PL175338B1 - Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) - Google Patents
Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV)Info
- Publication number
- PL175338B1 PL175338B1 PL94323368A PL32336894A PL175338B1 PL 175338 B1 PL175338 B1 PL 175338B1 PL 94323368 A PL94323368 A PL 94323368A PL 32336894 A PL32336894 A PL 32336894A PL 175338 B1 PL175338 B1 PL 175338B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hcv
- virus
- hepatitis
- type
- epitope
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 94
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 23
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 36
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 claims 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims 1
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 claims 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 9
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N OOOO Chemical compound OOOO RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N N-methylisoleucine Chemical compound CCC(C)C(NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 2
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101100132481 Oryza sativa subsp. japonica NAC071 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
1. Polipeptyd posiadajacy sekwencje reszt aminokwasowych odpowiadajaca epi- topowi typowo swoistemu znajdujacemu sie w obrebie regionu rdzeniowego wirusa za- palenia watroby typu C, znamienny tym, ze epitop ten zlokalizowany jest miedzy reszta- mi aminokwasowymi 67 i 84 wirusa zapalenia watroby typu C albo homologicznymi regio- nami innych typów wirusów zapalenia watroby typu C. F IG . 1 PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu znajdującemu się w obrębie regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzujący się tym, że epitop ten zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 67 i 84 wirusa zapalenia wątroby typu C albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu w obrębie regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzuje się tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwasowymi 1689 i 1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C. Ponadto przedmiotem wynalazku jest polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu w obrębie regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C, charakteryzujący się tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 i 2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C, który charakteryzuje się tym, że zawiera połączenie epitopów typowo swoistych z wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym połączenie to zawiera co najmniej jeden epitop z regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C. Korzystnie reagent ten stanowi połączenie, które obejmuje co najmniej jeden typowo swoisty epitop wybrany z regionu NS4, regionu NS5 i regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C. Również korzystnie reagent stanowi połączenie, które obejmuje wiązkę typowo swoistych epitopów z regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C. W jeszcze bardziej korzystnym rozwiązaniu reagent, połączenie to ponadto obejmuje co najmniej jeden typowo swoisty epitop z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C.
175 338
Korzystnie reagent według wynalazku jest związany na trwałym podłożu nitrocelulozowym.
W oparciu o polipeptyd lub reagent według wynalazku możliwe jest utworzenie kompozycji i sposobów w użytecznych do klasyfikowania wirusów HCV na podstawie genotypu i serotypu. Kompozycje mogą zawierać swoiste dla danego typu epitopy, epitopy swoiste dla wiązki typów, kwasy nukleinowe kodujące te epitopy do użycia jako sondy oraz kwasy nukleinowe komplementarne do regionów flankujących te, które kodują epitopy, do stosowania jako primery.
Współczesny sposób klasyfikowania HCV zawiera etapy uzyskania od danego osobnika próbki zawierającej przeciwciało, kontaktowania tej próbki ze swoistym dla danego typu epitopem albo z epitopami swoistymi dla wiązki typów w warunkach pozwalających na wiązanie antygenu z przeciwciałem i oznaczenia, czy przeciwciała obecne w próbce wiążą się z tym epitopem.
Możliwe jest także zastosowanie sposobu klasyfikowania HCV, który zawiera etapy uzyskania od danego osobnika próbki zawierającej przeciwciało, kontaktowanie tej próbki z drugim swoistym dla danego typu epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach pozwalających na wiązanie antygenu z przeciwciałem, i określenia, czy przeciwciała obecne w próbce wiążą się z pierwszym lub z drugim epitopem.
W niniejszym opisie użyte są następujące skróty reszt aminokwasowych:
A = alanina,
I = izoleucyna,
L = leucyna,
M = metionina,
F = fenyloalanina,
P = prolina,
W = trypofan,
V = walina,
N = asparagina,
C = cysteina,
Q = glutamina,
G = glicyna,
S = seryna,
T = treotonina,
Y = tyrozyna,
R = arginina,
H = histydyna,
K = lizyna,
D = kwas asparaginowy, i
E = kwas glutaminowy.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych wywodzące się z regionu rdzeniowego i podtypy, z których je otrzymano są następujące:
1. PEGRTWAQ, podtyp 1a albo 1b
2. STGKSWGK, podtyp 2a lub 2b
3. SEGRSTWAQ, podtyp 3a albo 4.
Inny zestaw polipeptydów obejmuje typowo-swoisty epitop otrzymany z niestrukturalnego regionu 4 wirusa HCV (NS4). Ten drugi zestaw obejmuje obszar pomiędzy resztami aminokwasowymi 1689 a 1718 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów HCV.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych oraz typy i podtypy, z których one pochodzą są następujące:
1. CSQHLPY, podtyp 1a
2. CASHLPY, podtyp 1b
3. CASRAAL, podtyp 2a albo 2b.
175 338
Jeszcze inny zestaw polipeptydów obejmuje epitop typowo-swoisty albo epitopy swoiste względem wiązki typów, otrzymane z niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby typu C. Ten zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 a 2313 wirusa HCV-1 i homologicznymi regionami innych typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Poszczególne sekwencje reszt aminokwasowych oraz typy i podtypy, z których pochodzą są następujące:
1. PDYEPPWHG. podtyp 1a
2. PDYVPPVVHG, podtyp 1b
3. PDYQOATVAG, podtyp 2a
4. PGYEPPTVLG, podtyp 2b
5. FAQASPVW, podtyp 1a
6. FPPQALPIW, podtyp 1b
7. FPQALPAW, podtyp 2a
8. FPPQALPPW, podtyp 2b.
Polipeptyd według wynalazku składający się z sekwencji reszt aminokwasowych opisanych powyżej epitopów typowo swoistych i epitopów swoistych wobec wiązki typów kodowany jest przez cząsteczki kwasu nukleinowego. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są użyteczne jako sondy, np. w próbach plamienia Southera lub w innych próbach rozpoznania DNA, takich jak próba wychwytywania. opisana w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4.868.105 i 5.124.246.
Natomiast cząsteczki komplementarne do sekwencji kwasu nukleinowego flankujących regiony kodujące epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste wobec wiązki typów są użyteczne do prowadzenia łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR) do oznaczania genotypów konkretnych HCV.
Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat strategii doświadczalnego oznaczenia serotypu, fig. 2 - schemat strategii wyczerpującego mapowania epitopu, fig. 3 - kompilację wykresów przedstawiających wyniki mapowania epitopu wirusa HCV 1a (Rodney), fig. 4 - kompilację wykresów przedstawiających wyniki mapowania epitopu wirusa HCV 2b (Nomoto).
Definicje
Wirus zapalenia wątroby typu C albo HCV odnosi się do tych rodzajów wirusa, których typy patogenne powodują NANBH oraz do pochodzących od nich typów atenuowanych albo defektywnych cząstek interferujących. Wirus ten jest opisany w publikacjach cytowanych w niniejszym opisie. Genom HCV jest zbudowany z RNA. Wirusy zawierające RNA charakteryzują się stosunkowo wyższymi szybkościami mutacji spontanicznych, szacowanych na rząd 10'3 do 10- na wbudowany nukleotyd (FIlds i Knipe, Fundamental Virology, 1986, Raven Press, NY). Ponieważ heterogenność i płynność geneotypu są u RNA-wirusów cechami dziedzicznymi, w obrębie rodzaju HCV istnieje wiele typów i podtypów, które mogą być wirulentne albo niezłośliwe.
Namnażanie, identyfikacja, detekcja i izolacja różnych typów i izolatów HCV są udokumentowane w piśmiennictwie. Jak zaznaczono, wszystkie sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe pochodzą z wymienionych typów HCV. Ilość sekwencji genomowych HCV-1 i aminokwasowych jest taka, jaka jest opisana przez Choo i wsp., Brit. Med. Bull. 1990, 46, 423-441. Ujawnienie zawarte w opisie pozwala na oznaczenie różnych typów.
Użyty w opisie termin typ oznacza wirusy HCV różniące się pod względem genotypu o więcej niż około 30%, określenie podtyp oznacza wirusy HCV różniące się pod względem genotypu o 10 - 20%, a określenie izolat oznacza wirusy różniące się genotypowo o mniej niż około 10%. Klasyfikowanie odnosi się do rozróżnienia jednego typu wirusa HCV od drugiego typu.
W publikacji zgłoszenia międzynarodowego, WO 93/CMD365 znajduje się formacja o kliku typach/podtypach HCV, zwłaszcza o typie lub podtypie CDC/HCV1 (zwanym również HCV-1).
175 338
Informacja o jednym typie albo podtypie, taka jak częściowa sekwencja genomowa lub aminokwasowa, jest wystarczająca dla specjalisty z tej dziedziny stosującego standardowe techniki do wyizolowania nowych typów HCV. Przykładowo, przeprowadzono skrining kilku różnych typów HCV w sposób opisany poniżej. Takie typy, które uzyskano z wielu surowic ludzkich (i z różnych stref geograficznych) klasyfikowano stosując sposób i odczynniki opisane w niniejszym opisie.
Wprowadzono strukturę genomu i sekwencję nukleotydową genomowego RNA wirusa HCV-1. Okazuje się, że genom jest jednoniciowym RNA zawierającym 10.000 nukleotydów. Genom posiada nić dodatnią i ciągłą, translacyjną otwartą ramkę odczytu (ORF) kodującą poliproteinę złożoną z około 3000 aminokwasów. W tej ramce ORF, białko strukturalne jest kodowane w mniej więcej pierwszej ćwiartce regionu końca aminowego, a z większej części tej poliproteiny powstają białka niestrukturalne (NS). Przy porównaniu ze wszystkimi znanymi sekwencjami wirusowymi, obserwuje się niewielkie, ale znaczące ko-liniowe homologię z białkami niestrukturalnymi (NS) z rodziny flawiwirusa i z pestywirusami (co do których, obecnie uważa się, że stanowią część rodziny Flaviwirusów).
Opierając się na przypuszczalnych resztach aminokwasowych kodowanych przez sekwencję nukleotydową HCV-1 i na innym dowodzie, wyprowadzono możliwe domeny białkowe kodowanej poliproteiny HCV oraz przybliżone wiązania. Są one przedstawione w tabeli 1.
Tabela 1
| Przypuszczalna domena | Przybliżone wiązanie (numery aminokwasów) |
| C (białko nukleokapsydu) | 1-191 |
| E1 (białko otoczki wirionu) | 192 - 383 |
| E2/NS1 (otoczka) | 384 - 800 |
| NS2 (funkcja nieznana) | 800 -1050 |
| NS3 (proteaza) | 1050 -1650 |
| NS4 (funkcja nieznana) | 1651 - 2100 |
| NS5 (polimeraza) | 2100 - 3011 (koniec) |
Te domeny są przypuszczalne. Przykładowo, granica E1-NS2 znajduje się prawdopodobnie w regionie 750 - 810, a granica NS3-NS4 istnieje przypuszczalnie w regionie około 1640 - 1650. Istnieje również dowód na to, że wersja C zawierająca 191 aminokwasów (aa) jest prekursorem podlegającym dalszemu przetwarzaniu do długości około 170 aminokwasów i do NS2. Obydwa białka są dalej przetwarzane do dwu białek dojrzałych.
Różne typy HCV definiuje się według różnych kryteriów, takich jak np. ORF o długości od około 9.000 nukleotydów do około 12.000 nukleotydów, kodująca białko o rozmiarach podobnych do rozmiarów HCV-1, kodowana poliproteina o właściwościach hydrofobowych i/lub antygenowych podobnych do tych, jakie posiada HCV-1 oraz obecność ko-liniowych sekwencji polipeptydowych zachowanych w wirusie HCV-1.
Do identyfikacji typów HCV można zastosować następujące parametry homologii kwasu nukleinowego i homologii aminokwasowej, bądź pojedynczo, bądź w kombinacji. Na ogół, jak podano powyżej, różne typy HCV wykazują około 70% homologii, podtypy wykazują 80 - 90% homologii, a izolaty charakteryzują się homologią około 90 procentową.
Używane w opisie określenie: polinukleotyd pochodzący z określonej sekwencji odnosi się do sekwencji polinukleotydowej złożonej z co najmniej około 6 nukleotydów, korzystnie, co najmniej około 8 nukleotydów, korzystniej, co najmniej około 10 do 12
175 338 nukleotydów, a nawet bardziej korzystnie, co najmniej około 15 do 20 nukleotydów korespondujących z regionem tej określonej sekwencji nukleotydowej. Wyrażenie korespondujący oznacza homologiczny z określoną sekwencją albo do niej komplementarny. Korzystnie, sekwencja regionu, z którego pochodzi polinukleotyd jest homologiczna z sekwencją unikalną w genomie HCV albo jest do tej sekwencji komplementarna.
Techniki hybrydyzacji do oznaczania komplementarności sekwencji kwasów nukleinowych są znane. Są one np. opisane przez Maniatisa i wsp. (1982). Ponadto, niedopasowania polinukleotydów dupleksowych powstających w wyniku hybrydyzacji można oznaczyć znanymi technikami, w tym np. techniką trawienia nukleazą, taką jak nukleaza S1, która swoiście trawi jednoniciowe obszary polinukleotydów dupleksowych. Regiony, z których mogą pochodzić typowe sekwencję DNA obejmują, ale nie ograniczają się do np. regionów kodujących epitopy typowo swoiste oraz regiony nie podlegające transkrypcji ani/lub translacji.
Pochodny polinukleotyd niekoniecznie fizycznie pochodzi w przedstawionej sekwencji nukleotydowej, ale może być otrzymany w dowolny sposób, w tym np. przez syntezę chemiczną, przez replikację DNA albo przez odwrotną transkrypcję lub translację. Poza tym, można modyfikować kombinacje regionów odpowiadających wyznaczonej sekwencji znanymi metodami, tak, aby były one odpowiednie do zamierzonego zastosowania.
Podobnie, określenie: polipeptyd albo sekwencja aminokwasową pochodząca z określonej sekwencji aminokwasowej albo sekwencji kwasu nukleinowego odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową identyczną z tą, jaką posiada polipeptyd kodowany w tej sekwencji albo jego części, która to część składa się z co najmniej 3 do 5 aminokwasów, korzystniej, co najmniej 8-10 aminokwasów, a jeszcze korzystniej co najmniej 11 do 15 aminokwasów albo odnosi się do polipeptydu, który jest możliwy do identyfikacji immunologicznej za pomocą polipeptydu kodowanego w tej sekwencji. Termin ten obejmuje również polipeptyd wytwarzany przez ekspresję określonej sekwencji kwasu nukleinowego.
Rekombinantowy lub pochodny polipeptyd nie musi powstawać w wyniku translacji określonej sekwencji kwasu nukleinowego. Można go wytwarzać w dowolny sposób, obejmujący np. syntezę chemiczną albo ekspresję rekombinantowego układu ekspresyjnego albo izolację z HCV, w tym z mutowanego HCV. Polipeptydy przedstawione w niniejszym opisie są relatywnie krótkie, a zatem, najłatwiej się je syntetyzuje drogą chemiczną.
Taki rekombinantowy lub pochodny polipeptyd może zawierać w swej sekwencji jeden lub większą ilość analogów aminokwasów albo aminokwasów nie występujących w stanie naturalnym. Metody wbudowywania analogów aminokwasów do sekwencji są znane. Można również włączać jeden lub większą ilość znaczników, co jest sprawą znaną dla specjalisty z tej dziedziny. Szczegółowy opis analogów i mimotopów znajduje się w opisie patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5.194.392.
Do analogów peptydowych należą analogi, w których dokonano delekcji, addycji, podstawienia albo modyfikacji przy zachowaniu zdolności rozpoznawania typu wirusa HCV. Do korzystnych podstawień należą podstawienia konserwatywne, to znaczy takie, w których dana reszta jest zastąpiona przez mną resztę tego samego typu. Jak wiadomo, aminokwasy występujące w stanie naturalnym można dzielić na kwaśne, zasadowe, obojętne i polarne albo obojętne i niepolarne. Ponadto, trzy kodowane aminokwasy są aromatyczne. Korzystne jest, aby kodowane polipeptydy różniące się od naturalnego epitopu zawierały podstawione kodony dla aminokwasów należących do tej samej grupy co zastępowany aminokwas. Tak więc, aminokwasy zasadowe: Lys, Arg i His są w zasadzie wzajemnie wymienialne, aminokwasy kwaśne: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy są wzajemnie wymienialne, obojętne, polarne aminokwasy: Ser, Thr, Cys, Gln i Asn są wzajemnie wymienialne, niepolarne alifatyczne aminokwasy: Gly, Ala, Val, De i Leu są w stosunku do siebie nawzajem konserwatywne (ale z powodu rozmiarów, ściślej spokrewnione są Gly z Ala oraz Val z Ile i z Leu), a także aromatyczne aminokwasy: Phe, Trp i Tyr są wzajemnie wymienialne. Prolina jest aminokwasem niepolarnym i obojętnym, a pomimo tego stwarza
175 338 trudności z powodu swego wpływu na konformację. Podstawienia proliną lub w miejsce proliny nie są korzystne za wyjątkiem przypadków, kiedy można uzyskać tę samą albo zbliżoną konformację. Do polarnych aminokwasów reprezentujących zmiany konserwatywne należą Ser, Thr, Gln, Asn i w mniejszym stopniu Met. Ponadto, Ala, Gly i Ser, jakkolwiek klasyfikuje się je w różnych kategoriach, wydają się być wzajemnie wymienialne, a Cys dodatkowo pasuje do tej grupy albo może być klasyfikowana do polarnych obojętnych aminokwasów.
Należy poza tym zaznaczyć, że jeśli polipeptydy wytwarza się syntetycznie, można również dokonywać podstawień przez aminokwasy, które nie są kodowane przez dany gen. Do takich alternatywnych reszt należą na przykład omega-aminokwasy o wzorze H2N(CH2)nCOOH, w których n ma wartość 2 do 6. Są to obojętne, niepolarne aminokwasy, takie jak sarkozyna (Sar), t-butylo-alanina (t-BuA), t-butylo-glicyna (t-BuG), N-metyloizoleucyna (N-Melle) i norleucyna (NIe). Przykładowo, fenyloglicynę można podstawić w miejsce Trp, Tyr albo Phe, aromatycznego aminokwasu obojętnego. Cytrulina (Cit) i sulfotlenek metioniny (MSO) są polarne, ale obojętne, cykloheksyloalanina (Cha) jest obojętna i niepolarna, kwas cysternowy (Cya) jest kwaśny, a omityna (Orn) jest zasadowa. Właściwości konformacyjne nadane obecnością reszt proliny można zachować podstawiając jedną lub większą ilość tych reszt hydroksyproliną (Hyp).
Termin polinukleotyd rekombinantowy oznacza w niniejszym opisie polinukleotyd pochodzenia genomowego, cDNA, półsyntetyczny, który ze względu na swe pochodzenie albo w wyniku manipulacji (1) nie jest związany ani z całością, ani z częścią polinukleotydu, z którym jest związany w stanie naturalnym, (2) jest połączony z polinukleotydem innym niż ten, z którym jest związany w stanie naturalnym albo (3) nie występuje w stanie naturalnym.
Termin polinukleotyd oznacza w niniejszym opisie polimeryczną formę nukleotydów o dowolnej długości, zarówno rybonukleotydów jak i dezoksyrybonukleotydów. Termin ten odnosi się tylko do struktury pierwszorzędowej cząsteczki. Tak więc, obejmuje on dwu- i jednoniciowy DNA i RNA. Zawiera on również znane typy modyfikacji, np. znaczniki znane w stanie techniki, formy metylowane, formy o strukturze cap (osłonięte), formy zawierające podstawienie jednego lub większej ilości naturalnie występujących nukleotydów analogiem, polinukleotydy zawierające modyfikacje międzynukleotydowe, takie jak np. wiązania nie zawierające ładunków (np. metylofosfonianowe, fosfotrójestrowe, amidofosforanowe, karbaminianowe i podobne) oraz takie, które zawierają ładunki (np. tiofosforany, ditiofosforany i podobne), takie, które zawierają reszty wiszące, np. białka, takie jak nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnalne i poli-L-lizyna, polinukleotydy zawierające interkalatory (takie jak akrydyna, psoralen i podobne), zawierające chelatory (np. metale, metale radioaktywne, bor, metale utleniające i podobne), takie, które zawierają środki alkilujące, takie, które zawierają wiązania modyfikowane (np. alfa anomeryczne kwasy nukleinowe i podobne) oraz niemodyfikowane formy tego polinukleotydu. Polinukleotydy przedstawione w opisie są relatywnie krótkie, a zatem łatwo je otrzymać na drodze syntezy chemicznej.
Określenie oczyszczony polipeptyd odnosi się do polipeptydu w stanie zasadniczo wolnym od innych polipeptydów, to znaczy, w kompozycji zawierającej co najmniej około 50% wagowych (stosunek żądanego polipeptydu do całkowitej ilości wszystkich polipeptydów w kompozycji), korzystnie co najmniej około 70%, a nawet bardziej korzystnie, co najmniej około 90% żądanego polipeptydu, bez uwzględnienia materiału niebiałkowego w tej kompozycji. Techniki oczyszczania wirusowych polipeptydów są znane. Oczyszczone przeciwciała są zdefiniowane podobnie w stanie techniki.
Wyrażenie epitop oznacza determinantę antygenową polipeptydu. Epitop może zawierać 3 albo większą ilość aminokwasów decydujących o miejscu wiązania z przeciwciałem. W zasadzie, epitop składa się z co najmniej 5 aminokwasów, a czasem zawiera co najmniej 8 aminokwasów. Metody mapowania epitopów są znane.
Termin epitop typowo-swoisty odnosi się do epitopu występującego w jednym typie HCV. Wyrażenie epitop swoisty dla wiązki typów znajduje się w więcej niż jednym, ale nie we
175 338 wszystkich typach HCV. Przykładowo, konkretny epitop może być rozpoznawany przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-1, ale nie będą rozpoznawane albo będą rozpoznawane mniej skutecznie przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-2. Podobnie, epitop swoisty dla wiązki typów pochodzący z HCV-3 może być rozpoznany przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusem HCV-3 albo HCV-4, ale nie przez przeciwciała pochodzące od pacjenta zakażonego wirusami HCV-1 albo HCV-2. Konserwatywnymi epitopami są te, które są rozpoznawane przez przeciwciała swoiste dla wszystkich typów HCV.
Polipeptyd jest reaktywny immunologicznie z przeciwciałem, które przyłącza się do peptydu w wyniku rozpoznawania przez to przeciwciało swoistego epitopu zawartego w tym polipeptydzie. Reaktywość immunologiczną można oznaczać przez wiązanie z przeciwciałem, zwłaszcza przez oznaczanie kinetyki wiązania z przeciwciałem i/lub przez oznaczanie kompetycji wiązania, stosując jako czynniki konkurencyjne znane polipeptydy zawierające epitop, przeciwko któremu jest skierowane to przeciwciało. Techniki określania, czy polipeptyd jest reaktywny immunologicznie z danym przeciwciałem są znane.
Stosowany w niniejszym opisie termin przeciwciało odnosi się do polipeptydu albo grupy polipeplydów zawierających co najmniej jedno miejsce wiążące. Miejsce wiążące przeciwciała albo domena wiążąca powstają w wyniku sfałdowania domen zmiennych cząsteczki przeciwciała z utworzeniem trójwymiarowych przestrzeni wiążących, w których kształt powierzchni wewnętrznej i rozmieszczenie ładunków jest komplementarne do charakteiystycznych cech epitopu na antygenie, co pozwala na reakcję immunologiczną z tym antygenem. Miejsce wiążące przeciwciała może się tworzyć z domeny o łańcuchu ciężkim i/lub lekkim (odpowiednio Vh i Vl) tworzącej hiperzmienne pętle biorące udział w wiązaniu antygenu. Określenie przeciwciało oznacza np. przeciwciała zwierząt kręgowych, przeciwciała hybrydowe, przeciwciała chimerowe, przeciwciała zmienione, przeciwciała jednowartościowe, białka Fab i przeciwciała jedno-domenowe.
Przeciwciała swoiste wobec polipeptydów i polipeptydy można wytwarzać dowolnym sposobem znanym w stanie techniki. Przykładowo, polipeptydy na ogół zawiesza się w buforze akceptowalnym fizjologicznie, miesza się je z odpowiednim adiuwantem i wstrzykuje zwierzęciu. Sposoby otrzymywania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych są znane i nie są podane w niniejszym opisie.
Określenie polipeptyd oznacza polimer aminokwasowy i nie określa długości własnej produktu. Tak więc, definicją polipeptydu są objęte polipeptydy, oligopeptydy i białka. Termin ten nie obejmuje modyfikacji postekspresyjnych tego polipeptydu, np. glikozylacji, ascetylacji, fosforylacji i podobnych. Definicją tą objęte są np. polipeptydy zawierające jeden lub większą ilość analogów aminokwasów (w tym np. aminokwasy nie występujące w stanie naturalnym i podobne), polipeptydy z podstawionymi wiązaniami oraz inne znane modyfikacje, zarówno występujące w stanie naturalnym, jak i nie występujące w naturze.
Pod określeniem leczenie rozumie się profilaktykę i/lub terapię. Stosowane w opisie określenie osobnik odnosi się do kręgowców, zwłaszcza należących do rodzaju ssaków i obejmuje, ale nie ogranicza się do zwierząt (np. psów, kotów, bydła, świni, owiec, kóz, królików, myszy, szczurów, świnek morskich i podobnych) oraz do naczelnych, w tym małp, szympansów, pawianów i ludzi.
Wyrażenie nić sensowna kwasu nukleinowego oznacza sekwencję wykazującą homologię do sekwencji mRNA. Nić antysensowna oznacza sekwencję komplementarną do nici sensownej.
Genom z nicią dodatnią danego wirusa oznacza taki wirus, w którym genom, zarówno RNA jak i DNA, jest jednoniciowy i koduje wirusowy polipeptyd albo polipeptydy. Przykładami RNA wirusów z nicią dodatnią są Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae i Caliciviridae. Do takich wirusów należą również Flaviviridae, poprzednio klasyfikowane jako Togaviridae (Fields i Knipe, 1986).
Termin zawierająca przeciwciało próbka ciała odnosi się do składnika ciała danego osobnika służącego jako źródło żądanych przeciwciał. Zawierające przeciwciała składniki
175 338 organizmu są znane i obejmują, ale nie ograniczają się do np. osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych sekcji przewodów: oddechowego,pokarmowego i moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, białych krwinek i szpiczaków.
Próbka biologiczna oznacza próbkę tkanki lub płynu wyizolowanego z osobnika, obejmującą, ale nie ograniczającą się do np. osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu limfatycznego, zewnętrznych sekcji skóry i przewodów: oddechowego, pokarmowego i moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, komórek krwi, nowotworów i narządów. Termin ten obejmuje również próbki składników hodowli komórkowych in vitro (obejmujących, ale nie ograniczających się do kondycjonowanego medium wytworzonego w wyniku wzrostu komórek w podłożu hodowlanym, komórek przypuszczalnie zakażonych wirusem, komórek rekombinantowych i składników komórkowych).
W praktycznym wykonaniu wynalazku, o ile nie podano inaczej, są zastosowane konwencjonalne techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA, syntezy polipeptydów i kwasów nukleinowych i immunologii znane w stanie wiedzy. Techniki te są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie, np.: Maniatis, Fitsch i Sambrook: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (1982); dNa Cloning, tomy I i II (wyd. D.N. Glover, 1985); Oligonucleo tide Synthesis (wyd. M.J. Gait, 1984); 'Nucleic Acid Hybridization (wyd. B.D. Hames i S.J. Higgins, 1984); Transcription and Translation (wyd. B.D. Hames i S.J. Higgins, 1984); Animall Cell Culture (wyd. R.I. Freshney, 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal; A practical Guide To Molecular Cloning, (1984); seria: Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (wyd. J.H. Miller i M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., tom 154 i tom 155 (wyd. odpowiednio Wu i Grossman i Wu), (wyd.: Mayer i Waler, 1987); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londyn); Scopes, (1987) Protein Purification: Pronciples and Practice, Ii wyd. (Springer Verlag, N.Y.) i Handbook of Experimenal Immunology, tomy I-IV (wyd.: D.M. Weir i C.C. Blackwell, 1986).
Wszystkie patenty, zgłoszenia i publikacje patentowe cytowane powyżej i poniżej są włączone do opisu jako odnośniki.
Wynalazek obejmuje polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu, który znajduje się w obrębie regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C. Przedmiotem wynalazku jest także reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Sposoby wykrywania i klasyfikowania infekcji wirusem HCV, w których stosuje się reagent polipeptyd według wynalazku obejmują zarówno próby immunologiczne jak i identyfikację kwasu nukleinowego metodami obejmującymi hybrydyzację metodą Southema i łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy (PCR). W celu identyfikacji zakażenia HCV, próbkę biologiczną inkubuje się z jednym z polipeptydów według wynalazku w warunkach umożliwiającyh wiązanie antygenu z przeciwciałem i wykonuje się oznaczenie, czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem obecnym na polipeptydzie.
Próby immunologiczne i zestawy diagnostyczne
Peptydy według wynalazku zawierające epitopy typowo swoiste i epitopy swoiste dla wiązki typów są użyteczne w próbach immunologicznych do wykrywania obecności przeciwciał HCV albo obecności wirusa i/lub antygenów wirusowych w próbkach biologicznych. Projektowanie prób immunologicznych jest przedmiotem ogromnej zmienności i znanych jest wiele formatów. W próbie immunologicznej będzie się stosować co najmniej jeden epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów.
Polipeptydy według wynalazku są przydatne do oznaczania typu HCV przez zastosowanie epitopów do oznaczenia obecności przeciwciał swoistych względem typu albo przeciwciał swoistych dla wiązki typów. Polipeptydy te są również przydatne do generowania przeciwciał swoistych względem danego typu albo przeciwciał swoistych dla wiązki typów,
175 338 które to przeciwciała mogą być następnie stosowane w próbie immunologicznej do odróżniania różnych typów HCV.
Polipeptydy te pochodzą z trzech różnych regionów genomu HCV. Jeden zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów otrzymany z rdzeniowego regionu HCV. Następny zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów, otrzymany z niestrukturalnego regionu 4 (NS4) wirusa HCV. Trzeci zestaw polipeptydów zawiera epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów, otrzymany z niestrukturalnego regionu 5 (NS5) wirusa zapalenia wątroby C. Ten zestaw znajduje się pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 a 2313 wirusa HCV-1 i w homologicznych regionach innych typów wirusa zapalenia wątroby typu C.
Polipeptydy te nadają się do stosowania w próbach immunologicznych na określenie jednego albo większej ilości typów HCV. W celu oznaczenia jednego typu, próbkę kontaktuje się z jednym lub z większą ilością polipeptydów zawierających epitop swoisty dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie antygenu z przeciwciałem i oznacza się, czy przeciwciała w próbce wiążą się z epitopem.
W próbie immunologicznej zaprojektowanej na oznaczanie konkretnego typu wirusa HCV, pobiera się od osobnika próbkę biologiczną, kontaktuje się ją z pierwszym typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała z antygenem, kontaktuje się ją z drugim typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach umożliwiających wiązanie przeciwciała z antygenem i oznacza się, czy przeciwciała w próbce wiążą się z pierwszym lub z drugim epitopem. Procedury te można powtarzać z dowolną ilością polipeptydów zawierających epitopy typowo swoiste i/lub epitopy swoiste dla wiązki typów.
Na ogół, próba immunologiczna na obecność przeciwciał anty-HCV polega na selekcji i przygotowaniu badanej próbki podejrzanej o obecność przeciwciał, takiej jak próbka biologiczna, inkubacji tej próbki z epitopem typowo swoistym lub z epitopem swoistym dla wiązki typów w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało i wykryciu powstania takich kompleksów. Odpowiednie warunki inkubacji są znane z piśmiennictwa. Próbę immunologiczną można bez ograniczeń prowadzić w formacie heterogennym albo homogennym, może to być typ standardowy lub kompetytywny.
W formacie heterogennym wiąże się epitop typowo swoisty albo epitop swoisty dla wiązki typów ze stałym podłożem w celu ułatwienia oddzielenia próbki od polipeptydu po inkubacji. Przykłady stałych podłoży, które można użyć obejmują, ale nie ograniczają się do nitrocelulozy (np. w formie błony albo ścianki wgłębienia w płytce do mikromianowania), polichlorku winylu (np. w formie arkuszy albo ścianki wgłębienia w płytce do mikromianowania), lateksu polistyrenowego (np. w formie perełek albo płytek do mikromianowania, fluorku poliwinylidyny znanego pod nazwą ImmulonR), bibuły dwuazowanej, błon nylonowych, perełek aktywowanych i perełek Proteiny A. W formacie heterogennym można np. stosować płytki do mikromianowania Dynatech ImmulonR 1 albo ImmulonR 2 albo perełki polistyrenowe o średnicy 0,25 cala (Precision Plastic Ball). Stałe podłoże zawierające typowo swoisty epitop albo epitop swoisty dla wiązki typów zazwyczaj przemywa się po oddzieleniu go od badanej próbki, a przed detekcją związanych przeciwciał. Formaty standardowe i kompetytywne są znane w piśmiennictwie.
W formacie homogennym, badaną próbkę inkubuje się z typowo swoistym epitopem albo z epitopem swoistym dla wiązki typów w roztworze. Przykładowo, próbę prowadzi się w warunkach, w których zachodzi precypitacja utworzonych kompleksów antygen-przeciwciało. Zarówno formaty standardowe jak i kompetytywne tych prób są znane w stanie techniki. t
W formacie standardowym, wykonuje się bezpośredni pomiar ilości przeciwciał HCV tworzących kompleks z epitopem typowo swoistym albo z epitopem swoistym dla wiązki typów. Można tego dokonać przez oznaczenie zdolności wiązania znakowanych
175 338 anty-ksenogenicznych (np. anty-ludzkich) przeciwciał rozpoznających epitop na przeciwciałach anty-HCV w wyniku powstawania kompleksu. W formacie kompetytywnym, ilość przeciwciał obecnych w próbce oznacza się pośrednio, przez monitorowanie wpływu współzawodnictwa na wiązanie znanej ilości znakowanego przeciwciała (lub innego kompetytywnego ligandu) w tym kompleksie.
W teście inhibicyjnym oznacza się zdolność przeciwciał do wiązania się z polipeptydami zawierającymi różne epitopy typowo swoiste lub epitopy swoiste dla wiązki typów. Przeciwciała te najpierw kontaktuje się z polipeptydami zawierającymi epitop (epitopy) dla jednego typu lub wiązki typów HCV i następnie z polipeptydami zawierającymi epitop (epitopy) dla innego typu lub wiązki typów HCV. Procedurę tę można powtórzyć dla dodatkowych typów lub wiązki typów HCV.
Utworzone kompleksy zawierające przeciwciało anty-HCV (albo w przypadku próby kompetytywnej. pewną ilość przeciwciała współzawodniczącego) wykrywa się jedną z wielu znanych technik, zależnie od formatu. Przykładowo, nieznakowane przeciwciała HCV w kompleksie można wykryć stosując koniugat antyksenogenicznej ig skompleksowanej ze znacznikiem (np. znacznikiem enzymatycznym).
W typowych próbach immunologicznych, badaną próbkę, na ogół próbkę biologiczną, inkubuje się z polipeptydami zawierającymi jeden lub większą ilość epitopów typowo swoistych albo epitopów swoistych dla wiązki typów w warunkach pozwalających na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało. Można stosować różne formaty. Przykładowo, można zastosować technikę kanapkową, w której przeciwciało związane ze stałym podłożem inkubuje się z badaną próbką, następnie podłoże przemywa się, inkubuje się z drugim znakowanym przeciwciałem przeciw badanemu typowi i powtórnie przemywa się nośnik. Badany typ wirusa wykrywa się oznaczając, czy to drugie przeciwciało wiąże się z podłożem. W formacie kompetytywnym, który może być heterogenny lub homogenny, badaną próbkę zazwyczaj inkubuje się z przeciwciałem oraz bądź kolejno bądź jednocześnie, ze znaczonym antygenem konkurencyjnym. Te i inne formaty są znane w technice.
Przeciwciała skierowane przeciw epitopom typowo swoistym albo epitopom swoistym dla wiązki typów można użyć w próbach immunologicznych do wykrywania antygenów wirusowych u pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby NANBH i u zakażonych dawców krwi. Ponadto, przeciwciała te mogą być szczególnie użyteczne do wykrywania dawców i pacjentów z ostrą fazą choroby.
W próbie immunologicznej można stosować np. przeciwciało monoklonalne skierowane przeciw epitopowi typowo swoistemu albo epitopowi swoistemu wobec wiązki typów, kombinację przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw epitopom jednego antygenu wirusowego, monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw epitopom różnych antygenów wirusowych, przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw temu samemu antygenowi wirusowemu albo przeciwciała poliklonalne skierowane przeciw różnym antygenom wirusowym. Procedury postępowania mogą być oparte np. na zasadzie kompetycji albo na reakcji bezpośredniej lub na technikach kanapkowych. W próbach tych można stosować podłoża stałe albo wykorzystywać immunoprecypitację. W większości prób stosuje się znaczone przeciwciało albo znaczony polipeptyd. Jako znaczniki stosuje się znaczniki enzymatyczne, fluorescencyjne, chemiluminescencyjne, radioaktywne albo cząsteczki barwnika. Znane są również techniki, w których amplifikuje się sygnały wysyłane przez sondę. Przykładami takich technik są te, w których stosuje się biotynę i awidynę, próby immunologiczne z użyciem znaczonego enzymu i pośrednie, takie jak ELISA.
Badania nad mapowaniem antygenowym metodą ekspresji cDNA HCV wykazały, że wiele klonów zawierających te cDNA wytwarzało polipeptydy reagujące immunologicznie z surowicą pochodzącą od osobników wykazujących obecność NANBH. Żaden pojedynczy polipeptyd nie był reaktywny immunologicznie ze wszystkimi surowicami. Pięć z tych polipeptydów wykazywało wysoką reaktywność immunologiczną z przeciwciałami przeciw epitopom HCV w tych polipeptydach, które to przeciwciała wykrywano w wielu różnych surowicach od pacjentów, chociaż nie zachodziło całkowite nakładanie
175 338 się podczas detekcji. Tak więc, wyniki badania immunologiczności polipeptydów kodowanych w różnych klonach świadczą o tym, że w skutecznych systemach wykrywania zakażenia HCV można stosować panele epitopów. Epitopy w takim panelu można konstruować w formie jednego albo wielu polipeptydów. Testy na obecność różnych epitopów mogą być sekwencyjne albo jednoczesne.
Zestawy do diagnostyki immunologicznej zawierające odpowiednie znakowane odczynniki wytwarza się przez zapakowanie odpowiednich materiałów, łącznie z polipeptydami według wynalazku zawierającymi epitopy typowo swoiste bądź epitopy swoiste dla wiązki typów albo przeciwciałami skierowanymi przeciw epitopom typowo swoistym bądź epitopom swoistym dla wiązki typów, w odpowiednich pojemnikach razem z pozostałymi odczynnikami i materiałami wymaganymi do przeprowadzenia oznaczenia jak również odpowiedniego zestawu instrukcji prowadzenia próby.
Należy zwrócić uwagę na obecność regionów zmiennych i hiperzmiennych w genomie HCV. Zakłada się, że homologia w tych regionach będzie znacznie mniejsza od homologii w całym genomie.
Techniki oznaczania homologii sekwencji kwasu nukleinowego i aminokwasowych są znane w stanie techniki. Przykładowo, można bezpośrednio oznaczyć sekwencję aminokwasową i porównać ją z sekwencjami według wynalazku. Alternatywnie, można oznaczyć (zwykle poprzez pośredni cDNA) sekwencję nukleotydową materiału genomowego przypuszczalnego typu wirusa HCV, następnie oznaczyć kodowaną przez nią sekwencję aminokwasową i porównać odpowiednie regiony.
Przykład I. Porównanie głównych epitopów wielu różnych typów HCV
Porównano homologię reszt aminokwasowych wstępującą między różnymi typami i podtypami HCV dla różnych regionów. Podtyp HCV jest taki, jak opisany metodą analizy filogenetycznej Simmonds’a. Numery sekwencji aminokwasowej odpowiadają numerom opisanym dla prototypowej sekwencji HCV-1 (Choo i wsp.). Tabela 2 przedstawia homologię reszt aminokwasowych wyrażoną w procentach dla epitopów typowo swoistych i epitopów swoistych dla wiązki typów regionu NS4 i dla konserwatywnego głównego epitopu. Tabela 3 przedstawia homologię reszt aminokwasowych pomiędzy dwoma epitopami typowo swoistymi albo epitopami swoistymi dla wiązki typów regionu NS5. Tabela 4 przedstawia homologię reszt aminokwasowych wyrażoną w procentach dla konserwatywnych głównych epitopów i epitopów typowo swoistych z regionu rdzeniowego.
Tabela 2
| Homologie aminokwasowe (w %) między różnymi podtypami HCV | |||
| Podtyp HCV | Przykłady skrótów typów | Główne epitopy typowo swoiste regionu NS4 (1689-1718 aa)* | Główny epitop konserwatywny regionu NS4 (1910-1936 aa)* |
| la | HCV-1 (1a)/(1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J (1a)/(1b) | 83% | 100% |
| 2a | HCV-J6 (1a)/(2a) | 47% | 93% |
| 2b | HCY-J8 (1a)/(2b) | 43% | 93% |
175 338
Tabela 3
Homologie aminokwasowe (w %) między różnymi podtypami HCV
| Podtyp HCV | Przykłady skrótów typów | Główne epitopy typowo swoiste regionu NS5 (2281-2313 aa)* | Główny epitop konserwatywny regionu NS4 (2673-2707 aa)* |
| la | HCV-1 (1a)/(1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J (1a)/(1b) | 76% | 89% |
| 2a | HCV-J6 (1a)/(2a) | 70% | 83% |
| 2b | HCV-J8 (1a)/(2b) | 73% | 83% |
| 3a | HCV-E-bl (1a)/(3a) | 77% | |
| 3b | HCV-Tb (1a)/(3b) | 83% |
Tabela 4
Homologię reszt aminokwasowych (w %) między różnymi podtypami HCV
| Podtyp HCV | Przykłady skrótów typów | Konserwatywne główne epitopy regionu rdzeniowego (10-45 aa)* | Główne epitopy typowo-swoiste regionu rdzeniowego (67-84 aa)* |
| la | HCV-1 (1a)/(1a) | 100% | 100% |
| 1b | HCV-J (1a)/(1b) | 98% | 100% |
| 2a | HCV-J6 (1a)/(2a) | 98% | 61% |
| 2b | HCV-J8 (1a)/(2b) | 98% | 61% |
| 3a | HCV-E-bl (1a)/(3a) | 93% | 89% |
| 4 | HCY-EG-21 (1a)/(4) | 98% | 83% |
Przykład II. Synteza peptydów
Zsyntetyzowano dwa zestawy polipeptydów. Pierwszy zestaw zaprojektowano w celu przeprowadzenia mapowania epitopów HCV-1, a drugi zestaw zaprojektowano tak, aby mógł służyć do oznaczeń, które epitopy zidentyfikowane w badaniach nad mapowaniem epitopów są epitopami typowo swoistymi. W pierwszym zestawie polipeptydów zsyntetyzowano techniką Mimotopes 64 zestawy (oraz duplikaty) częściowo nakładających się oktapeptydów obejmujące całą poliproteinę HCV-1 (3011 reszt aminokwasowych).
Drugi zestaw polipeptydów przygotowano sposobem opisanym przez Geysen’a (J. Trop. Med. Pub. Health, 21, 523-533, 1990) i Merrifield’a (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963). '
W tym drugim zestawie polipeptydów, do syntezy epitopu typowo swoistego wyselekcjonowano cztery regiony antygenowe reprezentujące główne epitopy niekonserwatywnych sekwencji w HCV-1 z rdzenia, z regionów NS4, NS5 i odpowiednich sekwencji z podtypów HCV-1b, 2a, 3a i 4. Sekwencję z rdzenia wyselekcjonowano z mniej konserwatywnego regionu reszt aminokwasowych 67-88. Sekwencję z regionu NS4 wyselekcj onowano z reszt aminokwasowych 1689-1718. Sekwencje z regionu NS5 wyselekcjonowano z reszt aminokwasowych 2281-2313 i 2673-2707.
175 338
Przykład III. Próbki biologiczne
W celu oznaczenia efektywności polipeplydów pod względem rozróżniania poszczególnych przeciwciał swoistych wobec różnych typów HCV, zebrano surowice od 24 zakażonych chronicznie wirusem NANBH z różnych obszarów świata, w tym ze wschodniego i zachodniego wybrzeża Stanów Zjednoczonych, z Japonii, krajów Europy Zachodniej, krajów Europy Południowej i Południowej Afryki. Izolację wirusowego RNA, syntezę cDNa, reakcje amplifikacji PCR, sekwencjonowanie DNA i hybrydyzację z sondami oligonukleotydowymi prowadzono w sposób opisany przez Cha i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 7144-7148,1992.
Przykład IV. Procedury mapowania epitopu
W celu określenia, które regiony HCV zawierają epitopy bądź grupowo dwoiste bądź konserwatywne, poddano mapowaniu całą poliproteinę HCV-1. Zastosowany sposób w zasadzie odpowiada schematowi przedstawionemu na fig. 2.
Zsyntetyzowano techniką Mimotopes 64 zestawy (oraz duplikaty) częściowo pokrywających się oktapeptydów w oparciu o całą poliproteinę HCV-1 (3011 aminokwasów). Do mapowania epitopów i analizy epitopów swoistych dla wiązki typów wyselekcjonowano panel 40 próbek, z których 25 było próbkami reaktywnego przeciwciała HCV ze Stanów Zjednoczonych, 9 próbek zawierających reaktywny HCV pochodziło z Japonii, a 6 próbek, były to próbki nie zawierające HCV, stanowiące kontrolę negatywną. Próby immunologiczne wykonywano standardową techniką ELISA.
Kryteria identyfikacji głównych epitopów oparto na częstości reakcji przeciwciała i intensywności reakcji przeciwciała (miano) przeciw tym epitopom. Wyniki są przedstawione na fig. 3 i 4.
Przykład V. Enzymatyczna próba immunologiczna peptydo-pochodna (peptydo-pochodna technika ELISA).
W celu ustalenia optymalnej próby immunologicznej, w której byłyby użyte polipeptydy opisane w przykładzie 2, przeprowadzono dwa oddzielne typy peptydo-pochodnej próby ELISA i porównano wyniki. Pierwszym typem próby ELISA był Nunc MaxiSorb™ polegający na prostej adsorpcji peptydów. W drugim typie użyto zestaw Nunc Covalinc NH . W tym teście polipeptydy były wiązane kowalencyjnie. Tworzenie wiązań amidowych między kwasami karboksylowymi a aminami inicjowano przez dodanie karbodiimidu. W celu zmniejszenia hydrolizy, można wytworzyć aktywny ester, dodając do powyższej mieszaniny koniugacyjnej N-hydroksy-sukcynimidu (NHS).
W pierwszym typie próby ELISA przygotowywano płytki do mikromianowania następująco: Polipeptydy umieszczano w dołkach płytek do mikromianowania Nunc MaxiSorb™ w stężeniu 1 ug/dołek w 100 jwl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Polipeptydy pozostawiono do absorpcji przez dobę w temperaturze pokojowej. Następnie płytki przemywano cztery razy roztworem PBS bez detergenta, po czym dołki pokrywano ilością 220 «l odczynnika Superblock® (Pierce) przez godzinę, następnie zasysano bez dalszego przemywania i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Oznaczenie prowadzono w sposób następujący: próbkę surowicy o objętości 5 «l nanoszono do dołków z dodatkiem 100 μ 5% odtłuszczonego mleka i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Następnie dołki przemywano 5 razy w roztworze PBS z dodatkiem 0,05% Tween’u. W celu oznaczenia stopnia wiązania ludzkich przeciwciał do polipeplydów zastosowano koniugat charakteryzujący się powinowactwem oczyszczonej IgG koziej anty-ludzkiej znakowanej peroksydazą chrzanu (Jackson Laboratories). Koniugat ten uprzednio rozcieńczano do stężenia IgG wynoszącego 5% w 150 mM NaCl, PBS, 5% surowicy końskiej (denaturowanej ciepłem). Ilości po 100 al tego koniugatu umieszczano w dołkach i inkubowano przez godzinę w temperaturze 37°C. Następnie dołki przemywano 5 razy roztworem PBS/Tween z dodatkiem OPD [dwuchlorowodorku orto-fenyleno-diaminy w ilości jedną tabletkę na bufor wywołujący 0,02% roztwór H2O2 buforowany buforem cytrynianowo-fosforanowym, Sigma] przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym oznaczano przeciwciała przy 492 nm i 620 nm. Odcięcie oznaczano na podstawie
175 338
200 losowych (normalnych) próbek, gdzie 7 odchyleń standardowych od średniej wynosiło około 0,45.
Płytki do mikromianowania dla drugiego typu oznaczeń techniką ELISA przygotowano następująco. Polipeptydy umieszczano w dołkach płytek do mikromianowania MaxiSorb w stężeniu 10 mg/dołek w 50 μ 1 wody. Do tych polipeptydów dodano 25 μ 1 0,1 M odczynnika NHS (sulfo-N-hydroksysukcynimid, Pierce) i 25 μ1 0,1 M EDC [1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylokarbodiimid, Sigma] i mieszano w temperaturze pokojowej w czasie 30 minut na tacy wahliwej. Następnie, całą zawartość dodano do 52 ml schłodzonego lodem 0,1 M roztworu węglanu sodowego o wartości pH = 8,6. Ilość 100 μl tej mieszaniny stosowano do pokrywania dołków w płytkach do mikromianowania i następnie inkubowano w temperaturze 4°C w czasie 30 minut. Płytki przemywano 4 razy, roztworem o składzie: PBS/0,1% Triton Χ-100. Płytki te traktowano odczynnikiem p nazwie Superblock i dalej prowadzono próbę w sposób podany powyżej.
Uzyskane wyniki są przedstawione w tabelach 5-14.
175 338
Tabela 5
Anaiiza serotypowa epitopów w różnych typach HCV
175 338
Tabeaa 6
Anaiiaa serotypowa epttopów w różnych typach HCV
175 338
Analiza serotypowa epitopów w różnych typach HCV
175 338
Tabela 8
Analiza serotypowa epttopów w różnych typach HCV
175 338
175 338 <0 m
Tabel a 10
Zestawienie głównych typowo swoistych epitoóów w częśca rdzeniowea i w regioncch NS4 a NS5
0) β
X
AJ ro ?
β (U to β
o
Λ
Cd ro rd rd ro rd xj<
OC0S — AJ I CU fa| -rdXX
OAOU ta— (U
AJ to OZIOl sss Hm|m| to azla OOO WHca aw|M| ł I I
Λ >i Η(ΝΛ xJ 3 •r-i-r-łi-H
Cw* π5 ίΰ <τ5 OcoHfNm
Jj I I i I rdX>>> C3A0OOO ca—zza
-rd
O s
(U c
>1
AJ ro β
<D co O β O— -O > rd >44 Η i 2 O> O x ou •Η a ΟΪ β O o— (DAJ ft N-rd faO Ό Ib ZZ β ID >Z ~Qa β φιηαο O C^aZ •H 3 I 04 04 CrtCLnZa (DrMrdZJ ao—HZ <D β
X
AJ ro β
<D to β— O W 44 rd X Xrd a' Οσι rd
Cd ro
Cd
X 01 >
aj co ta -H to (4 Z| an q ca— Oj ro m
>
o
Z
Cd i
>
U a
>
>1
X a o
Air.
dżin w Om Z Z (DCh H rd β (U I O βω . -H srd Z tjiocn Z (DrHrd o Z0— (4
Oj
ω.
Zł <D
AJ ta •rl
O ca o s o a-43 Xm rd AJrd m-rd Xd a' ro
O rd rd AJCO i •HCd>
omo ca—z a
a ___ caoiaia X <D β
s
X
AJ ro β
(D ca
CrtnOd1 0344 σι Z rd
XCdZ a a' x O OCOQ •rd AJ 00 a OMCdZ <d acd< c4ta-s
OO <IZI Z > > a Hd|<|ai H|Hl>ia daaz aaz< Ołta<a xxoia| QO1<taj| alfa
H ai*ł r-3 >
o
Ml
H
H fal·* >
u
Ml
Cd ro
Cd o
C4 a
x o
u
U z
a x
o u
(043 (043 Cd Cd rd rd I I I I >>>> OOOO ZZZZ o
zi u
Zl ro
Cd (043 rd rd I I >> . OO o KK z m
I >
<D β * £ (U M CO <C β—a 0X0 aoa xz XtdX a> o Om O aj x Z H| Ml -rdtocaol oł ardu ca—azi zi
175 338
CU CU CU CU 2 522 CU CU CU CU >4 > >4 X o o o o
CU CU 0« CU
Tabeaa 11
Anaiżaa serotypowa epiooóów z różnych typów sekwencji HCV (I) z próbkk cCronCczneto zapalenia wątroby NANBH od płatn^h dawców. Regoon sekwencji: rdzńń (67-84) o»x && < O < < 2 2X2 e-» co co co os x cc es O O O O ω η ω ω cu co co co cc cc cc cc Λ (£, CC CC
2S33 •o
CU o
Om
O
U tt
W
T3 *
CU
4)
Om
Λ •Ο
Ο
CU
CU >* o
CU
aj «β «a <J5 — <e < te —«►
Η Μ Π 5f
HM rr 1/1
O O O O liii W W W O O O O h r
CU CU CU CU υ υ u u —-»— CN
X) XI w ♦H OJ | ca <a «n tfl <Q f0 ** *-* nrr <
H M V in H O O O O U i 1 i i ω «-1 «-<«-< «Η O O O O CN «r ’Τ oj
CU O. CU CU u υ u υ u u φ \D C* irt Γ* CD \D ο» Γ* Γ* Κ0
C0 ο — I cc o
OJ α
(Q „G«2 (Q
OJ
CU υ
cn <
co «a
CN
I I
W «-Μ
O o mt mt CU o, u u
o.
υ
CU u
«ty tn O O i < W
O o
CU CU υ u <
co ω σ> o σ»
-< Ο
U0 ^-ι \0 σ» —.
Ό X
Ο OJ cr> ~
175 338
C4
U £>
ca
H
CU &
•g
O uN ź
Ό
OO ·♦-<
’Ł o
c3 £
o
Om >>
W o
ź o
cj »
ca
Ό
Λ
U >.
c ca —r, cu « ' o . X ! m .
z
Λ g o Z n
w · · Ctf* -X» C c3 <o §
Ί3 ω
Λ ζ/3 Om
S C
N O o Sd ?P α Di
N υ
Ξ o
>-,
X3 o
4*
1) x>
O >-,
CU
N
O O ϋ o X X < J > > &< < CU CU CU ££ CU CL, CU tU u > X X Q O CU CU SC Cl « SC S S E-· ω td W Cd Cd >_□>(J O J J CU CU CU >
CU o
CU o
CU
J <
σ <
u.
Ό
O
X •9 <U
I-I < CU
CU CU CU CU CU CU o
<
>
H <
CU σ
x
O
CU =5
CU £·
O •S
JO
N
CU o
’cu <υ
| <a | «5 | |||||
| «<·**. | tU | *“·* <·*»» | »“4 | |||
| <0 | -Q «3 XI | (0 X! (0 Λ | *»·<» | |||
| »u | Η N (N | < | Η Η (\ N | < | ||
| S—* | *-*· | co | »—»» *—«» V-* *— | co | ||
| o | Η N O | w | O H (N n | M | ||
| o | O O O | J | o o o o | J | ||
| 1 | 1 1 | w | 1111 | td | ||
| i\J | <\J ΓΝ f\J | in | nj r>j ri m | tn | ||
| o | O O O | w | O O O O | to | ||
| ’Τ | TT T? | 2 | χτ ’Τ | 2 | ||
| α | CU CU CU | CU CU CU CU | t | |||
| □ | □ υ α | U | u υ u □ | Ui | ||
| σι | b \o > | ’Τ | w r** cn rj | rsj | ||
| ιη | in H H | \O | «9* Cft ’Τ | |||
| • | • * · | • | • · · · | • | ||
| rH H O | in | γν o in o | o | |||
| o | ||||||
| u | to | |||||
| <N | ||||||
| to | *»·<» CO | |||||
| ω | Ή | Γ* > | ||||
| -d | O | «—( | ||||
| > | σ> | O | ||||
| o | \O | 1 | ||||
| 1) Ł, | \o o\ | < co | ||||
| 9 | > | |||||
| o | Ή | Γ9 | ||||
| X | --- | |||||
| .o | ||||||
| Ό | a- | |||||
| t9 |
175 338
Tabea a 13
Atianai serajowi βρΐ^^ιν z różnymi typć)w sekwe^ncji HCV (I)
G
O u,
XJ
U «υ
Ό
CL,
N
175 338 o o X X
ŹŹ
X X X X w >
X X Q Q O, X u o < J > > Eh t* < fi. X X a w X X O O X CL.
(C 43 (0 42 H rt N PJ o e> o u X X < J « ££££« X X *£ X CL. X X CL.
w > σ w * x x x x O C3 O O * X X fi. CU (0 43 W rU
U u X X ££ X CU cu o. w > X X O Q CU CU u
<
>
Eh <
CU o
X
Q cu
Analiza serotypowa epitopów z różnych typów sekwencji HCV (I; z próbek chronicznego zapalenia wątroby NANBH od płatnych dawców. Region sekwencji: NS5 (2281-2313)
Ό
O
O o
O
CZ1
| Q | a | X | |
| ia | a | SC | |
| 2 | 2 | 2 | 2 |
| Eh | w | w | Eh |
| ca | ca | ca | ca |
| > | J | > | M |
| J | J | J | o |
| CU | CU | CU | > |
| CU | CU | CU | CU |
| 2 | 2 | 2 | 2 |
| X | X | X | X |
| Q | Cl | Q | O |
| a. | CU | CU | CU |
| a | a | a | X |
| < | < | < | < |
| 2 | 2 | 2 | 2 |
| w | < | X | |
| cu | CU | CU | X |
| j | J | J | ►a |
| < | < | < | < |
| O CU | CU | X | |
| < | IX | CU | X |
| Cu | u. | tu | X |
λ es
Su
O cu o
CU u
CU ω
1-1 >
CM * o
U w
cu
Ł>
Cu
| 0 | |||||
| > | |||||
| t/5 | <0 | ||||
| O | Z—U. X—u | Ή | Z“*u Z“*» Z-* | ||
| (0 43 ra’42 | £ | 10 43 <0 42 | *—* | 10 42 (0 43 | < |
| Η H f\J (“>J | 0 < | Η H OJ OJ | < | H d N N | co |
| *—* «- Z X—» | g-w | »-* ·«—* | w | X—z z o^z »_z | W |
| O H pj ri | 0 κ oj n | M | O rd OJ n | J | |
| OOOO | M J | OOOO | J | OOOO | CJ |
| I 1 1 1 | ta | 1111 | ta | 1 1 1 1 | |
| OJ OJ OJ OJ | in | OJ OJ OJ OJ | in | OJ OJ OJ OJ | in |
| OOOO | w | OOOO | w | OOOO | w |
| τ <r -e | 2 | v rr | 2 | ·<τ ·σ | 2 |
| a cu a. a | 1 | Q« Oa th | | | CU X CU CU | 1 |
| υ υ 0 u | łd | 0000 | )h | □ a u υ | )u |
| co σι o r- | 0 | 0 n 0 co | kO | co σι rn o | cn |
| η ιη h | n | co -e in in | CO | vo n O 0 | co |
| r- ko 0 0 | kD | P Ϊ1 0 0 | kO | > r- 1Γ1 0 | 0 |
<0 in
O <
o
LD
X x>
'2 x «-< X O —
175 338
Przykład VI. Test inhibicyjny
Testy inhibicyjne przeprowadzono w celu stwierdzenia, czy badane peptydy mogą między sobą współzawodniczyć o wiązanie z przeciwciałami. Zsyntetyzowano trzy zestawy krótkich polipeptydów z regionów rdzeniowych NS4 i NS5 różnych typów sekwencji HCV. Polipeptydy te pokrywają regiony sekwencji aminokwasowych od 1689 do 1696, od 1696 do 1702 i od 1711 do 1917. Testy inhibicji prowadzono dodając do próbki 10 μ g powyższych polipeptydów i inkubując próbki w temperaturze 37°C w czasie godziny, po czym prowadzono oznaczenie techniką ELISA, jak opisano powyżej. W przypadkach, kiedy hamowanie wiązania przeciwciała wynosiło powyżej 50%, uznawano, że polipeptyd ma działanie hamujące. Wyniki są przedstawione w tabeli 15.
Tabela 15
| 1 | SQHLPY | CHIEN-101 | Region NS4 | 1712-1717 | la |
| 2 | ASRAAL | CHIEN-102 | 1712-1717 | 2a | |
| 3 | ASKAAL | CHIEN-103 | 1712-1717 | 2b | |
| 4 | PDREVLY | CHIEN-104 | 1696-1972 | 1a, 1b, 2a | |
| 5 | PDYRPPVVHG | CHIEN-105 | Region NS5 | 2304-2313 | la |
| 6 | PDYQPATVAG | CHIEN-106 | 2304-2313 | 2a | |
| 7 | FAQALPVW | CHIEN-107 | 2281-2288 | la | |
| 8 | FPPQALPPW | CHIEN-108 | 2281-2288 | 2b | |
| 9 | STGKSWGK | CHIEN-109 | Rdzeń | 71-78 | 2a & 2b |
| 10 | SEGRSWAQ | CHIEN-110 | Rdzeń | 71-78 | 4 |
Przykład VII. Klasyfikowanie HCV w próbce klinicznej
Epitopy typowo swoiste lub swoiste dla wiązki typów przedstawione w tabeli 16, powyżej', użyto w próbie ELISA opisanej w przykładzie 5 do badania 13 próbek klinicznych pochodzących od pacjentów z zapaleniem wątroby nie-A, nie-B (10 płatnych dawców, 3 pacjentów z nabytym przez transfuzję zapaleniem wątroby nie-A, nie-B). W tabeli 17 przedstawione są wyniki tych prób. W każdej próbce klinicznej oznaczano reaktywność z dwunastoma różnymi peptydami odpowiadającymi podanym regionom (aa 67-84, 16891718 lub 2281-2313) reprezentującym różne epitopy typowo swoiste lub swoiste względem wiązki typów. Każda próbka daje z danym charakterystycznym dla typu peptydem następującą odpowiedź: brak reakcji (NR), słaba reakcja (WR) albo reakcja (R). Wyniki tej próby określają genotyp HCV dla każdej próbki, korelujący z genotypem HCV oznaczonym w łańcuchowej reakcji z udziałem polimerazy, PCR, podanym w kolumnie po prawej stronie.
175 338 ta
ΓΜ co
I r* o
o«
CU
X o
CU
I o* o
Φ
X
U W >
X X
Q
CU
Tabela 16
Główne typowo swoista epnopa HCV w rdzeniu i w regioncch NS4 i NS5
(0 m
i >
u
X
I
I
X u
>
ω w
i >
υ
Τ χ
χ
X >
Ο
W v>
Ίο ’a •o hM s
o 'Sb x
>
O
O ** >
»-4 | σ> o o O X o **
CU tu o us u > cc O (X o*o
CU X X X X X z u X J
ϋ cc cc
X ϋ
υ σ
ω iC
U cc cc
X o
u w
o o
UC
175 338 ¢3
U
X)
Λ
Η
| GENOTYP | (β | CS | CS | X | <0 | X 04 | <· | (β | CS | CS 04 | X | X Ol | <*> | |||||
| X 04 | Cd Z | 8 | NR i | NR | 8 | Od | NR | NR | WR | NR | -1 NR | 8 | NR | |||||
| C8 CM | g | NR | g | NR | i | g | NR | NR | 1 | cd | cd Z | g | 1 | |||||
| X | NR | g | NR | NR | i | NR | NR | NR | g | g | NR | g | NR | |||||
| NS5(2281- 2313) | « | & | ai | oi | g | cd | NR | NR | NR | cd | oi $ | NR | NR | NR | ||||
| X 04 | NR | g | g | NR | cd | Od | NR | id | NR | g | oi Z | cd | 1 NR | |||||
| « 04 | g | NR | NR | g | cd | cd | g | cd | g | g | NR | cd | g | |||||
| X | NR | NR | NR | % | Cd | WR | od | cd | WR | NR | g | NR | NR | |||||
| PRÓBKA KLINICZNA HCV OCENIANA WEDŁUG GENOTYPÓW | NS4( 1689-1718 | α | a | NR | NR | od | WR | cd | cd | Od | NR | NR | NR | Q O KT 8 i li* 5 Z Λ O Λ > W < v Z Cl | ||||
| NR | NR | g | NR | NR | g | NR | g | g | NR | NR | NR | |||||||
| <*) | NR | NR | cd | NR | NR | NR | NR | NR | 8 | NR | NR | 8 | g | |||||
| 2a i 2b | g | g | cd | g | g | Cd | g | NR | g | NR | NR | cd | NR | |||||
| rdzeń (6784aa) | X | cd | NR | NR | NR | NR | NR | NR | NR | NR | ||||||||
| PRÓBKA | || OPIS | PRÓBKI NANBH OD PŁATNYCH DAWCÓW | FF 25951 | 96727 | <o X Γ*· Ci 1 oo | || 96696 | || FF 25910 | <3“ <X7 O 1 ΓΟ | 84 18699 | 25931 | ,| FF 25912 | 84 017778 | CHRONICZNE NANBHPO TRANSFUZJI | || NAC5 | ca | -V» A | ODCIĘCIE OD=1 0 |
175 338
| 0~ CAn Łco §2 φ i 0 4J H §· 1 ? M € > aJ cp G U > -U Φ H -Q | Φ rh c o <Ή 'Cl Φ Li 44 0 pj H Γ“» ϋ c 0) 3 44 Φ Vł G O > U ε φ <M <3 H N Ό 3 N | |
| 3 3 > o 3 Ό Ch >. -μ X 0 > c •N Ό L> I-J r-i 0 C Φ 3 X (U 0) •w c 3 c 3 O Lt 0 Ch | □ H > 0 Lf 3 Cl St C> & c ir Ó-- Ό 2 m ę η,ξ a- -ł£ cf 44 σι £ <x |
| M | ||||
| > | ||||
| 44 | ||||
| 3 | ||||
| ε | ||||
| Φ | >· N | |||
| fi | ||||
| Cl •H Π | Φ 0 | |||
| 3 | fi | |||
| ώ | 3 | |||
| 0 | § | |||
| 3 | •H | 1 | ||
| O | C | O | ||
| α | >»<- | Li | ||
| 3 | Χ53 | Φ | ||
| Ll | oc | •Λ | ||
| *7» | Lł L | |||
| ChZ | Φ | |||
| > | U | H | ||
| α | •m | c | ||
| 0 | <vz | nj | ||
| 44 | Cr- | N | ||
| H | ti α | O | ||
| 04 | Φ c | <a | ||
| Φ | c-irt | c | ||
| C | N | |||
| .3* | Ή | 0 | ||
| n | c | |||
| 35 | <c | M | ||
| Li | CG | |||
| Φ | rh | c | ||
| -< | UX' | o | ||
| 3 | «c | >1 | ||
| 3 | c | c | ||
| H | β 4- | <a | ||
| •r4*r | 44 | |||
| a | CC | 41 | ||
| 3 1 | s, | |||
| 0 | 3 | N | ||
| 44 | X | 3 | ||
| 14 | 44 C | |||
| » | t | > | ||
| «. | 3*· | 0 | ||
| 3 | £J | 14 3 | ||
| 0 | U*- | H 0 | ||
| fi | >1^ | . | C > | |
| 0 | > r_ | X | ||
| H | c | 3 C | ||
| ίτ> | c | |||
| Φ | 'Q-r- | <a a* | ||
| Li | LlM- | nc | ||
| Ch> | O | |||
| N | L | (C H | ||
| 3<1 | •4 | |||
| 3 | 3 | Φ 3 | ||
| O | Ή | J4 0 | ||
| α | ϋ> | |||
| > | Φ»- | £J± | ||
| 44 | Ή C | |||
| Ch | CC | |||
| Φ | <n | |||
| α | 3 2 | |||
| 0 | ||||
| 3 | 4J-— | |||
| N | 44 rti | |||
| Φ | a»- | |||
| μ | r-fc | |||
| fi | o— | |||
| > | Li | |||
| E2_ | Ojr a a | . | ||
| n; |
Ο
Li_
175 338 1 HCV DNA(RNA) θ.θθθ
Proteina HCV 3,000
FIG. 2
175 338
175 338
testowane próbki (ODxDFl
Miano przeciwciała częstotliwość względna
175 338
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 6,00 zł
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu znajdującemu się w obrębie regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienny tym, że epitop ten zlokalizowany jest między resztami aminokwasowymi 67 i 84 wirusa zapalenia wątroby typu C albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
- 2. Polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu w obrębie regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienny tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwasowymi 1689 i 1718 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
- 3. Polipeptyd posiadający sekwencję reszt aminokwasowych odpowiadającą epitopowi typowo swoistemu w obrębie regionu NS5 wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienny tym, że epitop ten zlokalizowany jest pomiędzy resztami aminokwasowymi 2281 i 2313 wirusa zapalenia wątroby typu C-1 albo homologicznymi regionami innych typów wirusów zapalenia wątroby typu C.
- 4. Reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C, znamienny tym, że zawiera połączenie epitopów typowo swoistych z wirusa zapalenia wątroby typu C, przy czym połączenie to zawiera co najmniej jeden epitop z regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 5. Reagent według zastrz. 4, znamienny tym, że połączenie to obejmuje co najmniej jeden typowo swoisty epitop wybrany z regionu NS4, regionu NS5 i regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 6. Reagent według zastrz. 4, znamienny tym, że połączenie to obejmuje wiązkę typowo swoistych epitopów z regionu NS4 wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 7. Reagent według zastrz. 6, znamienny tym, że połączenie to ponadto obejmuje co najmniej jeden typowo swoisty epitop z regionu rdzeniowego wirusa zapalenia wątroby typu C.
- 8. Reagent według zastrz. 4, znamienny tym, że reagent jest związany na trwałym podłożu nitrocelulozowym.Wynalazek dotyczy polipeptydu i reagenta do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), a zwłaszcza do sposobu klasyfikowania HCV przy użyciu nowych peptydów zależnych od typu wirusa.Wiadomo, że wirusowe zapalenie wątroby powodowane jest przez pięć różnych wirusów, znanych jako wirusy zapalenia wątroby A, B, C, D i E. HAV jest RNA-wirusem i nie powoduje długotrwałych objawów klinicznych. HBV jest DNA wirusem. HDV jest wirusem zależnym, niezdolnym do zakażenia komórek w nieobecności HBV. HEV jest wirusem przenoszonym z wodą. Początkowo, wirus HCV zidentyfikowano i scharakteryzowano jako przyczynę zapalenia wątroby nie-A i nie-B (NANBH). Wirus ten został ujawniony przez Houghtona i wsp. w publikacji opisu patentowego europejskiego, EP 388.232. Doprowadziło to do opracowania wielu nieswoistych i swoistych polipeptydów użytecznych jako odczynniki immunologicznie do identyfikacji HCV (Choo i wsp., Science, 1989 244, 359-362;175 338Kuo i wsp., Science 1989, 244, 362-364 i Houghton i wsp., Hepatology, 1991,14, 381-388. Wirus HCV jest główną przyczyną zapalenia wątroby nabywanego po transfuzji krwi.Prototypowy izolat HCV jest scharakteryzowany w publikacji opisów patentowych europejskich, nr 318.216 i 388.232. Stosowany w niniejszym opisie termin HCV obejmuje nowo wyizolowane rodzaje wirusów NANBH. Termin HCV-1. odnosi się do wirusa opisanego w wyżej cytowanych publikacjach.Od czasu pierwszej identyfikacji wirusa HCV, zidentyfikowano i oznaczono symbolami od HCV-1 do HCV-6 co najmniej sześć równych typów tego wirusa (Cha i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 7144-7148). W obrębie tych typów istnieje wiele podtypów. Typ wirusa, którym jest zakażony pacjent jest odpowiedzialny za prognozę klinicznego przebiegu zakażenia oraz reakcję na różne rodzaje leczenia (Yoshika i wsp., Hepatology, 1992,16, 293-299). W świetle faktu, że najgroźniejszym rezultatem infekcji wirusem HCV jest rak komórek wątroby, mogłaby być użyteczna możliwość oznaczania typu lub typów wirusa HCV, którymi jest zakażony pacjent.Sposobem stosowanym obecnie do oznaczania typu wirusa jest oznaczenie jego genotypu, polegające na izolowaniu wirusowego RNA i oznaczaniu sekwencji różnych segmentów techniką łańcuchowej reakcji z użyciem polimerazy (PCR). Sposób ten jest praco- i czasochłonny i nie nadaje się do analizowania próbek przechowywanych w warunkach nie pozwalających na konserwacje RNA ani próbek pobranych od pacjentów z niedostatecznym mianem wirusa. Użyteczny byłby więc sposób klasyfikacji HCV przez analizę immunologiczną albo oznaczanie serotypu.Stosowanym obecnie sposobem skriningu krwi i diagnozowania pacjentów jest próba immunologiczna. W próbie tej wykorzystuje się antygen z HCV-1, który zawiera wystarczającą ilość pospolitych epitopów do tego, aby były wykrywane przeciwciała wobec innych typów HCV. Ta próba nie daje rozróżnienia pomiędzy infekcjami różnymi typami wirusa HCV.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6040093A | 1993-05-10 | 1993-05-10 | |
| PCT/US1994/005151 WO1994027153A1 (en) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL175338B1 true PL175338B1 (pl) | 1998-12-31 |
Family
ID=22029220
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94323368A PL175338B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) |
| PL94323367A PL175360B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C |
| PL94311653A PL175342B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94323367A PL175360B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Cząsteczka kwasu nukleinowego i kompozycja do wykrywania infekcji wirusa zapalenia wątroby typu C |
| PL94311653A PL175342B1 (pl) | 1993-05-10 | 1994-05-09 | Sposób klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6054264A (pl) |
| EP (1) | EP0698216B2 (pl) |
| JP (1) | JP3645904B2 (pl) |
| KR (1) | KR100330278B1 (pl) |
| CN (1) | CN1129795C (pl) |
| AT (1) | ATE281647T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ294629B6 (pl) |
| DE (1) | DE69434117T3 (pl) |
| DK (1) | DK0698216T4 (pl) |
| ES (1) | ES2232815T5 (pl) |
| GE (1) | GEP20012421B (pl) |
| HU (1) | HU224513B1 (pl) |
| PL (3) | PL175338B1 (pl) |
| PT (1) | PT698216E (pl) |
| RO (1) | RO115471B1 (pl) |
| RU (1) | RU2158928C2 (pl) |
| SK (1) | SK282543B6 (pl) |
| UA (1) | UA46707C2 (pl) |
| WO (1) | WO1994027153A1 (pl) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE610436T1 (de) * | 1991-11-21 | 1995-08-03 | Common Services Agency | Detektion des Hepatis-C Virus. |
| US7255997B1 (en) * | 1993-04-27 | 2007-08-14 | N.V. Innogenetics S.A. | Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| CA2139100C (en) | 1993-04-27 | 2009-06-23 | Geert Maertens | New sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents |
| DK0698216T4 (da) * | 1993-05-10 | 2009-06-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Fremgangsmåder til typebestemmelse af hepatitis-C-virus og anvendte reagenser heri |
| US7070790B1 (en) | 1993-06-29 | 2006-07-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5882852A (en) * | 1993-06-29 | 1999-03-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates |
| DE19504302A1 (de) * | 1995-02-09 | 1996-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Methode zur serologischen Typisierung mittels typspezifischer Antigene |
| WO1996034013A1 (en) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Srl, Inc. | Antigen peptide compound and immunoassay method |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| RU2146825C1 (ru) * | 1998-05-07 | 2000-03-20 | Харламова Флора Семеновна | Способ диагностики внепеченочной персистенции вирусных антигенов в тканях у детей, больных хроническим гепатитом в, или дельта, или с |
| US7052830B1 (en) | 1998-06-09 | 2006-05-30 | Branch Andrea D | Hepatitis C virus peptides and uses thereof |
| WO2000031130A1 (en) * | 1998-11-20 | 2000-06-02 | Bio Merieux | Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications |
| US6995299B2 (en) * | 1999-11-02 | 2006-02-07 | University Of Connecticut | Propagation of human hepatocytes in non-human animals |
| US8124348B2 (en) | 2000-08-23 | 2012-02-28 | Jonathan Zmuda | Oral fluid rapid assay for hepatitis C virus (HCV) antibodies using non-antibody labeling of IgA molecules recognizing HCV peptide epitopes |
| US20030152942A1 (en) * | 2001-05-09 | 2003-08-14 | Lance Fors | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US7196183B2 (en) * | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
| CA2481502A1 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Achillion Pharmaceuticals, Inc. | Hcv antiviral and cytotoxicity drug screening assay |
| WO2005010035A2 (en) * | 2003-07-22 | 2005-02-03 | Branch Andrea D | Alternate reading frame polypeptides derived from hepatitis c and methods of their use |
| CN1852915A (zh) * | 2003-07-25 | 2006-10-25 | 艾登尼科斯（开曼）有限公司 | 治疗包括丙型肝炎的黄病毒科病毒所致疾病的嘌呤核苷类似物 |
| ES2596753T3 (es) * | 2003-08-29 | 2017-01-11 | Fujirebio Europe N.V. | Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo |
| RU2269134C2 (ru) * | 2003-11-27 | 2006-01-27 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера | Способ прогнозирования исходов острого вирусного гепатита с |
| CN1977050B (zh) | 2004-01-07 | 2012-09-05 | 第三次浪潮技术公司 | 丙型肝炎病毒基因型的确定 |
| JP4533656B2 (ja) * | 2004-04-28 | 2010-09-01 | アボットジャパン株式会社 | 特異性の改良されたｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗体測定法 |
| US7858752B2 (en) * | 2006-12-05 | 2010-12-28 | Abbott Laboratories | Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| CN110261616B (zh) * | 2019-04-30 | 2021-07-20 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| EP0318216B2 (en) * | 1987-11-18 | 2001-08-29 | Chiron Corporation | NANBV diagnostics |
| US5350671A (en) * | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
| KR0185373B1 (ko) * | 1989-03-17 | 1999-05-01 | 로버트 피. 블랙버언 | Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용 |
| US5106726A (en) * | 1990-02-16 | 1992-04-21 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV |
| WO1991015771A1 (en) * | 1990-04-04 | 1991-10-17 | Chiron Corporation | Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies |
| US6190864B1 (en) * | 1991-05-08 | 2001-02-20 | Chiron Corporation | HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics |
| HU227547B1 (en) * | 1991-06-24 | 2011-08-29 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides |
| PT787807E (pt) * | 1991-08-27 | 2003-08-29 | Hoffmann La Roche | Iniciadores e sondas para a deteccao da hepatite c |
| EP0532258A2 (en) * | 1991-09-09 | 1993-03-17 | Immuno Japan Inc. | Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes |
| CA2119013A1 (en) * | 1991-09-16 | 1993-04-01 | Richard R. Lesniewski | Hepatitis c assay |
| DE610436T1 (de) * | 1991-11-21 | 1995-08-03 | Common Services Agency | Detektion des Hepatis-C Virus. |
| DE69334323D1 (de) | 1992-07-16 | 2010-05-06 | Advanced Life Science Inst Inc | Antigenetische Peptide für die Gruppierung des Hepatitis C Virus sowie Reagenzien und Verfahren dafür |
| AU680450B2 (en) * | 1992-11-06 | 1997-07-31 | Mimotopes Pty Ltd | Support for the synthesis of modular polymers |
| ATE281526T1 (de) | 1993-05-05 | 2004-11-15 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus typ 4,5 und 6 |
| DK0698216T4 (da) * | 1993-05-10 | 2009-06-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Fremgangsmåder til typebestemmelse af hepatitis-C-virus og anvendte reagenser heri |
| US5885771A (en) * | 1993-10-29 | 1999-03-23 | Srl, Inc. | Antigenic peptide compound and immunoassay |
-
1994
- 1994-05-09 DK DK94916061T patent/DK0698216T4/da active
- 1994-05-09 AT AT94916061T patent/ATE281647T1/de active
- 1994-05-09 UA UA95114832A patent/UA46707C2/uk unknown
- 1994-05-09 PL PL94323368A patent/PL175338B1/pl unknown
- 1994-05-09 RO RO95-01952A patent/RO115471B1/ro unknown
- 1994-05-09 JP JP52562794A patent/JP3645904B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 PL PL94323367A patent/PL175360B1/pl unknown
- 1994-05-09 GE GEAP19942944A patent/GEP20012421B/en unknown
- 1994-05-09 CZ CZ19952929A patent/CZ294629B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 PL PL94311653A patent/PL175342B1/pl unknown
- 1994-05-09 DE DE69434117T patent/DE69434117T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 WO PCT/US1994/005151 patent/WO1994027153A1/en not_active Ceased
- 1994-05-09 PT PT94916061T patent/PT698216E/pt unknown
- 1994-05-09 EP EP94916061A patent/EP0698216B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 CN CN94192560A patent/CN1129795C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 RU RU95122701/13A patent/RU2158928C2/ru active
- 1994-05-09 KR KR1019950704993A patent/KR100330278B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 SK SK1359-95A patent/SK282543B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 HU HU9503219A patent/HU224513B1/hu active IP Right Grant
- 1994-05-09 ES ES94916061T patent/ES2232815T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-11-09 US US08/336,553 patent/US6054264A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-11 US US08/439,157 patent/US6416944B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-11-09 US US09/437,895 patent/US6416946B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL175338B1 (pl) | Polipeptyd i reagent do klasyfikowania jednego lub większej liczby typów wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) | |
| EP0591431B1 (en) | Hepatitis c virus (hcv) polypeptides | |
| Dammacco et al. | Hepatitis C virus infection, mixed cryoglobulinemia, and non-Hodgkin's lymphoma: an emerging picture | |
| Burioni et al. | Dissection of human humoral immune response against hepatitis C virus E2 glycoprotein by repertoire cloning and generation of recombinant Fab fragments | |
| Mondelli et al. | Antibody responses to hepatitis C virus hypervariable region 1: evidence for cross‐reactivity and immune‐mediated sequence variation | |
| JP2002528140A (ja) | ヒトｐａｎ−ｈｃｖヒトモノクローナル抗体 | |
| ES2272065T3 (es) | Epitopos en proteinas de cubierta viricas y anticuerpos especificos dirigidos contra estos epitopos: uso para la deteccion de antigeno virico de hcv en tejido de hospedantes. | |
| Chang et al. | Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus | |
| CA2162250C (en) | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein | |
| WO1994013700A1 (en) | Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv | |
| AU671594C (en) | Hepatitis C virus (HCV) polypeptides | |
| JPH08505131A (ja) | 肝炎ｃ型ウイルス（ｈｃｖ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法 | |
| WO1998029747A1 (en) | Reagents and methods for detecting hepatitis gb virus antigen | |
| JPWO1992001714A1 (ja) | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原 |