JP4682160B2

JP4682160B2 - Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法

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Publication number: JP4682160B2
Application number: JP2007017373A
Authority: JP
Inventors: 智義大野; 雅一向出; 一昌引地; 雅史溝上
Original assignee: SRL, INC.
Current assignee: SRL, INC.
Priority date: 1995-02-01
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2016-02-01
Also published as: JP2007175056A

Description

本発明は、新規オリゴヌクレオチド、それから成るＣ型肝炎ウイルスのジェノタイプ判別用プライマー及びそれを用いるＣ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法に関する。

世界各地のＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」ということがある）の遺伝子配列が決定され（例えば特表平５−５００１５５号及び特開平５−３０１８８７号）、その結果、世界各地に異なるタイプのＨＣＶが存在することが明らかになった。従来、ウイルスのタイプ分類は感染源の推定やその地理的分布等の分子疫学的な調査研究を目的に汎用されていたが、ことＨＣＶに関しては、臨床上Ｃ型慢性肝炎患者のインターフェロン治療効果を予測する上でも有用であることがわかり、治療上どうしてもＨＣＶのタイプ分類が必要になった。

ウイルスを分類する場合、従来、ウイルスの抗原性の違いを利用する血清型を利用してなされてきた。しかしながら、血清型では正確なタイプ分類を行うことができないことがわかってきた。一方、ウイルスを構成するタンパク質は遺伝子によりコードされている。そして、その遺伝子の変異により進化していく。従って、ウイルス間の比較をする場合、先に述べた血清型を比較するより、ウイルス遺伝子間の違いを比較した方がより本質的である。すなわち、ＨＣＶについても、ジェノタイプ（遺伝子型）に基づき分類する方がより本質的であり、正確である。

従来、ＨＣＶのジェノタイプの分類は、各研究者によってまちまちであった。従って、ある研究者があるジェノタイプに関する研究を発表したとしても、他の研究者はそのジェノタイプが自分が使っている分類のどれに該当するのかを明確に知ることができず、他の研究者の成果を効率よく利用できなくなっており、問題であった。そこで、国際的にＨＣＶのジェノタイプの分類を統一するために、各国の研究者たちが共同で、統一的なジェノタイプの分類方法を提唱した（Hepatology, 19: 1321-1334, 1994, Correspondence, "A Proposed System for the Nomenclature of Hepatitis C Viral Genotypes"、以下、この分類方法を、便宜的に「国際統一分類法」と呼ぶことがある）。この国際統一分類法は、ＨＣＶのＮＳ−５領域の変異に基づいてＨＣＶを１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、３ｂ、４ａ、５ａ及び６ａの１１タイプに分類するものである。今後、ＨＣＶのジェノタイプは、この分類に基づいて行われるものと予想される。従って、今後もたらされるＨＣＶに関する種々の情報を効率良く利用するためには、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法に基づき分類する必要がある。

特開平５−３０１８８７号は、ＰＣＲを利用してＨＣＶのジェノタイプを判定する方法を開示している。すなわち、各ジェノタイプに特異的な配列を選択し、これらの配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、被検試料中のＨＣＶゲノムのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されるか否か、さらには増幅されるＤＮＡのサイズを測定することにより、ＨＣＶのジェノタイプを分類する方法が記載されている。

特表平５−５００１５５号公報特開平５−３０１８８７号公報 Hepatology, 19: 1321-1334, 1994, Correspondence, "A Proposed System for the Nomenclature of Hepatitis C Viral Genotypes"

しかしながら、この方法では、ジェノタイプの分類が独自のものであり、国際統一分類法に基づいて行われたものではない。従って、この公開公報に記載されているプライマーを用いたのでは国際統一分類法に基づく分類を行うことはできない。また、下記実施例で示されるように、この方法では、一部の型について、ＨＣＶが試料中に存在するにもかかわらず、ＨＣＶ陰性と判定されることがかなりの頻度で起きる。従って、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法に基づいて正確に分類するための手段が求められている。

従って、本発明の目的は、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法に基づいて正確に、かつ、簡便に分類するための手段を提供することである。

本願発明者らは、多数の被検試料を用いて鋭意研究の結果、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法に基づき重複することなく分類することができ、かつ、ＰＣＲによる増幅が効率良く起きるプライマー領域を設定することに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、検体中のＣ型肝炎ウイルスゲノム又はその一部を鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程と、該ｃＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１２及び１７に記載の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドを同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行うことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプ３ａの判別方法を提供する。

本発明により、ＨＣＶのジェノタイプを国際統一分類法に基づいて正確に、かつ、簡便に分類するために用いることができる新規なオリゴヌクレオチド、それからなるプライマー及びそれを用いるＨＣＶのジェノタイプの判別方法が提供された。

なお、本願発明者らは、上記の国際統一分類法による分類に加え、さらに６ｂ（７ａ）、６ｃ（７ｂ）、６ｄ（８ａ）及び６ｇを加えた（GenBank Accession No. D64170及びD64173）。これらのうち、本発明は６ｂの判定を可能にするプライマーをも提供するものであり、６ｂには、ＶＮ７８７(GenBank Accession No. D17486)、ＶＮ８４３(GenBank Accession No. D17489)、ＶＮ５４０ (GenBank Accession No. D14209) 、Ｂ５及びＢ７株(GenBank Accession No. D64170 及びD64173) が含まれる。

上述のように、本発明の方法に用いることができるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１〜３０、４７、４８、６６〜６９で示されるものである。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合に、各プライマーがハイブリダイズするＨＣＶゲノム上の領域、該領域のセンス鎖又はアンチセンス鎖の別、そのプライマーによって判別できる型及び本願発明者らが便宜的に付したプライマー名を下記表１に示す。

＊：「センス又はアンチセンス」の表示は、プライマーがハイブリダイズするＤＮＡ鎖がセンス鎖かアンチセンス鎖かを示す。

なお、上記表１において、「コンセンサス」は、全ての型に共通にハイブリダイズするプライマーである。また、配列番号２において、「Ｎ」はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＩ（イノシン）を示す。

なお、上記表１における、各ジェノタイプのゲノム上の領域の塩基番号の基準となるＨＣＶの株名及び該塩基番号を記載した文献を下記表２に示す。

＊：１ａのうち、配列番号２５〜２８
文献１：Ohno, T. et al., Thesis (1993) The University of Tokyo, "Hepatitis C Virus"
文献２：Wu Rong-Rong et al, Journal of Medical Virology (1994, in press)
文献３：Ohno Tomoyoshi et al., Journal of Gastroenterology (1994, in press)
文献４：Ohno Tomoyoshi et al., Journal of Medical Virology 42: 409-413 (1994)
文献５：Bukh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 8239-8243 (1994)
文献６：Choo, Q.-L., et al, "Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2451-2455 (1991)

なお、後述のＰＣＲにより増幅されるものは二本鎖ｃＤＮＡであるから、上記各オリゴヌクレオチドとそれぞれ相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド同士の組合せをプライマーとして用いても同じ領域が増幅される。従って、これらの相補的なオリゴヌクレオチドもＨＣＶのジェノタイプ判別のためのプライマーとして用いることができ、本発明の範囲内に入る。

上記の各オリゴヌクレオチドは、市販のＤＮＡ合成機を用いた化学合成により容易に調製することができる。

本発明の方法により、検体中のＨＣＶのジェノタイプを分類するためには、先ず、検体中のＨＣＶのＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡの調製は、逆転写酵素とプライマーを用いて行うことができ、この方法自体は周知であり、その一例が下記実施例にも記載されている。

次いで、得られたｃＤＮＡを鋳型として、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行う。ＰＣＲの方法自体は、この分野において周知であり（Saiki et al., Science, 239, 487-491, 1988)、センス鎖にハイブリダイズするプライマーとアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマーとを用い、これらのプライマーと鋳型ＤＮＡと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、アニーリング、伸長、変性の工程から成るサイクルを２０回ないし４０回程度繰り返すことにより行うことができる。ＰＣＲの一例も下記実施例に記載されている。

ＰＣＲには常に少なくとも一対のプライマーが必要であり、これらは鋳型ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれハイブリダイズする必要がある。従って、判別しようとする型のためのプライマー（表１参照）を選び、これと反対側の鎖にハイブリダイズするプライマー（コンセンサスプライマー又はその型のためのプライマー）を選んで上記ＰＣＲを行う。特定の型を判別するためのプライマーは、その型の鋳型ＤＮＡにのみハイブリダイズし、他の型の鋳型ＤＮＡにはハイブリダイズできないので、そのプライマーを用いてもし増幅が起きれば、検体中のＨＣＶがその型のジェノタイプであることがわかる。

もっとも、１対ずつのプライマーを用いてジェノタイプ判別を行っていたのでは、１つの検体についてＰＣＲを何回も行わなければならないので、不便である。もし、３種以上のプライマーを同時に用いてＰＣＲを行い、ジェノタイプに応じて異なるサイズの領域が増幅されるのであれば、１回のＰＣＲで複数のジェノタイプの判別を行うことができるので有利である。本発明のプライマーは、そのように選択されており、これらを混合して用いてＰＣＲを行うと、各ジェノタイプに応じて異なるサイズの領域が増幅されるように設定されている。

もっとも、本発明のプライマーを全て混合してＰＣＲを行うと、後の電気泳動工程において検出すべきバンドの数が多くなりすぎ、また、近いバンドを識別して検出する必要があるので、型判別が容易ではなくなる。もっとも、十分に大きなゲルを用いて時間をかけて電気泳動を行えば、近接したサイズのバンドでも離れた位置に検出することが可能であるので、全プライマーを混合して用いることもできる。

上述のように、全てのプライマーを混合して用いるとかえって不便であるので、３個以上のプライマーをセットで用いることが好ましい。この場合、各プライマーセットにはコンセンサスプライマーを１対（センス及びアンチセンス）含めておくことが好ましい。一対のコンセンサスプライマーを含めておくと、ＨＣＶが検体中に存在すれば、そのジェノタイプにかかわらず、必ず増幅バンド（以下、一対のコンセンサスプライマーにより増幅されたバンドをコンセンサスバンドと言うことがある）が検出されるので、もしも、各ジェノタイプ特異的プライマーによってバンドが全く検出されなかった場合に、検体がＨＣＶ陰性なのか、検体に含まれるＨＣＶの型が用いたプライマーでは検出できないものであるのかを知ることができるので好ましい。さらに、各プライマーセットに１つのジェノタイプを検出するためのプライマーを複数含ませることもできる。このようにすれば、１つのプライマーが増幅に失敗したとしても、同じジェノタイプを検出する他のプライマーでうまく複製が起きれば、そのジェノタイプを検出することができるので、判定の確実性を高めることができる。

本願発明者らは、このような点を考慮に入れて、実際に検体の分析を行う上で極めて好ましいプライマーの組合せを設定することに成功した。下記表３〜１７にそれらを示す。もっとも、プライマーの組合せは、下記具体例に限定されるものではなく、要は、各ジェノタイプを増幅するためのセンス及びアンチセンスプライマーがそれぞれ含まれていればよい。

(1) プライマーセット１（１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂの型判別用）

(2) プライマーセット２（１ａ、３ａ、４ａ、５ａ、６ａの型判別用）

(3) プライマーセット３（１ｂ、２ａ、２ｂの型判別用）

(4) プライマーセット４（１ａの型判別用）

(5) プライマーセット５（１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂの型判別用）

(6) プライマーセット６（１ａ、１ｂの型判別用）

(7) プライマーセット７（１ｂ、２ａ、２ｂの型判別用）

(8) プライマーセット８（１ｂ、２ａ、２ｂ、３ｂの型判別用）

（なお、ＯＭＭ３ｂはＯＭＭ１５の配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号４２に示されている）。

(9) プライマーセット９（１ａ、３ａ、４ａ、５ａの型判別用）

（なお、ＯＭＭ１ａＳ、ＯＭＭ１ａＡ、ＯＭＭ３ａ、ＯＭＭ４ａ及びＯＭＭ５ａは、それぞれＯＭＭ２１、ＯＭＭ２１１、ＯＭＭ２３、ＯＭＭ２４及びＯＭＭ２５の塩基配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号４５、４６、４１、４３及び４４にそれぞれ示されている。）

(10)プライマーセット１０（１ａ、３ａ、４ａ、５ａ、６ａの型判別用）

(11)プライマーセット１１（１ａ、３ａ、４ａ、５ａ、６ａの型判別用）

（なお、ＯＭＭ２１ＴＣＳは、ＯＭＭ２１ＴＣの塩基配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号４９に示されている）。

(12)プライマーセット１２（１ｂ、２ａ、２ｂの型判別用）

（なお、ＯＭＭ１ｂ、ＯＭＭ２ａＳ、ＯＭＭ２ａＡ及びＯＭＭ２ｂは、それぞれＯＭＭ１１、ＯＭＭ１２１、ＯＭＭ１３及びＯＭＭ１４の塩基配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号６２、６３、６４及び６５にそれぞれ示されている）。

(13)プライマーセット１３（１ａの型判別用）

（なお、ＯＭＭ２２Ｃは、ＯＭＭ２２の塩基配列を限定したもので、その塩基配列は配列表の配列番号３５に示されている）。

(14)プライマーセット１４（３ａ、４ａ、５ａの型判別用）

(15)プライマーセット１５（３ｂ、６ａ、６ｂの型判別用）

上記から明らかなように、各プライマーセットを単独で用いたのでは、各表の冒頭に記載したジェノタイプの検出しか行うことができない。しかしながら、上記のプライマーセットの複数を別個に用いて各検体についてＰＣＲを行うことにより、より多くのジェノタイプの判別を行うことができる。例えば、上記プライマーセット１及び２を別個に用いてＰＣＲを行うことにより、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、４ａ、５ａ及び６ａのジェノタイプを判別することができる。

下記実施例に記載するように、上記の各プライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合の電気泳動パターンが図１ないし図１５に示されている。

次いで、ＰＣＲにより増幅された増幅産物を検出する。増幅産物の検出は、ゲル電気泳動により行うことが好ましい。ＤＮＡのゲル電気泳動による分離、検出方法は、この分野において周知であり、また、一例が下記実施例に記載されている。

なお、ジェノタイプ特異的プライマーを用いる増幅に先立ち、一対のコンセンサスプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、次いで、ジェノタイプ特異的プライマー（例えば、上記プライマーセット）を用いてＰＣＲを行うことにより、分析の感度をさらに高めることができる。好ましいプライマーとして、ＯＭＭ１とＯＭＭ２の組合せを挙げることができる。

なお、上記本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーとしてのみならず、適当な標識を付すことにより、ＨＣＶジェノタイプ判別用のプローブとして用いることも可能である。この場合には、上記各オリゴヌクレオチドよりも延長されたものであってよく、特に３’末端方向に数塩基延長されたものでもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするＨＣＶゲノムの領域には、各ジェノタイプに特異的なアミノ酸配列を有するペプチドをコードするものがある。従って、それらのアミノ酸配列と特異的に反応する抗体をＨＣＶと反応させることにより、検体中に含まれるＨＣＶの型判別を直接的に行うことができる。また、それらのアミノ酸配列を含むペプチドを血清等の体液と反応させることにより、該体液中に含まれる、各ＨＣＶジェノタイプに特異的な抗体を検出することができ、それによって、ＨＣＶの型判別を行うことができる。これらは、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡや放射免疫測定法、ラテックス凝集法等の周知のイムノアッセイにより容易に行うことができる。

本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域のＨＣＶゲノムがコードする各ジェノタイプに特異的なアミノ酸配列は、配列表の配列番号５０〜６１に示されており、各オリゴヌクレオチドの名称、該アミノ酸配列（配列番号で示す）及び該アミノ酸配列に特異的なＨＣＶジェノタイプを下記表１８に示す。

以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において用いたプライマーは、そのプライマーを示す配列表に記載された配列中に複数の塩基を示す記号が用いられている場合には、それらの記号により示される塩基の混合物を用いた。

実施例１
(1) 試料の調製
ＨＣＶキャリアの血清１００μｌ（２１３検体）をＲＮＡｚｏｌＢ（商品名、ｂｉｏｔｅｘｉｎｃ．，ＵＳＡ）９００μｌ及びクロロホルム１５０μｌと混合し、５秒間攪拌し、−２０℃で５分間インキュベートした。次いで、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を５００μｌのイソプロパノール及び２０μｇのグリコーゲンと混合し、−２０℃で１５分間インキュベートした。次いで、これを１２０００ｒｐｍで２０分間遠心した。沈殿に７５％エタノールを１ｍｌ加え、懸濁後、１２０００ｒｐｍで３分間遠心した。この７５％エタノール処理〜遠心操作をさらに２回行い、沈殿をデシケーター中で１５分間乾燥させ、精製されたＲＮＡを得た。

(2) プライマーの調製
オリゴヌクレオチド（プライマー）は、Model 394 DNA シンセサイザ（商品名、Perkin-Elmer Corporation) 又は8909 expedite (TM) Nucleic Acid synthesis system（商品名、Milipore Corporation) で合成した。さらに、ＯＰＣカラム又はＨＰＬＣを用いて常法により精製した。

(3) ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成は、精製乾燥したＲＮＡを１５μｌのＤＥＰＣ処理水（Milli-Q reagent water system（ミリポア社製）で精製した水に０．２％になるようにジエチルピロカーボネートを加え、１６時間攪拌し、さらに高温高圧滅菌（オートクレーブ）処理した水）に溶解し、６０℃で５分加温後、１００単位のモロニーネズミウイルス逆転写酵素（Molony murine virus reverse transcriptase 、商品名；GIBCO-BRL, USA) を含む逆転写溶液（５０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.3) 、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭ MgCl_２、１０ｍＭジチオスレイトール）を１５μｌ加え、４２℃で６０分加温し行った。なお、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしては、ＯＭＭ２を１０ｐｍｏｌ用いた。

(4) ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、コンセンサスプライマーＯＭＭ１及びＯＭＭ２を用いて上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅（Saiki ら、Science 239, 481-491, 1988) した。反応溶液は１０ｍＭ Tris-HCl (pH 8.3)、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、５０ｍＭＫＣｌ、８００μＭｄＮＴＰ、１．２５単位のAmpliTaq DNA polymerase （商品名、日本ROCHE)、プライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ２がそれぞれ５ｐｍｏｌで行った。ＰＣＲ条件はサイクル３５、変性９４℃、３０秒、アニール５０℃、３０秒、伸長７２℃、１分で行った。さらに増幅産物を上記プライマーセット１、２、３又は４でそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅（ＰＣＲサイクル２５、変性９４℃、３０秒、アニール６２℃、３０秒、伸長７２℃、１分）を行った。

(5) 電気泳動
得られた増幅産物を、アガロースゲル（トリス−ボレートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電気泳動（１５０Ｖ定電流）した。電気泳動後、紫外線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を行った。バンド移動度の差異により型判定を行った。

(6) 結果
各プライマーセット１、２、３及び４を用いて得られた電気泳動パターンをそれぞれ図１、２、３及び４に示す。各図において、一番左側のレーンは分子量マーカーの泳動パターンを示す。また、各レーン中、コンセンサスバンドは、各プライマーセットに含まれるコンセンサスプライマーにより増幅された増幅産物のバンドであり、検体中にＨＣＶが存在すれば、そのジェノタイプに関係なく、常に一定の位置に現れるものである。各ジェノタイプに特有のバンドの右側には短い矢印を付して示した。この矢印で示されるバンドが検出されれば、その検体のＨＣＶジェノタイプは、そのバンドのあるレーンの頂部に記載された型のジェノタイプである。各図から明らかなように、本発明のプライマーを用いることにより、ＨＣＶのジェノタイプの分類を国際統一分類に従って行うことができることが確認された。

実施例２
ｃＤＮＡ増幅の際に用いるプライマーとしてランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを用い、１回目のＰＣＲにＯＭＭ１、ＯＭＭ２及びＯＭＭ３をプライマーとして用い、２回目のＰＣＲにプライマーセット５を用い、かつ、プライマー濃度が１０ｐｍｏｌであることを除き、実施例１と同様に行った。得られた電気泳動パターンを図５に示す。

比較例１
上記の２１３検体を、特開平５−３０１８８７号に記載の方法により型判別を行った。その結果、上記本発明の実施例により型判別可能であった２２検体（２ａ型２０例、２ｂ型２例）について、どのプライマーを用いても増幅が起きなかった（ＨＣＶ陰性）。なお、上記２１３検体は全て、５’非翻訳領域に設定したプライマーＹＣＳ、ＹＣＳ２及びＭＳ１３を用いたＰＣＲ（特願平６−１４２５６４号の第４０段落に記載）により、ＨＣＶ陽性であることを各検体について３回確認しているＨＣＶ陽性検体である。

実施例３、４
塩基配列を決定したＨＣＶ株１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂそれぞれ５例ずつの血清から実施例１と同様にしてＲＮＡを抽出し、ＯＭＭ２のうち配列番号３１で示される塩基配列を有するものを用いて実施例１と同様にｃＤＮＡ合成を行った。

次いで、ＯＭＭ２のうち配列番号３１で示される配列を有するものと、ＯＭＭ１のうち配列番号３２で示される塩基配列を有するものとをプライマーとして用い、１回目のＰＣＲを９４℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、６０秒のサイクルで３５サイクル行った。その５０分の１（１μｌ）をさらにＰＣＲで増幅した。この２回目のＰＣＲは、上記プライマーセット６（実施例３）又はプライマーセット７（実施例４）を用いて行った。もっとも、各プライマーセット中、ＯＭＭ２１、ＯＭＭ２１１、ＯＭＭ２２、ＯＭＭ１１、ＯＭＭ１２、ＯＭＭ１３及びＯＭＭ１４は、それぞれ、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９で示される塩基配列を有するものを用いた。２回目のＰＣＲは９４℃、３０秒、６２℃、３０秒、７２℃、６０秒のサイクルで２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を実施例１と同様にアガロース電気泳動で分離した。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図６及び図７に示す。

実施例５〜８
上記プライマーセット８（実施例５）、プライマーセット９（実施例６）、プライマーセット１０（実施例７）又はプライマーセット１１（実施例８）を用いて２回目のＰＣＲを行うことを除き、実施例３及び４と同様な操作を行った。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図８、図９、図１０及び図１１に示す。

実施例９〜１２
血清は２００例のＣ型慢性肝炎患者由来のものを用いた。ＲＮＡは、ＲＮＡｚｏｌＢ（商品名；ＢｉｏＬａｂ）で血清１５０μl より調整した。ｃＤＮＡ合成は、300ng のランダムヘキサマー（商品名；ギブコＢＲＬ）、１００ＵのＭＭＬＶ−ＲＴ（商品名；ギブコＢＲＬ）、５０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（商品名；宝酒造）を用い、３０μl の系で１時間、３７゜Ｃでインキュベーションした。ｃＤＮＡ１０μl を、上記１ｓｔ−ＰＣＲ用プライマーＯＭＭ１、２、３各１００ｎｇを用い、５０μl の系で、９４℃、２０秒、５０℃、２０秒、７２℃、４５秒、３５回でＰＣＲを行った。その１μl をそれぞれの型判別用プライマーセット１２（実施例９）、１３（実施例１０）、１４（実施例１１）、１５（実施例１２）で２ｎｄ−ＰＣＲを行った。条件は９４℃、２０秒、６２℃、２０秒、７２℃、４５秒、２５回で増幅バンドを３％アガロース(0.5% EtBr 含む）電気泳動（１５０Ｖ、３０分）でＤＮＡサイズマーカー、φX174/HaeIII digest（商品名；東洋紡）で検出されるバンドと比較しジェノタイプを判定した。得られた電気泳動パターンをそれぞれ図１２、図１３、図１４及び図１５に示す。

実施例１３
１１カ国のＣ型慢性肝炎患者由来の血清を用いて、ＨＣＶの型判別を行った。この検査は具体的には次のように行った。

（１）試料の調製等は、実施例１と同様に行い、ｃＤＮＡ合成は、プライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ２、ＯＭＭ３及び、ランダムヘキサマー（商品名；ギブコＢＲＬ）を使用した。

（２）ＰＣＲ
検出感度を上げるために、１回目のＰＣＲでは、コンセンサスプライマーＯＭＭ１、ＯＭＭ２およびＯＭＭ３を用いて上記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。さらに増幅産物を下記表１９〜２２に示すプライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄでそれぞれ２回目のＰＣＲ増幅（ＰＣＲサイクル２５、変性９４℃、１５秒、アニール６２℃、１５秒、伸長７２℃、４５秒）をおこなった。

プライマーセット
１）プライマーセットＡ（１ｂ、２ａ、２ｂの型判別用）

２）プライマーセットＢ（１ａの型判別用）

３）プライマーセットＣ（３ａ、５ａ、４の型判別用）

４）プライマーセットＤ（３ｂ、６ａ、６ｂの型判別用）

（３）電気泳動
得られた増幅産物を、３％アガロースゲル（トリス−ボレートバッファー、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム）で電気泳動（１５０Ｖ定電流）した。電気泳動後、紫外線照射下で、ポラロイド（ポラロイドタイプ６６７）撮影を行った。バンド移動度の差異により型判定を行った。

上記の方法において、各プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのそれぞれについて得られた電気泳動パターンを図１６ないし図１９にそれぞれ示す。また、上記方法により判別された型を有する人数を地域別に下記表２３に示す。

＊：パキスタン／バングラデシュ

プライマーセット１を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット２を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット３を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット４を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット５を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット６を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット７を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット８を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット９を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット１０を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット１１を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット１２を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット１３を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット１４を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセット１５を用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセットＡを用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセットＢを用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセットＣを用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。プライマーセットＤを用いてＰＣＲを行って得られた電気泳動パターンの模式図である。

Claims

検体中のＣ型肝炎ウイルスゲノム又はその一部を鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程と、該ｃＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号１２及び１７に記載の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドを同時にプライマーとして用いてＰＣＲを行うことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプ３ａの判別方法。
前記配列番号１２に記載の塩基配列が配列番号４１に記載の塩基配列である請求項１記載の方法。