PL222314B1 - Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest bioczujnik elektrochemiczny zawierający przetwornik w postaci złotej elektrody oraz immobilizowaną na powierzchni elektrody sondę DNA. Sonda jednoniciowego DNA zawiera od 15 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji i zmodyfikowana jest metalokarboboranem: kompleksem karboboran - Fe (III) (3,3'-Fe-1,2-C2B10H11 -1',2'-C2B10H11). Kolejnym przedmiotem rozwiązania jest zastosowanie bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze oraz rozróżniania położenia komplementarnych sekwencji oligonukleotydów w produktach PCR.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 222314 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 400337 (51) I_nt Cl

G01N 27/327 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 10.08.2012 (54)

Bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika

(43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.02.2014 BUP 04/14	(73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT ROZRODU ZWIERZĄT I BADAŃ ŻYWNOŚCI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Olsztyn, PL INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL INSTYTUT BIOLOGII MEDYCZNEJ POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Łódź, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.07.2016 WUP 07/16	(72) Twórca(y) wynalazku: JERZY RADECKI, Olsztyn, PL HANNA RADECKA, Olsztyn, PL IWONA GRABOWSKA, Olsztyn, PL AGNIESZKA SIRKO, Warszawa, PL ANNA GÓRA-SOCHACKA, Warszawa, PL ZBIGNIEW LEŚNIKOWSKI, Łódź, PL AGNIESZKA OLEJNICZAK, Łódź, PL
	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zbigniew Kamiński

PL 222 314 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest bioczujnik elektrochemiczny oraz zastosowanie bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze.

W ostatnich latach obserwuje się wzrastające zainteresowanie czujnikami elektrochemicznymi przeznaczonymi do wykrywania DNA (bioczujniki/genoczujniki). Bioczujniki charakteryzują się takimi pożądanymi cechami jak: krótki czas wykonania analizy, miniaturyzacja, prostota i stosunkowo niski koszt wytwarzania [1,2].

W większości opisanych, opracowanych do tej pory bioczujników detekcja opiera się na: (i) p omiarze zmian elektroaktywności niemodyfikowanych zasad nukleinowych takich jak guanina, adenina i cytozyna wywołanych reakcją hybrydyzacji [3], lub (ii) pomiarze zmian elektrochemicznych parametrów granicy faz elektroda/roztwór wywołanych reakcją hybrydyzacji (czujniki typu jono-kanałowego) [4].

W przypadku bioczujników, których podstawą działania jest elektroaktywność niemodyfikowanych zasad nukleinowych (głównie adeniny i guaniny) na powierzchni elektrod węglowych, najpoważniejszym problemem jest uzyskanie odpowiednio silnego sygnału analitycznego. Unieruchamianie ssDNA bezpośrednio na powierzchni elektrod węglowych jest niewystarczające. W celu zwiększenia efektywności procesu utlenienia guaniny, adeniny czy też cytozyny stosuje się modyfikacje powierzchni elektrod węglowych np. nanorurkami węglowymi [5], czy też nanorurkami węglowymi zmodyfikowanymi kompleksem ftalocyjaniny z kobaltem [6, 7].

W związku z trudnościami związanymi z wykorzystaniem pomiaru zmian elektroaktywności zasad nukleinowych wynikających z wysokiego poziomu tła, zdecydowana większość genoczujników należy do grupy czujników jono-kanałowych. W wyniku procesu hybrydyzacji, zmienia się nie tylko stopień uporządkowania powierzchni elektrody, ale także zwiększa się jej ładunek ujemny. Zatem, następuje zwiększone elektrostatyczne odpychanie ujemnie naładowanego markera redoks obecnego w roztworze badanym, lub zwiększone elektrostatyczne przyciąganie w przypadku zastosowania markera redoks naładowanego dodatnio. Te zjawiska stanowią podstawę generowania sygnałów analitycznych czujników typu jono-kanałowego [8, 9]. Niekorzystną cechą tego typu czujników jest konieczność dodawania znaczników aktywnych elektrochemicznie do roztworów badanych.

Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest umiejscowienie znaczników aktywnych elektrochemicznie na powierzchni elektrod. W dotychczasowych doniesieniach opisano elektrochemiczne bioczujniki, w których zastosowano sondy oligonukleotydowe posiadające znacznik redoks-aktywny na jednym z końców sondy DNA, natomiast grupę - SH na końcu przeciwnym [10-14]. W ten sposób sonda zostaje unieruchomiona na powierzchni elektrody złotej poprzez tworzenie wiązania kowalencyjnego Au-S, co powoduje, że znacznik redoks-aktywny znajduje się w określonej odległości od elektrody, zależnej od długości łańcucha oligonukleotydowego sondy. W wyniku reakcji hybrydyzacji (spontanicznego łączenia się komplementarnych nici DNA, zgodnie z regułą parowania zasad nukleinowych Watsona-Cricka) powstaje podwójna helisa, która charakteryzuje się ściśle określoną strukturą, bardziej sztywną niż jednoniciowa sonda DNA umocowana do elektrody na jej powierzchni. Ta zmiana powoduje wzrost odległości znacznika redoks-aktywnego, kowalencyjnie umocowanego do sondy DNA od powierzchni elektrody. W konsekwencji, obserwuje się utrudnienie przebiegu reakcji utlenienia i redukcji znacznika redoks [10-14].

Do związków często stosowanych do modyfikacji sond DNA należą ferrocen [15-17] i błękit metylenowy [18-20]. Powyższe związki są często wykorzystywane do tego celu, ponieważ charakteryzują się wysoką odwracalnością procesów utleniania i redukcji oraz wielkościami potencjałów utleniania i redukcji odpowiednimi do przeprowadzania pomiarów z zastosowaniem elektrod złotych. Poza tym są one komercyjnie dostępne w formie umożliwiającej łatwe przyłączenie do chemicznie zsyntetyzowanych oligonukleotydów. Jednakże, jak pokazują badania, zastosowanie sond DNA modyfikowanych ferrocenem w złożonych mieszaninach, takich jak np. osocze krwi, skutkuje częściową utratą elektroaktywności centrów redoks-aktywnych [19, 21].

Przyczyną tego zjawiska, jest niespecyficzna adsorpcja białek obecnych w osoczu na powierzchni elektrody. Sprzyja temu zjawisku charakterystyczny dla ferrocenu dodatni potencjał. Sondy DNA zmodyfikowane błękitem metylenowym są mniej wrażliwe na obecność składników złożonych matryc [19, 21]. Jakkolwiek znaczniki w postaci grupy ferrocenylowej pozwalają na uzyskanie diagnostycznego sygnału, to jednak element detekcyjny bioczujnika oparty na tak znakowanej sondzie nie jest trwały. W trakcie przechowywania sondy w buforze następuje degradacja ferrocenu. Dodatkowo sondy te charakteryzują się spadkiem czułości w kolejnych powtórzeniach pomiarów elektrochemiczPL 222 314 B1 nych a także spadkiem wartości szczytowej prądu, w miarę upływu czasu (o 91% spada wartość prądu po 180 h przechowywania sondy w buforze) [19]. Genoczujniki elektrochemiczne były wielokrotnie przedmiotem zgłoszeń patentowych oraz patentów. W dokumencie patentowym US20100059391A1 ujawniono sposób modyfikacji elektrody poprzez zakotwiczenie sondy specyficznej dla biocząsteczki. Elektroda ta jest następnie poddawana działaniu biocząsteczki, która jest wychwytywana przez sondę tworząc kompleks. Następnie związana przez sondę biocząsteczka reaguje z elektroaktywnym znac znikiem posiadającym względem niej zdolność do wiązania. Biocząsteczka tworząc kompleks ze znacznikiem elektroaktywnym na powierzchni elektrody zmodyfikowanej, tworzy elektrodę roboczą. Elektroda robocza jest umieszczana w elektrolicie. Pomiar elektrochemiczny prowadzi się między elektrodą roboczą a elektrodą odniesienia. Zarejestrowany sygnał elektrochemiczny pochodzi od zakotwiczonego na powierzchni elektrody roboczej znacznika redoks-aktywnego i jest on wprost proporcjonalny do stężenia biocząsteczki.

Z kolei w zgłoszeniu patentowym US20040171043A1 przedstawiono nośnik do efektywnego umocowania sondy DNA, sposób oceny nośnika oraz sposób oznaczania kwasów nukleinowych.

W dokumencie patentowym US6391624B1 ujawniono ulepszoną sondę biologiczną o wysokiej czułości, która wykorzystuje modyfikowaną sondę ssDNA przyłączoną do elektrody zawierającą wiele (więcej niż jeden) znaczników redoks-aktywnych. Wykorzystanie większej liczby znaczników redoks-aktywnych zwiększa czułość sondy. Modyfikacja oligonukleotydów polega na przyłączeniu cząsteczki donora oraz akceptora elektronu, których obecność zmienia właściwości elektrochemiczne powstających hybryd. Wybrane grupy zmodyfikowanych oligonukleotydów są komplementarne do unikalnych charakterystycznych sekwencji analizowanych DNA lub RNA. Próbka zawierająca anality np.: diagnostyczny DNA czy produkt PCR (amplikon) poddawana jest działaniu sondy. Ich komplementarne fragmenty ulegają hybrydyzacji z sondą oligonukleotydową. W momencie przyłożenia napięcia, nastąpi przepływ prądu z niewielkim oporem przez wytworzone hybrydy. Pomiar natężenia prądu lub zmian natężenia prądu wskazuje na obecność lub brak poszukiwanego, diagnostycznego DNA lub RNA w analizowanym materiale.

W zgłoszeniu patentowym GB2280754A przedstawiono sposób oraz układ pomiarowy do wykrywania hybrydyzacji DNA, który może być również przydatny do wykrywania mutacji genetycznych. Wynalazek ten dostarcza informacji o sposobie wykrywania hybrydyzacji DNA bez zastosowania radioaktywnych izotopów i obejmuje następujące etapy: denaturację wzorca DNA, kontaktowanie wzorca z elektrodą do pomiaru elektrochemicznego, pomiar polarograficznego sygnału odniesienia ssDNA, kontaktowanie próbki analizowanej z sondą oligonukleotydową w warunkach zapewniających możliwość zajścia hybrydyzacji, usunięcie nadmiaru reagentów oraz odczytanie sygnału polarograficznego z elektrody i porównanie go z sygnałem odniesienia.

Wysokoczuła elektrochemiczna metoda detekcji DNA została również opisana w zgłoszeniu patentowym WO02063041A1. W metodzie tej wykorzystano mieszane interkalatory oraz zestaw odczynników do praktycznego oznaczania ssDNA z wykorzystaniem zjawiska hybrydyzacji.

W zgłoszeniu patentowym US2002010668A1 ujawniono sposób wykrywania kwasów nukleinowych (RNA, DNA) posiadających przynajmniej jedną wstępnie wybraną zasadę (adeninę, guaninę, 6-merkaptoguaninę, 8-okso-guaninę czy 8-osko-adeninę) obejmujący (a) reakcję kwasu nukleinowego z kompleksem metalu przejściowego zdolnego do utlenienia wstępnie wybranej zasady w reakcji typu redoks; (b) wykrywanie reakcji redoks; (c) określenie obecności lub braku obecności kwasu nukleinowego na podstawie wykrywanej reakcji redoks wybranej zasady. Sposób ten może być wykorzystany w wielu zastosowaniach, włączając sekwencjonowanie DNA, pomiary diagnostyczne, czy analizy.

Biorąc pod uwagę powyższe wady i zalety stosowanych do tej pory znaczników redoks, w przedmiotowym rozwiązaniu zastosowano sondę DNA zawierającą alternatywny typ znacznika redoks-aktywnego: metalokarboboran - kompleks karboboranu z Fe(III) [22-25]. Właściwości elektrochemiczne szeregu metalokarboboranów są znane już od wielu lat [26].

W odróżnieniu od wymienionych powyżej znaczników redoks-aktywnych, typu ferrocen czy błękit metylenowy przyłączonych na końcach oligonukleotydowych sond, kompleks karboboranu z Fe(III) został kowalencyjnie przyłączony do sondy jednoniciowego DNA zawierającej od 15 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji w sposób zapewniający jego położenie blisko powierzchni elektrody złotej (w odległości równej 10-40 wiązań kowalencyjnych). Utworzenie na powierzchni elektrody podwójnej helisy w wyniku hybrydyzacji komplementarnych oligonukleotydów zmienia grubość podwójnej warstwy na granicy faz powierzchnia elektrody/roztwór analizowany, a także zmienia się dostępność anionów obecnych w roztworze badanym do kompleksu karboboran-Fe(III). Zmiana tych parametrów

PL 222 314 B1 ma wpływ na reakcję utlenienia i redukcji centrum Fe(III). To stanowi podstawę generowania sygnału analitycznego [27-29].

W badaniach, do monitorowania reakcji hybrydyzacji przy pomocy opracowanego bioczujnika zastosowano metodę woltamperometrii fali prostokątnej Osteryounga. Przebadano czułość bioczujnika w stosunku do oligonukleotydów w pełni komplementarnych i w pełni niekomplementarnych do modyfikowanej sondy o długości 20 nukleotydów, czyli takiej samej jak długość sondy, oraz produktów reakcji PCR, o długości 180 par zasad, które zawierały sekwencje w pełni komplementarne do sondy na końcu 3', 5', w środku, oraz nie zawierające sekwencji komplementarnej do sondy. Otrzymane wyniki świadczą o wysokiej selektywności bioczujnika, oraz wysokiej czułości - rzędu fmoli. Opracowany bioczujnik nie wymaga znakowania analizowanych sekwencji ssDNA. Wymaga jedynie znakowania sondy DNA.

W literaturze patentowej brak jest doniesień odnośnie zastosowania elektrod modyfikowanych kompleksem karboboran-Fe(III). Niemniej, istnieją doniesienia patentowe traktujące o modyfikacjach sond karboboranami. I tak przykładowo, w zgłoszeniu japońskim JP2005274525A ujawniono bioczip utworzony na bazie samoorganizującej się warstwy utworzonej z pochodnej karboboranów. Przy czym łańcuch DNA został przyłączony do samoorganizującej się warstwy poprzez sprzęganie amidowe.

Z kolei w zgłoszeniu patentowym WO2004096824A2 ujawniono nową klasę detalowanych nukleozydów oraz koniugatów nukleotydów zawierających metalokarboboran, jak również oligonukleotydów modyfikowanych metalokarboboranem. Tak modyfikowane nukleozydy, nukleotydy oraz oligonukleotydy mogą służyć między innymi jako startery w amplifikacji RNA i DNA, leki antyuczuleniowe, nośniki boru w BNCT, radiofarmaceutyki posiadające szeroki zakres izotopów użytecznych w różnych typach radioterapii, molekularne sondy, elementy bioczujników czy materiały dla nanotechnologii.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowej sondy DNA, która dzięki nowemu typowi mocowania do elektrody zapewni obecność centrum redoks-aktywnego Fe(III) blisko jej powierzchni (odległość 10-40 wiązań kowalencyjnych) oraz zastosowanie opracowanego bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA, w szczególności komplementarnych sekwencji ssDNA składających się z 20 oligonukleotydów oraz produktów PCR posiadających komplementarne sekwencje w różnych położeniach w stosunku do końca 5'.

Nieoczekiwanie okazało się, że cel ten można osiągnąć poprzez modyfikację sondy DNA kompleksem karboboran-Fe(III).

Przedmiotem rozwiązania jest bioczujnik elektrochemiczny zawierający przetwornik w postaci złotej elektrody oraz immobilizowaną na powierzchni elektrody sondę DNA, charakteryzujący się tym, że sonda jednoniciowego DNA zawierająca od 20 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji zmodyfikowana jest metalokarboboranem: kompleksem karboboran-Fe(III) (3,3‘-Fe-1,2-C₂B₁₀H₁₁-1‘,2‘-C₂B₁₀H₁₁), przy czym centrum redoks-aktywne (metalokarboboran) znajduje się w stosunku do powierzchni elektrody w odległości równej od 10 do 40 wiązań kowalencyjnych.

Korzystnie zmodyfikowana sonda DNA umieszczona/przytwierdzona jest na powierzchni złotej elektrody poprzez wytworzenie wiązania amidowego.

Kolejnym przedmiotem rozwiązania jest zastosowanie bioczujnika opisanego jak wyżej do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze.

Korzystnie zastosowanie bioczujnika do oznaczania komplementarnych sekwencji ssDNA składających się z 20 oligonukleotydów.

Równie korzystnie zastosowanie bioczujnika do oznaczania produktów PCR posiadających komplementarne sekwencje w różnych położeniach w stosunku do końca 5'.

Korzystnie zastosowanie bioczujnika do rozróżniania położenia komplementarnych sekwencji oligonukleotydów w produktach PCR.

Przedmiot rozwiązania został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia (A) Struktury chemiczne sondy NH₂--OLIGO-Fe-CB (B) poszczególne etapy modyfikacji elektrod złotych przy pomocy sondy NH₂--OLIGO-Fe-CB poprzez wytworzenie wiązań peptydowych z grupami karboksylowymi w obecności EDC/NHS, fig. 2 przedstawia przykładowe krzywe woltamperometryczne fali pr ostokątnej Osteryoung (OSWV) zarejestrowane dla elektrody roboczej zmodyfikowanej sondą OLIGO-Fe-CB (A) po procesie hybrydyzacji z 20-merowym w pełni komplementarnym ssDNA w zakresie stężeń: 0.00 fM (a), 0.01 fM (b), 0.05 fM (c), 0.1 fM (d), 0.5 fM (e) (B) po procesie hybrydyzacji z 20-merowym w pełni niekomplementarnym ssDNA; zakres stężeń: 0.00 fM (a), 0.01 fM (b), 0.05 fM (c), 0.1 fM (d), 0.5 fM (e). Skład buforu: 1 M NaCl, 0.1 M NaCO 0.01 M KH₂PO4, pH 7.0. Parametry

PL 222 314 B1 pomiarowe OSWV: impuls potencjału: 5 mV, częstotliwość fali prostokątnej: 20 Hz, amplituda potencjału: 50 mV.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania.

Oligonukleotyd modyfikowany jednostką metalokarboranylową zawierającą jon Fe(III) (3,3'-Fe-1,2-C₂Bi₀H₁₁-1’,2’-C₂Bi₀H₁₁), gdzie modyfikacja przyłączona jest do zasady nukleinowej-adeniny. Oligonukleotyd otrzymano metodą amidofosforynową. Ostatni monomer: 2'-deoksyadenozynę zmodyfikowaną metalokarboranem zawierającym jon Fe(III) przyłączono do końca 5'-oligomeru metodą H-fosfoniową. Otrzymany, modyfikowany oligonukleotyd składający się z dziewiętnastu reszt nukleotydowych, odcięto od złoża za pomocą wodnego roztworu amoniaku. Docelowy oligonukleotyd oczyszczono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) a jego struktura i jednorodność została potwierdzona analizą MALDI i PAGE [25].

1. Synteza sondy modyfikowanej karboboranem-Fe(III) (skrót: OLIGO-Fe-CB)

Oligonukleotyd zawierający wiązanie potrójne (5'-NH₂-C6-alkin-CCT-CAA-GGA-GAG-AGA-AGA-AG-3') (MW. 6631,50) rozpuszczono w wodzie dejonizowanej (0,6 ml). Z roztworu pobrano 6 pl, uzupełniono wodą do 1000 pl i wykonano widmo UV względem wody przy długości fali 260 nm. Z roztworu pobrano 1 jednostkę optyczną (ODU) (0,03 pg, 4,63 nmola). Do roztworu zawierającego i ODU (w tym przypadku 17,14 pl) dodano tris[(1-benzyl-1H-2,3-triazol-4-yl)metylo]aminę (42,99 pg, 81,03 nmola, 18,06 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 0,42 ml wody dejonizowanej). Następnie dodano askorbinian sodu (22,93 pg, 115,75 nmola, 4,70 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 0,205 ml wody dejonizowanej), siarczan miedzi (2,89 pg, 11,56 mmola, 4,70 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 1,63 ml wody dejonizowanej) oraz metalokarboran zawierający grupę azydową ([8-N₃-(CH₂CH₂O)₂-1,2-C₂B₉H₁₀)(1’,2’-C₂B₉H₁₁-3,3’Fe], 41,95 pg, 92,60 mmola, 21 pl roztworu powstałego przez rozpuszczenie 1 mg tego związku w 0,50 ml wody dejonizowanej). Wszystkie składniki dobrze ze sobą zmieszano. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej, z załączonym mieszadłem magnetycznym. Po dwóch godzinach reakcji dodano ponownie: tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo]aminę (42,99 pg, 81,03 nmola, 18,06 pl), askorbinian sodu (22,93 pg, 115,75 nmola, 4,70 pl), siarczan miedzi (2,89 pg, 56 mmola, 4,70 pl) oraz metalokarboran zawierający grupę azydową ([8-N₃-(CH₂CH₂O)₂-1,2-C₂B₉Hio)(1’,2’-C₂B₉Hii-3,3’Fe], 41,95 pg, 92,60 mmola, 21 pl). Reakcję zakończono po 2 godzinach od dodania dodatkowej porcji substratów.

Po tym czasie mieszaninę reakcyjną zamrożono w temperaturze -70°C do czasu oczyszczania za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Warunki analizy HPLC: kolumna HPLC - Alltech Econosil RP-C18, 5 pm, 4.6 x 250 mm, detekcja UV przy długości fali λ = 268 nm, przepływ 1 ml/min, analizę przeprowadzono w temperaturze pokojowej, gradient analizy: 20 min od 0% D do 100% D, 5 min 100% D, 5 min od 100% D do 0% D (bufor A: mieszanina acetonitryl:woda (2:98, v/v) w 0,1 M wodorowęglanie trietyloamoniowym; bufor D: mieszanina acetonitryl:woda (40:60, v/v) w 0,1 M wodorowęglanie trietyloamoniowym). Zbierano frakcje modyfikowanego oligonukleotydu i zatężano na wirówce próżniowej. Pozostałość odparowano kilkakrotnie z 95% etanolem usuwając wodorowęglan trietyloamoniowy. Pozostałość rozpuszczono w wodzie (0,2 ml) i liofilizowano. RP-HPLC Rf = 15.88 min; MALDI-TOF MS: m/z (%) = 7082,16 [M+1] (100%).

2. Przyłączanie sond oligonukleotydowych z karboboranem-Fe(III) (skrót: OLIGO-Fe-CB) do powierzchni elektrod złotych

Etapy otrzymywania genoczujnika zostały przedstawione na Fig. 1. Elektrody złote, po uprzednim wstępnym mechanicznym oczyszczeniu przy użyciu aluminy, czyszczone były elektr ochemicznie w 0.5 M KOH w zakresie potencjału -0.4 V + +1.2 V. Tak przygotowane elektrody, umieszczane były w pierwszym etapie w 1 mM etanolowym roztworze kwasu 3-merkaptopropionowego z dodatkiem 2% v/v kwasu trifluorooctowego na 3 godziny. Następnie elektrody, po opłuk aniu 10% roztworem amoniaku w etanolu, zanurzano do roztworu zawierającego 100 mM 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropyl)karbodiimidu (ang. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) (EDC) oraz 50 mM N-Hydroksy-sukcynoimidu (ang. N-hydroxysuccinimide) (NHS) w 0.05 M buforze MES, pH 5.5 na 1 godzinę. Celem tego etapu było wytworzenie wiązań peptydowych pomiędzy grupami karboksylowymi znajdującymi się na powierzchni elektrody oraz grupami aminowymi sondy DNA.

W kolejnym kroku, na powierzchnię elektrod nakraplano 10 pl roztworu OLIGO-Fe-CB o stężeniu 0.01 mM w 0.05 M buforze MES, pH 7.0 na 48 godzin i pozostawiano elektrody w lodówce, zabezpieczone przed odparowywaniem roztworu. Po zadanym czasie, spłukiwano elektrody buforem 0.05 M MES o pH 7.0 i umieszczano je na 0.5 minuty w roztworze 0.1 M etanoloaminy w buforze MES

PL 222 314 B1 pH 7.0. Po ostatnim etapie modyfikacji, spłukiwano elektrody buforem o pH 7.0 i umieszczano w roztworze kondycjonującym: 1 M NaCl, 0.1 M NaClO₄, 0.01 M KH₂PO₄, pH 7.2 na ok. 18 godzin w lodówce.

3. Badanie procesu hybrydyzacji pomiędzy sondą oligonukleotydową zawierającą karboboran-Fe(III) (OLIGO-Fe-CB) unieruchomioną na powierzchni elektrody złotej, a ssDNA komplementarnym znajdującym się w roztworze badanym

Elektrody złote zmodyfikowane wg. procedury opisanej w punkcie 2, umies zczano w celce pomiarowej, w roztworze 1 M NaCl, 0.1 M NaCIO₄, 0.01 M KH₂PO₄, pH 7.2 i rejestrowano woltamperogramy, aż do momentu uzyskania niezmiennego w czasie sygnału. W kolejnym kroku, na p owierzchnię elektrody nakraplano 10 ul roztworu ssDNA o danym stężeniu w zakresie od 0.01 do 0.05 fmola, w buforze 1 M NaCl, 0.1 M NaCIO₄, 0.01 M KH₂PO₄, pH 7.2, i pozostawiano elektrody na 1 godzinę, pod przykryciem uniemożliwiającym odparowanie roztworu, w temperaturze pokoj owej. Po 1 h elektrody spłukiwano powyższym buforem i umieszczano w celce elektrochemicznej. Rejestrowano woltamperogramy do momentu uzyskania stabilnego powtarzalnego pomiaru. W wyniku reakcji hybrydyzacji obserwowano obniżanie piku prądu redukcji/utlenienia Fe(III) w kompleksie z karboboranem. Zmiany te były proporcjonalne do stężenia ssDNA komplementarnego obecnego w roztworze badanym.

Sygnał (obniżenie natężenia prądu reakcji utleniania i redukcji Fe(III)) generowany w obecności w pełni komplementarnych 20-merowych sekwencji DNA był proporcjonalny do jego stężenia w zakresie od 0.01 fM do 0.05 fM.

W obecności 20-merowych sekwencji DNA w pełni niekomplementarnych do sondy nie obserwowano znaczących zmian natężenia prądu reakcji utleniania i redukcji Fe(III).

Bioczujnik wykorzystano również do wykrywania komplementarnych do sondy sekwencji oligonukleotydów znajdujących się w różnych położeniach w produktach PCR.

Najsilniejszy sygnał obserwowano w przypadku produktu PCR posiadającego komplementarne sekwencje oligonukleotydów na końcu 3', najsłabszy sygnał obserwowano dla produktu PCR z komplementarną sekwencją na końcu 5'. Produkt PCR posiadający komplementarne sekwencje pośrodku, generował sygnał pośredni.

Powyższe różnice są prawdopodobnie spowodowane różnym stopniem dostępności komplementarnych sekwencji oligonukleotydów znajdujących się w produktach PCR do sondy DNA przym ocowanej przy pomocy wiązania peptydowego do powierzchni elektrody.

Literatura:

[1] Chang, Haixin; Wang, Ying; Li, Jinghong, Electrochemical DNA Sensors: From Nanoconstruction to Biosensing, Current Organic Chemistry, Volume 15, Number 4, February 2011, 506-517.

[2] F. Lucarelli, Tombelli S., Minunni M., Marrazza G., Mascini M., Electrochemical and piezoelectric DNA biosensors for hybridization detection. Anal. Chim. Acta. 609, 2008, 139-159.

[3] E. Palecek, Fifty Years of Nucleic Acid Electrochemistry, Electroanal., 2009, 21 (3-5), 239-251.

[4] J. Wang, Electrochemical nucleic acid biosensors, Anal. Chim. Acta, 469, 2002, 63-69.

[5] J. Wang, A. N. Kawde, M. Musameh, Carbon - nanotube - modified glassy carbon electrodes for amplified label - free electrochemical detection of DNA hybridization, Analyst, 128, 2003, 912-916.

[6] A. Abbaspour, M. A. Mehrgardi, R. Kia, Electrocatalytic oxidation of guanine and ss-DNA at a cobalt (11) phthalocyanine modified carbon paste electrode, J. Electroanal. Chem., 568, 2004, 261-266.

[7] X. Zhu, S. Ai, Q. Chen, H. Yin, J. Xu, Label-free electrochemical detection of Avian Influenza Virus genotype utilizing multi-walled carbon nanotubes-cobalt phthalocyanine-PAMAM nanocomposite modified glassy carbon electrode, Electrochem. Comm. 11, 2009, 1543-1546.

[8] H. Aoki, p. Buhlmann, Y. Umezawa, Electrochemical detection of one-base mismatch in an oligonucleotide using ion-channel sensor with self-assembled PNA monolayers, Electroanal. 12, 2000, 1272-1276.

[9] Y. Umezawa, H. Aoki, Ion Channel Sensor Based on Artificial Receptors, 2004, 76, 320

A-326a.

[10] E. Farjami, L. Clima, K. Gothelf, E. E. Ferapontova, Off-On electrochemical hairpin-DNA-based genosensors for cancer diagnostics, Anal. Chem., 83, 2011, 1594-1602.

[11] K. Yang, Ch. Zhang, Improved sensitivity for the electrochemical biosensors with an adjunct probe, Anal. Chem. 82, 2010, 9500-9505.

PL 222 314 B1

[12] A. Patterson, F. Caprio, A. Valle - Belisle, D. Mascone, K. W. Plaxco, G. Palleschi, F. Ricci, Using triplex - forming nucleotide probes for reagentless, electrochemical detection of double stranded DNA, Anal. Chem. 82, 2010, 9109-9115.

[13] Y. Liu, N. Tuleouva, E. Ramanculov, A. Revzin, Aptamer - based electrochemical biosensors for interferon gamma detection, Anal. Chem., 82, 2010, 8131-8136.

[14] B. Yin, D. Wu, B. Ye, Sensitive DNA - based electrochemical strategy for trace bleomycin detection, Anal. Chem., 82, 2010, 8272-8277.

[15] A. Anne, Ch. Demaille, Dynamics of Electron Transport by Elastic Bending of Short DNA Duplexes. Experimental Study and Quantitative Modeling of the Cyclic Voltametric Behaviour of 3'-ferrocenyl DNA End-Grafted on Gold, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 542-3.

[16] H. Aoki, H. Tao, Label-and marker-free gene detection based on hybridization-induced conformational flexibility changes in ferrocene - PNA conjugate probe, Analyst, 2007, 132, 784-791. 557.

[17] Ch. Fan, K. W. Plaxco, A. J. Heeger, Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA, PNAS, 2003, 100 (16), 9134-9137.

[18] F. Ricci, R. Y. Lai, K. W. Plaxco, Linear, redox modified DNA probes as electrochemical DNA sensors, Chem. Comm. 2007, 36, 3768-3770.

[19] D. Kang, X. Zuo, R. Yang, F. Xia, K. W. Plaxco, R. J. White, Comparing the Properties of Electrochemical-Based DNA Sensors Employing Different Tags, Anal. Chem., 2009, 81 (21), 9109-9113.

[20] F. Ricci, K. W. Plaxco, E-DNA sensors for convinient, label - free electrochemical detection of hybridization, Microchim. Acta, 2008, 163, 149-155.

[21] E. E. Ferapontova, K. V. Gothelf, Effect of serum on an RNA - aptamer - based electrochemical sensor for theophylline, Langmuir, 2009, 25, 4279-4283.

[22] A. B. Olejniczak, M. Corsini, S. Fedi, P. Zanello, Z. L. Leśnikowski, Nucleoside-metallacaborane conjugates for multipotential electrochemical coding of DNA, El. Comm., 2007, 9, 1007-1011.

[23] A. B. Olejniczak, B. Gruner, V. Sicha, S. Broniarek, Z. J. Leśnikowski, Metallacarboranes as labels for multipotential electrochemical coding of DNA. [3-Chromium bis(dicarbollide)](-1)ate and Its Nucleoside Conjugates], Electroanal., 21,2009, 501-506.

[24] A. B. Olejniczak, J. Piesek, Z. J. Leśnikowski, Nucleoside-metallacarborane conjugates for base-specific metal labeling of DNA, Chem. Eur. J., 13, 2007, 311-318.

[25] A. B. Olejniczak, Metallacarboranes for the labeling of DNA, Can. J. of Chem., 89, 2011, 465-470.

[26] M. Corsini, F. Fabrizi de Biani, P. Zanello, Mononuclear metallacarboranes of group 6-10 metals: analouges of metallocenes: electrochemical and X-ray structural aspects, Coord. Chem. Rev., 250, 2006, 1351 -1372.

[27] Creager S. E.; Rowe G. K. J. of Electroanal. Chem. 1997, 420, 291-299.

[28] Smith Ch. P.; White H. S. Anal. Chem. 1992, 64, 2398-2405.

[29] Khor S. M.; Liu G.; Fairman C.; Iyengar S.; Gooding J. J. Biosens, and Bioelectr. 2011,26, 2038-2044.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Bioczujnik elektrochemiczny zawierający przetwornik w postaci złotej elektrody oraz immobilizowaną na powierzchni elektrody sondę DNA, znamienny tym, że sonda jednoniciowego DNA zawierająca od 20 do 40 nukleotydów o dowolnej sekwencji zmodyfikowana jest metalokarboboranem: kompleksem karboboran-Fe (III) (3,3’-Fe-1,2-C2B₁oH₁₁-1’,2’-C₂B₁oH₁₁), przy czym centrum redoks-aktywne (metalokarboboran) znajduje się w stosunku do powierzchni elektrody w odległości równej od 10 do 40 wiązań kowalencyjnych.
2. 2. Bioczujnik według zastrz. 1, znamienny tym, że zmodyfikowana sonda DNA umieszczona/przytwierdzona jest na powierzchni złotej elektrody poprzez wytworzenie wiązania amidowego.
3. 3. Zastosowanie bioczujnika opisanego według zastrz. 1 -2 do oznaczania komplementarnych sekwencji DNA w roztworze.
4. 4. Zastosowanie bioczujnika według zastrz. 3 do oznaczania komplementarnych sekwencji ssDNA składających się z 20 oligonukleotydów.

   PL 222 314 B1
5. 5. Zastosowanie bioczujnika według zastrz. 4 do oznaczania produktów PCR posiadających komplementarne sekwencje w różnych położeniach w stosunku do końca 5'.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 4 do rozróżniania położenia komplementarnych sekwencji oligonukleotydów w produktach PCR.