JP4184718B2 - 反応性固相担体の製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体高分子物質の構造の解析に有用な検出用具に関し、特に遺伝子の発現、変異、多型等の効率的な解析に有用な、多数の生物起源の高分子物質もしくはその類縁体を固相担体表面に整列固定させた検出用具に関する。本発明は特に、ＤＮＡ断片試料の塩基配列の解析に有用な、多数のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固相担体表面に高密度に整列固定させた高密度アレイ型検出用具（ＤＮＡ検出チップ）、そしてその高密度アレイ型検出用具の作製に有利に用いることのできる反応性固相担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が急速に進んでおり、それらのＤＮＡもしくはＤＮＡ断片の塩基配列の解析のために、ＤＮＡチップとよばれる、多数のＤＮＡ断片あるいは合成オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド誘導体を固相基板の表面に固定した検出用具が用いられている。このような固相基板の表面に結合固定されたヌクレオチド誘導体などの、ＤＮＡもしくはその断片あるいは合成オリゴヌクレオチドのような検出用分子はプローブ分子とも呼ばれる。代表的なＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体に多数のプローブ分子を整列固定させたマイクロアレイである。このＤＮＡチップの製造、そしてその使用に関するＤＮＡチップ関連技術は、ＤＮＡ以外の生体分子の検出にも利用可能であると考えられ、従って、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発等に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】
ＤＮＡチップ関連技術が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定する方法が考案されたことに始まる。この方法は、ゲル電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方法ではあったが、当初は実用化には至らなかった。
【０００４】
その後、上記のような構成のＤＮＡチップと、その作製技術が開発され、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調べることが可能となった。すなわち、作製されたＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片もしくはオリゴヌクレオチドに相補性を示すＤＮＡ断片試料（標的ＤＮＡ断片ともいわれる）は、一般的には、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片もしくはオリゴヌクレオチドと、標識したＤＮＡ断片試料とのハイブリダイゼーションを利用して検出される。
【０００５】
ＤＮＡチップ作製技術を実用化するためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に高密度に、かつ安定に整列させるための技術が必要とされる。
【０００６】
ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（「オン・チップ法」という。）と、予め調製用意したＤＮＡ断片あるいはオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法とが知られている。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせ、所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行なう方法（「マスキング技術」という）が代表的である。
【０００７】
予め調製用意したＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相担体表面に結合固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の種類に応じて下記の方法が知られている。
（１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）である場合には、ｃＤＮＡあるいはＰＣＲ産物を、ＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッタ装置により、ポリ陽イオン化合物（ポリリシン、ポリエチレンイミン等）で表面処理した固相担体の表面に点着し、ＤＮＡ断片の持つ電荷を利用して固相担体に静電結合させるのが一般的である。なお、固相担体表面の処理方法としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されている。このシランカップリング剤を用いた表面処理では、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により固相担体表面に固定されるため、ポリ陽イオン化合物による表面処理の場合と比較して、安定に固相担体表面に固定される。
【０００８】
上記のＤＮＡ断片の電荷を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行なう方法が報告されている。しかし、この固定方法では必ずしも充分なＤＮＡ断片の固定安定度が得られ難いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で（すなわち、高密度に）、かつ安定にＤＮＡ断片が結合固定することは、ＤＮＡ断片プローブと標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションの検出限界の向上に直接影響する。
【０００９】
（２）固定するオリゴヌクレオチド（プローブ分子）が合成オリゴヌクレオチドである場合には、まず反応活性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該オリゴヌクレオチドを点着して、該オリゴヌクレオチドを固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法も知られている。例えば、表面にアミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）の存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られている。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡ断片の電荷を利用して静電結合により固定する方法と比べると、オリゴヌクレオチドが固相担体表面に安定に結合固定されるという利点がある。しかし、ＰＤＣを存在させる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを用いる方法では、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低い（従って、加水分解が起こり易い）という問題点がある。
【００１０】
なお、近年、ＤＮＡチップのプローブ分子として、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド（合成されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド及びＤＮＡ分子やＤＮＡ断片、そしてＲＮＡ分子やＲＮＡ断片をも包含する）の代りに、ＰＮＡ（ペプチド核酸）と呼ばれるオリゴヌクレオチド類縁体を用いる技術も提唱されている。このＰＮＡの固相基板へ共有結合により固定するための方法として、アビジンとビオチンとを組合わせて用いる方法も知られている（特開平１１−３３２５９５号公報）。この公開公報には、固相基板として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを利用することの技術も記載されている。表面プラズモン共鳴バイオセンサ上にプローブ分子が固定されたＤＮＡチップを用いて、その表面にハイブリダイゼーションを介して結合固定されたＤＮＡ断片は、表面プラズモン共鳴現象を利用して検出することができる。
【００１１】
また、ＤＮＡチップの基板として、電荷結合素子（ＣＣＤ）を用いることも知られている（Nucleic Acids Research, 1994, Vol.22, No.11, 2124-2125）。
【００１２】
特開平４−２２８０７６号公報（米国特許第５３８７５０５号明細書に対応）には、ビオチン分子を付けた標的ＤＮＡを、アビジン分子を表面に固定した基体に結合させて、標的ＤＮＡを分離する技術が記載されている。
【００１３】
特公平７−４３３８０号公報（米国特許第５０９４９６２号明細書に対応）には、リガンド−受容体アッセイに用いる検出用具であって、表面に反応活性基を有する微孔質ポリマー粒子の表面に受容体分子を結合させた分析用具が記載されている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体の表面に、予め調製した、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を、迅速かつ安定に結合固定させるために特に有利に用いることができる反応性固相担体の製造方法を提供することを、その課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明により製造されるのは、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基（別に、ビニルスルホン基あるいはスルホニルビニル基と呼ぶこともある）もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介して共有結合により結合固定されてなる反応性固相担体である。
上記のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と連結基との連結体は、広義には、下記の式（１）により表わされるものである。
【００１６】
【化４】
−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ −−− （１）
【００１７】
［上記の式において、Ｘは、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；そして、Ｌは連結基を表わす］。
【００１８】
上記の式（１）において、Ｘは、−ＣＨ＝ＣＨ₂で表わされるビニル基であることが望ましく、
【００１９】
Ｌは、炭素原子以外の二価以上の原子を含む連結基であることが望ましい。Ｌとしては、−ＮＨ−、−Ｓ−、もしくは−Ｏ−などの連結部位を有する連結基であることが望ましい。Ｌの例としては、−（Ｌ¹）_n−ＮＨ−（ＣＲ¹Ｒ²）₂−または−（Ｌ¹）_n−Ｓ−（ＣＲ¹Ｒ²）₂−［但し、Ｒ¹及びＲ²は前記と同じ意味を表わし、Ｌ¹は連結基を表わし、そしてｎは０もしくは１である］で表わされる連結基を挙げることができる。特に、Ｌが、−（Ｌ¹）_n−ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂−［但し、Ｌ¹は連結基を表わし、そしてｎは０もしくは１である］で表わされる連結基あることが望ましい。上記のＬ¹は、−ＯＳｉ−で表わされる基を含む連結基であることが望ましい。
【００２０】
本発明の反応性固相担体は、表面にアミノ基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、もしくはカルボキシル基である反応性基が導入された、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体に、下記式（２）：
【００２１】
【化５】
Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ² −−− （２）
【００２２】
［上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互いに独立に、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙ（反応性前駆体基）を表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；そして、Ｌ²は連結基を表わす］
で表わされるジスルホン化合物を接触させることによって、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体の表面に、一群の、−ＳＯ ₂ −Ｌ ² −ＳＯ ₂ −Ｘ ² で表わされるジスルホニル基が共有結合により固定されてなる反応性固相担体として容易に製造することができる。
【００２３】
上記の式（２）で表わされるジスルホン化合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンを挙げることができる。
【００２４】
上記の固相担体表面に導入されている反応性基は、アミノ基、メルカプト基もしくはヒドロキシル基であることが望ましい。
【００２５】
本発明により得られる、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ共有結合により固定されてなる反応性固相担体は、該表面に、該反応性基と反応して共有結合を形成する反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を接触させることにより、スルホニル基を有する連結基を介してヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が担体表面に結合固定された固相担体とすることができる。
【００２６】
固相担体に固定するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表的な例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その分子の一方の端部もしくは端部附近に、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基などの、ビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応する共有結合を形成する反応性基を持つものが利用される。
【００２７】
上記のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、水性媒体の存在下、該固定ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体に対して相補性を示すオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはその断片、あるいはＲＮＡもしくはその断片）を接触させて、ハイブリダイゼーションを発生させることにより、その相補性オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを固定することができる。固定すべき相補性のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、その固定を外部から検知することが可能なように、検知可能な標識（例、蛍光標識）が結合していることが望ましい。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明により得られる反応性固相担体は、広義には、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体の表面に、一群のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基がそれぞれ連結基を介して共有結合により結合固定された構成を有している。
【００２９】
固相担体は、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体である。
【００３０】
本発明の反応性固相担体の製造に用いる固相担体としては、従来よりＤＮＡチップの製造に用いられているか、あるいはＤＮＡチップの製造用として提案されているガラス基板、シリコン基板、電極基板が好ましく利用することができる。
【００３１】
固相担体の表面には、ジビニルスルホン化合物などの二官能反応性化合物を共有結合により結合固定するために、ポリ陽イオン化合物（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等であることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンであることがさらに好ましい）などのアミノ基を側鎖に有するポリマーによって被覆処理（この場合、固相担体表面へ導入される反応性基は、アミノ基である）することが望ましい。あるいは、固相担体表面は、シランカップリング剤などの固相担体表面と反応する反応性基と、そして別にアミノ基などの反応性基を有する表面処理剤によって接触処理することができる。
【００３２】
固相担体表面は、ポリ陽イオン化合物による被覆処理の場合には、アミノ基もしくはメルカプト基がポリマー化合物と固体担体表面との静電結合によって固相担体表面に導入されるのに対して、シランカップリング剤による表面処理の場合には、固相担体表面に共有結合によって結合固定されるため、アミノ基もしくはメルカプト基が固相担体表面に安定に存在する。アミノ基およびメルカプト基の他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、あるいは水酸基も好ましく導入することができる。
【００３３】
アミノ基を有するシランカップリング剤としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシランあるいはＮ−β（アミノエチル）−γ−アミノプロピルメチルジメトキシシランを用いることが好ましく、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いることが特に好ましい。
【００３４】
ポリ陽イオン化合物を用いる処理に、シランカップリング剤による処理を組み合わせて行ってもよい。この方法により、疎水性、あるいは親水性の低い固相担体とＤＮＡ断片との静電的相互作用を促進することができる。ポリ陽イオン化合物による処理がされた固相担体表面上に、さらに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって、ポリ陽イオン化合物による処理がされた固相担体の凹凸を軽減することができる。固相担体の種類によっては、その担体中に親水性高分子等を含有させることも可能であり、このような処理を施した固相担体も好ましく用いることができる。
【００３５】
通常のＤＮＡチップ用の固相担体の表面には、予め区画あるいは想定された多数の領域が設定されており、各領域毎に上記のように、ジビニルスルホン化合物などの二官能性反応性化合物と反応することができる反応性基が予め導入されている。用いる固相担体の各領域の表面のそれぞれには、上記のアミノ基、メルカプト基、あるいはヒドロキシル基などの反応性基が備えられているが、そのような反応性基を持たない固相担体には、前述のように、シランカップリング剤による表面処理、あるいはアミノ基などの反応性基を側鎖に有するポリマーなどを固相担体の表面に塗布被覆する方法を利用して、反応性基の導入が行なわれる。
【００３６】
反応性基を備えた固相担体は、ジビニルスルホン化合物などの二官能性反応性化合物と接触することによって、その反応性基と二官能性反応性化合物とが反応し、共有結合が形成され、固相担体の反応性基部分が延長され、その先端もしくは先端附近にビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基を持つ反応性鎖が形成され、これにより本発明の反応性固相担体が生成する。
【００３７】
本発明により得られる反応性固相担体において、固相担体表面に導入されるビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と連結基との連結体は、広義には、下記の式（１）により表わされるものである。
【００３８】
【化６】
−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ −−− （１）
【００３９】
上記の式（１）において、Ｘは、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙ（反応性前駆体基）を表わす。Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、それぞれ互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表わす。炭素原子数が１乃至６のアルキル基の例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、及びｎ−ヘキシル基を挙げることができ、メチル基であることが特に好ましい。アリール基としては、フェニル基及びナフチル基を挙げることができる。Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は共に水素原子であることが好ましい。
【００４０】
Ｙは、−ＯＨ、−ＯＲ⁰、−ＳＨ、ＮＨ₃、ＮＨ₂Ｒ⁰（但し、Ｒ⁰は、水素原子を除く、アルキル基などの基である）などの求核試薬によって置換される基、あるいは塩基によって「ＨＹ」として脱離する基を表わし、その例としては、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、あるいは四級ピリジニウム基を表わす（Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基あるいは炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子あるいはアンモニウム基を表わす）を挙げることができる。
【００４１】
Ｌは、固相担体もしくは固相担体に結合している連結基と、上記−ＳＯ₂−Ｘ基とを連結している二価もしくはそれ以上の連結基を表わす。ただし、Ｌは単結合であってもよい。二価の連結基としては、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基、炭素原子数が３乃至１６の脂肪族環基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン基、Ｎ、ＳおよびＰからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至３個含む炭素原子数が２乃至２０の複素環基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ₂−、−ＳＯ₃−、−ＮＲ¹¹−、−ＣＯ−およびこれらの組み合わせから群より選ばれる基を一つあるいは複数個組み合わせてなる基であることが好ましい。Ｒ¹¹は、水素原子、炭素原子数が１乃至１５のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２１のアラルキル基であることが好ましく、水素原子もしくは炭素原子数が１乃至６のアルキル基であることがさらに好ましく、水素原子、メチル基もしくはエチル基であることが特に好ましい。
Ｌが−ＮＲ¹¹−、−ＳＯＮＲ¹¹−、−ＣＯＮＲ¹¹−、−ＮＲ¹¹ＣＯＯ−、および−ＮＲ¹¹ＣＯＮＲ¹¹−からなる群より選ばれる基を二個以上組み合わせてなる基である場合には、それらのＲ¹¹同士が結合して環を形成していてもよい。
【００４２】
Ｒ¹¹のアルキル基、Ｒ¹¹のアリール基、およびＲ¹¹のアラルキル基は、置換基を持っていてもよい。このような置換基としては、水酸基、炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルケニル基、炭素原子数が２乃至７のカルバモイル基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が７乃至１６のアラルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、スルファモイル基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、スルホ基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、カルボン酸基（もしくはそのＮａ塩、Ｋ塩等）、ハロゲン原子、炭素原子数が１乃至６のアルケニレン基、炭素原子数が６乃至２０のアリーレン基、スルホニル基、およびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。
【００４３】
上記「−Ｘ」基の好ましい具体例を以下に示す。また、「−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ」として使用できる基の例についても、その後に示す。
【００４４】
【化７】

【００４５】
【化８】

【００４６】
「−Ｘ」は、上記具体例中、（Ｘ１）、（Ｘ２）、（Ｘ３）、（Ｘ４）、（Ｘ７）、（Ｘ８）、（Ｘ１３）あるいは（Ｘ１４）であることが好ましく、（Ｘ１）あるいは（Ｘ２）であることがさらに好ましい。特に好ましいのは、（Ｘ１）で表わされるビニル基である。
【００４７】
Ｌの好ましい具体例を以下に示す。但し、ａは、１乃至６の整数であり、１もしくは２であることが好ましく、１であることが特に好ましい。ｂは、０乃至６の整数であり、２もしくは３であることが好ましい。
【００４８】
【化９】

【００４９】
Ｌとしては、上記記載の二価の連結基の他に、上記式のアルキレン基の水素原子が−ＳＯ₂ＣＨ＝ＣＨ₂基によって置換されてなる基も好ましい。
【００５０】
前記の式（１）で表わされるビニルスルホニル基もしくは反応性前駆体基が共有結合により固定された固相担体を得るために利用される二官能反応性化合物としては、下記の式（２）で表わされるジスルホン化合物が有利に利用できる。
【００５１】
【化１０】
Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ² −−− （２）
【００５２】
［上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互いに独立に、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙ（反応性前駆体基）を表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；そして、Ｌ²は連結基を表わす］。
【００５３】
すなわち、上記の式（２）で表わされるジスルホン化合物を、前記の固相担体と、例えば水性雰囲気にて、接触させることによって、目的の反応性固相担体を容易に製造することができる。
【００５４】
本発明で好ましく用いるジスルホン化合物の代表例を下記に示す。なお、ジスルホン化合物は、二種類以上を混合して用いてもよい。
【００５５】
【化１１】

【００５６】
【化１２】

【００５７】
上記の式（２）で表わされるジスルホン化合物の代表的な例としては、１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンを挙げることができる。
【００５８】
本発明で用いるジスルホン化合物の合成法については、たとえば、特公昭４７−２４２９号、同５０−３５８０７号、特開昭４９−２４４３５号、同５３−４１５５１号、同５９−１８９４４号等の各種公報に詳細が記載されている。
【００５９】
上記のようにして得られた反応性固相担体を利用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ断片、あるいはＲＮＡ断片などの天然起源のポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの検出固定のための検出具（一般にＤＮＡチップと呼ばれているもの）を作製するためには、上記の反応性固相担体を、その担体表面上のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応して共有結合を形成するアミノ基などの反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体と接触させる方法が利用される。すなわち、このようにして所望のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子を備えた検出具（いわゆるＤＮＡチップ）を作製することができる。
【００６０】
本発明により得られる反応性固相単体の固相基板表面に共有結合を介して結合されたビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基は、加水分解に対して高い抵抗性を有しているため、容易に安定に保存することができ、また、アミノ基を予め備えているか、あるいはアミノ基などの反応性基が導入されているかヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の反応性基と迅速に反応して、安定な共有結合を形成することができる。
【００６１】
プローブ分子として用いるヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、そしてペプチド核酸を挙げることができる。これらのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、天然起源のもの（ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ、あるいはＲＮＡ断片など）であってもよく、あるいは合成化合物であってもよい。また、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体としては、その糖単位部分に架橋基を有するＬＮＡと呼ばれる化合物（J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 13252-13253に記載）などの各種の類縁化合物が含まれる。
【００６２】
プローブ分子としてＤＮＡ断片を用いる場合は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以下、「ＰＣＲ産物」という）。ＰＣＲ法によって増幅しないものも、好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さらに、塩基配列の分析を目的とする場合、４_n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成して、それらを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００６３】
オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片などのヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の一方の末端には、前記のビニルスルホニル基もしくはその反応性前駆体基と反応して共有結合を形成する反応性基を導入する。このような反応性基は、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、もしくはカルボキシイミド基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。オリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片には、通常、クロスリンカーを介してこれらの反応性基が結合される。クロスリンカーとしては、たとえば、アルキレン基あるいはＮ−アルキルアミノ−アルキレン基が利用されるが、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルアミノ−ヘキシレン基であることが好ましく、ヘキシレン基であることが特に好ましい。なお、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はアミノ基を有しているため、通常は、改めて別に反応性基を導入する必要はない。
【００６４】
反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体と反応性固相担体との接触は、通常、該ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水溶液を反応性固相担体の表面に点着することにより実施される。具体的には、反応性基を備えたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を水性媒体に溶解あるいは分散して水性液としたのち、その水性液を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して行うことが好ましい。
【００６５】
点着後のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の乾燥を防ぐために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、点着後のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るものであって、検出対象の核酸断片試料（標的核酸断片）などの試料とのハイブリダイゼーションを妨げることがなく、かつ粘性があまり大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、そしてポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。このポリマーの分子量は、１０³乃至１０⁶の範囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリセリンあるいはエチレングリコールを用いることがさらに好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。高沸点の物質の濃度は、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水性液中、０．１乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至１容量％の範囲にあることが特に好ましい。
【００６６】
また、同じ目的のために、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を点着した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環境に置くことも好ましい。
【００６７】
反応性基を有するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を点着後、紫外線、水素化ホウ素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施してもよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて行ってもよく、特に加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行うことが好ましい。これらの後処理は、ポリ陽イオン化合物のみによって固相担体表面を処理した場合には特に有効である。点着後は、インキュベーションを行うことも好ましい。インキュベート後は、未反応のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を洗浄して除去することが好ましい。
【００６８】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の固定量（数）は、固相担体表面に対して、１０²乃至１０⁵種類／ｃｍ²の範囲にあることが好ましい。ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の量は、１乃至１０^-15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。点着によって、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の水性液は、固相担体表面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほとんど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要である。それぞれのドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。固相担体表面に点着するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ましく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好ましい。
【００６９】
図１に、本発明により得られる反応性固相単体を用いるオリゴヌクレオチド固定固相担体の製造方法および代表的なオリゴヌクレオチド固定固相担体の構成を模式的に示す。
上記のオリゴヌクレオチドが固定された固相担体の製造方法としては、前記式（２）で表されるジスルホン化合物を用いた場合、そのＸ¹およびＸ²によって四種類の製造方法が利用できる。
【００７０】
図１には、式（２）のジスルホン化合物のＸ¹とＸ²とが何れも−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙ（反応性前駆体基）である場合のオリゴヌクレオチドが固定された固相担体（Ｃ１）の製造方法（ａ）、およびＸ¹が−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙであって、Ｘ²が−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³である場合のオリゴヌクレオチド固定固相担体（Ｃ２）の製造方法（ｂ）を示す。ただし、Ｘ¹を、固相担体１の表面に導入された反応性基（Ｒ）と最初に反応する基と仮定して、そのＸ¹を−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³とする製造方法であってもよい。以下、「Ｘ¹」を、固相担体１の表面に導入された反応性基（Ｒ）と最初に反応する基として説明を行なう。
【００７１】
製造方法（ａ）および（ｂ）について説明する。
工程（１）：担体表面に反応活性基（Ｒ）が導入された固相担体１［固相担体（Ａ）］に、式（１）で表わされるジスルホン化合物を接触させ、Ｘ^１の−Ｙ部分に反応性基（Ｒ）を置換させることによって、−（ＣＲ¹Ｒ²）_n−ＳＯ₂−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ²基を固相担体表面に導入する。
【００７２】
工程（２）：工程（１）で導入された−（ＣＲ¹Ｒ²）_n−ＳＯ₂−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ²基のＸ²に、一方の末端に反応性基（Ｚ）を有するオリゴヌクレオチド２を接触させることによって反応性基（Ｚ）を付加させる、または該Ｘ²の−Ｙに該オリゴヌクレオチド２を接触させることによって反応性基（Ｚ）を置換させる。
【００７３】
本発明のプローブ分子固定用担体は、Ｘ¹を固相担体１の表面に導入された反応性基（Ｒ）と最初に反応する基とする場合に、そのＸ¹を−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³とする下記の方法によって製造されるものであってもよい。
【００７４】
工程（１）：固相担体１の表面に活性基（Ｒ）が導入された固相担体（Ａ）に、式（Ｉ）で表されるジスルホン化合物を接触させ、Ｘ¹の−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³に、反応性基（Ｒ）を付加させることによって、−Ｒ³Ｒ²Ｃ−Ｒ¹ＨＣ−ＳＯ₂−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ²基を固相担体表面に導入する。
【００７５】
工程（２）：工程（１）において導入された−Ｒ³Ｒ²Ｃ−Ｒ¹ＨＣ−ＳＯ₂−Ｌ−ＳＯ₂−Ｘ²基のＸ²に、一方の末端に反応性基（Ｚ）を有するオリゴヌクレオチドを接触させることによって反応性基（Ｚ）を付加させるか、あるいは該Ｘ²の−Ｙの部分に、該オリゴヌクレオチドを接触させることによって、この反応性基（Ｚ）を置換させる。
【００７６】
一方の末端に反応性基（Ｚ）を有するオリゴヌクレオチドは、図１において、２によって示される化合物である。クロスリンカー（Ｑ）は、必須ではないが、反応性のオリゴヌクレオチド２の調製の都合上、反応性基（Ｚ）とリン酸エステル基との間に存在するのが一般的である。−リン酸エステル基−ＮＮＮＮ・・・ＮＮは、オリゴヌクレオチドを表わす。Ｒ⁴は、反応性基（Ｒ）とＸ¹との反応によって、Ｚ¹は、Ｘ²と反応性基（Ｚ）との反応によってそれぞれ決定される基である。
【００７７】
図１の固相担体（Ｂ）の表面に反応性基（Ｚ）を有するオリゴヌクレオチド２を点着させると、Ｘ²またはＸ²の−Ｙと該反応性オリゴヌクレオチド片２との反応が起こるが、固相担体（Ｂ）の表面には該オリゴヌクレオチド２が結合していない未反応のＸ²も存在する。このようなＸ²は、後に行なわれる標識された核酸断片試料とのハイブリダイゼーションにおいて非特異的な反応を生じる可能性があり、非特異的な結合を測定してしまうおそれがあるため、予め該Ｘ²（即ち、例えば、Ｘ²のハロゲン原子）をマスク処理しておくことが好ましい。マスク処理は、固相担体（Ｃ１）（もしくは（Ｃ２））の表面に、アミノ基もしくはメルカプト基を有するアニオン性化合物を接触させることによって行うことが好ましい。該オリゴヌクレオチド２は、負の電荷を有するため、固相担体（Ｃ）表面にも負の電荷を発生させることによって、オリゴヌクレオチド２が未反応のＸ²と反応するのを防ぐことができる。このようなアニオン性化合物としては、Ｘ²のハロゲン原子と反応し、かつ負の電荷（ＣＯＯ^-、ＳＯ₃ ^-、ＯＳＯ₃ ^-、ＰＯ₃ ^-、もしくはＰＯ₂ ^-）を有するものであれば何れのものも用いることができるが、アミノ酸であることが好ましく、グリシンもしくはシステインであることが特に好ましい。また、タウリンも好ましく用いることができる。
【００７８】
本発明によって得られる反応性固相単体を用いて製造されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体の寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ固定固相担体では通常、数週間であり、合成オリゴヌクレオチドが固定されてなる固相担体ではさらに長期間である。従って、このヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションである。
【００７９】
標識方法としては、ＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、本発明では蛍光法を用いることが好ましい。蛍光標識に利用される蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、市販のＣｙ Ｄｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。
【００８０】
試料核酸断片としては、通常、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料などの核酸断片試料が用いられる。
【００８１】
核酸断片試料は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好ましい。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴＰを用いることが好ましい。一回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は、点着する液量や標識方法によって異なるが、数μｇ以下である。なお、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体固定固相担体上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、核酸断片試料は低分子化しておくことが望ましい。原核生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なため、全ＲＮＡを標識することが好ましい。
【００８２】
核酸断片試料は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライマーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系において標的領域のＰＣＲを行なって得ることが好ましい。
【００８３】
ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標識した核酸断片試料が溶解あるいは分散してなる水性液を、本発明のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固定した固相担体上に点着することによって実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションの終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸断片試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００８４】
ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体を固定した固相担体を用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した核酸断片試料の使用量を非常に少なくできることである。そのため、固相担体に固定するヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の鎖長や標識した核酸断片試料の種類により、ハイブリダイゼーションの最適条件を設定する必要がある。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した核酸断片試料を二種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡ断片固定固相担体上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。
【００８５】
【実施例】
［実施例１］オリゴヌクレオチド固定スライドの作製、およびオリゴヌクレオチドの固定量の測定
本発明により得られる反応性固相単体を用いるオリゴヌクレオチドの固定方法を、オリゴヌクレオチドの反応経路によって表すこととし、その反応経路を図２に示す。図中、１は、スライドガラスを表す。
【００８６】
（１）ビニルスルホニル基が導入された固相担体（Ｂ）の作成
２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後、これを取り出し、エタノールで洗浄した後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次に、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を、５重量％１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、表面にビニルスルホニル基が導入された固相担体（Ｂ）を得た。
【００８７】
（２）オリゴヌクレオチドの点着と蛍光強度の測定
３’末端および５’末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたオリゴヌクレオチド（３’−ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡＴＣ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散した水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を、上記（１）で得たスライド（Ｂ）に点着した。直ちに、点着後の固相担体を２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、この固相担体を０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定された固相担体（Ｃ）を得た。この固相担体（Ｃ）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、２５００であり、バックグラウンド蛍光強度より大きく増加した。従って、本発明により得られる反応性固相単体を用いる固定化方法により、オリゴヌクレオチドが効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【００８８】
［実施例２］相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
（１）オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製
３’末端がアミノ基で修飾された４０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（３’−ＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＡＧ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を、実施例の（１）で得た固相担体（Ｂ）に点着した。直ちに、点着後の固相担体を２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、この固相担体を０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、オリゴヌクレオチドが固定された固相担体（Ｃ’）を得た。
【００８９】
（２）相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
５’末端にＣｙ５（蛍光標識）が結合した２２ｍｅｒの標的オリゴヌクレオチド試料（ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣ−５’）をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液、２０μＬ）に分散させたものを、上記（１）で得た固相担体（Ｃ’）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャーチャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶液、及び０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心処理し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１２１９であり、バックグラウンド蛍光強度より大きく増加した。従って、本発明により得られる反応性固相単体を用いて作製されたオリゴヌクレオチド固定固相担体を用いることによって、そのオリゴヌクレオチド固定固相担体に固定されているオリゴヌクレオチドと相補性を有する標的ＤＮＡ断片試料などの標的オリゴヌクレオチド試料を効率的に検出できることが分かる。
【００９０】
［実施例３］オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製、およびオリゴヌクレオチドの固定量の測定
（１）アミノ基が導入された固相担体（Ｂ１）の作製
２重量％アミノプロピルエトキシシラン（信越化学工業（株）製）のエタノール溶液に、スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次いで、このシラン化合物被覆固相担体（Ａ）を、クロロスルホニルイソシアナート（０．５ｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解したアセトニトリル溶液に２時間浸した後、取り出し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下乾燥し、固相担体（Ｂ１）を得た。
【００９１】
（２）オリゴヌクレオチドの点着と蛍光強度の測定
３’末端および５’末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたオリゴヌクレオチド（３’−ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡＴＣ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）に分散した水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を、上記（１）で得た固相担体（Ｂ１）に点着した。直ちに、点着後の固相担体を、２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、この固相担体を、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、オリゴヌクレオチドが固定された固相担体（Ｃ１）を得た。この固相担体（Ｃ１）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、３２１０であり、バックグラウンド蛍光強度より大きく増加した。従って、本発明により得られる反応性固相単体を用いる固定化方法により、標的ＤＮＡ断片試料などの標的オリゴヌクレオチド試料が効率よくスライドガラスに結合固定されたことが分かる。
【００９２】
［実施例４］相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
（１）オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製
３’末端が蛍光標識試薬で修飾されていないオリゴヌクレオチドを用いる以外は実施例１と同様にして、オリゴヌクレオチドが固定された固相担体（Ｃ１’）を得た。
（２）相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
５’末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチド試料（ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＣ−５’）をハイブリダイゼーション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、上記（１）で得た固相担体（Ｃ１’）に点着し、表面を顕微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャーチャンバー内にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、このものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、１０７８であり、バックグラウンド蛍光強度より大きく増加した。従って、本発明により得られる反応性固相単体を用いて作製されたオリゴヌクレオチド固定固相担体を用いることによって、固相担体に固定されているオリゴヌクレオチドと相補性を有する標的ＤＮＡ断片試料のような標的オリゴヌクレオチド試料を効率良く検出できることが分かる。
【００９３】
［実施例５］オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製、およびオリゴヌクレオチドの固定量の測定
クロロスルホニルイソシアナートの代わりに、スクシンイミジル（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（０．５ｇ）を用いる以外は、実施例３の（１）と同様にして固相担体（Ｂ２）を作製し、これを用いる以外は実施例３の（２）と同様の操作を行って、オリゴヌクレオチドが固定された固相担体（Ｃ２）を得た。固相担体（Ｃ２）表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、３２５０であり、バックグラウンド蛍光強度より大きく増加した。本発明により得られる反応性固相単体を用いることにより、オリゴヌクレオチドが効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【００９４】
［実施例６］相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
（１）オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製
３’末端が蛍光標識試薬で修飾されていないオリゴヌクレオチドを用いる以外は実施例３と同様にして、オリゴヌクレオチドが固定された固相担体（Ｃ２’）を得た。
（２）標的オリゴヌクレオチド試料の検出
上記（１）で得た固相担体（Ｃ２’）を用いる以外は実施例２と同様にしてスライドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、２３２５であり、バックグラウンド蛍光強度よりも大きく増加した。従って、本発明により得られる反応性固相単体を用いて作製されたオリゴヌクレオチド固定固相担体を用いることによって、オリゴヌクレオチド固定固相担体に固定されているオリゴヌクレオチドと相補性を有する標的ＤＮＡ試料のような標的オリゴヌクレオチド試料を効率良く検出できることが分かる。
【００９５】
［実施例７］オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製、およびオリゴヌクレオチドの固定量の測定
（１）ビニルスルホン化合物−シランカップリング剤結合体の合成
ビニルスルホニルアセト酢酸１．５ｇをテトラヒドロフラン７５ｍＬに溶解したのち、これに３−アミノプロピルトリエトキシシラン２．２ｇ、次いでＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、縮合剤）２．１ｇを添加して、室温で２時間攪拌した。得られた反応混合物を濃縮したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１０／１）により精製することにより、目的の結合体を得た。
【００９６】
（２）ビニルスルホン化合物固定基板の製造
上記の操作により得られたビニルスルホン化合物−シランカップリング剤結合体の２％水溶液を調製し、その水溶液にスライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸したのち取り出し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥して、ビニルスルホン化合物固定基板を得た。
【００９７】
（３）オリゴヌクレオチドの点着と蛍光強度の測定
３’末端および５’末端がそれぞれアミノ基、蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたオリゴヌクレオチド（３’−ＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡＴＣ−５’）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）に分散した水性液（１×１０^-6Ｍ、１μＬ）を、上記（２）で得た固相担体に点着した。点着後の固相担体を直ちに２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、この固相担体を、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩−クエン酸緩衝液）との混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、オリゴヌクレオチドが固定された固相担体を得た。この固相担体表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したところ、３５００であり、バックグラウンド蛍光強度より大きく増加した。従って、本発明の固定化方法により、オリゴヌクレオチドが効率よくスライドガラスに固定されたことが分かる。
【００９８】
［実施例８］オリゴヌクレオチド固定固相担体の作製、およびオリゴヌクレオチドの固定量の測定
（１）ビニルスルホニル基が表面に固定された金電極の作成
表面をアセトンで洗浄した金電極（表面積：２．２５ｍｍ²）の表面に、１１−アミノ−１−ウンデカチオールの水溶液（１ｍＭ）を２μＬ滴下し、室温で水溶液が乾燥しないようにしながら１０時間放置した後、蒸留水とエタノールとで電極表面を順次洗浄した。次いで、この金電極の表面に３％の１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタンを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を２μＬ滴下し、室温で２時間放置した後、蒸留水とエタノールとで電極表面を順次洗浄した。その後、１時間減圧下に乾燥することにより、表面にビニルスルホニル基が連結基を介して結合した金電極を得た。
【００９９】
（２）オリゴヌクレオチドの固定（電気化学的分析素子の製造）
上記の（１）で得た表面にビニルスルホニル基を有する金電極に、５’末端にアミノヘキシル基を導入したチミン２０量体のオリゴヌクレオチド（Ｔ₂₀）の水溶液（１００ピコモル／１μＬ）を２μＬ滴下し、室温で１時間放置した後、余分なオリゴヌクレオチド（Ｔ₂₀）を洗浄除去し、その後、乾燥することによって電気化学的分析素子を製造した。
【０１００】
（３）フェロセンラベル化オリゴヌクレオチドの調製
アデニンの２０量体（Ａ₂₀）の５’末端にアミノヘキシル基リンカーを結合させて、アミノヘキシル基結合オリゴヌクレオチドを得た。
上記で得たアミノヘキシル基結合オリゴヌクレオチドを用いて、竹中等によるAnalytical Biochemistry, 218, 436-443 (1994)に記載されている方法に従い、５’末端がフェロセンで標識されたアデニン２０量体のオリゴヌクレオチド（Ｆ１−Ａ₂₀）を調製した。
【０１０１】
（４）相補的な標的オリゴヌクレオチド試料の検出
上記の（２）で作成した電気化学的分析素子の表面に、上記の５’末端がフェロセンで標識されたアデニン２０量体のオリゴヌクレオチド（Ｆ１−Ａ₂₀）を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを滴下し、２５℃で３０分間インキュベートした。インキュベートが終了したのち、分析素子の表面を純水にて洗浄し、未反応の化合物Ｆ１−Ａ₂₀を除去した。
０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６０）溶液を測定溶液（３８℃）として、１００〜７００ｍＶの印加電圧範囲で、ディファレンシャル・パルス・ボルタンメトリー（ＤＶＰ）を行なったところ、４６０ｍＶの印加電圧において、化合物Ｆ１−Ａ₂₀に由来する応答電流が得られた。
上記の操作と結果によって、オリゴヌクレオチドが金電極の表面に安定に結合固定され、この電極を用いて、電気化学的標識物質によって標識された、相補的な標的ヌクレオチド試料の検出が可能であることが確認された。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明により得られる反応性固相単体を用いる固定方法を利用することによって、固相担体の表面に、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、あるいはペプチド核酸などのヌクレオチド誘導体あるいはその類縁体ヌクレオチドのプローブを安定かつ迅速に固定することができる。従って、本発明により得られる反応性固相単体を用いて作製されたヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体が固定された固相担体は、加水分解によるプローブの離脱が起こりにくい非常に安定な固相担体となる。特に、固相担体として、その表面にアミノ基等をシランカップリング剤を用いて導入した場合には、アミノ基等の固相担体表面への結合も、プローブの結合も共に共有結合であるため、固相担体上に強固にプローブを固定することができる。プローブの安定な固定により、遺伝子解析等に有効に利用することができる高い検出限界を有する検出用具を得ることができる。
【０１０３】
その一つの例として、本発明により得られる反応性固相単体を用いて作製されたオリゴヌクレオチド固定固相担体を用いて、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行なうことにより、オリゴヌクレオチド固定固相担体に固定されているプローブに相補性を有する核酸断片試料を感度よく検出することができる。また、オリゴヌクレオチドなどのプローブ試料を反応性固相担体の表面に点着後、グリシン等のアニオン性化合物で固相担体表面を処理することによって、試料核酸断片の非特的吸着を防ぐことができ、このことは相補性を有する核酸断片試料の高感度の検出に大きな効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明により得られる反応性固相単体を用いて作製される代表的なオリゴヌクレオチド固定固相担体および本発明により得られる反応性固相単体を用いる代表的なオリゴヌクレオチドの固定方法を示す模式図である。
【図２】実施例１の固定方法を示す模式図である。

Claims (4)

1. 表面にアミノ基、メルカプト基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、もしくはカルボキシル基である反応性基が導入された、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体に、下記式：
   【化２】
   Ｘ¹−ＳＯ₂−Ｌ²−ＳＯ₂−Ｘ²
   ［上記の式において、Ｘ¹およびＸ²は互いに独立に、−ＣＲ¹＝ＣＲ²Ｒ³、または−ＣＨＲ¹−ＣＲ²Ｒ³Ｙを表わし；Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、互いに独立に、水素原子、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｙは、ハロゲン原子、−ＯＳＯ₂Ｒ¹¹、−ＯＣＯＲ¹²、−ＯＳＯ₃Ｍ、及び四級ピリジニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；Ｒ¹¹は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基、及び炭素原子数が１乃至６のアルキル鎖を有する合計炭素原子数が７乃至２６のアラルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｒ¹²は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基および炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基からなる群より選ばれる基を表わし；Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子およびアンモニウム基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表わし；そして、Ｌ²は連結基を表わす］
   で表わされるジスルホン化合物を接触させることを特徴とする、ガラス、シリコン、もしくは金属のいずれかからなる固相担体の表面に、一群の、−ＳＯ ₂ −Ｌ ² −ＳＯ ₂ −Ｘ ² で表わされるジスルホニル基が共有結合により固定されてなる反応性固相担体の製造方法。
2. Ｘ ¹ およびＸ ² は、−ＣＨ＝ＣＨ ₂ で表わされるビニル基である請求項１に記載の反応性固相担体の製造方法。
3. 固相担体表面に導入されている反応性基がアミノ基、メルカプト基、もしくはヒドロキシル基である請求項１もしくは２に記載の反応性固相担体の製造方法。
4. 固相担体表面に導入されている反応性基がアミノ基である請求項３に記載の反応性固相担体の製造方法。

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