PL169880B1 - Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia watroby C PL PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia watroby C PL PL PLInfo
- Publication number
- PL169880B1 PL169880B1 PL92301282A PL30128292A PL169880B1 PL 169880 B1 PL169880 B1 PL 169880B1 PL 92301282 A PL92301282 A PL 92301282A PL 30128292 A PL30128292 A PL 30128292A PL 169880 B1 PL169880 B1 PL 169880B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- nucleic acid
- region
- hcv
- genotype
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 149
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 130
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 130
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 66
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 3
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 127
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- VJZUZDUNMYBEKF-TWXZUWJZSA-N (2r)-2-amino-3-[(e)-2-chloro-1,2-difluoroethenyl]sulfanylpropanoic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CS\C(F)=C(/F)Cl VJZUZDUNMYBEKF-TWXZUWJZSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 7
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 52
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 51
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Chemical group 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 101100282617 Bovine herpesvirus 1.1 (strain Cooper) gC gene Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 6
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- -1 latex Chemical class 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical class C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000724832 Non-A, non-B hepatitis virus Species 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical compound O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 6-Maleimidocaproic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O WOJKKJKETHYEAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 241000744472 Cinna Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013138 Drug Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010065556 Drug Receptors Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102100039019 Nuclear receptor subfamily 0 group B member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-STQMWFEESA-N Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M Saccharin sodium Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)[N-]S(=O)(=O)C2=C1 WINXNKPZLFISPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N bromoacetic acid Chemical compound OC(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000004931 filters and membranes Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000000891 luminescent agent Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 108700007621 mifamurtide Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N trehalose 6,6'-dimycolate Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)C(CCCCCCCCCCC3C(C3)CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)O2)O)O1)O)OC(=O)C(C(O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC)CCCCCCCCCCC1CC1CCCCCCCCCCCCCCCCCC XETCRXVKJHBPMK-MJSODCSWSA-N 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
- A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
- C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
1. Sposób wytwarzania produktu hybry- dyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapale- nia watroby C, znamienny tym, ze umieszcza sie kwas nukleinowy posiadajacy sekwencje nukleotydowa nie-HVC-1 osmiu lub wiecej nukleotydów w genomie wirusa zapalenia watroby C odpowiadajaca co najmniej jed- nemu z regionów zawierajacych region otoczki 1, region 5'UT, i region rdzenia odpowiadaja- cych sekwencjom o numerach 2-22, 24-32, 34- 51 i 53-66 na wykazie sekwencji, w warunkach, które to warunki hybrydyzacji moga wymusic zdolnosc tego kwasu nukleinowego do two- rzenia produktu hybrydyzacji z kwasem nukle- inowym wirusa zapalenia watroby C, i wymu- sza sie warunki hybrydyzacji dla utworzenia produktu hybrydyzacji w obecnosci kwasu nukleinowego wirusa zapalenia watroby C. F ig u r a 1 PL PL PL
Description
Zgłoszenie to jest kontynuacją w części opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 07/697 326, zatytułowanego „Sondy polinukleotydowe użyteczne do wykrywania wirusa zapalenia wątroby C“, zgłoszonego 8 maja 1991 r.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia wątroby C. Wirus zapalenia wątroby C (HCV) dawniej określany był jako przenoszona przez krew infekcja wirusem zapalenia wątroby nie-A nie-B (NANBV). Rozwiązanie niniejszego wynalazku pozwala na wytworzenie kompozycji oraz odpowiednich metod do wykrywania HCV jak również do opracowywania szczepionek do profilaktycznego leczenia infekcji HCV oraz opracowywania produktów zawierających przeciwciała do nadawania biernej odporności na HCV.
Podstawa wynalazku.
Prototypowy izolat HCV scharakteryzowano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 122714 (patrz także publikacja europejskiego opisu patentowego numer 318 216). W znaczeniu tu stosowanym, termin „HCV“ obejmuje nowe izolaty tego samego gatunku wirusowego. Termin „HCV-1“ odnosi się do terminu podanego w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 122714.
HCV wywołuje zakaźną chorobę, odróżnialną od innych postaci związanych z wirusami chorób wątroby, włącznie z tymi powodowanymi przez znane wirusy zapalenia wątroby, tj. wirusa zapalenia wątroby A (HAV), wirusa zapalenia wątroby B (HBV) i wirusa zapalenia wątroby delta (HDV), jak również zapalenia wątroby indukowanego przez cytomegalowirusa (CMV) lub wirusa Epsteina-Barra (EBV). HCV po raz pierwszy zidentyfikowano u osobników, którzy przeszli transfuzje krwi.
Istnieje znaczna potrzeba czułych, specyficznych metod wykrywania i identyfikowania nosicieli HCV oraz krwi lub produktów krwiopochodnych zanieczyszczonych HCV. Potransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) występuje u około 10% poddawanych transfuzji pacjentów, a HCV odpowiada za aż do 90% tych przypadków. Choroba często prowadzi do trwałego uszkodzenia wątroby (25-55%).
Opieka nad chorym, jak również zapobieganie zakażeniom HCV przez krew bądź produkty krwiopochodne, lub przez bliskie kontakty osobiste, wymagają skutecznych narzędzi do wyszukiwania, diagnozowania i prognozowania, przeznaczonych do wykrywania kwasów nukleinowych, antygenów i przeciwciał związanych z HCV.
Informacje w tym zgłoszeniu sugerują, że HCV ma kilka genotypów. To jest, informacja genetyczna wirusa HCV może nie być całkowicie identyczna dla wszystkich HCV, ale obejmować grupy o różniącej się informacji genetycznej.
Informacja genetyczna przechowywana jest w nitkowatych cząsteczkach DNA lub RNA. DNA składa się z łańcuchów połączonych kowalencyjnie dezoksyrybonukleotydów, a RNA składa się z łańcuchów połączonych kowalencyjnie rybonukleotydów. Swoisty charakter każdemu nukleotydowi nadaje jedna z czterech zasad: adenina (A), guanina (G), tymina (T) i cytocyza (C).
169 880
Zasady są komplementarne w tym sensie, że dzięki orientacji grup funkcyjnych, pewne pary przyciągają się i wiążą się ze sobą wzajemnie przez wiązania wodorowe i oddziaływania warstwowe π. Adenina z jednej nici DNA tworzy parę z tyminą z przeciwnej nici komplementarnej. Guaninaz jednej nici N^^A tworzy parę z cytozyną z przeciwnej nici komplementarnej. W RNA tyminę zastępuje urcyl (U), który tworzy parę z adeniną z przeciwnej nici komplementarnej. Kod genetyczny żywych organizmów przenoszony jest w sekwencji par zasad. Żywe komórki dokonują interpretacji, transkrypcji i translacji informacji kwasu nukleinowego w celu wytworzenia białek i peptydów.
Genom HCV składa się z pojedynczej, dodatniej nici RNA. Genom HCV posiada ciągłą translacyjną otwartą ramkę odczytu (ORF), która koduje poliproteinę od długości około 3000 aminokwasów. Wydaje się, że w ORF białka (o) strukturalne kodowane są w mniej więcej pierwszej ćwiartce regionu N-końcowego, przy czym większa część poliproteiny odpowiedzialna jest za białka niestrukturalne.
Poliproteina HCV obejmuje, od końca aminowego do końca karboksylowego, białko nukleokapsydu (C), białko otoczki (E) i białka niestrukturalne (NS) 1, 2 (b), 3, 4 (b) i 5.
HCV o różniących się genotypach mogą kodować białka, które wywołują zmienioną odpowiedź układu immunologicznego gospodarza. HCV o różniących się genotypach mogą być trudne do wykrycia technikami diagnostyki immunologicznej i technikami sond kwasów nukleinowych, które nie są specyficznie nastawione na taki genotyp.
Definicje wybranych terminów stosowanych w zgłoszeniu przedstawiono poniżej dla ułatwienia zrozumienia wynalazku. Termin „odpowiadający oznacza homologiczny z lub komplementarny do określonej sekwencji kwasu nukleino wego. Przy stosowaniu w przypadku kwasów nukleinowych i peptydów, odpowiadający odnosi się do aminokwasów lub peptydu w kolejności określonej sekwencją kwasu nukleinowego bądź nici do niego komplementarnej.
Termin „nie występujący naturalnie kwas nukleinowy odnosi się do części genomowego kwasu nukleinowego, cDNA, półsyntetycznego kwasu nukleinowego lub kwasu nukleinowego pochodzenia syntetycznego, który, z racji swojego pochodzenia lub w wyniku manipulacji: (1) nie jest połączony z całym kwasem nukleinowym, z którym jest połączony w przyrodzie, (2) jest związany z kwasem nukleinowym lub innym czynnikiem chemicznym innym niż ten, z którym jest związany w przyrodzie, lub (3) nie występuje w przyrodzie.
Termin „para wiążąca odnosi się do każdej pary cząsteczek, która wykazuje wzajemne powinowactwo lub zdolność wiązania. Dla celów niniejszego zgłoszenia, termin „ligand będzie odnosić się do jednej cząsteczki pary wiążącej, a termin „antyligand lub „receptor bądź „cel będzie odnosić się do drugiej cząsteczki pary wiążącej. Na przykład, w odniesieniu do kwasów nukleinowych, para wiążąca może obejmować dwa komplementarne kwasy nukleinowe. Jeden z kwasów nukleinowych można nazwać ligandem, a drugą nić nazywa się antyligandem, receptorem lub celem. Nazwa ligand lub antyligand jest przedmiotem arbitralnej wygody. Inne pary wiążące obejmują, na przykład, antygeny i przeciwciała, leki i miejsca receptorowe leków oraz enzymy i substraty enzymów, wymieniając niektóre.
Termin „oznacznik odnosi się do reszty cząsteczkowej możliwej do wykrywania, włącznie z, na przykład, ale nie wyłącznie, izotopami radioaktywnymi, enzymami, czynnikami luminescencyjnymi, czynnikami wytrącającymi i barwnikami.
Termin “podłoża obejmuje konwencjonalne podłoża, takie jak sączki i membrany, jak również podłoża możliwe do odzyskania, które można w znacznym stopniu rozproszyć w środowisku i usunąć lub oddzielić od środowiska przez immobilizację, sączenie, rozdzielanie lub podobne. Termin „podłoże pośrednie odnosi się do podłóż, które można wiązać z kwasami nukleinowymi, peptydami lub przeciwciałami przez partnerów wiążących, bądź wiązania kowalencyjne bądź niekowalencyjne.
Zidentyfikowano liczne szczepy i izolaty HCV. Porównując z sekwencją oryginalnego izolatu pochodzącego ze Stanów Zjednoczonych Ameryki („HCV-1 patrz Q.-L. Choo i in. (1989) Science 244; 359-362, Q.-L. Choo i in. (1990) Brit. Med. Bull. 46:423-441, Q.-L. Choo i in. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2451-2455 (1991) oraz publikacja europejskiego opisu patentowego numer 318216, cytowana powyżej), stwierdzono ze izolat japoński („HCV J1) znacznie się różnił zarówno sekwencją nukleotydową, jak i polipeptydową, w regionach NS3 i NS4. Wniosek ten rozciągnięto później na
169 880 regiony NS5 i otoczki (E1/S i E2/NS1) (patrz K. Takeuchiiin., J. Gen. Virol. (1990)71: 3027-3033, Y. Kubo, Nucl. Acids. Res. (1989) 17:10367-10372 oraz K. Takeuchi i in., Gene (1990) 91:287-291). Pierwszą grupę izolatów, pierwotnie zidentyfikowanych w Stanach Zjednoczonych Ameryki, określa się w niniejszym ujawnieniu „Genotyp I“, podczas gdy późniejszą grupę izolatów, początkowo zidentyfikowanych w Japonii, określa się tu „Genotyp II“.
Stwierdzono, że kwas nukleinowy odpowiadający agenomowi wirusowemu HCV, charakterystyczny dla różnych genotypów, jest użyteczny jako sonda w oznaczeniu hybrydyzacji kwasów nukleinowych, jako starter reakcji obejmujących syntezę kwasów nukleinowych, jako partner wiążący do oddzielania wirusowego kwasu nukleinowego HCV od innych składników, które mogą być obecne, oraz jako antysensowny kwas nukleinowy do zapobiegania transkrypcji lub translacji wirusowego kwasu nukleinowego. Bardziej szczegółowo, wskazano, że do tego celu korzystny jest nie występujący naturalnie kwas nukleinowy posiadając sekwencję kwasu nukleinowego co najmniej ośmiu nukleotydów odpowiadających sekwencji nukleotydowej genomu wirusa zapalenia wątroby C nie-HCV-1. Spośród tych sekwencji korzystne są sekwencje nukleotydowe wybierane spośród sekwencji obecnej w co najmniej jednym regionie spośród regionu NS5, regionu otoczki 1, regionu 5'UT i regionu rdzenia.
W odniesieniu do sekwencji, które odpowiadają regionowi NS5, sekwencję wybiera się spośród sekwencji o numerach 2-22. Sekwencja numer 1 odpowiada HCV-1. Sekwencje o numerach 1-22 zdefiniowano w Liście Sekwencji tego zgłoszenia. W odniesieniu do sekwencji odpowiadających regionowi otoczki 1, sekwencję wybiera się spośród sekwencji o numerach 24-32. Sekwencja numer 23 odpowiada HCV-1. Sekwencje o numerach 23-32 przedstawiono w Liście Sekwencji tego zgłoszenia. W odniesieniu do sekwencji, które odpowiadają regionom 5'UT, sekwencję wybiera się spośród sekwencji o numerach 34-51. Sekwencja numer 33 odpowiada HCV-1. Sekwencje numer 33-51 przedstawiono w Liście Sekwencji tego zgłoszenia. W odniesieniu do sekwencji, które odpowiadają regionowi rdzenia, sekwencję wybiera się spośród sekwencji o numerach 53-66. Sekwencja numer 52 odopwiada HCV-1. Sekwencje 52-66 przedstawiono w Liście Sekwencji tego zgłoszenia.
Kompozycje nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego o sekwencjach opisanych wyżej tworzą produkty hybrydyzacji z kwasami nukleinowymi odpowiadającymi różnym genotypom HCV.
HCV posiada co najmniej pięć genotypów, które będą opisywane w tym zgłoszeniu pod oznaczeniami GI-GV. Przykładami pierwszego genotypu, GI, są sekwencje o numerach 1-6,23-25, 33-38 i 52-57. Przykładami drugiego genotypu, GII są sekwencje o numerach 7-12, 26-28, 39-45 i 58-64. Przykładami trzeciego genotypu, GIII są sekwencje o numerach 13-17, 32, 46-47 i 65-66. przykładami czwartego genotypu, GIV, są sekwencje o numerach 20-22,29-31 i 48-49. Przykładami piątego genotypu, GV, są sekwencje o numerach 18, 19, 50 i 51.
Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia wątroby C polega na tym, że umieszcza się kwas nukleinowy posiadający sekwencję nukleotydową nie-HCV-1 ośmiu lub więcej nukleotydów w genomie wirusa zapalenia wątroby C odpowiadającą co najmniej jednemu z regionów zawierających region otoczki 1, region 5' UT i region rdeeni odpowiadających sekwencjom o numerach 2-22, 24-32, 34-51 i 53-66 na wykazie sekwencji w warunkach, które to warunki hybrydyzacji mogą wymusić zdolność tego kwasu nukleinowego do tworzenia produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia wątroby C, i wymusza się warunki hybrydyzacji dla utworzenia produktu hybrydyzacji w obecności kwasu nukleinowego wirusa zapalenia wątroby C.
Tworzenie produktu hybrydyzacji w sposobie według wynalazku jest użyteczne do wykrywania obecności jednego lub więcej genotypów HCV. Korzystnie, nie występujący naturalnie kwas nukleinowy tworzy produkt hybrydyzacji z kwasem nukleinowym HCV w jednym lub więcej regionach, obejmujących region NS5, region otoczki 1, region 5'UT i region rdzenia. Do wykrywaia produktu hybrydyzacji, korzystne jest w sposobie według wynalazku związanie nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego ze znacznikiem. Tworzenie produktu hybrydyzacji wykrywa się przez rozdzielenie produktu hybrydyzacji od znakowanego, nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego, który nie utworzył produktu hybrydyzacji. Również w sposobie według wynalazku tworzenie produktu hybrydyzacji jest użyteczne jako sposób oddzielania jednego lub więcej genotypów kwasu nukleinowego HCV od innych, potencjalnie obecnych składników. Dla takich
169 880 zastosowań korzystne jest związanie nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego z podłożem do oddzielania powstałego produktu hybrydyzacji od innych składników.
„Oznaczenia typu „sandwich kwasów nukleinowych wykorzystuje jeden kwas nukleinowy, związany ze znacznikiem, i drugi kwas nukleinowy, związany z podłożem. Rozwiązanie według niniejszego wynalazku przedstawia oznaczanie typu sandwich obejmujące dwa kwasy nukleinowe, oba posiadające sekwencje, które odpowidają kwasom nukleinowym HCV; jednakże, co najmniej jeden nie występujący naturalnie kwas nukleinowy posiada sekwencję kwasu nukleinowego HCV nie-HCV-1. Co najmniej jeden kwas nukleinowy zdolny jest do wiązania ze znacznikiem, a drugi zdolny jest do wiązania z podłożem. Związany z podłożem nie występujący naturalnie kwas nukleinowy stosuje się do rozdzielania produktów hybrydyzacji, które zawierają kwas nukleinowy HCV i nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego posiadającego sekwencję nie-HCV-1.
Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji według wynalazku pozwala na wykrywanie jednego lub więcej genotypów HCV. Metoda ta obejmuje etapy umieszczania nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego w warunkach, w których może występować hybrydyzacja. Nie występujący naturalnie kwas nukleinowy zdolny jest do tworzenia produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym z jednego lub więcej genotypów HCV. Przykładami pierwszego genotypu, GI, są sekwencje o numerach 1-6,23-25,33-38 i 52-57. Przykładami drugiego genotypu, GIl, są sekwencje o numerach 7-12, 26-28, 39-45 i 58-64. Przykładami trzeciego genotypu, GIII, są sekwencje o numerach 13-17, 32,46-47 i 65-66. Przykładami czwartego genotypu, GIV, są sekwencje o numerach 20-22 i 29-31. Przykładami piątego genotypu, GV, są sekwencje o numerach 18, 19, 50 i 51.
Produkt hybrydyzacji kwasu nukleinowego z nie wstępującym naturalnie kwasem nukleinowym posiadającym sekwencję nie-HCV-1, odpowiadającą sekwencjom genomu użyteczny jest jak starter reakcji syntezy kwasu nukleinowego.
Produkt hybrydyzacji kwasu nukleinowego HCV z niewystępującym naturalnie kwasem nukleinowym posiadającym sekwencję odpowiadającą określonemu genotypowi HCV, jest użyteczny jako starter reakcji syntezy kwasu nukleinowego takiego genotypu. Tak zsyntetyzowany kwas nukleinowy wskazuje na obecność jednego lub więcej genotypów HCV.
Syntezę kwasu nukleinowego może także ułatwić klonowanie kwasu nukleinowego w wektorach ekspresyjnych, które syntetyzują białka wirusowe.
Rozwinięcie powyżej przedstawionych korzystnych odmian sposobu według wynalazku wykazuje również użyteczność w wytwarzaniu czynników antysensownych do zapobiegania transkrypcji lub translacji wirusowego kwasu nukleinowego. Tworzenie produktu hybrydyzacji nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego, posiadającego sekwencje, które odpowiadają sekwencjom genomowym określonego genotypu HCV z kwasem nukleinowym HCV, może blokować translację lub transkrypcję takiego genotypu. Czynniki terapeutyczne' można tak przygotować, aby zawierały wszystkie pięć genotypów.
W oparciu o wyżej przedstawione kompozycje kwasów nukleinowych odpowiadające genomom wirusa HCV można syntetyzować kompozycje obejmujące nie występujący naturalnie peptyd o długości trzech lub więcej aminokwasów, odpowiadający kwasowi nukleinowemu posiadającemu sekwencję nie-HCV-1. Sekwencja nie-HCV-1 może odpowiadać sekwencji spośród jednego lub więcej regionów z regionu NS5, regionu otoczki 1, regionu 5'UT i regionu rdzenia. W odniesieniu do peptydów odpowiadających kwasowi nukleinowemu posiadającemu sekwencję nie-HCV-1 regionu NS5, sekwencja należy do grupy sekwencji o numerach 2-22. Sekwencja numer 1 odpowiada HCV-1. Sekwencje o numerach 1-22 przedstawiono w Liście Sekwencji. W odniesieniu do peptydów odpowiadających kwasowi nukleinowemu posiadającemu sekwencję nie-HCV-1 regionu otoczki 1, sekwencja należy do grupy sekwencji o numerach 24-32. Sekwencja numer 23 odpowiada HCV-1. Sekwencje o numerach 23-32 przedstawiono w Liście Sekwencji. W odniesieniu do peptydów odpowiadających kwasowi nukleinowemu posiadającemu sekwencję nie-HCV-1 regionu rdzenia, sekwencja należy do grupy sekwencji o numerach 53-56. Sekwencja numer 52 odpowiada HCV-1. Sekwencje o numerach 52-66 przedstawiono w Liście Sekwencji. Można również syntetyzować kompozycje peptydowe odpowiadające sekwencjom kwasów nukleinowych genotypu HCV. Przykładami pierwszego genotypu, GI, są sekwencje o numerach 1-6,23-25,33-38 i 52-57. Przykładami drugiego genotypu, GIl, są sekwencje o numerach 7-12, 26-28, 39-45 i 58-64. Przykładami trzeciego genotypu, GIII, są sekwencje o numerach 13-17, 32,46-47 i 65-66. Przykła169 880 dami czwartego genotypu, GIV, są sekwencje o numerach 20-22, 29-31, 48 i 49. Przykładami piątego genotypu, GV, są sekwencje o numerach 18, 19, 50 i 51.
Nie występujące naturalnie peptydy użyteczne są jako składnik szczepionki. Informacja o cVii7OT-łr»ło/-•ł-» nenln/HAun nmailhizio zcroPAtuoniy eTPTpniuTml·· ż^Arw uzCTiwtaiA leł*»
J Vi\ Π V11VJ UV11 UJV11 vikz TT Ulll VZ.i1 fł 1U V^/l WVV H U.liiv lJZjVZ.V|>1V11V1V , Α.νν/χν' VVVJ111UJI| MlJZ.jdllVlV ΙΙΛν niektóre z różnych genotypów HCV. Ukierunkowanie szczepionki na określony genotyp umożliwia profilaktyczne stosowanie w celu zapewnienia maksymalnej ochrony wobec tych czynników, z którymi zetknięcie jest prawdopodobne. Ukierunkowanie szczepionki na więcej niż jeden genotyp zapewnia szerszy zakres działania szczepionki.
Kompozycje peptydowe użyteczne są także do opracowania specyficznych przeciwciał skierowanych przeciw białkom HCV. Przykładem może być przeciwciało skierowane przeciw peptydom odpowiadającym sekwencji nie-HVC-1 genomu HCV. Sekwencję nie-HVC-1 w tym przypadku wybiera się spośród sekwencji następujących regionów: region NS5, regionu otoczki 1 i regionu rdzenia. Nie istnieją peptydy odpowiadające nie ulegającemu translacji regionowi 5'UT. Natomiast w odniesieniu do przeciwciał skierowanych przeciw peptydom regionu NS5, peptydy odpowiadają sekwencji spośród sekwencji o numerach 2-22. Korzystnie, w odniesieniu do przeciwciał skierowanych przeciw peptydowi odpowiadającemu regionowi otoczki 1, peptyd odpowiada sekwencji spośród sekwencji o numerach 24-32, a w odniesieniu do przeciwciał skierowanych przeciw peptydom odpowiadającym regionowi rdzenia, peptyd odpowiada sekwencji spośród sekwencji o numerach 53-66.
Przeciwciała skierowane przeciw peptydom, które odzwierciedlają określony genotyp, są użyteczne do wykrywania takich genotypów HCV i jako czynniki terapeutyczne. Możliwe jest również utworzenie przeciwciała skierowanego przeciw peptydowi odpowiadającemu kwasowi nukleinowemu posiadającemu sekwencje określonego genotypu. Przykładami pierwszego genotypu, GI, są sekwencje o numerach 1-6,23-25,33-38 i 52-57. Przykładami drugiego genotypu, GII, są sekwencje o numerach 7-12, 26-28, 39-45 i 58-64. Przykładami trzeciego genotypu, GIII, są sekwencje o numerach 13-17,32,46-47 i 65-66. Przykładami czwartego genotypu, GIV, są sekwencje o numerach 20-22,29-31 i 48,49. Przykładami piątego genotypu, GV, są sekwencje o numerach 18, 19, 50 i 51.
Niniejszy wynalazek opisano dalej na następujących figurach, które ilustrują sekwencje genotypów HCV. Sekwencje oznaczono numerami 1-145, które to numery i sekwencje są zgodne z numerami i sekwencjami przedstawionymi w Liście Sekwencji. Sekwencje numer 146 i 147 ułatwiają dyskusję oznaczenia, które to numery i sekwencje zgodne są z numerami i sekwencjami przedstawionymi w Liście Sekwencji.
Wynalazek został zilustrowany na rysunkach, na których fig. 1 przedstawia schematycznie organizację genetyczną HCV, fig. 2 - przedstawia sekwencje kwasów nukleinowych o nuemrach 1-22, które to sekwencje pochodzą z regionu NS5 genomu wirusowego HCV, fig. 3 - przedstawia sekwencje kwasów nukleinowych o numerach 23-32, które to sekwencje pochodzą z regionu otoczki 1 genomu wirusowego HCV, fig. 4- przedstawia sekwencje kwasów nukleinowych o numerach 33-51, które to sekwencje pochodzą z regionu 5'UT genomu wirusowego HCV i fig. 5 -przedstawia sekwencje kwasów nukleinowych o numerach 52-66, które to sekwencje pochodzą z regionu rdzenia genomu wirusowego HCV.
Lista Sekwencji przedstawia sekwencje o numerach 1-147.
W realizacji niniejszego wynalazku są wykorzystane, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne techniki chemii, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii, które są znane specjalistom w tej dziedzinie. Techniki takie wyjaśniono w pełni w literaturze. Patrz, np. Maniatis, Fitsch i Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, tom I i II (red. D.N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (red. M.J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (red. B. D. Hames i S. J. Higgins, 1984); seria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), szczególnie tom 154 i tom 155 (red. Wu i Grossman).
Biblioteki cDNA pochodzą z sekwencji kwasów nukleinowych obecnych w osoczu szympansów zainfekowanych HCV. Konstruowanie jednej z tych bibliotek, biblioteki „c“ (ATCC numer 40394) opisano w publikacji PCT numer W090/14436. Sekwencje biblioteki dotyczącej niniejszego wynalazku przedstawiono tu jako sekwencje o numerach 1, 23, 33 i 52.
169 880
Kwasy nukleinowe wyizolowane lub zsyntetyzowane są użyteczne, na przykład jako sondy, startery, geny antysensowne i do opracowywania układów ekspresyjnych do syntezy peptydów odpowiadających takim sekwencjom.
Opisane sekwencje kwasów nukleinowych definiują genotypy HCV w odniesieniu do czterech regionów genomu wirusowego. Fig. 1 - przedstawia schematycznie organizację HCV. Czterema regionami szczególnego zainteresowania są region NS5, region otoczki 1, region 5'UT i region rdzenia.
Sekwencje przedstawione w niniejszym zgłoszeniu jako sekwencje o numerach 1-22 sugerują co najmniej pięć genotypów w regionie NS5. Sekwencje o numerach 1-22 przedstawiono na fig. 2 jak również w Liście Sekwencji. Każda z sekwencji o numerach 1-22 pochodzi z kwasu nukleinowego posiadającego 340 nukleotydów z regionu NS5.
Pięć genotypów zdefiniowano przez podział na grupy sekwencji określonych przez sekwencje o numerach 1-22. Dla wygody, w niniejszym zgłoszeniu różne genotypy oznaczono numerami rzymskimi i literą „G“.
Przykładami pierwszego genotypu (GI) są sekwencje o numerach 1-6. Przykładami drugiego genotypu (Gil) są sekwencje o numerach 7-12. Przykładami trzeciego genotypu (GIII) są sekwencje o numerach 13-17. Przykładami czwartego genotypu (GIV) są sekwencje o numerach 20-22. Przykładami piątego genotypu (GV) są sekwencje o numerach 18 i 19.
Sekwencje przedstawione w niniejszym zgłoszeniu jako sekwencje o numerach 23-32 sugerują co najmniej cztery genotypy w regionie otoczki i HCV. Sekwencje o numerach 23-32 przedstawiono na fig. 3, jak również w Liście Sekwencji. Każda z sekwencji o numerach 23-32 pochodzi z kwasu nukleinowego posiadającego 100 nukleotydów z regionu otoczki 1.
Przykładami pierwszej grupy genotypów regionu otoczki 1 (GI) są sekwencje o numerach 23-25. Przykładami drugiego genotypu regionu otoczki 1 (GII) są sekwencje o numerach 26-28. Przykładami trzeciego genotypu regionu otoczki 1 (GIII) jest sekwencja o numerze 32. Przykładami czwartego genotypu regionu otoczki 1 (GIV) są sekwencje o numerach 29-31.
Sekwencje przedstawione w niniejszym zgłoszeniu jako sekwencje o numerach 33-51 sugerują co najmniej trzy genotypy w regionie 5'UTHCV. Sekwencje o numerach 33-51 przedstawiono na fig. 4, jak również w Liście Sekwencji. Każda z sekwencji o numerach 33-51 pochodzi z kwasu nukleidowego posiadającego 252 nukleotydy z regionu 5'UT, chociaż sekwencje 50 i 51 są nieco krótsze i mają około 180 nukleotydów.
Przykładami pierwszego genotypu 5'UT (GI) są sekwencje o numerach 33-38. Przykładami drugiego genotypu 5'UT (GII) są sekwencje o numerach 39-45. Przykładami trzeciego genotypu 5'UT (GIII) są sekwencje o numerach 46-47. Przykładami czwartego genotypu 5'UT (GIV) są sekwencje o numerach 48 i 49. Przykładami piątego genotypu 5'UT (GV) są sekwencje o numerach 50 i 51.
Sekwencje o numerach 48-62 sugerują co najmniej trzy genotypy w regionie rdzenia HCV. Sekwencje o numerach 52-66 przedstawiono na fig. 5, jak również w Liście Sekwencji.
Przykładami pierwszego genotypu regionu rdzenia (GI) są sekwencje o numerach 52-57. Przykładami drugiego genotypu regionu rdzenia (GII) są sekwencje o numerach 58-64. Przykładami trzeciego genotypu regionu rdzenia (GIII) są sekwencje o numerach 65 i 66. Sekwencje o numerach 52-65 składają się z 549 nukleotydów. Sekwencja numer 66 składa się z 510 nukelotydów.
Różne genotypy opisane o odniesieniu do każdego regionu są zgodne ze sobą. To jest, HCV posiadający cechy pierwszego genotypu w odniesieniu do regionu NS5 będzie w znacznym stopniu dostosowywać się do cech pierwszego genotypu regionu otoczki 1, regionu 5'UT i regionu rdzenia.
Kwasy nukleinowe wyizolowane lub zsyntetyzowane według sekwencji przedstawionych w sekwencjach o numerach 1-66 użyteczne są jako sondy, startery, ligandy, wychwytujące i czynniki antysensowne. Jako sondy, startery, ligandy wychwytujące i czynniki antysensowne, kwas nukleinowy będzie zazwyczaj zawierać osiem lub więcej nuklotydów dla zapewnienia specyficzności, jak również zdolności tworzenia stabilnych produktów hybrydyzacji.
Sondy.
Kwas nukleinowy wyizolowany lub zsyntetyzowany według sekwencji definiującej określony genotyp regionu genomu HCV można stosować jako sondę do wykrywania takiego genotypu, bądź, stosując łącznie z innymi sondami kwasów nukleinowych, do wykrywania zasadniczo wszystkich genotypów HCV.
169 880
Na podstawie przedstawionej w niniejszym zgłoszeniu informacji o sekwencjach, identyfikuje się sekwencje ośmiu lub więcej nukleotydów, które zapewniają pożądaną specyficzność lub wykluczenie w odniesieniu do różnych genotypów HCV, oraz innych sekwencji kwasów nukleinowych, dll kttrółr yfnwi β sto ind sss d λΚι oń ęłwn πnrołd st osi o iń n/tMinl'· k-uktiidw'*'·» pn
W1U. RtVlJVll pi U Π U UlVlld l Π V TT j OVtip»lVAirtł W W iii uiin,avii ii j uzi jr ui J
Specjaliści w tej dziedzinie łatwo stwierdzą, że sekwencje kwasów nukleinowych do stosowania jako sondy można dostarczyć ze znacznikiem dla ułatwienia wykrywania produktu hybrydyzacji.
Ligand wychwytujący.
Do stosowania jako ligand wychwytujący, kwas nukleinowy wybrany w opisany powyżej sposób w odniesieniu do sond, można łatwo związać z podłożami. Sposób, w którym kwas nukleinowy jest wiązany z podłożami, jest dobrze znany. Kwas nukleinowy posiadający sekwencje odpowiadające sekwencji spośród sekwencji o numerach 1-66 jest użyteczny do oddzielania wirusowego kwasu nukleinowego jednego genotypu od kwasu nukleinowego HCV o innym genotypie. Kwasy nukleinowe wyizolowane lub zsyntetyzowane według sekwencji spośród sekwencji o numerach 1-66, stosowane w kombinacjach, są użyteczne do wychwytywania zasadniczo wszystkich kwasów nukleinowych wszystkich genotypów HCV.
Startery.
Kwasy nukleinowe wyizolowane lub zsyntetyzowane według sekwencji tu opisanych użyteczne są jako startery do amplifikacji sekwencji HCV. W odniesieniu do technik reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencje kwasu nukleinowego o ośmiu lub więcej nukleotydach odpowiadających jednej lub więcej sekwencji o numerach 1-66 są użyteczne w połączeniu z odpowiednimi enzymami i odczynnikami do tworzenia kopii wirusowego kwasu nukleinowego. Wielorakość starterów posiadających różne sekwencje, odpowiadające więcej niż jednemu genotypowi, można stosować do tworzenia kopii wirusowego kwasu nukleinowego dla takich genotypów.
Kopie te można stosować w oznaczeniach diagnostycznych do wykrywania wirusa HCV. Kopie można także wstawiać do wektorów klonujących i ekspresyjnych dla utworzenia polipeptydów odpowiadających kwasowi nukleinowemu zsyntetyzowanemu przez PCR, jak zostanie opisane bardziej szczegółowo poniżej.
Czynniki antysensowne.
Kwasy nukleinowe wyizolowane lub zsyntetyzowane według sekwencji tu opisanych wykazują użyteczność jako geny antysensowne do zapobiegania ekspresji HCV.
Kwas nukleinowy odpowiadający genotypowi HCV wprowadza się do odpowiedniego nośnika, takiego jak liposomy, służącego do wprowadzania do komórek zainfekowanych HCV. Kwas nukleinowy posiadający osiem lub więcej nukleotydów zdolny jest do wiązania z wirusowym kwasem nukleinowym lub wirusowym matrycowym RNA. Korzystnie, w celu zapewnienia koniecznej stabilności produktu hybrydyzacji wirusowego kwasu nukleinowego lub wirusowego matrycowego RNA, antysensowny kwas nukleinowy składa się z 30 lub więcej nukleotydów. Metody wprowadzania antysensownego kwasu nukleinowego są znane w nauce, jak przedstawiono przykładowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 241 046 Papahadjopoulosa i in., wydany 23 grudnia 1980 r..
Synteza peptydów
Kwas nukleinowy wyizolowany lub zsyntetyzowany według opisanych tu sekwencji jest użyteczny do tworzenia peptydów. Sekwencje, których przykładami są sekwencje o numerach 1-32 i 52-66 można sklonować w odpowiednich wektorach lub zastosować do izolowania kwasu nukleinowego. Wyizolowany kwas nukleinowy łączy się z odpowiednimi łącznikami DNA i klonuje w odpowiednim wektorze. Wektor można zastosować do transformacji odpowiedniego organizmu gospodarza, takiego jak E. coli i wyizolować peptyd kodowany przez sekwencję.
Techniki klonowania molekularnego opisano w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis i in., Coldspring Harbor Laboratory (1982).
Wyizolowany peptyd jest użyteczny jako substancja antygenowa do opracowania szczepionek i przeciwciał skierowanych przeciw określonemu genotypowi HCV.
169 880
Szczepionki i przeciwciała.
Peptydy według niniejszego wynalazku są użyteczne do opracowywania przeciwciał i szczepionek.
Dostępność sekwencji cDNA lub pochodzących z nich sekwencji nukleotydowych (włącznie z odcinkami i modyfikacjami sekwencji) umożliwia konstruowanie wektorów ekspresyjnych kodujących antygenowo aktywne regiony peptydu kodowanego na którejkolwiek nici. Antygenowo aktywne regiony mogą pochodzić z regionu NS5, regionów otoczki 1 i regionu rdzenia.
Fragmenty kodujące pożądane peptydy otrzymuje się z klonów cDNA stosując konwencjonalne trawienie restrykcyjne lub metody syntezy i liguje się z wektorami, które mogą na przykład, zawierać części sekwencji fuzyjnych, takich jak beta-glukozydazy lub dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), korzystnie (SOD). Metody i wektory, które są użyteczne do wytwarzania polipeptydów, które zawierają sekwencje fuzyjne SOD opisano w publikacji Europejskiego Urządu Patentowego numer 0196056, opublikowanej 1 października 1986 r.
Każdą pożądaną część cDNA HCV zawierającą otwartą ramkę odczytu, na którejkolwiek sensownej nici, można otrzymać jako zrekombinowany peptyd, taki jak dojrzałe lub białko fuzyjne; alternatywnie, peptyd kodowany przez cDNA można dostarczyć przez syntezę chemiczną.
DNA kodujący pożądany peptyd, czy to w postaci fuzji czy dojrzałej, i niezależnie od tego czy zawiera sekwencję sygnałową dla umożliwienia sekwencji, można ligować z wektorami ekspresyjnymi odpowiednimi dla każdego dogodnego gospodarza. Zarówno eukariotyczne, jak i prokariotyczne układy gospodarzy stosuje się obecnie do tworzenia rekombinowanych peptydów. Peptyd ten izoluje się następnie ze zlizowanych komórek lub podłoża hodowlanego i oczyszcza w stopniu potrzebnym do zamierzonego użycia. Oczyszczanie można przeprowadzać znanymi technikami, na przykład przez różnicową ekstrakcję, frakcjonowanie solą, chromatografię na żywicach jonowymiennych, chromatografię powinowactwa, wirowanie i podobne. W celu zapoznania się z szeregiem metod oczyszczania białek patrz, na przykład, Methods in Enzymology. Peptydy takie można stosować jako środki diagnostyczne lub, tym które powodują powstanie przeciwciał neutralizujących, można nadawać postać szczepionki. Przeciwciała przeciw tym peptydom można także stosować jako środki diagnostyczne lub do biernej immunoterapi bądź izolowania i identyfikowania HCV.
Antygenowy region peptydu jest na ogół względnie mały- zazwyczaj ma długość 8 do 10 aminokwasów lub mniejszą. Fragmenty o długości tak małej, jak 5 aminokwasów, mogą stanowić region antygenowy. Odcinki te mogą odpowiadać regionowi NS5, regionowi otoczki 1 i regionowi rdzenia genomu HCV. Nie jest znana translacja regionu 5'UT. A zatem, stosując cDNA takich regionów, ekspresję zrekombinowanych DNA kodujących krótkie odcinki peptydów HCV odpowiadających takim regionom można prowadzić otrzymując albo białka fuzyjne, albo wyizolowane peptydy. Ponadto, krótkie sekwencje aminokwasów można bez trudu otrzymać przez syntezę chemiczną. W przypadkach, w których syntetyzowany peptyd ma właściwą konfigurację zapewniającą właściwy epitop, ale jest zbyt mały, aby był immunogenny, można go związać z odpowiednim nośnikiem.
W nauce znane są liczne techniki otrzymywania takiego wiązania, włącznie z tworzeniem wiązań dwusiarczkowych z zastosowaniem N-sukcynimidylo-3-/2pyridylotio/propionianu (SPDP) i sukcynimidyło-4-/N-maleimido-mety1o/cycloheksano-1-karboksylanu (SMCC) otrzymanych z Pierce Company, Rockford, Illinois (jeśli peptyd pozbawiony jest grupy sulfhydrylowej, można go dostarczyć przez dodanie reszty cysteiny). Odczynniki te tworzą związanie dwusiarczkowe pomiędzy sobą a resztą cysteiny na jednym białku i wiązanie amidowe poprzez grupę epsilon-aminową lizyny lub inną wolną grupę aminową na drugim białku. Znanych jest szereg takich czynników tworzących dwusiarczek/amid. Patrz, na przykład, Immun. Rev. (1982) 62; 185. Inne bifunkcjonalne czynniki sprzęgające tworzą raczej wiązanie tioeterowe, a nie dwusiarczkowe. Wiele z tych czynników tworzących tioetery jest dostępnych w handlu i obejmują reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, kwasu 2-bromooctowego, kwasu 2-jodooctowego, kwasu 4-Nmaleimido-metylo/-cykloheksano-1-karboksylowego i podobne. Grupy karboksylowe można aktywować przez ich połączenie z sukcynimidem lub solą sodową kwasu l-hydroksylo-2-nitro-4sulfonowego. Dodatkowe metody sprzęgania antygenów wykorzystują układ rotawirus „peptyd wiążący opisany w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 259 149, którego ujawnię169 880 11 nia włączono tu poprzez odnośnik literaturowy. Powyższa lista nie jest wyczerpująca, a modyfikacje wymienionych związków można oczywiście stosować.
Stosować można każdy nośnik, który sam nie indukuje tworzenia przeciwciał szkodliwych dla gospodarza. Odpowiednimi nośnikami są zazwyczaj duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka; polisacharydy, takie jak lateks, aktywowana Sepharose, agaroza, celuloza, perełki celulozowe i podobne; polimery aminokwasów, takie jak kwas poliglutaminowy, polilizyna i podobne; kopolimery aminokwasów oraz nieaktywne cząstki wirusowe. Szczególnie użytecznymi polimerami białkowymi są albuminy surowicy, hemocyjanina skałoczepa, cząsteczki immunoglobulin, tyroglobulina, owolbumina, toksoid tężcowy i inne białka dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe HCV kodowane przy co najmniej jednym epitopie wirusowym pochodzącym z regionu NS5, otoczki 1 i rdzenia są użytecznymi odczynnikami immunologicznymi. Nie jest znana translacja regionu 5'UT. Na przykład, peptydy zawierające takie skrócone sekwencje można stosować jako oczynniki w oznaczeniu immunologicznym. Peptydy te są także kandydatami na antygeny podjednostkowe w kompozycjach do wytwarzania antysurowic lub szczepionek. O ile skrócone sekwencje można wytwarzać stosując obróbkę natywnego białka wirusowego różnymi znanymi sposobami, to na ogół preferuje się przygotowywanie syntetycznych lub zrekombinowanych peptydów zawierających sekwencję HCV. Peptydy zawierające te skrócone sekwencje HCV można przygotować z całej sekwencji HCV (jednego lub więcej epitopów, albo sąsiadujących, albo nie sąsiadujących) lub sekwencji HCV i sekwencji heterologicznych w białku fuzyjnym. Użyteczne sekwencje heterologiczne obejmują sekwencje, które zapewniają sekwencje ze zrekombinowanego gospodarza, wzmacniają reaktywność immunologiczną epitopu(ów) HCV lub ułatwiają sprzęganie polipeptydu z podłożem do oznaczenia immunologicznego lub nośnikiem szczepionki. Patrz, na przykład, publikacja europejskiego opisu patentowego numer 116 201; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 722 840; publikacja europejskiego opisu patentowego numer 259 149; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 629 783.
Wielkość peptydów zawierających skrócone sekwencje HCV może różnić się w znacznym stopniu, minimalna wielkość odpowiada sekwencji o dostatecznej wielkości do dostarczenia epitopu HCV, podczas gdy wielkość maksymalna nie ma zasadniczego znaczenia. Dla wygody, wielkość maksymalna zazwyczaj nie jest większa niż ta wymagana do dostarczenia pożądanych epitopów HCV i funkcji sekwencji heterologicznej, jeśli ona występuje. Zazwyczaj, długość skróconej sekwencji aminokwasowej HCV pozostawać będzie w zakresie od około 5 do około 100 aminokwasów. Częściej jednakże, sekwencja HCV będzie miała maksymalną długość około 50 aminokwasów, korzystnie około 30 aminokwasów. Zazwyczaj pożądane jest wybranie sekwencji HCV o długości co najmniej około 10,12 lub 15 aminokwasów, aż do maksymalnej ilości około 20 lub 25 aminokwasów.
Sekwencje aminokwasowe HCV zawierające epitopy można zidentyfikować wieloma sposobami. Na przykład, całą sekwencję białkową odpowiadającą każdemu z regionów NS5, otoczki 1 i rdzenia można wykrywać przez przygotowanie serii krótkich peptydów, które razem obejmują całą sekwencję białkową takich regionów. Rozpoczynając od, na przykład, peptydów o około 100 aminokwasach, można rutynowo testować każdy peptyd na obecność epitopu(ów) wykazujących pożądaną reaktywność, a następnie testować coraz mniejsze i zachodzące na siebie fragmenty ze zidentyfikowanych peptydów o 100 aminokwasach aż do zmapowania interesującego epitopu. Znane jest także wykrywanie takich peptydów poprzez oznaczenia immunologiczne. Znane jest także przeprowadzenie analiz komputerowych sekwencji białkowej dla identyfikacji potencjalnych epitopów, a następnie przygotowanie peptydów zawierających zidentyfikowane regiony do wykrywania.
Immunogenność epitopów HCV można także wzmocnić przez przygotowanie ich w układach ssaczych lub drożdżowych w postaci fuzji z lub złożonej z białkami tworzącymi cząstki, takimi jak na przykład te związane z antygenem powierzchiowym wirusa zapalenia wątroby B. Patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 722 840. Konstrukcje, w których epitop HCV jest połączony bezpośrednio z sekwencją kodującą białko tworzące cząstki tworzy hybrydy, które są immunogenne wobec epitopu HCV. Ponadto, wszystkie z przygotowywanych wektorów
169 880 obejmują epitopy specyficzne dla HBV, posiadające różne stopnie immunogenności, takie jak, na przykład, peptyd pre-S. A zatem, cząstki skonstruowane z białek tworzących cząstki, które obejmują sekwencje HCV, są immunogenne wobec HCV i HBV.
r jrvuŁuinJ, uiiijgvu powier »ηνι wfltrnhu iUPęAM u»ef
V» jvol składany w cząstki w S. cerevisiae (P. Valenzuela i in. (1982)) jak również na przykład w komórkach ssaków (P. Valenzuela i in. (1984)). Wykazano, że tworzenie takich cząstek wzmacnia immunogenność monomerycznej podjednostki. Konstrukcje mogą także obejmować immunodominujący epitop HBS Ag, zawierający 55 aminokwasów regionu prepowierzchniowego (pre-S). Neurath i in. (1984). Konstrukcje cząstek pre-S-HBSAg zdolne do ekspresji w drożdżach ujawniono w europejskim opisie patentowym numer 174444 opublikowanym 19 marca 1986r.; hybrydy obejmujące heterologiczne sekwencje wirusowe do ekspresji w drożdżach ujawniono w europejskim opisie patentowym numer 175 261 opublikowanym 26 marca 1966 r. Konstrukcje te mogą także ulegać ekspresji w komórkach ssaków, takich jak komórki jajników chomika chińskiego (CHO), stosując wektor SYTO-reduktazy dihydrofolianowej (Michelle i in. (1984).
Ponadto, części sekwencji kodującej białko tworzące cząstki można zastąpić kodami kodującymi epitop HCV. W wyniku tego zastąpienia można wykryć regiony, których udział nie jest wymagany do agregacji jednostek z utworzenien immunogennych cząstek w drożdżach lub ssakach, eliminując zatem kompetycję dodatkowych miejsc antygenowych HBV z epitopem HCV.
Szczepionki.
Z jednego lub więcej immunogennych peptydów pochodzących z HCV można przygotowywać szczepionki. Obserwowana homologia pomiędzy HCV a flaviwirusami dostarcza informację dotyczącą peptydów, które prawdopodobnie są najbardziej skuteczne jako szczepionki, tak jak regiony genomu, który je koduje.
Multiwalencyjne szczepionki przeciw HCV mogą składać się z jednego lub więcej epitopów z jednego lub więcej białek pochodzących z regionów NS5, otoczki 1 i rdzenia. W szczególności, przewiduje się, że szczepionki będą zawierały jedno lub więcej białek HCV lub antygenów podjednostkowych pochodzących z regionów NS5, otoczki 1 i rdzenia. Nie jest znana translacja regionu 5'UT.
Przygotowanie szczepionek zawierających immunogenny peptyd jako składnik aktywny jest znane specjalistom w tej dziedzinie. Szczepionki takie przygotowuje się zazwyczaj w postaci do iniekcji, albo jako płynne roztwory, albo zawiesiny; można także przygotowywać postacie stałe odpowiednie do przygotowania roztworu lub zawiesiny w płynie przed iniekcją. Preparat można także emulgować lub białko zamykać w liposomach. Aktywne składniki immunogenne miesza się często z zarobkami, które są dopuszczalne farmaceutycznie i kompatybilne ze składnikiem aktywnym. Odpowiednimi zarobkami są, na przykład, woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol, etanol, i podobne, oraz ich połączenia. Ponadto, jeśli jest to pożądane, szczepionka może zawierać nieznaczne ilości substancji pomocniczych, takich jak czynniki zwilżające bądź emulgujące, czynniki buforujące pH i/lub adiuwanty, które wzmacniają skuteczność szczepionki. Przykłady adiuwantów, które mogą być skuteczne, obejmują, ale nie ograniczają się do wodorotlenku glinu, N-acetylo-muramylo-L-teronylo-D-izoglutaminy (thr-MDP), N-acetylo-nor-muranylo-Lananylo-D-izoglutaminy (CGP 11637, opisane jako nor-MDP), N-acetyłomuramylo-L-alanylo-Dizoglutaminylo-L-alamno-2-/1-2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy/-etyloammy (CGP 19835A, opisanej jako MTP-PE) i RIBI, zawierający trzy składniki wyekstrahowane z bakterii, monofosforylo-lipid A, dimykolan trehalozy i szkielet ściany komórkowej (MPL + TDM + CWS) w emulsji 2% skwalen/Tween 80. Skuteczność adiuwantu można określić mierząc ilość przeciwciał skierowanych przeciw immunogennemu peptydowi zawierającemu sekwencję antygnową HCV powstających w wyniku podawania peptydu w szczepionkach, które zawierają również różne adiuwanty.
Dogodnie, szczepionki podaje się pozajelitowo, przez iniekcję, na przykład podskórną lub domięśniową. Dodatkowe postacie, które są odpowiednie do innych dróg podawania, obejmują czopki i, w pewnych przypadkach, postacie do podawania doustnego. W przypadku czopków, tradycyjne spoiwa i nośniki mogą obejmować, na przykład, glikole polialkilenowe lub triacylogilicerole; czopki takie można tworzyć z mieszanin zawierających składnik aktywny w zakresie 0/5% do 10%, korzystnie l%-2%. Postacie do podawania doustnego obejmują takie normalnie wykorzystywane zarobki, jak, na przykład, mannitol, laktoza, skrobia, stearynian magnezowy, sól sodowa sacharyny, celuloza, węglan magnezowy i podobne o czystości farmaceutycznej.
169 880
Poniższe przykłady przedstawiono dla celów ilustracyjnych i nie ograniczają one zakresu niniejszego wynalazku.
I. Wykrywanie RNA HCV z surowicy.
OM Λ x x tt j L χ4 τ m TT m » z·· 1τ 1 z> «· z> i©·» »· »»·» -» Z* Z-v <ł ·** « Λ ,-r iuyuuwą, fenol i culoiuioim, zgodnie z o o r* m·........
JU1U TT JLVOUJUV OVi ϊΤΜτinstrukcjami producenta zestawu (zestaw RNAzoT B, Cinna/biotecx). Wyekstrahowany RNA wytrącono izopropanolem i przemyto etanolem. Z całkowitej ilości 25μ! surowicy wyizolowano RNA, a oczyszczony RNA zawieszono ponownie w 5 μΐ pirowęglanie dietylowym traktowanym wodą w celu przygotowania do syntezy cDNA.
II. Synteza cDNA i amplifikacja w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
Tabela 1 wymienia sekwencje i pozycje (w odniesieniu do HCV1) wszystkich starterów PCR i sond zastosowanych w tych przykładach. Oznaczenia literowe nukleotydów zgodne są z 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825. A zatem, litery A, C, G, T i U stosuje się w zwykłym znaczeniu adeniny, cytozyny, guaniny, tyminy i uracylu. Litera M oznacza A lub C; R oznacza A lub G; W oznacza A lub T/U; S oznacza C lub G; Y oznacza C lub T/U; K oznacza G lub T/U; V oznacza A lub C lub G, nie T/U; H oznacza A lub C lub T/U, nie G; D oznacza A lub G lub T/U, nie C; B oznacza C lub G lub T/U, nie A; N oznacza (A lubC lub G lub T/U) bądź (nieznany lub inny). Tabele 1 przedstawiono poniżej.
Tabela 1
| Numer sekwencji | Sekwencja (5'-3') | Sekwencja nukleotydową |
| 67 | CAAACGTAACACCAACCGRCGCCCACAGG | 374- 402 |
| 68 | ACAGAYCCGCAKAGRTCCCCCACG | 1192-1169 |
| 69 | GCAACCTCGAGGTAGA^C^C^TC^AC^C^^TATCCC | 509- 538 |
| 70 | GCAACCTCGTGGAAGG^C^C^A^C^A^A^C^CTA^TCCC | 509- 538 |
| 71 | GTCACCAATGATTGCCCTAACTCGAGTATT | 948- 977 |
| 72 | GTCACCAACCACTGCTCCAACTCAAC | 948- 973 |
| 73 | TCCACATCATCGCTGCWGCYCACTCCCC | 1375-1402 |
| 74 | TGGAYATCCTCGYCCCCCCYCACTCCGG | 1375-1402 |
| 75 | ATGATGAACTGGTCVCCYAC | 1308-1327 |
| 76 | ACCTTVGCCCAGTTSCCCRCCATGGA | 1453-1428 |
| 77 | AACCCACTCTATGYCCGGYCAT | 205- 226 |
| 78 | CAATCGCTCGCCTCACCC | 171- 188 |
| 79 | CCATGAATCACTCCCCTCTCACGAACTA | 30- 57 |
| 80 | TTCCGGCCCCACGCCCAA | 244- 227 |
Do syntezy cDNA i amplifikacji w PCR stosowano protokół opracowany przez PerkinElmer/Cetus (zestaw PCR RNA GeneAmp®). Do rozpoczęcia reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystano zarówno losowe heksamery, jak i startery ze specyficznymi sekwencjami komplementarnymi do HCV. Wszystkie procesy, z wyjątkiem dodawania i mieszania składników mieszaniny reakcyjnej, przeprowadzano w cyklizatorze termicznym (MJ Research, Inc.). Reakcję syntezy pierwszej nici cDNA zatrzymywano w temperaturze 99°C w ciągu 5 minut, a następnie schładzano w temperaturze 50°C w ciągu 5 minut przed dodaniem składników reakcji do kolejnej amplifikacji. Po początkowych 5 cyklach temperatury 97°C w ciągu 1 minuty, 50°C w ciągu 2 minut i 72°C w ciągu 3 minut następowało 30 cykli temperatury 94°C w ciągu 1 minuty, 55°C w ciągu 2 minut i 72°C w ciągu 3 minut, a następnie końcowe 7 minut elongacji w temperaturze 72°C.
Do analizy genotypu jako startery reakcji PCR zastosowano sekwencje o numerach 67 i 68. Startery te amplifikują odcinek odpowiadający regionom rdzenia i otoczki. Po amplifikacji produkty reakcji rozdzielono w żelu agarozowym, a następnie przeniesiono na nylonową membranę. Zimmobilizowanym produktom reakcji umożliwiono hybrydyzację ze znakowanym 32P kwasem nukleinowym odpowiadającym albo Genotypowi I (rdzenia lub otoczki 1) -bądź Genotypowi II (rdzenia lub otoczki 1). Kwas nukleinowy odpowiadający Genotypowi I zawiera sekwencje o numerach 69 (rdzenia), 71 (otoczki) i 73 (otoczki). Kwas nukleinowy odpowiadający Genotypowi II zaiwera sekwencje o numerach 70 (rdzenia), 72 (otoczki) i 74 (otoczki).
Sondy Genotypu I tylko hybrydyzowały z produktem zamplifikowanym z izolatów, które posiadały sekwencję Genotypu I. Podobnie, sondy Genotypu II hybrydyzowały tylko z produktem zamplifikowanym z izolatów, które posiadały sekwencję Genotypu II.
169 880
W innym doświadczeniu utworzono produkty PCR stosując sekwencje 79 i 80. Produkty analizowano jak opisano powyżej, z wyjątkiem zastosowania sekwencji numer 73 do wykrywania Genotypu I, sekwencji numer 74 do wykrywania Genotypu II, sekwencji numer 77 (5'UT) do wykrywania Genotypu III oraz sekwencji numer 78 (5'UT) do wykrywania Genotypu IV. Każda z sond hybrydyzowała w sposób specyficzny dla genotypu.
III. Wykrywanie CiEGiy HCV z zaszozowamem oznaczenia liybrydyzacji typu sandwind RNA HCV.
W przykładzie tym opisano wzmocnione oznaczenie hybrydyzacji kwasu nukleinowego w fazie roztworu typu sandwich. W oznaczeniu wykorzystuje się kilka sond kwasów nukleinowych dla uzyskania wychwytywania i wykrywania. Kwas nukleinowy sondy wychwytującej jest zdolny do wiązania komplementarnej sondy związanej ze stałym nośnikiem i kwasu nukleinowego HCV dla uzyskania wychwytywania. Kwas nukleinowy sondy wykrywającej posiada pierwszy odcinek (A), który wiąże się z kwasem nukleinowym HCV, oraz drugi odcinek (B), który hybrydyzuje z drugim wzmacniającym kwasem nukleinowym. Wzmacniający kwas nukleinowy posiada pierwszy odcinek (Bx), który hybrydyzuje z odcinkiem (B) kwasu nukleinowego sondy, i zawiera także piętnaście powtórzeń odcinka (C). Odcinek (C) wzmacniającego kwasu nukleinowego jest zdolny do hybrydyzowania z trzema znakowanymi kwasami nukleinowymi.
Sekwencje kwasów nukleinowych, które odpowiadają sekwencjom nukleotydowym genu otoczki i izolatów Grupy I przestawiono w sekwencjach o numerach 81-99. Tabela 2 przedstawia obszary genomu HCV, którym odpowiadają sekwencje kwasów nukleinowych i korzystne zastosowanie sekwencji.
Tabela 2
| Typ sondy | Numer sekwencji | Sekwencja komplementarna do pozycji nukleotydowycy |
| znacznik | 81 | 879- 911 |
| znacznik | 82 | 912- 944 |
| wychwytująca | 83 | 945- 977 |
| znacznik | 84 | 978-1010 |
| znacznik | 85 | 1011-1043 |
| znacznik | 86 | 1044-1076 |
| znacznik | 87 | 1077-1109 |
| wychwytująca | 88 | 1110-1142 |
| znacznik | 89 | 1143-1175 |
| znacznik | 90 | 1176-1208 |
| znacznik | 91 | 1209-1241 |
| znacznik | 92 | 1242-1274 |
| wychwytująca | 93 | 1275-1307 |
| znacznik | 94 | 1308-1340 |
| znacznik | 95 | 1341-1373 |
| znacznik | 96 | 1374-1406 |
| znacznik | 97 | 1407-1439 |
| znacznik | 98 | 1440-1472 |
| znacznik | 99 | 1473-1505 |
Sekwencje kwasów nukleinowych, które odpowiadają sekwencjom genu otoczki i izolatów HCV z Grupy II przedstawiono w sekwencjach o numerach 100-118. Tabela 3 przedstawia obszary genomu HCV, którym odpowiadają kwasy nukleinowe i korzystne zastosowanie sekwencji.
169 880
Tabela 3
| t yp sondy | Numer sekwencji | Sekwencja komplementarna do pozycji nukleotydowych |
| znacznik | 100 | 879- 911 |
| znacznik | 101 | 912- 944 |
| wychwytująca | 102 | 945- 977 |
| znacznik | 103 | 978-1010 |
| znacznik | 104 | 1011-1043 |
| znacznik | 105 | 1044-1076 |
| znacznik | 106 | 1077-1109 |
| wychwytująca | 107 | 1110-1142 |
| znacznik | 108 | 1143-1175 |
| znacznik | 109 | 1176-1208 |
| znacznik | 110 | 1209-1241 |
| znacznik | 111 | 1242-1274 |
| wychwytująca | 112 | 1275-1307 |
| znacznik | 113 | 1308-1340 |
| znacznik | 114 | 1341-1373 |
| znacznik | 115 | 1374-1406 |
| znacznik | 116 | 1407-1439 |
| wychwytująca | 117 | 1440-1472 |
| znacznik | 118 | 1473-1505 |
Sekwencje kwasów nukleinowych, które odpowiadają sekencjom nukleotydowym genu C i regionu 5'UT przedstawiono w sekwencjach 119-145. Tabela 4 podaje sekwencje z ich korzystnym zastosowaniem.
Tabela 4
| Typ sondy | Numer sekwencji | Typ sondy | Numer sekwencji |
| 1 | 2 | 1 | 2 |
| wychwytująca | 119 | znacznik | 133 |
| znacznik | 120 | znacznik | 134 |
| znacznik | 121 | znacznik | 135 |
| znacznik | 122 | wychwytująca | 136 |
| wychwytująca | 123 | znacznik | 137 |
| znacznik | 124 | znacznik | 138 |
| znacznik | 125 | znacznik | 139 |
| znacznik | 126 | wychwytująca | 140 |
| wychwytująca | 127 | znacznik | 141 |
| znacznik | 128 | znacznik | 142 |
| znacznik | 129 | znacznik | 143 |
| znacznik | 130 | wychwytująca | 144 |
| wychwytująca | 131 | znacznik | 145 |
| znacznik | 132 |
Wykrywające i wychwytujące odcinki specyficzne dla HCV oraz ich stosowane w tym oznaczeniu nazwy były następujące:
Sekwencjami wychwytującymi są sekwencje o numerach 119-122 i 141-144.
Sekwencjami wykrywającymi są sekwencje o numerach 119-140.
Każda sekwencja wykrywająca zawierała, poza sekwencjami zasadniczo komplementarnymi do sekwencji HCV, przedłużenie 5'-końcowe (B), które jest komplementarne do odcinka drugiego wzmacniającego kwasu nukleinowego. Sekwencję przedłużenia (B) przedstawiono w Liście Sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacjnym 146 i odtworzono poniżej.
169 880
AGGCATAGGACCCGTGTCTT
Każda sekwencja wychwytująca zawierała, poza sekwencjami zasadniczo komplementarnymi do sekwencji HCV, sekwencję komplementarną do DNA związanego z fazą stałą. Sekwencja d S l Λ -ro n re mo e/n t fnr^n ai rd*·» <-r td ι/N aha )c ow io n zzrzif ar\W-ą « oso
Kumprviiiviu.ai no. i/im z.vvi<ii.auGgv z ια£ί| becik wuajuu w «.ici bly wo. wtvuw^c4v4·
Sekwencję komplementarną do DNA związanego z podłożem przedstawiono jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym 147 i odtworzono poniżej.
CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG
Płytki do mikromiareczkowania przygotowano w następujący sposób. White Microlite i Removawell (polistyrenowe płytki do mikromiareczkowania, 96 studzienek/płytkę) kupiono w Dynatech Inc.
Każdą studzienkę wypełniono 200μΐ 1NHCl i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 15-20 minut. Płytki przemyto następnie 4 razy 1XPBS i zawartość studzienek odsysano usuwając płyn. Studzienki napełniono następnie 200^l 1 NNaOH i ń^lcu^łoow^^r^o w temperauuree pokojowej w ciągu 15-20 minut. Płytki ponownie przemyto cztery razy 1XPBS i zawartość studzienek odsysano usuwając płyn.
Poli(Phe-Lys) kupiono w Sigma Chemicals, Inc. Polipeptyd ten posiada stosunek molowy Phe:Lys 1:1 i średnią masę cząsteczkową 47 900 gm/mol. Ma on średnią długość 309 aminokwasów i zawiera 155 grup aminowych/mol. Roztwór polipeptydu o stęż^^iu 1 mg/ml zmieszano z 2M NaCl/1X PBS do końcowego stężenia 0,1 mg/ml (pH 6,0). Do każdej studzienki dodano objętość 200μΐ tego roztworu. Płytkę zawinięto w plastyk dla zapobiegnięcia wysychaniu i inkubowano przez noc w temperaturze 30°C. Płytkę przemyto następnie cztery razy 1X PBS i zawartość studzienek odsysano usuwając płyn.
Do sprzęgnięcia kwasu nukleinowego o sekwencji komplementarnej do sekwencji o numerze identyfikacyjnym 147 z płytkami, określanego tu dalej jako immobilizowany kwas nukleinowy, zastosowano następującą procedurę. Syntezę immobilizowanego kwasu nukleinowego posiadającego sekwencję komplementarną do sekwencji numer 133 opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym numer 883096976. 20 mg suberynianu disukcynimidylowego rozpuszczono w 300 μΐ dimetyloformamidu (DMF). 26 jednostek OD260 immobilizowanego kwasu nukleinowego dodano do 100μΐ buforu do sprzęgania (50 mM fosoran sodowy, pH 7,8). Następnie mieszaninę sprzęgającą dodano do roztworu DSS-DMF i mieszano na mieszadle magnetycznym w ciągu 30 minut. Kolumnę NAP-25 zrównoważono 10 mM fosforanem sodowym, pH6,5. Mieszaninę sprzęgającą roztworu DSS-DMF dodano w temperaturze 4°C do 2 ml 10 mM fosforanu sodowego, pH6,5. Mieszaninę zmieszano na wstrząsarce i nałożono na zrównoważoną kolumnę NAP-25. Aktywowany DSS DNA immobilizowanego kwasu nukleinowego wyełuowano z kolumny 3,5 ml 10 mM fosforanu sodowego, pH6,5. 5,6 jednostek OD260 wyeluowanego aktywowanego DSS DNA immobilizowanego kwasu nukleinowego dodano do 1500 ml 50 mM fosforanu sodowego, pH 7,8. Objętość 50μΐ tego roztworu dodano do każdej studzienki i płytki inkubowano przez noc. Płytki przemyto następnie cztery razy 1X PBS i zawartość studzienek odsysano usuwając płyn.
Ostateczne usuwanie z płytek przeprowadzono w następujący sposób. Do każdej studzienki dodano objętość 200^l 0,2 N NaOH, zawierającego 0,5% (w/v) SDS. Płytkę zawijano w plastyk i inkubowano w temperaturze 65°C w ciągu 60 minut. Płytki przemyto następnie cztery razy 1X PBS i zawartość studzienek odsysano usuwając płyn. Tak przygotowaną płytkę przechowywano z perełkami środka osuszającego w temperaturze 2-8°C.
Próbki surowicy do oznaczania analizowano stosując PCR, a następnie przeprowadzono analizę sekwencji dla określenia genotypu.
Do każdej studzienki dodano preparatu próbki składającego się z 50 μΐ próbki surowicy i 150pl buforu P-K (2 mg/ml) proteinazy K w 53 mM Tris-HCl, pH 8,0/0,6M NaCl/0,06 M cytrynian sodowy/8mM EDTA, pH 8,0/1, 3% SDS/16 μg/ml zsonifikowanego DNA spermy łososia/7% formamid/50fmoli sond wychwytujących/160fmoli sond wykrywających). Płytki wstrząsano do zmieszania zawartości w studzience, przykryto i inkubowano w ciągu 16 godzin w temperaturze 62°C.
Po okresie dalszych 10 minut w temperaturze pokojowej, zawartości każdej studzienki odsysano usuwając cały płyn i studzienki przemyto dwa razy buforem do przemywania (0,1% SDS/0,015 M NaCl/0,0015 M cytrynian sodowy). Do każdej studzienki dodano następnie wzmac169 880 niającego kwasu nukleinowego (50 μΐ 0,7 fmola/μΐ roztworu w 0,48 M NaCl/0,048 M cytrynianie sodowym/0,1% SDS/0,5% „odczynniku blokującym (Boehringer Mannheim, numer katalogowy 1096 176)). Po przykryciu płytek i wytrząsaniu do zmieszania zawartości studzienek, płytki inkuPo dalszym okresie 10 minut w temperaturze pokojowej płytki przemyto jak opisano powyżej.
Do każdej studzienki dodano następnie kwasu nukleinowego znakowanego fosfatazą alkaliczną, ujawnionego w europejskim opisie patentowym numer 883096976 (50μΐ/studzienkę o stężeniu 2,66 fmola/μΐ). Po inkubacji w ciągu 15 minut w temperaturze 52°C i 10 minut w temperaturze pokojowej, studzienki dwukrotnie przemyto jak powyżej, a następnie trzy razy 0,015 M NaCl/0,0015M cytrynianem sodowym.
Wykorzystano zapoczątkowywaną enzymatycznie reakcję dioksoetanu (Schaap i in., Tet. Lett, (1987) 28; 1159-1162 i publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer 0254051), otrzymanego z Lumingen, Inc. Do każdej studzienki dodano ilość 50μ1 Lumiphos 530 (Lumigen). W studzienki lekko postukano, tak że odczynnik mógł opaść na dno i delikatnie zawirowano, aby rozmieścił się on równo na dnie. Studzienki przykryto i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 20-40 minut.
Następnie płytki odczytywano na luminometrze Dynatech ML 1000. Wynik otrzymywano jako pełną całkę światła wytwarzanego podczas reakcji.
W oznaczeniu stwierdzono dodatni wynik w każdej z próbek surowicy, niezależnie od genotypu.
IV. Ekspresja polipeptydu kodowanego przez sekwencje charakterystyczne dla różnych genotypów.
Polipeptydy HCV kodowane przez sekwencje spośród sekwencji o numerach 1-66 ulegały ekspresji jako fuzja polipeptydu z dysmutazą ponadtlenkową (SOD). cDNA niosące takie sekwencje zsubklonowano w wektorze ekspresyjnym pSODcfl (Steimer i in. (1986)).
Najpierw DNA wyizolowany z pSODcfl traktowano restryktazami BamHI i EcoRI i z liniowym DNA utworzonym przez enzymy restrykcyjne zligowano następujący łącznik:
GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA
CCT TAA GAC TAT TTT AA 3
Po sklonowaniu wyizolowano plazmid zawierający wstawkę.
Plazmid zawierający wstawkę poddano trawieniu restrykcyjnemu EcoRI. Z tym przeprowadzonym w postać liniową DNA plazmidowym zligowano cDNA HCV. Mieszaninę DNA zastosowano do transformacji szczepu D1210 E. coli (Sadler i in. (1980)). Polipeptydy wyizolowano w żelach.
V. Antygenowość polipeptydów.
Antygenowość polipeptydów utworzonych w części IV oszacowano w następujący sposób. Szpilki polietylenowe rozmieszczone na klocku w szeregach 8 X 12 (Coselco Mimetopes, Victoria, Australia) przygotowano przez ich umieszczenie w kąpieli (20% v/v piperydyna w dimetyloformamidzie (DMF)) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Szpilki usunięto, przemywano w DMF w ciągu 5 minut, następnie przemyto cztery razy w metanolu (2 minuty/przemywanie). Szpilkom umożliwiono wyschnięcie na powietrzu w ciągu co najmniej 10 minut, następnie przemywano w DMF (5 minut). W DMF (80μ1) rozpuszczono 1-hydroksybenzotriazol (HOBt, 367 mg) do stosowania w sprzęganiu zablokowanych polipeptydów przygotowanych w części IV.
Zablokowane aminokwasy umieszczono w studzienkach płytki do mikromiareczkowania z HOBt, a klocek ze szpilkami umieszczono na płytkę, zanurzając szpilki w studzienkach. Całość zamknięto następnie w plastykowym woreczku i umożliwiono reakcję w temperaturze 25°C w ciągu 18 godzin do sprzęgnięcia pierwszych aminokwasów ze szpilkami. Następnie usunięto klocek i szpilki przemyto DMF (2 minuty), metanolem (4 X, 2 minuty) i ponownie DMF (2 minuty) dla oczyszczenia i odblokowania związanych aminokwasów. Procedurę powtarzano dla każdego dodatkowego sprzęganego aminokwasu, do przygotowania wszystkich oktamerów.
Następnie wolne N-końce zacetylowano dla skompensowania wolnych grup aminowych, jakże większość epitopów nie występuje w N-końcu, a zatem nie mają jego dodatniego ładunku. Acetylację przeprowadzono napełniając studzienki płytki do mikromiareczkowania DMF/bez18
169 880 wodnikiem octowym/trietyloaminą (5:2:1 v/v/v) i umożliwiając szpilkom reakcją w studzienkach w ciągu 90 minut w temperaturze 20°C. Szpilki przemyto następnie DMF (2 minuty) i metanolem (4 X, 2 minuty) i suszono na powietrzu w ciągu co najmniej 10 minut.
Grupy blokujące łańcuchy boczne usunięto przez traktowanie szpilek kwasem trifluorccctowym/fenolem/ditioetanem (95:2,5:1,5) w woreczkach polipropylenowych w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie szpilki przemyto dichlorometanem (2 x, 2 minuty), 5% diizopropyloetyloaminą/dichlorometanem (2 x, 5 minut), dichlorometanem (5 minut) i suszono na powietrzu w ciągu co najmniej 10 minut.Następnie szpilki przemyto wodą (2 minuty), metanolem (18 godzin), wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i przechowywano w zamkniętych plastikowych woreczkach nad żelem krzeminkowym. IV.B.15.b Assay of Peptides.
Szpilki niosące oktamery sonifikowano w ciągu 30 minut w buforze do rozbijania (1% sodowy siarczan dodecylu, 0,1% 2-merkaptoetanol, 0,1 M NaHaPOą) w temperaturze 60°C. Szpilki następnie zanurzano kilka razy w wodzie (60°C), a następnie we wrzącym metanolu (2 minuty) i umożliwiano wyschnięcie na powietrzu.
Szpilki następnie oplaszczono wstępnie, z mieszaniem, w ciągu 1 godziny w temperaturze 25°C w studzienkach do mikromiareczkowania zawierających 200μ1 buforu do blokowania (1 % owoalbumina, 1% BSA, 0,1% Tween i 0,05% NaN 3 w PBS). Następnie szpilki zanurzono w studzienkach do mikromiareczkowania zawierających 175μ1 antysurowic otrzymanych od pacjentów z diagnozą HCV i umożliwiono inkubację w temperaturze 4°C przez noc. Tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałami poliklonalnymi surowicy a polipeptydem wskazywało na wywołanie przez peptydy odpowiedzi immunologicznej in vivo. Peptydy takie są potencjalnie użyteczne do opracowywania szczepionek.
A zatem, wynalazek ten opisano i zilustrowano. Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że można wykonać wiele jego odmian i modyfikacji, nie odbiegając od zakresu dołączonych zastrzeżeń oraz treści i zakresu niniejszego wynalazku.
Claims (20)
1. Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia wątroby C, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy posiadający sekwencję nukleotydową nie-HVC-1 ośmiu lub więcej nukleotydów w genomie wirusa zapalenia wątroby C odpowiadającą co najmniej jednemu z regionów zawierających region otoczki 1, region 5'UT, i region rdzenia odpowiadających sekwencjom o numerach 2-22,24-32,34-51 i 53-66 na wykazie sekwencji, w warunkach, które to warunki hybrydyzacji mogą wymusić zdolność tego kwasu nukleinowego do tworzenia produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia wątroby C, i wymusza się warunki hybrydyzacji dla utworzenia produktu hybrydyzacji w obecności kwasu nukleinowego wirusa zapalenia wątroby C.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nie-HCV-1 w genomie wirusa zapalenia wątroby C wybiera się sekwencję w co najmniej w jednym z regionów obejmujących zasadniczo region NS5, region otoczki 1, region 5'UT i region rdzenia.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nukleotydowej nie-HCV-1 wybiera się sekwencję w regionie NS5.
4. Sposób według zatrz. 3, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową wybiera się sekwencję nie-HCV-1 odpowiadającą sekwencji o numerach 2, 4-6, 10-12, 14-16 i 18-22.
5. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nie-HCV-1 wybiera się sekwencję w regionie otoczki 1.
6. Sposób według zatrz. 5, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nie-HCV-1 wybiera się spośród sekwencji o numerach 24-32.
7. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową wybiera się sekwencję nie-HCV-1 odpowiadającą sekwencji w regionie 5'UT.
8. Sposób według zatrz. 7, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową wybiera się sekwencję nie-HCV-1 wybraną spośród sekwencji o numerach 34-39 i 41-51.
9. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nie-HCV-1 wybiera się sekwencję w regionie rdzenia.
10. Sposób według zatrz. 9, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nie-HCV-1 wybiera się spośród sekwencji o numerach 53-57 i 58-66.
11. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową odpowiadającą sekwencji nukleotydowej nie-HCV-1 wybiera się jeden lub więcej genotyp wirusa zapalenia wątroby C.
12. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy o sekwencji odpowiadającej sekwencji pierwszego genotypu, który to pierwszy genotyp jest zdefiniowany przez sekwencje o numerach 1-6 w regionie NS5,23-25 w regionie otoczki 1, 33-38 w regionie 5'UT i 52-57 w regionie rdzenia.
13. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy o sekwencji odpowiadającej sejwencji drugiego genotypu, który to drugi genotyp jest zdefiniowany przez sekwencje o numerach 7-12 w regionie NS5, 26-28 w regionie otoczki 1, 39-45 w regionie 5'UT i 58-64 w regionie rdzenia.
14. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy o sekwencji odpowiadającej sekwencji trzeciego genotypu, który to trzeci genotyp jest zdefiniowany przez sekwencje o numerach 13-17 w regionie NS5,32 w regionie otoczki 1,46-47 w regionie 5'UT i 65-66 w regionie rdzenia.
15. Sposób według zatrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy o sekwencji odpowiadającej sekwencji czwartego genotypu, który to czwarty genotyp jest zdefiniowany przez sekwencje o numerach 20-22 w regionie NS5, 29-31 w regionie otoczki 1 i 48-49 w regionie 5'UT.
169 880
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy o sekwencji odpowiadającej sekwencji piątego genotypu, który to piąty genotyp jest zdefiniowany przez sekwencje o numerach 18-19 w regionie NS5 i 50-51 w regionie 5'UT.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze umieszcza się produkt hybrydyzaji zdolny do pełnienia funkcji startera reakcji syntezy kwasu nukleinowego.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy zaopatrzony w znacznik do wykrywania produktu hybrydyzacji.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy, który znajduje się na podłożu służącym do oddzielania produktu hybrydyzacji od roztworu.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że umieszcza się kwas nukleinowy zdolny do zapobiegania transkrypcji lub translacji wirusowego kwasu nukleinowego.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69732691A | 1991-05-08 | 1991-05-08 | |
| PCT/US1992/004036 WO1992019743A2 (en) | 1991-05-08 | 1992-05-08 | Hcv genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL169880B1 true PL169880B1 (pl) | 1996-09-30 |
Family
ID=24800701
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92312096A PL170151B1 (pl) | 1991-05-08 | 1992-05-08 | Sposób wykrywania jednego lub wiecej genotypów wirusa zapalenia watroby C PL PL PL |
| PL92301282A PL169880B1 (pl) | 1991-05-08 | 1992-05-08 | Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia watroby C PL PL PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92312096A PL170151B1 (pl) | 1991-05-08 | 1992-05-08 | Sposób wykrywania jednego lub wiecej genotypów wirusa zapalenia watroby C PL PL PL |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1394256A3 (pl) |
| JP (7) | JPH06508026A (pl) |
| KR (1) | KR100193801B1 (pl) |
| AT (1) | ATE252154T1 (pl) |
| BG (3) | BG64627B1 (pl) |
| CA (1) | CA2108466C (pl) |
| CZ (2) | CZ288720B6 (pl) |
| DE (1) | DE69233234T2 (pl) |
| DK (1) | DK0585398T3 (pl) |
| ES (1) | ES2207633T3 (pl) |
| FI (1) | FI115725B (pl) |
| HU (1) | HU227548B1 (pl) |
| IE (1) | IE921482A1 (pl) |
| NO (1) | NO309532B1 (pl) |
| PL (2) | PL170151B1 (pl) |
| PT (1) | PT100472B (pl) |
| RO (1) | RO117267B1 (pl) |
| RU (1) | RU2155228C2 (pl) |
| SK (1) | SK284205B6 (pl) |
| WO (1) | WO1992019743A2 (pl) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5428145A (en) * | 1991-08-09 | 1995-06-27 | Immuno Japan, Inc. | Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems |
| EP0532167A3 (en) * | 1991-08-09 | 1993-03-31 | Immuno Japan Inc. | Non-a, non-b hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems |
| US5427909A (en) * | 1991-09-09 | 1995-06-27 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes |
| AU671967B2 (en) * | 1991-11-21 | 1996-09-19 | Common Services Agency | Hepatitis-C virus testing |
| US6667387B1 (en) | 1996-09-30 | 2003-12-23 | N.V. Innogenetics S.A. | HCV core peptides |
| US6709828B1 (en) | 1992-03-06 | 2004-03-23 | N.V. Innogenetics S.A. | Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them |
| US5686272A (en) * | 1992-05-29 | 1997-11-11 | Abbott Laboratories | Amplification of RNA sequences using the ligase chain reaction |
| NZ286209A (en) * | 1992-09-10 | 2000-09-29 | Isis Pharmaceuticals Inc | Use of HCV RNA anti-sense nucleotide sequences for treating Hepatitis C virus related disease |
| US6423489B1 (en) * | 1992-09-10 | 2002-07-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases |
| JPH06153961A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Imuno Japan:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法 |
| EP0905258A3 (en) | 1992-11-27 | 2001-01-31 | Innogenetics N.V. | Method for detecting nucleic acid sequences based on the use of solid phase immobilised nucleotide probes (line probe assay) |
| US7258977B1 (en) | 1992-11-27 | 2007-08-21 | Innogenetics N.V. | Process for typing of HCV isolates |
| US7255997B1 (en) | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| ATE552340T1 (de) * | 1993-04-27 | 2012-04-15 | Innogenetics Nv | Hepatitis c virus genotypsequenzen sowie ihre verwendung als behandlungs- und nachweismitteln |
| JPH0775585A (ja) * | 1993-06-14 | 1995-03-20 | Immuno Japan:Kk | Ｃ型肝炎ウイルス関連オリゴヌクレオチドならびにｃ型肝炎 ウイルス遺伝子型判定方法 |
| US7070790B1 (en) | 1993-06-29 | 2006-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5882852A (en) * | 1993-06-29 | 1999-03-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates |
| EP0729973A4 (en) * | 1993-10-29 | 1998-12-30 | Srl Inc | AN ANTIQUE PEPTIDE COMPOUND AND IMMUNOASSAY PROCEDURE |
| WO1995030746A1 (en) * | 1994-05-10 | 1995-11-16 | The General Hospital Corporation | Antisense inhibition of hepatitis c virus |
| US7129337B1 (en) | 1994-10-21 | 2006-10-31 | Innogenetics N.V. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agents |
| US5851759A (en) * | 1996-04-19 | 1998-12-22 | Chiron Corporation | Heteroduplex tracking assay (HTA) for genotyping HCV |
| IT1284847B1 (it) * | 1996-06-07 | 1998-05-22 | Sorin Biomedica Diagnostics Sp | Procedimento per la rivelazione di acidi nucleici specifici di hcv |
| WO1999024606A2 (de) | 1997-11-04 | 1999-05-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Spezifisches und sensitives nukleinsäurenachweisverfahren |
| US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| AU2001292151B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-05-04 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US6586584B2 (en) | 2001-01-29 | 2003-07-01 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detection of Hepatitis C virus |
| US7196183B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| US8124747B2 (en) | 2003-08-29 | 2012-02-28 | Innogenetics | HCV clade and prototype sequences thereof |
| CN1977050B (zh) | 2004-01-07 | 2012-09-05 | 第三次浪潮技术公司 | 丙型肝炎病毒基因型的确定 |
| KR100733186B1 (ko) * | 2005-05-31 | 2007-06-27 | 재단법인 목암생명공학연구소 | Ｈｃｖ 유전자에 특이적인 작은 간섭 ｒｎａ 및 그를유효성분으로 포함하는 ｃ형 간염 치료제 |
| US8071561B2 (en) | 2007-08-16 | 2011-12-06 | Chrontech Pharma Ab | Immunogen platform |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2012739T5 (es) * | 1987-11-18 | 2001-12-01 | Chiron Corp | Diagnosticos para nanbv. |
| HUT54896A (en) * | 1989-03-17 | 1991-04-29 | Chiron Corp | Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv |
| ES2029171A6 (es) * | 1989-12-18 | 1992-07-16 | Wellcome Found | Un procedimiento para preparar un polipeptido virico de hepatitis no a y no b post-transfusional (pt-nanbh) |
| WO1991014779A1 (en) * | 1990-03-28 | 1991-10-03 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Diagnostic for hepatitis virus |
| AU660925B2 (en) * | 1990-04-06 | 1995-07-13 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis C virus epitopes |
| FI913068A (fi) * | 1990-06-25 | 1991-12-26 | Univ Osaka Res Found | Non-a-, non-b-hepatitisviruspartiklar. |
| EP0933426A1 (en) * | 1990-06-25 | 1999-08-04 | The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University | Non-a, non-b hepatitis virus genomic cdna fragments and antigen polypeptides |
| EP0510952A1 (en) * | 1991-04-26 | 1992-10-28 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotide primers and their application for high-fidelity detection of non-a, non-b hepatitis virus |
-
1992
- 1992-05-08 DK DK92913881T patent/DK0585398T3/da active
- 1992-05-08 CZ CZ19932377A patent/CZ288720B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 JP JP4512055A patent/JPH06508026A/ja not_active Withdrawn
- 1992-05-08 PL PL92312096A patent/PL170151B1/pl unknown
- 1992-05-08 EP EP03013389A patent/EP1394256A3/en not_active Withdrawn
- 1992-05-08 PL PL92301282A patent/PL169880B1/pl unknown
- 1992-05-08 CA CA002108466A patent/CA2108466C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-08 ES ES92913881T patent/ES2207633T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-08 RU RU93058449/13A patent/RU2155228C2/ru active
- 1992-05-08 EP EP92913881A patent/EP0585398B1/en not_active Revoked
- 1992-05-08 WO PCT/US1992/004036 patent/WO1992019743A2/en not_active Application Discontinuation
- 1992-05-08 SK SK1232-93A patent/SK284205B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 RO RO93-01493A patent/RO117267B1/ro unknown
- 1992-05-08 DE DE69233234T patent/DE69233234T2/de not_active Revoked
- 1992-05-08 KR KR1019930703367A patent/KR100193801B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 HU HU9303166A patent/HU227548B1/hu unknown
- 1992-05-08 PT PT100472A patent/PT100472B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 AT AT92913881T patent/ATE252154T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 CZ CZ19961210A patent/CZ288722B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-07-01 IE IE148292A patent/IE921482A1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-11-05 BG BG101876A patent/BG64627B1/bg unknown
- 1993-11-05 BG BG98200A patent/BG62142B1/bg unknown
- 1993-11-05 NO NO934019A patent/NO309532B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-11-08 FI FI934937A patent/FI115725B/fi not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-09-04 BG BG101876A patent/BG101876A/xx unknown
-
2002
- 2002-05-10 JP JP2002134998A patent/JP2003024090A/ja not_active Withdrawn
- 2002-05-10 JP JP2002135000A patent/JP2003009893A/ja not_active Withdrawn
- 2002-05-10 JP JP2002134999A patent/JP2003009892A/ja not_active Withdrawn
- 2002-05-10 JP JP2002134997A patent/JP2003009891A/ja not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-06-04 JP JP2004167859A patent/JP2004290204A/ja not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-03-05 JP JP2008055639A patent/JP2008178416A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL169880B1 (pl) | Sposób wytwarzania produktu hybrydyzacji z kwasem nukleinowym wirusa zapalenia watroby C PL PL PL | |
| US6297370B1 (en) | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics | |
| Simmonds et al. | Mapping of serotype-specific, immunodominant epitopes in the NS-4 region of hepatitis C virus (HCV): use of type-specific peptides to serologically differentiate infections with HCV types 1, 2, and 3 | |
| JP4296174B2 (ja) | Ｇ型肝炎ウイルスおよびその分子クローニング | |
| US6312889B1 (en) | Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
| US7402315B2 (en) | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 | |
| CA2123875C (en) | Hepatitis-c virus testing | |
| IE83867B1 (en) | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics | |
| WO1991015771A1 (en) | Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies | |
| EP0642666B2 (en) | Hepatitis c assay | |
| Hotta et al. | Analysis of the core and E1 envelope region sequences of a novel variant of hepatitis C virus obtained in Indonesia | |
| DK175975B1 (da) | NANBV-diagnostika og -vacciner | |
| Chien et al. | Distinct subtypes of hepatitis C virus defined by antibodies directed to the putative core, NS4, and NS5 region polypeptides | |
| RU2162894C2 (ru) | Полипептид, обладающий антигенными свойствами вируса гепатита с и его фрагмент (варианты), диагностический реагент (варианты), набор для обнаружения антител (варианты), способ обнаружения антител (варианты) |