における極大吸収波長を含む第2の帯域の光の強度と、この第2の帯域よりも長波長側に位置する第1の波長帯域の光の強度と、この第2の波長帯域よりも短波長側に位置する第3の波長帯域の光の強度とを測定し、
    測定した光の強度から、それぞれの帯域における吸光度を算出し、算出した吸光度の時間変化量を算出し、
    算出した吸光度の時間変化量に基づいて、生体分子の相互作用を測定することを特徴とする生体分子相互作用測定方法。
  7. 前記光源から照射される光が白色光であり、前記第1の帯域が赤色域であり、前記第2の帯域が緑色域であり、前記第3の帯域が青色域であることを特徴とする請求項に記載の生体分子相互作用測定方法。
  8. 前記光源からの照射光を光ファイバでセンサウェル中のランニングバッファに浸漬した貴金属微粒子に導き、貴金属微粒子からの反射光を照射光に用いたものとは異なる光ファイバで、フォトダイオードおよびフィルタを備えた光検出手段に導くことを特徴とする請求項に記載の生体分子作用測定方法。
  9. 波長をλ、測定した光強度をL(λ)、標準測定強度をR(λ)、光量なしで測定した光強度をd(λ)とすると、次式で求められる吸光度A(λ)を前記波長帯域毎に算出し、
    A(λ)=−log[L(λ)/{(R(λ)−d(λ))}]、
    第1の波長帯域の吸光度をA(λ1)、第2の波長帯域の吸光度をA(λ2)、第3の波長帯域の吸光度をA(λ3)、第1の波長帯域の吸光度の変化量をΔA(λ1)、第3の波長帯域の吸光度の変化量をΔA(λ3)としたとき、次式で求められる結合シグナルUを算出し、
    U=ΔA(λ3)/(A(λ2)−A(λ3))−ΔA(λ1)/(A(λ2)−A(λ1))、
    算出した結合シグナルに基づいて、生体分子の相互作用を測定することを特徴とする請求項6に記載の生体分子相互作用測定方法。
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