PT1658302E - Análogos do nucleósido purina para o tratamento de doenças provocadas por flaviviridae incluindo hepatite c - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DO NUCLEÓSIDO PURINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS PROVOCADAS POR FLAVIVIRIDAE INCLUINDO HEPATITE C"

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. N° 60/490216, apresentado em 25 de Julho, 2003.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção está incluída na área da química farmacêutica e, em particular, na área dos nucleósidos de purina, a sua síntese e sua utilização como agentes anti-Flaviviridae no tratamento de hospedeiros infectados com Flaviviridae e, especialmente com Hepatite C.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Vírus Flaviviridae A família Flaviviridae de vírus compreende, pelo menos, três géneros distintos: pestivírus, que provocam doença no gado e porcos; flavivirus, que são a causa principal de doenças, tais como febre da dengue e febre-amarela, e hepacivirus, tal como hepatite C (HCV). 0 género flavivirus inclui mais do que 68 membros, separados em grupos com base na relação serológica (Calisher et al., J. Gen. Virol, 1993, 70, 37-43). Os sintomas clínicos variam e incluem febre, encefalite e febre hemorrágica 1 (Fields Virology, Editores: Fields, B. N., Knipe, D. M., e Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, PA, 1996, Capitulo 31, 931-959). Os flavivírus de interesse global que estão associados com a doença humana incluem o virus da Dengue, vírus da febre hemorrágica, tais como o vírus Lassa, Ebola e da febre-amarela, síndrome do choque e vírus da encefalite Japonesa (Halstead, S. B., Rev. Infect. Dis., 1984, 6, 251-264; Halstead, S. B., Science, 239:476-481, 1988; Monath, T. P., New Eng. J. Med, 1988, 319, 641-643). 0 género pestivírus inclui o vírus da diarreia bovina virai (BVDV), vírus da febre suína clássica (CSFV, também denominado vírus da peste suína) e vírus da doença da Fronteira (BDV) em ovelhas (Moennig, V. et al. Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). As infecções por pestivírus do gado domesticado (gado bovino, porcos e ovelhas) provocam perdas económicas significativas a nível mundial. 0 BVDV provoca a doença mucosal em gado bovino e é de importância económica significativa para a indústria do gado (Meyers, G. e Thiel, H.-J., Advances in Virus Research, 1996, 47, 53-118; Moennig V., et al., Adv. Vir. Res. 1992, 41, 53-98). Os pestivírus humanos não foram tão extensamente caracterizados como os pestivírus animais. No entanto, estudos de análises serológicas indicam exposição a pestivírus considerável em humanos.

Pestivírus e hepacivirus são grupos de vírus relacionados intimamente, incluídos na família Flaviviridae. Outros vírus intimamente relacionados nesta família, incluem o Vírus GB-A, agentes do tipo vírus GB-A, do vírus GB-B e do vírus GB-C (também denominado vírus da hepatite G, HGV) . 0 grupo hepacivirus (vírus da hepatite C; HCV) consiste em vários vírus relacionados intimamente mas genotipicamente distinguíveis que 2 infectam humanos. Existem, aproximadamente, 6 genótipos de HCV e mais do que 50 subtipos. Devido às semelhanças entre pestivírus e hepacivirus, combinados com a fraca capacidade dos hepacivírus em crescer de um modo eficiente em cultura celular, é muitas vezes utilizado o vírus da diarreia virai bovina (BVDV) como substituto para estudar os vírus HCV. A organização genética dos pestivírus e hepacivírus é muito semelhante. Estes vírus de cadeia de ARN proteica positiva, possuem uma grelha de leitura aberta grande simples (ORF) que codifica todas as proteínas virais necessárias para a replicação de vírus. Estas proteínas são expressas como uma poliproteína que é processada co- e pós-tradução através de proteinases celulares e codificadas por vírus para proporcionar as proteínas virais maduras. As proteínas virais responsáveis pela replicação do genoma virai de ARN estão localizadas dentro, aproximadamente, do terminal carboxilo. Dois terços das ORF são denominadas proteínas não estruturais (NS). A organização genética e o processamento da poliproteína da porção da proteína não estrutural da ORF para pestivírus e hepacivírus são muito semelhantes. Para ambos, pestivírus e hepacivírus, as proteínas não estruturais (NS) maduras, na ordem sequencial a partir do terminal amino da região que codifica a proteína não estrutural até ao terminal carboxilo da ORF, consistem de p7, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B.

As proteínas NS de pestivírus e hepacivírus partilham domínios de sequência que são característicos de funções proteicas específicas. Por exemplo, a glicoproteína NS1 é uma proteína de superfície celular que é deslocada para o lúmen do ER. A NS1 foi inicialmente caracterizada como um antigénio de fixação do complemento solúvel encontrado no soro e tecidos de 3 animais infectados e, agora, é conhecida como estimuladora das respostas imunitárias humorais na sua forma extracelular. Os anticorpos para a NS1 podem ser utilizados para conferir imunidade passiva a determinados pestivírus e flavivírus. A NS1 tem sido implicada no processo da replicação do ARN, onde se acredita que tenha uma função funcional no processamento citoplasmát ico do ARN. A NS2A é uma proteína pequena (aproximadamente com 22 kd) de função desconhecida. Estudos sugerem que se liga a NS3 e NS5 e, deste modo, pode ser uma recrutadora dos moldes de ARN para a replicase ligada à membrana. A NS2B também é uma proteína pequena (cerca de 14 kd) que está associada à membrana e é um co-factor necessário para a função da protease da serina de NS3, com a qual forma um complexo.

As proteínas NS3 dos vírus em ambos os grupos são proteínas associadas a membrana, grandes (cerca de 70 kd) que possuem motivos de sequência de aminoácidos característicos de proteinases de serina e de helicases (Gorbalenya et al. (1988) Nature 333:22; Bazan e Fletterick (1989) Virology 171:637-639; Gorbalenya et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17.3889-3897). Assim, as proteínas NS3 têm actividade enzimática, necessária para processar poliproteínas para a replicação do ARN. A extremidade C-terminal das proteínas NS3, têm uma actividade de trifosfatase de ARN que parece modificar a extremidade 5' do genoma antes da adição da 5'-cap por guanililtransferase. A NS4A e NS4B são proteínas hidrofóbicas associadas à membrana, pequenas (cerca de 16 kd e cerca de 2 7 kd, respectivamente) que parecem ter uma função na replicação do ARN por ancoragem dos componentes da replicase às membranas celulares (Fields, Virology, 4a Edição, 2001, p. 1001). 4

As proteínas NS5 são as maiores (cerca de 103 kd) e as mais conservadas, com homologia de sequência a outros vírus de ARN de cadeia ( + ) . Têm também uma função importante na replicação de vírus. As proteínas NS5B de pestivírus e hepacivírus são as enzimas necessárias para a síntese do intermediário de ARN de cadeia negativa que são complementares ao genoma virai, e dos intermediários de ARN de cadeia negativa. O produto do gene de NS5B tem Gly-Asp-Asp (GDD) como uma sequência demarcada, com a qual partilha com transcriptases reversas e outras polimerases virais e que é passível de previsão da actividade da polimerase de ARN dependente de ARN (RdRP) (DeFrancesco et al., Antiviral Research, 2003, 58:1-16). De um modo interessante, foi verificado que a cauda hidrofóbica longa do resíduo 21 do terminal C da NS5B, é necessária para direccionar a NS5B para a membrana ER, mas a sua remoção não tem outro efeito e, de facto, conduz a solubilidade e actividade enzimática aumentada (Tomei et al., J. Gen. Virol., 2000, 81 : 759-767; Lohmann et al., J. Virol., 1997, 71:8416-28; Ferrari et al., J. Virol., 1999, 73:1649-54) .

Os produtos da enzima NS5B têm os motivos caracteristicos das polimerases de ARN direccionadas para ARN e, além disso, partilham homologia com enzimas metiltransferases que estão envolvidas na formação do cap de ARN (Koonin, E.V. e Dolja, V.V. (1993) Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28:375-430; Behrens et al.(1996) EMBO J. 15:12-22; Lchmannet al.(1997) J. Virol. 71:8416-8428; Yuan et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 232:231-235; Hagedorn, document PCT WO 97/12033; Zhong et al. (1998) J. Virol. 72.9365-9369). A estrutura cristalina não ligada da NS5B mostra a caracteristica estrutural única do enrolamento numa forma clássica de "mão direita", na qual os 5 subdomínios dos dedos, palma e polegar podem ser reconhecidos (uma característica que partilha com outras polimerases), mas diferem de outras polimerases "mão direita meio aberta", por terem formas mais compactas devido aos dois loops extensos que atravessa os domínios do dedo e polegar no topo da cavidade do local activo (DeFrancesco et al. at 9). Os subdomínios do dedo, polegar e palma rodeiam a cavidade do local activo, à qual o molde de ARN e substratos de NTP têm acesso via dois túneis carregados positivamente (Bressanelli et al., J. Virol., 2002, 76, 3482-92) . Os domínios do dedo e polegar têm fortes interacções que limitam as suas capacidades para alterar a conformação, independentemente, uma da outra, uma característica estrutural partilhada por outros RdRP. O domínio do polegar contem um loop em forma de gancho β que se estende em direcção à fenda do local activo e pode ter uma função na restrição da ligação do molde/iniciador no local activo da enzima (DeFrancesco et ai., at 10). Estão a ser realizados estudos para determinar a função deste loop no mecanismo de iniciação da síntese de ARN (_Id. )

Os resíduos da reacção de transferência do nucleotidilo estão localizados no domínio da palma e contêm o motivo da assinatura GDD (DeFrancesco et ai., at 9). A geometria da palma está altamente conservada em todas as polimerases e tem um centro catalítico conservado, com dois iões metálicos conservados que é necessário para catalisar uma reacção de transferência de fósforo no local activo da polimerase.

Acredita-se que é utilizado pelos pesti-, flavi- e hepacivírus, o modelo de iniciação de novo da polimerização do ARN, em vez do mecanismo "copy back". No modelo de iniciação de novo, a síntese de ARN complementar é iniciada na extremidade 3' 6 do genoma por um trifosfato de nucleótido, em vez de um ácido nucleico ou um iniciador de proteína. A NS5B purificada é capaz de realizar este tipo de acção, independentemente, do iniciador, e acredita-se que o loop β do terminal C corrige a posição da extremidade 3' do molde de ARN funcionando como um porta que retarda o deslize da extremidade 3' do ARN através do local activo da polimerase (Hong et al., Virology, 2001, 285:6-11).

Bressanelli et al. referiram a estrutura da polimerase NS5B em complexo com os nucleótidos nos quais foram observados três locais de ligação de nucleótidos distintos no centro catalítico do RdRP de HCV e o complexo exibe uma geometria semelhante ao complexo de iniciação de novo da polimerase phi 6 (Bressanelli et al., J. Virol., 2002, 76: 3482-92). Assim, a iniciação de novo ocorre e, aparentemente, é seguida por prolongamento do ARN, final da polimerização e libertação da nova cadeia. Em cada destes passos está a oportunidade para intervenção e inibição do ciclo de vida virai.

As acções e funções das proteínas NS dos pestivírus e hepacivírus no ciclo de vida dos vírus são directamente análogos. Em ambos os casos, as proteinases da serina de NS3 são responsáveis por todo o processamento proteolítico dos precursores da poliproteína a jusante da sua posição na ORF (Wiskerchen e Collett (1991) Virology 184:341-350; Bartenschlager et al. (1993) J. Virol. 67:3835-3844; Eckart et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 192:399-406; Grakoui et al. (1993) J. Virol. 67:2832-2843; Grakoui et al. (1993)

Proc. Natl. Acad Sei. USA 90:10583-10587; Hijikata et al. (1993) J. Virol. 67:4665-4675; Tome et al. (1993) J. Virol. 67: 4017-4026). A proteína NS4A, em ambos os casos, actua como um cofactor com a protease da serina NS3 (Bartenschlager et al. (1994) J. Virol. 68:5045-5055; Failla et al. (1994) J. Virol. 7 68: 3753-3760; Lin et al. (1994) 68 : 8147-8157; Xu et al. (1997) J. Virol. 71:5312-5322). A proteína NS3 de ambos os vírus funciona, também, como uma helicase (Kim et al. (1995) Biochem.

Biophys. Res. Comm. 215: 160-166; Jin e Peterson (1995) Arch.

Biochem. Biophys., 323:47-53; Warrener e Collett (1995) J. Virol. 69:1720-1726). Finalmente, as proteínas NS5B dos pestivírus e hepacivírus têm actividade prevista de polimerase de ARN direccionada para ARN (Behrens et al. (1996) EMBO J. 15:12-22; Lchmannet ai. (1997) J. Virol. 71:8416-8428; Yuan et ai. (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 232:231-235; Hagedorn, documento PCT WO 97/12033; Zhong et al.(1998) J. Virol. 72.9365-9369) .

Vírus da Hepatite C O vírus da hepatite C (HCV) é a principal causa mundial de doença crónica do figado. (Boyer, N. et al. J. Hepatol. 32:98-112, 2000). O HCV provoca uma infecção virai de crescimento lento e é a principal causa de cirrose e carcinoma hepatocelular (Di Besceglie, A. M. e Bacon, B. R., Scientific American, Oct. : 80-85, (1999); Boyer, N. et al. J. Hepatol. 32:98-112, 2000). Estima-se que 170 milhões de pessoas no mundo

estão infectadas com HCV. (Boyer, N. et al. J. Hepatol. 32:98-112, 2000) . A cirrose provocada por infecção por hepatite C crónica provoca 8000-12000 mortes por ano nos Estados Unidos e infecção por HCV é a principal indicação para transplante do fígado. O HCV é conhecido como a causa de, pelo menos, 80% das hepatites após transfusão e uma proporção substancial da hepatite aguda esporádica. Evidências preliminares implicam, 8 também, o HCV em muitos casos de hepatite crónica "idiopática", cirrose "criptogénica" e, provavelmente, carcinoma hepatocelular não relacionado com outros vírus da hepatite, tal como Vírus da Hepatite B (HBV). Uma pequena proporção de pessoas saudáveis parece ser portadora de HCV crónica, variando com a geografia e outros factores epidemiológicos. Os números podem exceder, substancialmente, os apresentados para o HBV, apesar da informação seja ainda preliminar; não se sabe ao certo quantas destas pessoas têm doença hepática crónica sub-clínica. (The Merck Manual, cap. 69, p. 901, 16a ed., (1992)). O HCV é um vírus de envelope contendo um genoma de ARN de cadeia única no sentido positivo de, aproximadamente, 9,4 kb. O genoma virai consiste de uma região não traduzida (UTR) 5', uma grelha de leitura aberta longa, codificando um precursor de poliproteína de, aproximadamente, 3011 aminoácidos e uma UTR 3' curta. A UTR 5' é a parte mais altamente conservada do genoma de HCV e é importante para a iniciação e controlo da tradução da poliproteína. A tradução do genoma de HCV é iniciada por um mecanismo independente de cap conhecido como entrada do ribossoma interno. Este mecanismo envolve a ligação dos ribossomas a uma sequência de ARN, conhecida como o local de entrada do ribossoma interno (IRES). Foi recentemente determinada uma estrutura terciária do ARN como sendo um elemento estrutural essencial da IRES de HCV. As proteínas estruturais virais incluem uma proteína principal da nucleocápside (C) e duas glicoproteínas de envelope, EI e E2. 0 HCV codifica também duas proteinases, uma metaloproteinase dependente de zinco codificada pela região NS2-NS3 e uma proteinase da serina codificada na região NS3. Estas proteinases são necessárias para clivar as regiões específicas da 9 poliproteína precursora em péptidos maduros: a ligação entre NS2 e NS3 é a protease NS2/NS3 autocataliticamente clivada, enquanto as ligações restantes são clivadas pelo domínio da protease da serina N-terminal do NS3 complexado com NS4A. A proteína NS3 contém a actividade de helicase dependente de NTP que desenrola o ARN duplo durante a replicação. Os 21 aminoácidos hidrofóbicos do terminal carboxilo da proteína 5 não estrutural, NS5B, contem a polimerase ARN dependente de ARN que é essencial para a replicação virai (Fields Virology, Quarta Edição, Editores: Fields, B. N., Knipe, D. M., e Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 2001, Capítulo 32, p. 1014-1015). O NS5B é conhecido por se ligar a ARN não especif icamente e interagir directamente com NS3 e NS4A que, por sua vez, formam complexos com NS4B e NS5A (JÇd. 0 1015; Ishido et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998; 244:35-40). Determinadas experiências in vitro utilizando NS5B e guanosina 5'-mono-, di-e trifosfato, bem como 5'-trifosfato de 2'-desoxi- e 2', 3'-didesoxi-guanosina como inibidores de HCV, sugerem que o HCV-Rd.RP pode ter uma especificidade específica para grupos 5'-trifosfatos e 2'- e 3'-OH (Watanabe et ai., documento U.S. 2002/0055483). De outro modo, a(s) função(s) das restantes proteínas não estruturais, NS4A, NS4B e NS5A (a metade terminal amino da proteína 5 não estrutural) permanecem desconhecidas.

Um foco significativo da pesquisa antiviral actual está direccionado para o desenvolvimento de métodos melhorados de tratamento de infecções crónicas por HCV em humanos (Di Besceglie, A. M. e Bacon, B. R., Scientific American, Outubro: 80-85, (1999)). 10 Métodos para Tratar Infecções por Flaviviridae 0 desenvolvimento de novos agentes antivírais para infecções por Flaviviridae, especialmente hepatite C, está a decorrer actualmente. Estão a ser desenvolvidos inibidores específicos das enzimas derivadas de HCV, tais como os inibidores da protease, helicase e polimerase. Os fármacos que inibem outros passos na replicação do HCV estão, também, em desenvolvimento, por exemplo, fármacos que bloqueiam a produção dos antigénios de HCV a partir do ARN (inibidores de IRES), fármacos que previnem o processamento normal das proteínas de HCV (inibidores da glicosilação), fármacos que bloqueiam a entrada do HCV nas células (por bloqueio do seu receptor) e agentes citoprotectores não específicos que bloqueiam a lesão celular provocada por infecção virai. Além disso, estão, também, em desenvolvimento abordagens moleculares para tratar hepatite C, por exemplo, ribozimas, que são enzimas que clivam moléculas de ARN virais específicas e estão sob investigação oligonucleótidos anti-sentido, que são pequenos segmentos complementares de ADN que se ligam a ARN virai e inibem a replicação virai. Vários tratamentos de HCV são revistos por Bymock et ai. em Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 11:2; 79-95 (2000) e De Francesco et al. em Antiviral Research, 58: 1-16 (2003). A Idenix Pharmaceuticals, Ltd. divulga nucleósidos ramificados e a sua utilização no tratamento de HCV e flavivírus e pestivírus nas Publicações de Patente US N° 2003/0050229 Al, 2004/0097461 Al, 2004/0101535 Al, 2003/0060400 Al, 2004/0102414 Al, 2004/0097462 Al e 2004/0063622 Al que correspondem às Publicações Internacionais N° WO 01/90121 e WO 01/92282. Um método para o tratamento da infecção por hepatite C (e flavivírus e pestivírus), em humanos e outros 11 animais hospedeiros é divulgado nas publicações da Idenix que incluem administração de uma quantidade eficaz de nucleósidos 1', 2', 3' ou 4'-ramificado β-D ou β-L biologicamente activos ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, administrado sozinho ou em combinação, opcionalmente num veículo farmaceuticamente aceitável. Ver também as Publicações das Patentes U.S. N° 2004/0006002 e 2004/0006007, bem como os documentos WO 03/026589 e WO 03/026675. A Idenix Pharmaceuticals, Ltd. divulga também na Publicação de Patente US N° 2004/0077587 profármacos de nucleósidos ramificados farmaceuticamente aceitáveis e a sua utilização no tratamento de HCV e flavivírus e pestivírus em profármacos. Ver também as Publicações PCT N° WO 04/002422, WO 04/002999 e WO 04/003000. Além disso, a Idenix Pharmaceuticals, Ltd. Divulga, também no documento WO 04/046331 mutações de Flaviviridae provocadas por nucleósidos 2'-ramificados β-D ou β-L biologicamente activos ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco.

Biota Inc. divulga vários derivados de fosfato de nucleósidos, incluindo nucleósidos 1', 2', 3' ou 4’-ramificados β-D ou β-L, para o tratamento de infecção por hepatite C na Publicação de Patente Internacional WO 03/072757.

Emory University e a University of Georgia Research Foundation, Inc. (UGARF) divulgam a utilização de 2'-fluoronucleósidos para o tratamento de HCV na Patente US N° 6348587. Ver também o Pedido de Patente US N° 2002/0198171 e Publicação de Patente Internacional WO 99/43691.

BioChem Pharma Inc. (agora Shire Biochem, Inc.) divulga a utilização de vários nucleósidos de 1,3-dioxolano para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae na Patente 12 US N° 6566365. Ver também a Patente US N° 6340690 e 6605614; Publicação de Patentes US N°. 2002/0099072 e 2003/0225037, bem como a Publicação Internacional N° WO 01/32153 e WO 00/50424.

BioChem Pharma Inc. (agora Shire Biochem, Inc.) divulga também vários outros nucleósidos 2'-halo, 2'-hidroxilo e 2'-alcoxilo para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae na Publicação de Patente US N° 2002/0019363 bem como a Publicação Internacional N° WO 01/60315 (PCT/CA01/00197; apresentada em 19 de 2001). ICN Pharmaceuticals, Inc. divulga vários análogos de nucleósidos que são úteis na modulação da resposta imunitária na Patente US N° 6495677 e 6573248. Ver também documentos WO 98/16184, WO 01/68663 e WO 02/03997. A Patente US N° 6660721; Publicação de Patentes US N° 2003/083307 Al, 2003/008841 AI e 2004/0110 7118; bem como as Publicações de Patentes Internacionais N°. WO 02/18404; WO 02/100415, WO 02/094289 e WO 04/043159; apresentadas em nome de F. Hoffmann-La Roche AG, divulgam vários nucleósidos análogos para o tratamento da replicação do ARN de HCV.

Pharmasset Limited divulga vários nucleósidos e antimetabolitos para o tratamento de vários virus, incluindo Flaviviridae e, em particular, HCV, nas Publicações de Patentes US N° 2003/0087873, 2004/0067877, 2004/0082574, 2004/0067877, 2004/002479, 2003/0225029 e 2002/00555483, bem como nas Publicações de Patentes Internacionais N° WO 02/32920, WO 01/79246, WO 02/48165, WO 03/068162, WO 03/068164 e WO 2004/013298. 13 A Publicação de Patente Internacional N° WO 2005/009418 divulga vários nucleósidos modificados para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae. (incluindo BVDV e HCV), Orthomyxovirdae (incluindo, Influenza A e B) ou Paramyxxoviridae (incluindo RSV) ou patologias relacionadas com a proliferação celular anormal.

Merck & Co., Inc. e Isis Pharmaceuticals divulgam na Publicação da Patente US N° 2002/0147160, 2004/0072788, 2004/0067901 e 2004/0110717; bem como nas Publicações de Patentes Internacionais correspondentes N° WO 02/057425 (PCT/US02/01531; apresentada em 18 de Janeiro de 2002) e WO 02/057287 (PCT/US02/03086; apresentada em 18 de Janeiro de 2002), vários nucleósidos e, em particular, vários nucleósidos pirrolopirimidina, para o tratamento de virus cuja replicação está dependente da polimerase de ARN dependente de ARN, incluindo Flaviviridae e, em particular, HCV. Ver também documentos WO 2004/000858, WO 2004/003138, WO 2004/007512 e WO 2004/009020. A publicação de Patente US N° 2003/028013 Al, bem como as Publicações de Patentes Internacionais N° WO 03/051899, WO 03/061576, WO 03/062255 WO 03/062256, WO 03/062257 e WO 03/061385, submetidas por Ribapharm, estão também relacionadas com a utilização de determinados análogos de nucleósidos para tratar o virus da hepatite C.

Genelabs Technologies divulga na Publicação da Patente US N° 2004/0063658, bem como nas Publicações de Patentes Internacionais N° WO 03/093290 e WO 04/028481, vários derivados de nucleósidos modificados na base, incluindo nucleósidos 1', 14 2', 3' ou 4'-ramificados β-D ou β-L, para o tratamento de infecção por hepatite C.

Eldrup et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (27 de Abril, 2003, Savannah, Ga.) p. A75) descrevem a relação da actividade e estrutura dos nucleósidos 2'-modificados para a inibição do HCV.

Bhat et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (27 de April, 2003, Savannah, Ga.); p A75) descrevem a síntese e propriedades farmacocinéticas dos análogos de nucleósidos como possíveis inibidores da replicação de ARN de HCV. Os autores referem que os nucleósidos 2'-modificados demonstraram uma potente actividade inibidora nos ensaios de replicação baseados em células.

Olsen et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (27 de Abril, 2003, Savannah, Ga.) p A76) descrevem também os efeitos dos nucleósidos 2'-modificados na replicação do ARN de HCV.

Krawczyk et al. divulgam a síntese de nucleósidos 2-azapurme 4-substituídos e a sua utilização no tratamento de citomegalovírus humano (HCMV) . Krawczyk et al., Nucleósidos, Nucleotides & Nucleic Acids. 19: 39-68 (2000).

As variantes dos vírus resistentes a fármacos podem emergir após tratamento prolongado com um agente antiviral. A resistência ao fármaco ocorre, mais tipicamente, por mutação de 15 um gene que codifica uma enzima utilizada na replicação virai, e, por exemplo, no caso do VIH, transcriptase reversa, protease ou polimerase de ADN. Foi demonstrado que a eficácia de um fármaco contra uma infecção virai pode ser prolongada, aumentada ou restaurada por administração do composto em combinação ou alternado com um segundo e, talvez, um terceiro, composto antiviral que induz uma mutação diferente da provocada pelo fármaco principal. Alternativamente, as farmacocinéticas, biodistribuição ou outros parâmetros do fármaco podem ser alterados por essa combinação ou terapia de alternação. Em geral, a terapia de combinação é tipicamente preferida sobre a terapia de alternação porque induz pressões simultâneas múltiplas no vírus. No entanto, não se pode prever que mutações serão induzidas no genoma virai por um determinado fármaco ou se a mutação é permanente ou provisória ou como uma célula infectada com uma sequência virai mutada irá responder à terapia com outros agentes em combinação ou alternado. Isto é exacerbado pelo facto de que existe uma falta de dados sobre as cinéticas da resistência ao fármaco em culturas de longo termo tratadas com agentes antivirais modernos.

Tendo em conta a gravidade das doenças associadas com pestivírus, flavivírus e vírus da hepatite C e a sua expansão em animais e humanos, tem sido um objecto da presente invenção proporcionar um composto, método e composição para o tratamento de hospedeiros infectados com qualquer membro da família Flaviviridae, incluindo o vírus da hepatite C.

Além disso, é um objectivo da presente invenção proporcionar um composto, método e composição farmaceuticamente aceitável para a profilaxia e/ou tratamento de um hospedeiro e, 16 particularmente, um humano, infectado com qualquer membro da família Flaviviridae.

Além disso, dado o perigo crescente de outras infecções por Flaviviridae, permanece uma forte necessidade em proporcionar novos agentes farmacêuticos eficazes que tenham baixa toxicidade para o seu hospedeiro.

Deste modo, é um objectivo da presente invenção proporcionar um composto, método e composição para o tratamento de um hospedeiro infectado com qualquer membro da família Flaviviridae, incluindo o vírus da hepatite C que tenha uma toxicidade baixa para o hospedeiro. É outro objectivo da presente invenção proporcionar um composto, método e composição, geralmente para o tratamento de doentes infectados com pestivírus, flavivírus ou hepacivírus.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um composto como apresentado na reivindicação 1, uma composição como apresentada na reivindicação 13 e utilizações como apresentadas nas reivindicações 26 e 29. São descritos métodos e composições para o tratamento de infecção por pestivírus, flavivírus e vírus da hepatite C que incluem a administração de uma quantidade eficaz de um nucleósido beta-D ou beta-L das Fórmulas (I) e (II) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco. 17

Numa primeira forma de realização principal, é proporcionado um composto da Fórmula (I) ou um seu sal f armaceuticamente aceitável ou profármaco:

0) em que cada R é, independentemente, H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato; alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, acilo, -C(0)-(alquilo), -C(0)(alquilo inferior), -C(0)-(alcenilo), -C(0)-(alcinilo), lípido, fospolípido, hidrato de carbono, péptido, colesterol, um resíduo ou derivado de aminioácido, ou outro grupo de saída farmaceuticamente aceitável que é capaz de proporcionar H ou fosfato, quando administrado in vivo; n é 0-2; quando X é CH2, CH0H, CH-alquilo, CH-alcenilo, CH-alcinilo, C-dialquilo, CH-0-alquilo, CHO-alcenil-, CH-0-alcinilo, CH-S-alquilo, CH-S-alcenilo, CH-S-alcinilo, CH-halogéneo ou C-(halogéneo)2, 18 então cada R1 e R1' é, independentemente, H, OH, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -I(alquilo inferior), -0(alcenilo), -0(alcinilo), halogéneo, alquilo halogenado, -NO2, -NH2, -NH(alquilo inferior), -N(alquilo inferior)2, -NH(acilo), -N(acilo)2, -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo, ou SCH-halogéneo, em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; quando X é 0, S[0]n, NH, N-alquilo, N-alcenilo, N-alcinilo, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo ou SCH-halogéneo, então, cada R1 e R1' é, independentemente, H, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), alquilo halogenado, -C(0)H2, -C (0) NH (alquilo) , -C (0) N (alquilo) 2, -C(H)=N-NH2, C(S)NH2, C(S)NH(alquilo) ou C(S)N(alquilo)2, em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; cada R2 e R3 é, independentemente, H, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, I, CN, N02, -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) e -C(0)N(alquilo)2, N3, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, alquilo halogenado, 19 -C(Ο)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -O(alquilo), -0(alcenilo), -0(alcinilo), -0C(0)NH2, NC, C(0)0H, SCN, OCN, -S(alquilo), -S(alcenilo), -S(alcinilo), -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), um resíduo de aminoácido ou derivado, um pró-fármaco ou grupo de saída que proporciona OH in vivo ou um anel heterocíclico com 3-7 membros opcionalmente substituído, com 0, S e/ou N, independentemente, como um heteroátomo considerado individualmente ou em combinação; cada R2' e R3' é, independentemente, H; alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo), -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -O(acil), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido, ciano, N02, -S(alquilo), -S(alcenilo), -S(alcinilo), NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH (alcinilo) , -NH(acilo), ou -N(acilo)2 e R3 em 3'-C pode ser também OH; e A base é seleccionada do grupo consistindo de:

20 e

em que: cada A é, independentemente, N ou C-R5; cada W é H, OH, -O(acilo), -0 (alquiloCi_4) , -0 (alcenilo) , -0 (alcinilo) , -0C(0)R4R4, -0C(0)NR4R4, SH, -S(acilo), -S (alquiloCi_4) , NH2, NH(acilo), N(acilo)2, NH (alquiloCi-4) , N (alquiloCi_4) 2, -N (cicloalquilo) alquilCi_4amino, di (alquiloCi_4) amino, cicloalquilaminoC3_6, halogéneo, alquiloCi-4, alcoxiloCi-4, CN, SCN, OCN, SH, N3, N02, NH=NH2, N3, NHOH, -C(0)NH2, -C (0) NH (acilo) , -C (0) N (acilo) 2, -C (0) NH (alquiloCi_4) , -C(0)N(alquiloCi-4)2, -C(0)N(alquil)(acilo) ou alquilo halogenado; 21 cada Z é 0, S, NH, N-OH, N-NH2, NH (alquilo), N (alquilo) 2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, SH, N02, NH2, N3, NH=NH, NH(alquilo), N(alquilo)2, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloC4-6; cada R5 é, independentemente, H, Cl, Br, F, I, CN, OH, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo, carboxilo, C(=NH)NH2, alcoxiloC4-4, alquiloxiC4-4carbonilo, N3, NH2, NH (alquilo), N (alquilo) 2, N02, N3, CF3 especialmente alquilo halogenado, alquilCi_4amino, di (alquilC4-4) amino, cicloalquilC3-6amino, alcoxiloC4-6, SH, -S (alquiloC4-4) , -S (alceniloC4-4) , -S (alciniloC4-4) , alquilC4-6tio, alquilCi_6Sulfonilo, (alquilCi_4) o-2aminometil, cicloalquilC3_ 6amino-alcenilo, -alcinilo, -(O)alquilo, -(O)alcenilo, - (O) alcinilo, -(O)acilo, -O (alquiloCi-4) , -O (alceniloCi-4) , -O (alciniloCi-4) , -0-C(O)NH2, -OC (O)N(alquil) , -0C(0)R'R", —C(O)OH, C(O)O-alquilo, C(O)O-alcenilo, C(O)O-alcinilo, S-alquilo, S-acilo, S-alcenilo, S-alcinilo, SCN, OCN, NC, -C(0)-NH2, C(O)NH(alquilo), C(O)N(alquilo)2, C(O)NH(acilo), C(O)N(acilo)2, (S)-NH2, NH-alquilo, N(dialquilo)2, NH-acilo, N-diacilo ou um heterociclo com 3-7 membros com O, S ou N considerados, independentemente, em qualquer combinação; cada R' e R'' é, independentemente, H, alquiloCi_6, alceniloC2-6f alciniloC2-6r halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxiCi-4carbonilo, NH2, alquilC4-4amino, di (alquilCi_4) amino, alcoxiloC4-6f alquilC4-6Sulfonilo ou (alquilCi_4) 0-2aminomet ilo; e 22 todas as suas formas tautoméricas, enantioméricas e estereoisoméricas; com a advertência que quando X é S na Fórmula (I), então o composto não é 5-(4-amino-imidazo[4,5-d][1,2,3]triazin-7-il)-2-hidroximetil-tetra-hidro-tiofen-3-ol ou 7-(4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetra-hidro-tiofen-2-il)-3,7-di-hidro-imidazo[4,5-d][1,2,3]triazin-4-ona.

Numa segunda forma de realização principal, é proporcionado um composto da Fórmula (II) ou um seu sal f armaceut icamente aceitável ou profármaco:

em que: R, R2, R2 , R3 e R3 são todos como definido acima; X* é CY3; Y3 é hidrogénio, alquilo, bromo, cloro, fluoro, iodo, azido, ciano, alcenilo, alcinilo, -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), CF3, -C0NH2, -CONH(alquilo) ou -CON(alquilo)2; 23 R1 é H, OH, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -0(acilo inferior), -0(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), -0(alcinilo), halogéneo, alquilo halogenado, -N02, -NH2, -NH(alquilo inferior), -N(alquilo inferior)2, -NH(acilo), -N(acilo)2, —C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo) ou -C(0)N(alquilo)2, em que uma substituição opcional no alquilo, alcenilo e/ou alcinilo pode ser um ou mais grupos halogéneo, hidroxilo, alcoxilo ou alquiltio considerados em qualquer combinação; a Base é definida como acima para Fórmulas (A) - (G); e todas as suas formas tautoméricas, enantioméricas e estereoisoméricas; com a advertência de que quando X é S na Fórmula (I), depois o composto não é 5-(4-amino-imidazo[4,5-d][l,2,3]triazin-7-il)-2-hidroximetil-tetra-hidro-tiofen-3-ol ou 7-(4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetra-hidro-tiofen-2-il)-3,7-di-hidro-imidazo[4,5-d][1,2,3]triazin-4-ona.

Em formas de realizaçao preferidas, as Bases (A)-(G) têm uma estrutura seleccionada do grupo consistindo de: 24

em que cada R' e R'', independentemente, é H, alquiloC4-6, alceniloC2-6, alciniloC2-6, halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxiCi_4carbonilo, NH2, alquilCi_4amino, di (alquilC1_4) amino, alcoxiloC4_6, alquilC1_6Sulfonilo, aminometil (alquilC4_4) 0-2, como proporcionado acima nas definições de A e Z para as Fórmulas da Base (A)-(G); cada W é, independentemente, H, alcoxilo, OH, SH, O-alcinilo, halogenado O-alcenilo

Cl, Br, I, O-alquilo, S-alcenilo F, alquilo S-alquilo, S-alcinilo, 25 -0C(0)NR4R4, O-acilo, S-acilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, NH-cicloalquilo, NH-acilo, NH=NH, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; e cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi_6; cada Z é 0, S, NH, N-OH, N-NH2, NH(alquilo), N (alquilo) 2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, SH, N02, NH2, N3, NH=NH, NH(alquilo), N(alquilo)2, C0NH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2 .

Nas suas formas de realização preferidas, os compostos da presente invenção compreendem nucleósidos, nos quais cada variável na Fórmula (I) é seleccionada do seguinte, em qualquer combinação: X é 0 ou S; R é H ou fosfato; Ri é H, CH20H ou C0NH2; R2 é OH ou F; R3 é alquilo, especialmente metilo ou propinilo ou H na posição 3'; A é H, CH ou N; Z é 0, S ou NH; W é NH2, Cl, OMe, OH, NH-ciclopropilo, S-Me; e cada R' e R'', independentemente, é Cl, CN, C0NH2 ou Me.

Nas suas formas de realização preferidas para a Fórmula (II), os compostos da presente invenção compreendem nucleósidos nos quais cada variável na Fórmula (II) é seleccionada a partir do seguinte, em qualquer combinação: X* é CH; R é H ou fosfato; Ri é H, CH20H ou C0NH2; R2 é OH ou F; R3 é alquilo, especialmente metilo ou propinilo ou H na posição 3'; A é H, CH ou N; Z é 0, S ou NH; W é NH2, Cl, OMe, OH, NH-ciclopropilo, S-Me; e cada R' e R'', independentemente, é Cl, CN, C0NH2 ou Me.

Em todas as formas de realização, os substituintes opcionais são seleccionados do grupo consistindo de um ou mais grupos halogéneo, amino, hidroxilo, carboxilo e alcoxilo ou átomos, 26 entre outros. É para ser entendido que todas as formas estereoisoméricas e tautoméricas dos compostos apresentados estão aqui incluídas.

Os compostos activos da presente invenção podem ser administrados em passos combinados, alternados ou sequenciais com outro agente anti-HCV. Na terapia de combinação, as dosagens eficazes de dois ou mais agentes são administradas em conjunto, enquanto na terapia em passos alternados ou sequenciais, é administrada uma dosagem eficaz de cada agente em série ou sequencialmente. As dosagens dadas irão depender das taxas de absorção, inactivação e excreção do fármaco, bem como de outros factores conhecidos pelos especialistas na técnica. É para ser notado que os valores de dosagem irão, também, variar com a gravidade da patologia a ser aliviada. É para ser também entendido que para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos e calendários deverão ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade individual e avaliação profissional da pessoa que está a administrar ou supervisionar a administração das composições.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 apresenta esquemas estruturais generalizados para a Fórmula (I) e Fórmula (II) dos ribofuranosilnucleósidos da presente invenção.

Figura 2 apresenta estruturas generalizadas para bases de 2-azapurina da presente invenção. 27

Figura 3 mostra esquemas estruturais para bases preferidas da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um composto, método e composição para o tratamento de um pestivirus, flavivírus e/ou hepatite C em humanos ou outros animais hospedeiros que inclui a administração de uma quantidade eficaz de tratamento anti-pestivirus, anti-flavivírus ou anti-HCV com beta-D- ou beta-L-nucleósido como aqui descrito ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, opcionalmente num veiculo farmaceuticamente aceitável. Os compostos desta invenção quer possuem actividade antiviral ou são metabolizados num composto que exibe tal actividade.

Os flavivirus incluídos no âmbito desta invenção são discutidos no geral em Fields Virology, Editores: Fields, N., Knipe, D.M. e Howley, P.M.; Lippincott-Raven Pulishers, Filadélfia, PA; Capítulo 31 (1996). Os flavivírus específicos incluem, sem limitação: Absettarov; Alfuy; Apoi; Aroa; Bagaza; Banzi; Bououi; Bussuquara; Cacipacore; Carey Island; Dakar bat; Vírus da Dengue 1, 2, 3 e 4; Edge Hill; Entebbe bat; Gadgets Gully; Hanzalova; Hypr; Ilhéus; meningoencefalite Israel-Turquia; encefalite Japonesa; Jugra; Jutiapa; Kadam; Karshi; Kedougou; Kokoera; Koutango; Kumlinge; Kunjin; doença da Floresta de Kyasanur; Langat; doença de Louping; Meaban; Modoc; leucoencefalite do morcego da Montanha; encefalite de Murray valley; Naranjal; Negishi; Ntaya; febre hemorrágica de Omsk; morcego de Phnom-Penh; Powassan; Rio Bravo; Rocio; Royal Farm; encefalite primavera-verão na Rússia; Saboya; encefalite de St. 28

Louis; Sal Vieja; San Perlita; Saumarez Reef; Sepik; Sokuluk; Spondweni; Stratford; Temusu; Tyuleniy; Uganda S, Usutu, Wesselsbron; Nilo Ocidental; Yaounde; Febre-amarela; e Zika.

Os pestivirus incluídos no âmbito desta invenção são também discutidos, no geral, em Fields Virology (Id.). Os pestivirus específicos incluem, sem limitação: vírus da diarreia virai de bovinos ("VDV"); vírus da febre suína clássica ("CSFV"), também conhecida como vírus da cólera dos cães); e vírus da doença do viajante ("DV"). 0 HCV é um membro da família, Flaviviridae; no entanto, o HCV foi agora colocado num novo género monotípico, hepacivírus.

Compostos Activos, Seus Sais Farmaceuticamente Activos e Profármacos

Numa primeira forma de realização, é proporcionado um composto da Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco:

© em que R é H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato; alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, 29 alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, acilo, -C(O)-(alquilo), -C(O)(alquilo inferior), -C(0)-(alcenilo), -C(0)-(alcinilo), lípido, fospfolípido, hidrato de carbono, péptido, colesterol, um resíduo ou derivado de aminoácido, ou outro grupo de saída farmaceuticamente aceitável que é capaz de proporcionar H ou fosfato quando administrado in vivo; n é 0 - 2; quando X é CH2, CHOH, CH-alquilo, CH-alcenilo, CH-alcinilo, C-dialquilo, CH-O-alquilo, CHO-alcenilo-, CH-O-alcinilo, CH-S-alquilo, CH-S-alcenilo, CH-S-alcinilo, CH-halogéneo ou C-(halogéneo)2, então cada R1 e R1' é, , independentemente, H, OH, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -I(alquilo inferior), -0(alcenilo), -0(alcinilo), halogéneo, alquilo halogenado, -N02, -NH2, -NH(alquilo inferior), -N(alquilo inferior)2, -NH(acilo), -N(acilo)2, -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo ou SCH-halogéneo, em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; quando X é 0, S[0]n, NH, N-alquilo, N-alcenilo, N-alcinilo, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo ou SCH-halogéneo, 30 então, cada R1 e R1 é, independentemente, H, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), alquilo halogenado, -C (0) H2, -C (0) NH (alquilo) , -C (0) N (alquilo) 2, -C(H)=N-NH2, C(S)NH2, C (S)NH(alquilo) ou C (S) N (alquilo) 2, em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; cada R2 e R3 é, independentemente, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, I, CN, N02, -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) e -C (0) N (alquilo) 2, N3, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, alquilo halogenado, -C(0)0-(alquilo) , -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -O(alquilo), -0(alcenilo), -0(alcinilo), -0C(0)NH2, NC, C(0)0H, SCN, OCN, -S(alquilo), -S(alcenilo) , -S(alcinilo) , -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), um resíduo de aminoácido ou derivado, um profármaco ou grupo de saída que proporciona OH in vivo ou um anel heterocíclico com 3-7 membros opcionalmente substituído, com 0, S e/ou N independentemente, como um heteroátomo considerado individualmente ou em combinação; cada R2' e R3' é, independentemente, H; alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo), -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido, ciano, 31 N02, -S(alquilo), -S(alcenilo) , -S(alcinilo) , NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), -NH(acilo), ou -N(acilo)2 e R3 em 3'-C pode ser também OH; e A base é seleccionada do grupo consistindo de: e

em que: cada A é, independentemente, N ou C-R5; 32 W é H, OH, -O(acilo), -O (alquiloCi-4) , -O (alcenilo) , -O (alcinilo) , -0C(0)R4R4, -0C(0)N R4R4, SH, -S(acilo), -S (alquiloCi_4) , NH2, NH(acilo), N(acilo)2/ NH (alquiloCi_4) , N (alquiloCi_4) 2, -N (cicloalquilo) alquilCi_4amino, di (alquiloCi_4) amino, cicloalquilC3_6amino, haloqéneo, alquiloCi-4, alcoxiloCi-4, CN, SCN, OCN, SH, N3, N02, NH=NH2, N3, NHOH, -C(0)NH2, -C (0) NH (acilo) , -C (0) N (acilo) 2, -C (0) NH (alquiloCi_4) , -C (0) N (alquiloCi_4) 2, -C(0)N(alquil)(acilo) ou alquilo haloqenado; Z é 0, S, NH, N-OH, N-NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, SH, N02, NH2, N3, NH=NH, NH(alquilo), N(alquilo)21 C0NH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi-6; cada R5 é, independentemente, H, Cl, Br, F, I, CN, OH, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo, carboxilo, C(=NH)NH2, alcoxiloCi_4, alquiloxiCi-4carbonilo, N3, NH2, NH (alquilo), N (alquilo) 2, N02, N3, CF3 especialmente alquilo halogenado, alquilCi_4amino, di (alquilCi_4) amino, cicloalquilC3_6amino, alcoxiloCi_6, SH, -S (alquiloCi_4) , -S (alceniloCi-4) , -S (alciniloCi_4) , alquilCi_6tio, alquilCi_6sulfonilo, (alquilCi_4) o-2aminometil, cicloalquilC3_6amino-alcenilo, -alcinilo, -(0)alquilo, - (0) alcenilo, - (0) alcinilo, -(O)acilo, -0 (alquiloCi_4) , —0 (al ceni 1 oC i-4) , -0 (alciniloCi_4) , -0-C(0)NH2, -0C(O)N(alquilo), -0C(0)R'R", -C(0)0H, C(0)0-alquilo, C(0)0-alcenilo, C(0)0-alcinilo, S-alquilo, S-acilo, S-alcenilo, S-alcinilo, SCN, OCN, NC, -C(0)-NH2, 33 C(0)NH(acilo), C(0)NH(alquilo), C(0)N(alquilo)2, C(0)N(acilo)2, (S)-NH2, NH-alquilo, N(dialquilo)2, NH-acilo, N-diacilo ou um heterociclo com 3-7 membros com 0, S ou N considerados, independentemente, em qualquer combinação; cada R' e R' ' é, independentemente, H, alquiloCi_6, alceniloC2_6, alciniloC2-6, halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxicarboniloCi-4, NH2, alquilCi-4amino, di (alquilCi-4) amino, alcoxiloCi-6, alquilCi_6Sulf onilo ou aminometil (alquilCi-4) 0-2; e todas as suas formas tautoméricas, enantioméricas e estereoisoméricas; com a advertência que quando X é S na Fórmula (I), então o composto não é 5-(4-amino-imidazo[4,5-d][1,2,3]triazin-7-il)-2-hidroximetil-tetra-hidro-thiofen-3-ol ou 7-(4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetra-hidro-tiofen-2-il) -3, 7-di-hidro-imidazo[4,5-d] [1,2,3]triazin-4-ona.

Numa segunda forma de realização principal, é proporcionado um composto da Fórmula (II) ou um seu sal f armaceut icamente aceitável ou profármaco:

(Π) 34 em que: R, R2, R2', R3 e R3' são todos como definido acima; X* é CY3; Y3 é hidrogénio, alquilo, bromo, cloro, fluoro, iodo, azido, ciano, alcenilo, alcinilo, -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), CF3, -CONH2, -CONH(alquilo) ou -CON(alquilo)2; R1 é H, OH, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -0(acilo inferior), -0(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), -0(alcinilo), halogéneo, alquilo halogenado, -NO2, —NH2, -NH(alquilo inferior), -N(alquilo inferior)2, -NH(acilo), -N(acilo)2, -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo) ou -C(0)N(alquilo)2, em que uma substituição opcional no alquilo, alcenilo e/ou alcinilo pode ser um ou mais grupos halogéneo, hidroxilo, alcoxilo ou alquiltio considerados em qualquer combinação; a base é definida como acima para Fórmulas (A)-(G); e A e Z são como definido acima; com a advertência de que quando X é S na Fórmula (I), depois o composto não é 5-(4-amino-imidazo[4,5-d] [l,2,3]triazin-7-il)-2-hidroximetil-tetra-hidro-tiofen-3-ol ou 7-(4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetra-hidro-tiofen-2- il)-3,7-di-hidro-imidazo[4,5-d][1,2,3]triazin-4-ona. 35 todas as suas formas tautoméricas, enantioméricas e estereoisoméricas.

Em formas de realização preferidas, as Bases (A)-(G) têm uma estrutura seleccionada do grupo consistindo de:

em que cada R' e R'', independentemente, é H, alquiloC4_6, alceniloC2-6/· alciniloC2-6, halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxiC4_4carbonilo, NH2, alquilC4_4amino, di (alquilCi_4) amino, alcoxiloCi_6> alquilCi_6Sulfonilo, 36 aminometil (alquilCi_4) 0-2/ como proporcionado acima nas definições de A e Z para as Fórmulas da Base (A)-(G); cada W é, independentemente, H, Cl, Br, I, F, alquilo halogenado, alcoxilo, OH, SH, O-alquilo, S-alquilo, O-alcenilo, O-alcinilo, S-alcenilo, S-alcinilo, -OC (0)NR4R4, O-acilo, S-acilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2/ NH-cicloalquilo, NH-acilo, NH=NH, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; e cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi-6; cada Z é O, S, NH, N-OH, N-NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, SH, N02, NH2, N3, NH=NH, NH(alquilo), N(alquilo)2, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2.

Nas suas formas de realização preferidas, os compostos da presente invenção compreendem nucleósidos, nos quais cada variável na Fórmula (I) é seleccionada dos seguintes, em qualquer combinação: X é O ou S; R é H ou fosfato; Ri é H, CH2OH, ou CONH2; R2 é OH ou F; R3 é alquilo, especialmente metilo ou propinilo ou H na posição 3'; A é H, CH ou N; Z é O, S ou NH; W é NH2, Cl, OMe, OH, NH-ciclopropilo, S-Me; e cada R' e R'' é, independentemente, Cl, CN, CONH2 ou Me.

Nas suas formas de realização preferidas para a Fórmula (II), os compostos da presente invenção compreendem nucleósidos, nos quais cada variável na Fórmula (II) é seleccionada das seguintes, em qualquer combinação: X* é CH; R é H ou fosfato; Ri é H, CH2OH ou CONH2; R2 é OH ou F; R3 é alquilo, especialmente metilo ou propinilo ou H na posição 3'; A é H, CH ou N; Z é O, S 37 ou NH; W é NH2, Cl, OMe, OH, NH-ciclopropilo, S-Me; e cada R' e R'' é, independentemente, Cl, CN, CONH2 ou Me.

Em todas as formas de realização, os substituintes opcionais são seleccionados do grupo consistindo de um ou mais dos grupos ou átomos de halogéneo, amino, hidroxilo, carboxilo e alcoxilo, entre outros. É para ser entendido que todas as formas estereoisoméricas e tautoméricas dos compostos apresentados estão aqui incluídas.

Numa forma de realização particular, é proporcionado um composto da Fórmula (III) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco:

(HD cada R, R2* e R3* é, independentemente, H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato; alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, acilo, -C(0)-(alquilo), -C(0)(alquilo inferior), -C(0)-(alcenilo), -C(0)-(alcinilo), lípido, fosfolípido, hidrato de carbono, péptido, colesterol, um resíduo ou derivado de aminoácido, ou outro grupo de saída farmaceuticamente aceitável que é 38 capaz de proporcionar H ou fosfato quando administrado in vivo; X é 0, S[0]n, CH2, CHOH, CH-alquilo, CH-alcenilo, CH-alcinilo, C-dialquilo, CH-O-alquilo, CH-O-alcenilo, CH-O-alcinilo, CH-S-alquilo, CH-S-alcenilo, CH-S-alcinilo, NH, N-alquilo, N-alcenilo, N-alcinilo, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo, SCH-halogéneo ou C-(halogéneo)2, em que alquilo, alcenilo ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; n é 0 - 2; cada R2' é, independentemente, H; alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo), -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -OH, -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido, ciano, N02, -S(alquilo), -S(alcenilo), -S(alcinilo), NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), -NH(acilo) ou -N(acilo)2; e a Base é definida como acima para as fórmulas (A)-(G); e, de um modo preferido, é uma Base como definido pelas estruturas (i)-(xi) acima.

Numa forma de realização, o R2' é um alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido ou ciano. Numa forma de realização particular, R2' é um alquilo, alcenilo ou alcinilo 39 opcionalmente substituído; halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3. Ainda noutra forma de realização particular, R2' é CH3 ou CF3.

Numa forma de realização, cada R, R2* e R3* é, independentemente, H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato. Noutra forma de realização, cada R, R2* e R3* é, independentemente, H. Ainda noutra forma de realização, cada R, R2* e R3* é, independentemente, H, acilo, ou um resíduo acilo de aminoácido.

Numa forma de realização, X é 0 ou S. Noutra forma de realização, X é 0.

Noutra forma de realização particular, é proporcionado um composto da Fórmula (IV) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco:

(IV) cada R, R2* e R3* é, independentemente, H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato; alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, alcenilo ou 40 alcinilo opcionalmente substituído, acilo, -C(0)-(alquilo), -C(0)(alquilo inferior), -C(0)-(alcenilo), -C(0)-(alcinilo), lípido, fosfolípido, hidrato de carbono, péptido, colesterol, um resíduo ou derivado de aminoácido, ou outro grupo de saída farmaceuticamente aceitável que é capaz de proporcionar H ou fosfato quando administrado in vivo; X é 0, S[0]n f CH 2, CHOH, CH-alquilo, CH-alcenilo, CH-alcinilo, C-dialquilo, CH-O-alquilo, CH-O-alcenilo, CH-O-alcinilo, CH-S-alquilo, CH-S-alcenilo, CH-S-alcinilo, NH, N-alquilo, N-alcenilo, N-alcinilo, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo, SCH-halogéneo ou C-(halogéneo)2? em que alquilo, alcenilo ou alcinilo pode ser opcionalmente substituído; n é 0 - 2; cada R3' é, independentemente, H; alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo), -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -OH, -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido, ciano, N02, -S(alquilo), -S(alcenilo) , -S(alcinilo), NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), -NH(acilo), ou -N(acilo)2; e A base é definida como acima para as fórmulas (A)-(G); e, de um modo preferido, é uma Base como definido pelas estruturas (i)-(xi) acima. 41

Numa forma de realização, o R3' é um alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido ou ciano. Numa forma de realização particular, R3' é um alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3. Ainda noutra forma de realização particularmente preferida, R3' é CH3 ou CF3.

Numa forma de realização, cada R, o * * R2 e R3 é, independentemente, H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato. Noutra forma de realização, cada R, R2* e R3* é, independentemente, H. Ainda noutra forma de realização, cada R, R2* e R3* é, independentemente, H, acilo ou um resíduo acilo de aminoácido. Numa forma de realizaçao, X é 0 ou S. Noutra forma de realização, X é 0.

Os nucleósidos beta-D- e beta-L- desta invenção pertencem a uma classe de agentes anti-pestivírus, anti-flavivírus e anti-HCV que inibem a polimerase virai. Os nucleósidos de trifosfato podem ser avaliados para a sua capacidade para inibir a polimerase virai de HCV, flavivírus ou pestivírus, in vitro, de acordo com os métodos de avaliação estabelecidos acima. A Chiron Corporation desenvolveu um sistema de replicão, para testar potenciais compostos anti-HCV, que utiliza uma sequência peptídica particular com um local de reconhecimento da protease de HCV (documentos U.S. 6436666; U.S. 6416946; U.S. 6416944; U.S. 6379886; e U.S. 6326151, da Chiron Corporation). Outros sistemas para avaliar a capacidade dos compostos para inibir o HCV e vírus relacionados, incluem aqueles do Rice (ver documento 42 U.S. 5874565) e o ensaio de inibição da polimerase do Dr. Ralf Bartenschlager (ver documento EP 1043399 A2) .

Um meio alternativo para avaliar a capacidade de um composto para inibir o HCV, pestivírus e/ou flavivírus é através da utilização de sistemas de modelo animal passíveis de previsão. O modelo de escolha que tem sido utilizado pelos requerentes para testar o HCV é o chimpanzé, . Os chimpanzés proporcionam um excelente sistema baseado em mamíferos para estudar os compostos anti-HCV e ter uma visão da capacidade de previsão ou não da actividade do fármaco baseada na proximidade da sua relação de espécie com os humanos. O composto activo da presente invenção pode ser administrado em passos combinados, alternados ou sequenciais com outro agente anti-HCV. Na terapia de combinação, as dosagens eficazes de dois ou mais agentes são administradas simultaneamente, enquanto na terapia de passos alternados ou sequenciais, é administrada uma dosagem eficaz de cada dos agentes em série ou sequencialmente. As dosagens dadas irão depender das taxas de absorção, inactivação e excreção do fármaco, bem como de outros factores conhecidos pelos especialistas na técnica. É para ser entendido que os valores de dosagem irão também variar com a gravidade da patologia a ser aliviada. É para ser também entendido que para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem e calendários específicos, deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com as necessidades individuais e as considerações profissionais da pessoa que está a administrar ou supervisionar a administração das composições. 43

Em particular, a presente invenção proporciona o seguinte: a) um composto beta-D- ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV) ou um sal farmaceuticamente aceitável ou pró-fármaco do mesmo; b) uma composição farmacêutica compreendendo um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, opcionalmente em conjunto com um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; c) uma composição farmacêutica compreendendo um composto beta-D ou beta-L-nucleósido de Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável; d) uma composição farmacêutica para o tratamento ou profilaxia de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro, especialmente um hospedeiro a quem foi diagnosticado ter ou em risco de vir a ter tal infecção, compreendendo um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, em conjunto com um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável; e) uma formulação farmacêutica compreendendo o composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, em conjunto com um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; 44 f) um método para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro, compreendendo um composto beta-D ou beta-L-nucleósido de Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, opcionalmente com um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; g) um método para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; h) um método para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; i) um método para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente com um 45 veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; j) um método para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; k) utilização de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, opcionalmente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus ou HCV num hospedeiro; l) utilização de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes, opcionalmente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus e/ou HCV num hospedeiro; m) utilização de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, opcionalmente com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção por pestivírus, flavivírus e/ou HCV num hospedeiro; 46 n) utilização de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, com um ou mais de outros agentes antivirais eficazes e, opcionalmente, com um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção por pestivirus, flavivirus e/ou HCV num hospedeiro; o) um composto beta-D ou beta-L-nucleósido de Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, substancialmente na ausência de enantiómeros do nucleósido descrito ou, substancialmente isolado a partir de outras entidades químicas; p) um processo para a preparação de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, como proporcionado em maior detalhe abaixo; e q) um processo para a preparação de um composto beta-D ou beta-L-nucleósido da Fórmula (I)-(IV), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, substancialmente na ausência de enantiómeros do nucleósido descrito ou substancialmente isolado a partir de outras entidades químicas. 0 composto activo pode ser administrado como qualquer sal ou profármaco que, após administração ao recipiente, é capaz de proporcionar, directamente ou indirectamente, o composto relacionado, ou que exibe, ele próprio, actividade. Os exemplos não limitativos são os sais farmaceuticamente aceitáveis que são referidos, de uma forma alternativa, como "sais fisiologicamente aceitáveis" e um composto que foi alquilado ou acilado na posição 5' ou na base purina ou pirimidina, formando, deste modo, um tipo de "profármaco farmaceuticamente aceitável". Além disso, as modificações podem afectar a actividade fisiológica do composto, em alguns casos aumentando a actividade relativamente ao composto relacionado. Isto pode ser facilmente avaliado por preparação do sal ou profármaco e testada a sua actividade antiviral de acordo com os métodos aqui descritos ou outros métodos conhecidos pelos especialistas na técnica.

Estereoquimica É apreciado que os nucleósidos da presente invenção têm vários centros quirais e podem existir e ser isolados em formas opticamente activas e racémicas. Alguns compostos podem exibir polimorfismo. É para ser entendido que a presente invenção abrange qualquer forma racémica, opticamente-activa, diastereomérica, polimórfica ou estereoisomérica ou as suas misturas, de um composto da invenção, que possui as propriedades úteis aqui descritas. É bem conhecido na técnica como preparer formas opticamente activas (por exemplo, por resolução da forma racémica através de técnicas de recristalização, através da síntese a partir de materiais de partida opticamente activos, através da síntese quiral ou através da separação cromatográfica utilizando uma fase estacionária quiral). São conhecidos na técnica, exemplos dos métodos para obter materiais opticamente activos e incluem, pelo menos, os seguintes. 48 i) separação física dos cristais - uma técnica em que os cristais macroscópicos dos enantiómeros individuais são separados manualmente. Esta técnica pode ser utilizada se existem os cristais dos enantiómeros separados, i. e., o material é um conglomerado e os cristais são visualmente distintos; ii) cristalização simultânea - uma técnica em que os enantiómeros individuais são cristalizados em separado a partir de uma solução do racemato, apenas possível se este último for um conglomerado no estado sólido; iii) resoluções enzimáticas - uma técnica através da qual se verifica a separação parcial ou completa de um racemato por virtude das taxas de reacção diferentes para os enantiómeros com uma enzima; iv) síntese assimétrica enzimática - uma técnica sintética através da qual, pelo menos um passo da síntese utiliza uma reacção enzimática para obter um precursor sintético enantiomericamente puro ou enriquecido do enantiómero desejado; v) síntese assimétrica química uma técnica sintética através da qual o enantiómero desejado é sintetizado a partir de um precursor aquiral sob condições que produzem assimetria (i. e., quiralidade) no produto que pode ser alcançada utilizando catalisadores quirais ou auxiliares qu i r a i s; vi) separações diastereoméricas - uma técnica através da qual um composto racémico é feito reagir com um reagente 49 enantiomericamente puro (o auxiliar quiral) que converte os enantiómeros individuais em diastereómeros. Os diastereómeros resultantes são depois separados por cromatografia ou cristalização em virtude das suas diferenças estruturais agora mais distintas e o auxiliar quiral mais tarde removido para obter o enantiómero desejado; vii) transformações assimétricas de primeira e segunda ordem - uma técnica através da qual os diastereómeros do racemato equilibram para proporcionar uma preponderância em solução do diastereómero a partir do enantiómero desejado ou onde a cristalização preferida do diastereómero a partir do enantiómero desejado perturba o equilíbrio, tal que, eventualmente em princípio, todo o material é convertido no diastereómero cristalino a partir do enantiómero desejado. 0 enantiómero desejado é, depois, libertado do diastereómero; viii) resoluções cinéticas - esta técnica refere-se ao alcançar da resolução parcial ou completa de um racemato (ou de outra resolução de um composto parcialmente resolvido) em virtude de taxas de reacção desiguais dos enantiómeros com um reagente ou catalisador quiral, não racémico, sob condições cinéticas; ix) síntese enantiospecífica a partir dos precursores não-racémicos - uma técnica de síntese através da qual é obtido o enantiómero desejado através dos materiais de partida não quirais e onde a integridade estereoquímica não é ou é apenas minimamente comprometida ao longo da síntese; 50 x) cromatografia líquida quiral - uma técnica através da qual os enantiómeros de um racemato são separados numa fase móvel líquida em virtude das suas interacções diferentes com uma fase estacionária. A fase estacionária pode ser feita de material quiral ou a fase móvel pode conter um material quiral adicional para provocar as interacções diferentes; xi) cromatografia gasosa quiral - uma técnica através da qual o racemato é volatilizado e os enantiómeros são separados em virtude das suas interacções diferentes na fase móvel gasosa com uma coluna contendo uma fase adsorvente fixa quiral não racémica; xii) extracção com solventes quirais - uma técnica através da qual os enantiómeros são separados em virtude da dissolução preferida de um enantiómero num solvente quiral particular; xiii) transporte através de membranas quirais - uma técnica através da qual um racemato é colocado em contacto com uma barreira de membrana fina. A barreira separa, tipicamente, dois fluidos miscíveis, um contendo o racemato e uma força motriz, tal como o diferencial de concentração ou pressão provoca o transporte preferido através da barreira membranar. A separação ocorre como um resultado da natureza quiral não racémica da membrana que permite que passe apenas um enantiómero do racemato através dela. 51

Definições 0 termo "alquilo", como aqui utilizado, a menos que indicado de outra forma, refere-se a um hidrocarboneto linear, ramificado, saturado ou terciário de, tipicamente, metilo, trifluorometilo, ciclopropilo, butilo, ciclopentilo, isopentilo, cíclico, primário, secundário ou Ci a Cio, e especif icamente inclui etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, neopentilo, hexilo, iso-hexilo, ciclo-hexilo, ciclo-hexilmetilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetibutilo e 2,3-dimetilbutilo. 0 termo inclui grupos alquilo substituídos e não substituídos. As porções com as quais o grupo alquilo pode ser substituído com um ou mais substituintes são seleccionadas do grupo consistindo de halo, incluindo Cl, F, Br e I de modo a formar, por exemplo, CF3, 2-Br-etilo, CH2F, CH2C1, CH2CF3 ou CF2CF3; hidroxilo, por exemplo CH2OH; amino, por exemplo, CH2NH2, CH2NHCH3 ou CH2N(CH3)2; carboxilato; carboxamido; alquilamino; arilamino; alcoxilo; ariloxilo; nitro; azido, por exemplo, CH2N3; ciano, por exemplo, CH2CN; tiol; ácido sulfónico; sulfato; ácido fosfónico; fosfato e fosfonato, não protegido ou protegido consoante necessário, conhecido pelos especialistas na técnica, por exemplo, como ensinado em Greene et al., Protective Groups em Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição (1991), aqui incorporado por referência. 0 termo "alquilo inferior", como aqui utilizado, a menos que indicado de outra forma, refere-se a um grupo alquilo linear, ramificado saturado de C3 a C6 ou, se apropriado, cíclico, como no ciclopropilo, por exemplo, grupo alquilo, incluindo ambas as formas substituídas e não substituídas. A menos que indicado de outro modo, neste pedido, quando alquilo é uma porção adequada, 52 é preferido o alquilo inferior. De um modo semelhante, quando alquilo ou alquilo inferior é uma porção adequada, é preferido o alquilo ou alquilo inferior não substituído.

Os termos "alquilamino" e "arilamino" referem-se a um grupo amino que tem um ou dois substituintes alquilo ou arilo, respectivamente. 0 termo "protegido", como aqui utilizado e, a a menos que indicado de outro modo, refere-se a um grupo que é adicionado a um átomo de oxigénio, azoto ou fósforo para prevenir a sua futura reacção ou com outros objectivos. São conhecidos vários grupos de oxigénio e azoto pelos especialistas na técnica da síntese orgânica. 0 termo "arilo", como aqui utilizado e, a não ser que seja especificado de outro modo, refere-se a fenilo, bifenilo ou naftilo e, de um modo preferido, fenilo. 0 termo inclui ambas as porções substituídas e não substituídas. 0 grupo arilo pode ser substituído com uma ou mais porções seleccionadas do grupo consistindo de alquilo, hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxilo, ariloxilo, nitro, ciano, tio, alquiltio, carboxamido, carboxilato, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato ou fosfonato, protegido ou não protegido consoante necessário, como conhecido pelos especialistas na técnica, por exemplo, como ensinado em Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição (1991), aqui incorporado por referência.

Os termos "alcarilo" e "alquilarilo" referem-se a um grupo alquilo com um substituinte arilo. 53

Os termos "aralquilo" e "arilalquilo" referem-se a um qrupo arilo com um substituinte alquilo. 0 termo "halo", como aqui utilizado, inclui bromo, cloro, iodo e fluoro. 0 termo base purina inclui, mas não está limitado a, adenina, bases 2-azapurina que são imidazo-triazinas opcionalmente substituídas, imidazo-piridazinas, pirrolo-piridazinas, pirrolo-triazinas, triazolo-triazinas, incluindo triazolo[4,5-d]triazinas, pirazolo-triazinas, incluindo pirazolo[4,5-d]triazinas, N6-alquilpurinas, N6-acilpurinas (em que acilo é C(0) (alquilo, arilo, alquilarilo ou arilalquilo), N6-benzilpurina, N6-halopurina, N6-vinilpurina, purina N6-acetilénica, N6-acilpurina, N6-hidroxialquilpurina, N6-tioalquilpurina, N2-alquilpurinas, N2-alquil-6-tiopurinas, C5-hidroxialquilpurina, N2-alquilpurinas, N2-alquil-6-tiopurinas, triazolopiridinilo, imidazolopiridinilo, pirrolopirimidinilo e pirazolopirimidinilo. A Base pode ser seleccionada do grupo consistindo de:

54 e

w

0 termo "acilo" refere-se a um éster do ácido carboxílico, no qual a porção não-carbonilo do grupo éster é seleccionado de alquilo ou alquilo inferior linear, ramificado ou cíclico; alcoxialquilo, incluindo metoximetilo; aralquilo incluindo benzilo; ariloxialquilo, tal como fenoximetilo; arilo incluindo fenilo opcionalmente substituído com halogéneo, alquiloCi-C6 ou alcoxiloCi-C6; ésteres de sulfonato, tais como alquilo ou aralquilsulfonilo incluindo metanossulfonilo; o éster de mono-, di- ou trifosfato; tritilo ou monometoxitritilo; benzilo substituído; trialquilsililo como, por exemplo, dimetil-t-butilsililo ou difenilmetilsililo. Os grupos arilo nos ésteres compreendem, de um modo óptimo, um grupo fenilo. 0 termo "acilo inferior" refere-se a um grupo acilo no qual a porção não-carbonilo é alquilo inferior.

Como aqui utilizado, os termos "substancialmente livre de" e "substancialmente na ausência de", refere-se a uma composição de 55 nucleósido que inclui, pelo menos, 85-90% em peso, de um modo preferido, 95%-98% em peso e, de um modo ainda mais preferido, 99%-100% em peso, do enantiómero designado desse nucleósido. Numa forma de realização preferida, os compostos resumidos nos métodos e os compostos desta invenção, são substancialmente livres de enantiómeros, outros que não para aquele designado.

De um modo semelhante, o termo "isolado" refere-se a uma composição de nucleósido que inclui, pelo menos, 85%-90% em peso, de um modo preferido, 95%-98% em peso e, de um modo ainda mais preferido, 99%—100% em peso, do nucleósido, o restante compreendendo outras espécies químicas ou enantiómeros. O termo "independentemente" é aqui utilizado para indicar que é aplicada uma variável em qualquer altura sem considerar a presença ou ausência de uma variável com a mesma ou outra definição no mesmo composto. Assim, num composto no qual R' ' aparece duas vezes e é definido como, independentemente, "carbono ou azoto" ambos os R' ' podem ser carbono, ambos os R' ' podem ser azoto ou um R' ' pode ser carbono e o outro pode ser azoto. O termo "hospedeiro", como aqui utilizado, refere-se a um organismo unicelular ou multicelular, no qual o vírus se pode replicar, incluindo linhas celulares e animais e, de um modo preferido, um humano. Alternativamente, o hospedeiro pode transportar uma parte do genoma do flavivírus ou pestivírus, cuja replicação ou função pode ser alterada pelos compostos da presente invenção. O termo hospedeiro refere-se especificamente a células infectadas, células transfectadas com todo ou parte do genoma do flavivírus ou pestivírus e animais, em particular, primatas (incluindo chimpanzés) e humanos. Na maioria das 56 aplicações animais da presente invenção, o hospedeiro é um doente humano. As aplicações veterinárias, em determinadas indicações, no entanto, são claramente antecipadas pela presente invenção, tal como nos chimpanzés. 0 termo "sal ou profármaco farmaceuticamente aceitável" é utilizado ao longo da descrição para descrever qualquer forma farmaceuticamente aceitável (éster, éster de fosfato, sal de um éster ou um grupo relacionado) de um composto nucleósido, que, após administração num doente, proporciona o composto nucleósido. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos e bases orgânicos e inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais adequados incluem aqueles derivados de metais alcalinos, tais como potássio e sódio, metais alcalino-terrosos, tais como cálcio e magnésio, entre vários outros ácidos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Os profármacos farmaceuticamente aceitáveis referem-se a um composto que é metabolizado, por exemplo, hidrolisado ou oxidado, no hospedeiro para formar o composto da presente invenção. Exemplos típicos de profármacos incluem compostos que têm grupos de protecção biologicamente variáveis numa porção funcional do composto activo. Os profármacos incluem compostos que podem ser oxidados, reduzidos, aminados, desaminados, hidroxilados, desidroxilados, hidrolisados, desidrolisados, alquilados, desalquilados, acilados, desacilados, fosforilados, desfosforilados para produzir o composto activo. Os compostos desta invenção possuem actividade antiviral contra flavivírus, pestivírus ou HCV, ou são metabolizados num composto que exibe tal actividade. 57

Formulações de Profármaco de Nucleósido

Qualquer um dos nucleósidos aqui descritos pode ser administrado como um profármaco nucleótido para aumentar a actividade, biodisponibilidade, estabilidade ou, de outro modo, alterar as propriedades do nucleósido. São conhecidos ligandos de vários profármacos nucleótidos. Em geral, a alquilação, acilação ou outras modificações lipofílicas do mono-, di- ou trifosfato do nucleósido reduzem a polaridade e permitem a passagem para as células. Exemplos dos grupos substituintes que podem substituir um ou mais hidrogénios na porção fosfato são alquilo, arilo, esteróides, hidratos de carbono, incluindo açúcares, 1,2-diacilglicerol, álcoois, acilo (incluindo acilo inferior); alquilo (incluindo alquilo inferior); éster de sulfonato, incluindo alquilo ou arilalquilsulfonilo, incluindo metanossulfonilo e benzilo, em que o grupo fenilo é opcionalmente substituído com um ou mais substituintes como proporcionado na definição aqui apresentada de um arilo; arilsulfonilo opcionalmente substituído; um lípido, incluindo um fosfolípido; um resíduo ou derivado de aminoácido; um hidrato de carbono; um péptido; colesterol; ou outro grupo de saída farmaceuticamente aceitável que, quando administrado in vivo, proporciona um composto em que R1 é, independentemente, H ou fosfato. São descritos muitos mais em R. Jones e N. Bischoferger, Antiviral Research, 1995, 27:1-17. Qualquer um destes pode ser utilizado em combinação com os nucleósidos divulgados para alcançar um efeito desejado.

Nos casos em que os compostos são suficientemente básicos ou ácidos para formar sais de ácido ou base não tóxicos estáveis, pode ser apropriada a administração do composto como um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente 58 aceitáveis são sais de adição de ácidos orgânicos formados com ácidos, que formam um anião fisiologicamente aceitável, por exemplo, tosilato, metanossulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, α-cetoglutarato e a-glicerofosfato. Podem também ser formados sais inorgânicos adequados, incluindo sais de sulfato, nitrato, bicarbonato e carbonato.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos utilizando processos convencionais bem conhecidos na técnica, por exemplo, fazendo reagir um composto suficientemente básico, tal como uma amina, com um ácido adequado, proporcionando um anião fisiologicamente aceitável. Podem ser também preparados sais de metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio ou lítio) ou metal alcalino terroso (por exemplo, cálcio) de ácidos carboxilicos. 0 nucleósido activo pode também ser proporcionado como um 5'-fosfoéter lipídico ou um lípido 5'-éter, como divulgado nas seguintes referências que são aqui incorporados por referência: Kucera, L.S., N. Iyer, E. Leake, A. Raen, Modest E.K., D.L.W., e C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation." AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. Iyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi e E.J. Modest. 1991.

Os exemplos não limitativos das patentes U.S. que divulgam substituintes lipofílicos adequados que podem ser covalentemente incorporados no nucleósido, de um modo preferido, na posição 59 5'-OH do nucleósido ou preparações lipofílicas, incluem as Patentes U.S. N° 5149794 (22 de Setembro de 1992, Yatvin et al. ) ; 5194654 (Mar. 16, 1993, Hostetler et al. e 5223263 (29 de Junho de 1993, Hostetler et al.); todas as quais estão aqui incorporadas por referência. Os pedidos de patente estrangeiras que divulgam substituintes lipofilicos que podem ser ligados aos nucleósidos da presente invenção ou preparações lipofílicas incluem os documentos WO 89/02733, W0 90/00555, W0 91/16920, W0 91/18914, W0 93/00910, W0 94/26273, W0 96/15132, EP 0350287, EP 939170544 e W0 91/19721.

Terapia de Combinação e Alternada

Tem sido reconhecido que as variantes de HCV resistentes a fármacos podem emergir após tratamento prolongado com um agente antiviral. A resistência a fármaco ocorrer tipicamente por mutação de um gene que codifica uma enzima utilizada na replicação virai. A eficácia de um fármaco contra a infecção por HCV pode ser prolongada, aumentada ou restaurada por administração do composto em combinação ou alternado com um segundo e, talvez terceiro, composto antiviral que induz uma mutação diferente da provocada pelo fármaco inicial. Alternativamente, as farmacocinéticas, biodistribuição ou outros parâmetros do fármaco podem ser alterados por tal terapia de combinação ou alternada. Em geral, a terapia de combinação é, tipicamente, preferida relativamente à terapia alternada porque induz stresses múltiplos, em simultâneo, sobre o vírus.

Qualquer dos tratamentos para o HCV, descritos nos Antecedentes da Invenção, pode ser utilizado em combinação ou 60 alternados com os compostos descritos neste pedido. Os exemplos não limitativos incluem: (1) Interferao

Os interferões (IFN) são compostos que estão disponíveis comercialmente para o tratamento de hepatites crónicas há já perto de uma década. Os IFN são glicoproteínas produzidas por células imunitárias em resposta a infecção virai. Os IFN inibem a replicação virai de muitos vírus, incluindo o HCV e quando utilizado como um tratamento isolado para a infecção por hepatite C, o IFN suprime o HCV-RNA no soro para níveis indetectáveis. Adicionalmente, o IFN normaliza os níveis de aminotransferase no soro. Infelizmente, os efeitos do IFN são temporários e uma resposta sustida ocorre em apenas 8%-9% dos doentes infectados cronicamente com HCV (Gary L. Davis.

Gastroenterology 118 : S104-S114, 2000). Várias patentes divulgam tratamentos para o HCV utilizando terapias baseadas em interferao. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5980884 de Blatt et al. divulga métodos para o re-tratamento de doentes infectados com HCV, utilizando interferão de consenso. A Patente U.S. N° 5942223 de Bazer et al. divulga uma terapia anti-HCV utilizando interferão-tau de ovino ou bovino. A Patente U.S. N° 5928636 de Alber et al. divulga uma terapia de combinação de interleucina-12 e interferão alfa para o tratamento de doenças infecciosas incluindo HCV. A Patente U.S. N° 5908621 de Glue et al. divulga a utilização de interferão modificado com polietilenoglicol para o tratamento de HCV. A Patente U.S. N° 5849696 de Chretien et al. divulga a utilização de timosinas, individualmente ou em combinação com interferão, 61 para o tratamento de HCV. A Patente U.S. N° 5830455 de Valtuena et al. divulga uma combinação da terapia de HCV empregando interferão e um captador de radicais livres. A Patente U.S. N° 5738845 de Imakawa, divulga a utilização de proteínas tau do interferão humano para o tratamento de HCV. São divulgados outros tratamentos baseados em interferão para HCV na Patente U.S. N° 5676942 de Testa et al., Patente U.S. N° 5372808 de Blatt et al. e Patente U.S. N° 5849696. (2) Ribavirina (Battaglia, A.M. et ai., Ann. Pharmacother, 2000,. 34, 487-494); Berenguer, M. et al. Antivir. Ther., 1998, 3 (Supl. 3), 125-136). A ribavirina (Ι-β-D-ribofuranosil-1-1,2,4-triazole-3-carboxamida) é um análogo nucleósido antiviral de amplo espectro indutor de não interferão sintético. É comercializado sob o nome comercial Virazole™ (The Merck Index, 11a edição, Editor: Budavari, S., Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, pl304, 1989); Rebetol (Schering Plough) e Co-Pegasus (Roche) . A Patente dos Estados Unidos N° 3798209 e RE29835 (ICN Pharmaceuticals) divulga e reivindica a ribavirina. A ribavirina é estruturalmente semelhante à guanosina e tem uma actividade in vitro contra vários vírus de ADN e ARN incluindo Flaviviridae (Gary L. Davis. Gastroenterology 118: S104-S114, 2000). A Patente U.S. N° 4211771 (da ICN Pharmaceuticals) divulga a utilização de ribavirina como um agente antiviral. A ribavirina reduz os níveis de amino transferase no soro para os níveis normais em 40% dos doentes, mas não reduz os níveis de ARN de HCV no soro (Gary L. Davis. Gastroenterology 118:S104-S114, 2000). Assim, a ribavirina individualmente não é eficaz na redução dos níveis de ARN virai. Adicionalmente, a ribavirina tem uma toxicidade significativa e é conhecida por induzir anemia. 62

Combinação de Interferão e Ribavirina A Schering-Plough vende ribavirina como cápsulas Rebetol® (200 mg) para administração a doentes com HCV. A FDA dos EUA aprovou as cápsulas de Rebetol para tratar infecção crónica de HCV em combinação com produtos de alpha interferão-2b da Schering, Intron® A e PEG-Intron™. As cápsulas de Rebetol não estão aprovadas para monoterapia (i. e., administração independente de Intron®A ou PEG-Intron), apesar do Intron A e PEG-Intron estejam aprovados para monoterapia (i. e., administração sem ribavirina). A Hoffman La Roche está a vender ribavirina com o nome Co-Pegasus na Europa e nos Estados Unidos, também para utilização em combinação com o interferão para o tratamento de HCV. Outros produtos de interferão alfa incluem Roferon-A (Hoffmann-La Roche), Infergen® (Intermune, anteriormente um produto de Amgen) e Wellferon® (Wellcome Foundation) estão aprovados actualmente pela FDA para a monoterapia de HCV. Os produtos de interferão actualmente em desenvolvimento para HCV incluem: Roferon-A (interferão alfa-2a) pela Roche, PEGASYS (interferão alfa-2a peguilado) pela Roche, INFERGEN (interferão alfacon-1) pela InterMune, OMNIFERON (interferão natural) pela Viragen, ALBUFERON pela Human Genome Sciences, REBIF (interferão beta-la) pela Ares-Serono, Omega Interferão pela BioMedicine, Oral Interferon Alpha pela Amarillo Biosciences e Interferão gama-lb pela InterMune. A combinação do IFN e ribavirina para o tratamento da infecção por HCV tem sido referida como eficaz no tratamento de doentes naive a IFN (por exemplo, Battaglia, A.M. et al., Ann. Pharmacother. 34:487-494, 2000). O tratamento de combinação é eficaz antes do desenvolvimento da hepatite e quando a doença histológica está presente (por exemplo, Berenguer, M. et al. 63

Antivir. Ther. 3 (Supl. 3):125-136, 1998). Actualmente, a terapia mais eficaz para HCV é a terapia de combinação de interferão peguilado com ribavirina (2002 NIH Consensos Development Conference on the Management of Hepatitis C) . No entanto, os efeitos secundários da terapia de combinação podem ser significativos e incluem hemólise, sintomas semelhantes à gripe, anemia e fadiga (Gary L. Davis. Gastroenterology 118:S104-S114, 2000). (3) Os inibidores da Protease têm sido desenvolvidos para o tratamento de infecções por Flaviviridae. Exemplos incluem, mas não estão limitados aos seguintes

Os inibidores da protease NS3 baseadas no substrato (ver, por exemplo, Attwood et al., Antiviral peptide derivatives, documento PCT WO 98/22496, 1998; Attwood et al., Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1999, 10, 259-273; Attwood et al., Preparation and use of amino acid derivatives as anti-viral agents, Patente Pub. Alemã DE 19914474; Tung et al. Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3 protease, documento PCT WO 98/17679), incluindo alfacetoamidas e hidrazinoureias e inibidores que terminam num electrófilo, tais como ácido borónico ou fosfonato (ver, por exemplo, Llinas-Brunet et al., Hepatitis C inhibitor peptide analogues, documento PCT WO 99/07734);

Os inibidores não baseados no substrato, tal como derivados 2,4,6-tri-hidroxi-3-nitro-benzamida (ver, por exemplo, Sudo K. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 238, 643-647; Sudo K. et al. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 1998, 9, 186), incluindo RD3-4082 e RD3-4078, o 64 último substituído na amida com uma cadeia de 14 carbonos e o uútimo processando um grupo para-íenoxifenilo;

As fenantrenoquinonas possuindo actividade contra a protease, por exemplo, num ensaio de SDS-PAGE e/ou autorradiografia, tal como, por exemplo, Sch 68631, isolado do caldo de cultura de fermentação de Streptomyces sp., (ver, por exemplo, Chu M. et ai., Tetrahedron Letters, 1996, 37, 7229-7232) e Sch 351633, isolado de fungus Penicillium griseofulvum que demonstram actividade num ensaio de proximidade de cintilação (ver, por exemplo, Chu M. et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9, 1949-1952); e

Inibidores selectivos de NS3, por exemplo, baseados na macromolécula elgin c, isolada de sanguessuga (ver, por exemplo, Qasim M.A. et al., Biochemistry, 1997, 36, 1598-1607). A potência nanomolar contra a enzima protease NS3 de HCV tem sido conseguida pela concepção de inibidores selectivos baseados na macromolécula eglin c. A eglin c, isolada da sanguessuga é um potente inibidor de várias proteases da serina, tais como proteases S. griseus A e B, α-quimotripsina, quimase e subtilisina. Várias patentes U.S. divulgam inibidores da protease para o tratamento de HCV. Os exemplos não limitativos incluem, mas não estão limitados aos seguintes. A Patente U.S. N° 6004933 de Spruce et al. divulga uma classe de inibidores da protease cisteína para a inibição da endopeptidase de HCV. A Patente U.S. N° 5990276 de Zhang et al. divulga inibidores sintéticos da protease NS3 do vírus da hepatite C. O inibidor é uma consequência de um substrato da protease NS3 ou um substrato do cofactor NS4A. A utilização das enzimas de restrição para tratar 65 HCV é divulgada na Patente U.S. N° 5538865 de Reyes et al. Os Péptidos como inibidores da protease da serina NS3 do HCV são divulgados no documento WO 02/008251 de Corvas International, Inc e WO 02/08187 e WO 02/008256 da Schering Corporation. Os tripéptidos inibidores de HCV são divulgados nas Patentes US N° 6534523, 6410531 e 6420380 da Boehringer Ingelheim e documento WO 02/060926 da Bristol Myers Squibb. Os péptidos de diarilo como inibidores da protease da serina NS3 de HCV são divulgados no documento WO 02/48172 da Schering Corporation. As Imidazoleidinonas como inibidores da protease da serina NS3 de HCV são reveladas no documento WO 02/08198 da Schering Corporation e documento WO 02/48157 da Bristol Myers Squibb. O documento WO 98/17679 da Vertex Pharmaceuticals e documento WO 02/48116 da Bristol Myers Squibb também divulgam inibidores da protease de HCV. (4) Derivados de tiazolidina, por exemplo, que mostram inibição relevante num ensaio de HPLC de fase reversa com uma proteína de fusão NS3/4A e substrato NS5A/5B (ver, por exemplo, Sudo K. et al., Antiviral Research, 1996, 32, 9-18), especialmente o composto RD-1-6250, possuindo uma porção cinamoílo fundida substituída com uma cadeia alquilo longa, RD4 6205 e RD4 6193; (5) Tiazolidinas e benzanilidas, por exemplo, como identificado em Kakiuchi N. et al. J. EBS Letters 421, 217-220; Takeshita N. et al. Analytical Biochemistry, 1997, 247, 242-246; (6) Inibidores da helicase (ver, por exemplo, Diana G.D. et ai., Compounds, compositions and methods for treatment of hepatitis C, Pat. U.S. N° 5633358; Diana G.D. et al., 66

Piperidine derivatives, pharmaceutical compositions thereof and their use in the treatment of hepatitis C, documento PCT WO 97/36554); (7) Inibidores da polimerase, tais como i) análogos dos nucleótidos, tais como gliotoxina (ver, por exemplo, Ferrari R. et al. Journal of Virology, 1999, 73, 1649-1654); ii) o produto natural cerulenina (ver, por exemplo, Lohmann V. et al., Virology, 1998, 249, 108-118); e iii) inibidores da polimerase não-nucleósido, incluindo, por exemplo, o composto R803 (ver, por exemplo, os documentos WO 04/018463 A2 e WO 03/040112 Al, ambos da Rigel Pharmaceuticals, Inc.); diaminopirimidinas substituídas (ver, por exemplo, o documento WO 03/063794 A2 da Rigel Pharmaceuticals, Inc.); derivados benzimidazole (ver, por exemplo, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14:119-124 e Bioorg.

Med Chem. Lett., 2004, 14:967-971, ambos da

Boehringer Ingelheim Corporation); fenilalaninas N,N-dissubstituídas (ver, por exemplo, J. Biol. Chem., 2003, 278:9495-98 e J. Med. Chem., 2003, 13:1283-85, ambas da Shire Biochem, Inc.); ácidos tiofeno-2-carboxílico substituídos (ver, por exemplo, Bioorg. Med Chem. Lett., 2004, 14:793-796 e Bioorg.

Med Chem. Lett., 2004, 14:797-800, ambos da Shire

Biochem, Inc.); a,γ-dicetoácidos (ver, por exemplo, J. Med. Chem., 2004, 14-17 e documento WO 00/006529

Al, ambos da Merck & Co., Inc.); e derivados do ácido 67 mecónico (ver, por exemplo, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 3257-3261, documentos WO 02/006246 AI e W003/062211 Al, todos da IRBM Merck & Co., Inc.); (8) Fosforotioato e oligodesoxinucleótidos anti-sentido (S-ODN) complementares, por exemplo, aos intervalos das sequências na região não codificada 5' (NCR) do vírus (ver, por exemplo, Alt M. et al., Hepatology, 1995, 22, 707-717) ou de nucleótidos 326-348 compreendendo a extremidade 3' do NCR e nucleótidos 371-388 localizados na região codificada do núcleo do ARN de HCV (ver, por exemplo, Alt M. et al., Archives of Virology, 1997, 142, 589-599; Galderisi U. et al., Journal of Cellular Physiology, 1999, 181, 251-257). (9) Inibidores da tradução dependente de IRES (ver, por exemplo, Ikeda N et al., Agent for the prevention and treatment of hepatitis C, Pub. da Patente Japonesa JP-08268890; Kai Y. et al. Prevention and treatment of virai diseases, Pub. da Patente Japonesa JP-10101591). (10) Ribozimas resitentes a nuclease (ver, por exemplo, Maccjak, D. J. et al., Hepatology 1999, 30, resumo 995; Patente U.S. N° 6043077 da Barber et al. e Patente U.S. N° 5869253 e 5610054 de Draper et al.). (11) Análogos do nucleósido foram também desenvolvidos para o tratamento de infecções por Flaviviridae.

Idenix Pharmaceuticals, Ltd. divulga nucleósidos ramificados e a sua utilização no tratamento de HCV e flavivirus e pestivirus na Publicação das Patentes US N° 2003/0050229 Al, 68 2004/0097461 Al, 2004/0101535 Al, 2003/0060400 Al, 2004/0102414 Al, 2004/0097462 Al e 2004/0063622 Al que correspondem às Publicações Internacionais N° WO 01/90121 e WO 01/92282. Um método para o tratamento da infecção por hepatite C (e flavivírus e pestivírus) em humanos e outros animais hospedeiros é divulgado nas publicações Idenix que incluem administrar uma quantidade eficaz de nucleósidos β-D ou β-L 1', 2', 3' ou 4'-ramificados biologicamente activos ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco, administrado individualmente ou em combinação, opcionalmente num veiculo farmaceuticamente aceitável. Ver também a Publicação de Patente U.S. N° . 2004/0006002 e 2004/0006007, bem como os documentos WO 03/026589 e WO 03/026675. Idenix Pharmaceuticals, Ltd. divulga também, na Publicação da Patente US N° 2004/0077587, profármacos ramificados farmaceuticamente aceitáveis e a sua utilização no tratamento de HCV e flavivírus e pestivírus em profármacos. Ver também as Publicações PCT N° WO 04/002422, WO 04/002999 e WO 04/003000. Além disso, Idenix Pharmaceuticals, Ltd. divulga também, no documento WO 04/046331, mutações de Flaviviridae provocados por β-D ou β-L nucleósidos 2'-ramificados biologicamente activos ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou profármaco.

Biota Inc. divulga vários derivados fosfato de nucleósidos, incluindo β-D ou β-L nucleósidos 1', 2', 3' ou 4'-ramificados, para o tratamento da infecção por hepatite C na Publicação de Patente Internacional WO 03/072757.

A Emory University e a University of Georgia Research Foundation, Inc. (UGARF) divulgam a utilização de 2'-fluoronucleóidos para o tratamento de HCV na Patente US 69 Ν° 6348587. Ver também a Publicação de Patente US N° 2002/0198171 e Publicação de Patente Internacional WO 99/43691.

BioChem Pharma Inc. (agora Shire Biochem, Inc.) divulga a utilização de vários nucleósidos 1,3-dioxolano para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae na Patente US N° 6566365. Ver também as Patentes US N° 6340690 e 6605614; Publicações das Patentes US N° 2002/0099072 e 2003/0225037, bem como as Publicações Internacionais N° WO 01/32153 e WO 00/50424.

BioChem Pharma Inc. (agora Shire Biochem, Inc.) divulga também outros 2'-halo, 2'-hidroxi e 2'-alcoxilo nucleósidos para o tratamento de uma infecção por Flaviviridae, na Publicação da Patente US N° 2002/0019363, bem como na Publicação Internacional WO N° 01/60315 (PCT/CA01/00197; apresentada em 19 de Fevereiro de 2001). ICN Pharmaceuticals, Inc. divulga vários análogos de nucleósidos que são úteis na modulação da resposta imunitária nas Patentes US N° 6495677 e 6573248. Ver também documentos WO 98/16184, WO 01/68663 e WO 02/03997. A Patente US N° 6660721; Publicação das Patentes US N° 2003/083307 Al, 2003/008841 AI e 2004/0110718; bem como a Publicação das Patentes Internacionais N° WO 02/18404; WO 02/100415, WO 02/094289 e WO 04/043159; apresentada em nome de F. Hoffmann-La Roche AG, divulgam vários análogos de nucleósidos para o tratamento da replicação do ARN do HCV.

Pharmasset Limited divulga vários nucleósidos e antimetabolitos para o tratamento de vários vírus, incluindo Flaviviridae e, em particular, HCV, na Publicação das Patentes 70 US N° . 2003/0087873, 2 0 0 4/0067877, 2004/0082574, 2004/0067877 e 2002/00555483, bem como na Internacionais N° . WO 02/32920, WO 03/068162, WO 03/068164 e 2004/002479, 2003/0225029

Publicação das Patentes WO 01/79246, WO 02/48165, WO 2004/013298.

Merck & Co., Inc. e Isis Pharmaceuticals, divulgam na Publicação das Patentes US N° 2002/0147160, 2004/0072788, 2004/0067901 e 2004/0110717; bem como na Publicação da Patente Internacional correspondente N° WO 02/057425 (documento PCT/US02/01531; apresentada em 18 de Janeiro de 2002) e WO 02/057287 (PCT/US02/03086; apresentada em 18 de Janeiro de 2002) vários nucleósidos e, em particular vários nucleósidos pirrolopirimidina, para o tratamento de vírus cuja replicação está dependente da polimerase de ARN dependente de ARN, incluindo Flaviviridae e, em particular, HCV. Ver também os documentos WO 2004/000858, WO 2004/003138, WO 2004/007512 e WO 2004/009020. A Publicação da Patente US N° 2003/028013 AI bem como a Publicação das Patentes Internacionais N°. WO 03/051899, WO 03/061576, WO 03/062255 WO 03/062256, WO 03/062257 e WO 03/061385, apresentadas em nome da Ribapharm, são também direccionadas para a utilização de determinados análogos de nucleósidos para tratar o vírus da hepatite C. A Genelabs Technologies divulga, na Publicação da Patente US N° 2004/0063658, bem como na Publicação das Patentes Internacionais N° WO 03/093290 e WO 04/028481, vários derivados de nucleósidos modificados na base, incluindo β-D ou β-L nucleósidos 1', 2', 3' ou 4'-ramificados, para o tratamento da infecção por hepatite C. 71

Eldrup et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (27 de Abril de 2003, Savannah, Ga.) p. A75), descreveu a relação entre a actividade estrutural dos nucleósidos 2-modificados para a inibição de HCV.

Bhat et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (27 de Abril, 2003, Savannah, Ga.); p A75) descrevem a síntese e propriedades farmacocinéticas dos análogos de nucleósidos como possíveis inibidores da replicação do ARN de HCV. Os autores referiram que os nucleósidos 2'-modificados demonstraram uma actividade inibidora potente nos ensaios de replicação baseada em células.

Olsen et al. (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16th International Conference on Antiviral Research (27 de Abril de 2003, Savannah, Ga.) p A76) descrevem também os efeitos dos nucleósidos 2'-modificados na replicação do ARN de HCV. (12) Outros compostos variados incluindo 1-amino-alquilciclo-hexanos (por exemplo, Patente U.S. N° 6034134 de Gold et al.), alquil-lípidos (por exemplo, Pat. U.S. N° 5922757 de Chojkier et al.), vitamina E e outros antioxidantes (por exemplo, Pat. U.S. N° 5922757 de Chojkier et al.), esqualeno, amantadina, ácidos biliares (por exemplo, Pat. U.S. N° 5846964 de Ozeki et al.), ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico (por exemplo, Pat. U.S. N° 5830905 de Diana et al.), benzenodicarboxamidas (por exemplo, Pat. U.S. N° 5633388 de Diana et al.), derivados do ácido poliadenílico (por exemplo, Pat. U.S. N° 5496546 72 de Wang et al.), 2', 3'-didesoxiinosina (por exemplo, Pat. U.S. N° 5026687 de Yarchoan et al.), benzimidazoles (por exemplo, Pat. U.S. N° 5891874 de Colacino et al.), extractos de planta (por exemplo, Patente U.S. N° 5837257 de Tsai et al., Patente U.S. N° 5725859 de Omer et al. e Patente U.S. N° 6056961) e piperidinas (por exemplo, Patente U.S. N° 5830905 de Diana et al.). (13) Outros compostos actualmente em desenvolvimento clínico para o tratamento de vírus da hepatite C incluem, por exemplo: Interleucina-10 por Schering-Plough, IP-501 por Interneuron, Merimebodib VX-497 por Vertex, AMANTADINE® (Symmetrel) por Endo Labs Solvay, HEPTAZYME® por RPI, IDN-6556 por Idun Pharma., XTL-002 por XTL., HCV/MF59 por Chiron, CIVACIR® (Hepatitis C Immune Globulin) por NABI, LEVOVIRIN® por ICN/Ribapharm, VIRAMIDINE® por ICN/Ribapharm, ZADAXIN® (timosina alfa-1) por Sei Clone, interferão peguilado mais timosina por Sei Clone, CEPLENE® (dicloridreto de histamina) por Maxim, VX 950/LY 570310 por Vertex/Eli Lilly, ISIS 14803 por Isis Pharmaceutical/Elan, IDN-6556 por Idun Pharmaceuticals, Inc., JTK 003 por AKROS Pharma, BILN-2061 por Boehringer Ingelheim, CellCept (mofetilo de micofenolato) por Roche, T67, um inibidor da β-tubulina, por Tularik, uma vacina terapêutica direccionada para E2 por Innogenetics, FK788 por Fujisawa Healthcare, Inc., IdB 1016 (Siliphos, oral silibin-fosfatdilcolina fitosoma), inibidores da replicação do ARN (VP50406) por ViroPharma/Wyeth, vacina terapêutica por Intercell, vacina terapêutica por Epimmune/Genencor, inibidor da IRES por Anadys, ANA 245 e ANA 246 por Anadys, immunotherapy (Therapore) por Avant, inibidor da protease por Corvas/SChering, inibidor da helicase por Vertex, 73 inibidor da fusão por Trimeris, terapia com célula T por CellExSys, inibidor da polimerase por Biocryst, química de ARN alvo por PTC Therapeutics, Dication por Immtech, Int., inibidor da protease por Agouron, inibidor da protease por Chiron/Medivir, terapia anti-sentido por AVI BioPharma, terapia anti-sentido por Hybridon, hemopurificador por Aethlon Medicai, vacina terapêutica por Merix, inibidor da protease por Bristol-Myers Squibb/Axys, Chron-VacC, uma vacina terapêutica por Tripep, UT 231B por United Therapeutics, inibidores da protease, helicase e polimerase por Genelabs Technologies, inibidores da IRES por Immusol, R803 por Rigel Pharmaceuticals, INFERGEN® (interferão alphacon-1) por InterMune, OMNIFERON® (interferão natural) por Viragen, ALBUFERON® por Human Genome Sciences, REBIF® (interferão por beta-la) por Ares-Serono, Interferão Omega por BioMedicine, Interferão Alfa Oral por Amarillo Biosciences, interferão gama, interferão tau e Interferão gama-lb por InterMune.

Composições Farmacêuticas

Os hospedeiros, incluindo humanos, infectados com pestivírus, flavivírus, HCV ou outros organismos que se replicam através de polimerases virais de ARN dependentenes de ARN, podem ser tratados por administração ao doente de uma quantidade eficaz do composto activo ou um profármaco farmaceuticamente aceitável ou um seu sal na presença de um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os materiais activos podem ser administrados através de qualquer via apropriada, por exemplo, oralmente, parentericamente, intravenosamente, 74 intradermicamente, subcutaneamente ou topicamente, na forma líquida ou sólida.

Uma dose preferida do composto para pestivírus, flavivírus ou HCV estará na gama de cerca de 1 a 50 mg/kg, de um modo preferido, 1 a 20 mg/kg, de peso corporal por dia, de um modo mais geral, 0,1 a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal do recipiente por dia. A gama de dosagem eficaz dos sais farmaceuticamente aceitávis e profármacos pode ser calculada com base no peso do nucleósido relacionado a ser distribuído. Se o sal ou profármaco exibe actividade por si só próprio, a dosagem eficaz pode ser estimada como acima, utilizando o peso do sal ou profármaco, ou através de outros meios, pelos especialistas na técnica. O composto é administrado convenientemente em qualquer forma de dosagem unitária adequada, incluindo, mas não limitado a uma quantidade contendo 7 a 3000 mg ou 70 a 1400 mg de ingrediente activo por forma de dosagem unitária. Uma dosagem oral numa forma de realização é 50-1000 mg. Noutra forma de realização, a forma de dosagem contem 0,5-500 mg; ou 0,5-100 mg; ou 0,5-50 mg; ou 0,5-25 mg; ou 1,0-10 mg.

De um modo ideal, o ingrediente activo deverá ser administrado para alcançar concentrações plasmáticas máximas do composto activo desde cerca de 0,2 a 70 μΜ, de um modo preferido, cerca de 1,0 a 10 μΜ. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por injecção intravenosa de uma solução de 0,1 a 5% do ingrediente activo, opcionalmente em solução salina ou administrado como um bolus do do ingrediente activo. 75 A concentração do composto activo na composição de fármaco irá depender das taxas de absorçao, inactivação e excreção do fármaco, bem como de outros factores conhecidos pelos especialistas na técnica. É para ser notado que os valores de dosagem irão variar também com a gravidade da patologia a ser aleviada. É para ser entendido que para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo, de acordo com a necessidade individual e considerações profissionais da pessoa que está a administrar ou supervisionar a administração das composições, e que as gamas de concentração apresentadas aqui são apenas exemplos e não são para ser consideradas como limitativas do âmbito da prática da composição revindicada. 0 ingrediente activo pode ser administrado de uma vez ou pode ser dividido em várias doses mais pequenas a serem administradas em intervalos de tempo variáveis.

Um modo preferido de administração do composto activo é a oral. As composições orais irão geralmente incluir um diluente inerte ou um veículo comestível. Podem ser colocadas em cápsulas de gelatina ou compressos em comprimidos. Para o objectivo da administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprmidos, trociscos ou cápsulas. Os agentes de ligação e/ou materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis podem ser incluídos como uma parte da composição.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza semelhante: um ligando, tais como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose, um agente desintegrante, tais como 76 ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante, tais como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslisante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tais como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo ou aromatizante de laranja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, pode conter, além do material do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo gordo. Além disso, as formas de dosagem unitárias podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma-laca ou outros agentes entéricos. 0 composto pode ser administrado como um componente de um elixir, suspensão, xarope, hóstia, pastilha elástica ou semelhantes. Um xarope pode conter, além dos compostos activos, sacarose como um agente adoçante e determinados conservantes, corantes e coloração e aromas. 0 composto ou um seu profármaco farmaceuticamente aceitável ou sais do mesmo, podem também ser misturados com outros materiais activos que não prejudicam a acção desejada ou com materiais que suplementam a acção desejada, tais como antibióticos, anti-fungicos, anti-inflamatórios ou outros antivirais, incluindo outros compostos nucleósidos. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica, sucutânea ou tópica podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, tais como água para injecção, solução salina, óleos de fixação, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicóis ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou parabenos de metilo; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como ácido 77 etilenodiaminetetraacético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser colocada no interior de ampolas, seringas descartáveis ou frasquinhos de dose múltipla de vidro ou plástico.

Se administrados intravenosamente, os veículos preferidos são solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS).

Numa forma de realização preferida, os compostos activos são preparados com veículos que irão proteger o composto contra a rápida eliminação do organismo, tal como formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de etilenovinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para preparação de tais formulações serão evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente a partir da Alza Corporation.

As suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direccionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antigénios virais), são também preferidos como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. N° 4522811 (que é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Por exemplo, as formulações lipossomais podem ser preparadas por dissolução do(s) lípido(s) apropriado(s) (tais como estearoilfosfatidiletanolamina, estearoilfosfatidilcolina, 78 aracadoilfosfatidilcolina e colesterol) num solvente inorgânico que é depois evaporado, deixando para trás um filme fino de lipido seco na superfície do recipiente. Uma solução aquosa do composto activo ou os seus derivados monofosfato, difosfato e/ou trifosfato é, depois, introduzida no recipiente. 0 recipiente é depois agitado à mão para libertar o material lipídico das paredes do recipiente e para dispersar agregados lipídicos, formando, deste modo, a suspensão lipossomal.

Processos para a Preparação dos Compostos Activos

Os nucleósidos da presente invenção podem ser sintetizados através de qualquer meio conhecido na técnica. Em particular, a síntese dos presentes nucleósidos pode ser alcançada por alquilação do açúcar, apropriadamente, modificado, seguido por glicosilação ou glicosilação seguida por alquilação do nucleósido, embora, de um modo preferido, alquilando o açúcar modificado, de um modo apropriado, seguido por glicosilação. As seguintes formas de realização não limitantes ilustram algumas metodologias gerais para obter os nucleósidos da presente invenção. A. Síntese Geral dos Nucleósidos 1'-C-ramifiçados

Os ribonucleósidos l'-C ramificados das seguintes estruturas: 79

em que R é H, fosfato (incluindo mono-, di- ou trifosfato ou um profármaco de fosfato estabilizado) ou fosfonato; n é 0 - 2; quando X é CH2, CHOH, CH-alquilo, CH-alcenilo, CH-alcinilo, C-dialquilo, CH-O-alquilo, CHO-alcenilo, CH-O-alcinilo, CH-S-alquilo, CH-S-alcenilo, CH-S-alcinilo, CH-halogéneo ou C-(halogéneo)2, então cada R1 e R1' é, independentemente, H, OH, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), -0(alcinilo), halogéneo, alquilo halogenado, -N02, -NH2, -NH(alquilo inferior), -N(alquilo inferior)2, -NH(acilo), -N (acil) 2, -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) , -C (0) N (alquilo) 2, S(0)N-alquilo, S(0)N-alcenilo, S(0)N-alcinilo, SCH-halogéneo, em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; 80 quando X é O, S[0]n/ NH, N-alquilo, N-alcenilo, N-alcinilo, S(O)N-alquilo, S(O)N-alcenilo, S(O)N-alcinilo ou SCH-halogéneo, então, cada R1 e R1 é, independentemente, H, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), alquilo halogenado, -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) , -C (0) N (alquilo) 2, -C(H)=N-NH2, C(S)NH2, C(S)NH(alquilo) ou C(S)N(alquilo)2, em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo podem ser opcionalmente substituídos; quando X* é CY3; então, cada R1 é, independentemente, H, OH, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, azido, ciano, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), -0(alcinilo), halogéneo, alquilo halogenado, -N02, -NH2, -NH(alquilo inferior), -N(alquilo inferior, -NH(acilo), -N(acilo)2, -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo) e -C(0)N(alquilo)2, em que uma substituição opcional no alquilo, alcenilo e/ou alcinilo pode ser um ou mais de grupos halogéneo, hidroxilo, alcoxilo ou alquiltio considerados em qualquer combinação; e Y3 é hidrogénio, alquilo, bromo, cloro, fluoro, iodo, azido, ciano, alcenilo, alcinilo, -C(0)0(alquilo), 81 -C(Ο)0(alquilo inferior), CF3, -CONH2, -CONH(alquilo), -CON(alquilo)2; cada R2 e R3 é, independentemente, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, I, CN, N02, -C(0)NH2, -C (O) NH (alquilo) , -C (O) N (alquilo) 2, N3, alquilo opcionalmente substituído, incluindo alquilo inferior, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, alquilo halogenado, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -O(alquilo), -0(alcenilo), -0(alcinilo), -0C(0)NH2, NC, C(0)OH, SCN, OCN, -S(alquilo), -S(alcenilo) , -S(alcinilo) , -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), um resíduo de aminoácido ou derivado, um profármaco ou grupo de saída que proporcina OH in vivo, ou um anel heterocíclico com 3-7 membros opcionalmente substituído com 0, S e/ou N, independentemente, como um heteroátomo considerado individualmente ou em combinação; cada R2' e R3' é, independentemente, H; alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alquilo inferior), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo), -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -O(acilo), -0(acilo inferior), -O(alquilo), -0(alquilo inferior), -0(alcenilo), halogéneo, alquilo halogenado e, particularmente, CF3, azido, ciano, N02, -S(alquilo), -S(alcenilo) , -S(alcinil), NH2, -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), -NH(acilo), ou -N(acilo)2 e R3 em 3'-C pode ser também OH; A base é seleccionada do grupo consistindo de: 82 e

ζ

(C)

w

em que cada A é, independentemente, N ou C-R5; W é H, OH, -O(acyl), -0 (alquiloCi-4) , -0 (alcenilo) , -0 (alcinilo) , -0C(0)R4R4, -0C(0)N R4R4, SH, -S(acilo), -S (alquiloCi-4) # NH2, NH(acilo), N(acilo)2, NH (alquiloCi_4) , N (alquiloCi-4) 2, -N (cicloalquil) alquilCi-4amino, di (alquilCi_4) amino, cicloalquilC3_6amino, halogéneo, alquiloCi-4, alcoxiloCi-4, CN, SCN, OCN, SH, N3, N02, NH=NH2, 83 Ν3, ΝΗΟΗ, -C(0)NH2, -C (Ο) ΝΗ (acilo) , -C (Ο)Ν (acilo) 2, -C (Ο) ΝΗ (alquiloCi-4) , -C (Ο) Ν (alquilCi_4, -C(Ο)Ν(alquil)(acilo) ou alquilo halogenado; Z é O, S, ΝΗ, N-OH, N-NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, SH, N02, NH2, N3, NH=NH, NH(alquilo), N(alquilo)2, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2· cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi-6; cada R5 é, independentemente, H, Cl, Br, F, I, CN, OH, alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, carboxilo, C(=NH)NH2, alcoxiloCi-4, alquiloxiCi-4carbonilo, N3, NH2, NH (alquilo), N (alquilo) 2, N02, N3, alquilo halogenado especialmente CF3, alquilCi-4amino, di (alquilCi-4) amino, cicloalquilC3_6amino, alcoxiloCi-6, SH, -S (alquiloCi-4) . -S (alceniloCi-4) , -S (alciniloCi-4) , alquilCi-6tio, alquilsulfonilCi_6, (alquilCi_4) 0-2aminometilo, cicloalquilC3_6amino, -alcenilo, -alcinilo, -(0)alquilo, - (0) alcenilo, - (0) alcinilo, -(O)acilo, -0 (alquiloCi_4) , -0 (alceniloCi-4) , -0 (alciniloCi-4) , -0-C(O)NH2, -0C (0) N (alquilo) , -0C(0)R'R", -C(0)0H, C (0) 0-alquilo, C(0)0-alcenilo, C(0)0-alcinilo, S-alquilo, S-acilo, S-alcenilo, S-alcinilo, SCN, OCN, NC, -C(0)-NH2, C(0)NH(alquilo), C(0)N(alquilo)21 C(0)NH(acilo), C(0)N(acilo)2, (S)-NH2, NH-alquilo, N(dialquilo)2, NH-acilo, N-diacilo ou um heterociclo com 3-7 membros com 0, S ou N considerados, independentemente, em qualquer combinação; cada R' e R' ' é, independentemente, H, alquiloCi-6, alceniloC2-6, alciniloC2-6, halogéneo, alquilo halogenado, 84 OH, CN, N3, carboxilo, alcoxiCi_4carbonilo, NH2, alquilCi_4amino, di (alquilCi_4) amino, alcoxiloC4-6, alquilC4_6Sulfonilo ou (alquilCi_4) o_2aminometilo; e todas as suas formas tautoméricas, enantioméricas e estereoisoméricas; com a advertência de que quando X é S na Fórmula (I), depois o composto não é 5-(4-amino-imidazo [4,5-d][1,2,3]triazin-7-il)-2-hidroximetil-tetra-hidro-tiofen-3-ol ou 7-(4-hidroxi-5-hidroxi-metil-tetra-hidro-tiofen-2-il)-3,7-di-hidro-imidazo[4,5-d][1,2,3]triazin-4-ona, pode ser preparado de acordo com as Esquemas 1, 2 ou 7 abaixo.

Modificação a partir da Lactona 0 principal material de partida para este objectivo é uma lactona, apropriadamente, substituída. A lactona pode ser adquirida ou pode ser preparada através de qualquer meio incluindo técnicas de epimerização, substituição e ciclização convencionais. A lactona pode ser opcionalmente protegida com um grupo de protecção adequado, de um modo preferido, com um grupo acilo ou sililo, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Greene et ai., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. A lactona protegida pode ser associada com um agente de ligação adequado, tal como um nucleófilo de carbono organometálico como um agente de Grignard, um organolítio, dialquilcobre e lítio ou R6-SiMe3 em TAF com o solvente não-prótico apropriado a uma temperatura adequada, para proporcionar o açúcar 1'-alquilado. 85 0 açúcar opcionalmente activado pode, depois, ser associado à base através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Townsend, Chemistry of Nuceleotides, Plenum Press, 1994. Por exemplo, um açúcar acilado pode ser associado a uma base sililada com um ácido de Lewis, tais como um tetracloreto de estanho, tetracloreto de titânio ou trimetilsililtriflato num solvente apropriado a uma temperatura adequada.

Subsequentemente, o nucleósido pode ser desprotegido por métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991.

Numa forma de realização particular, é desejado o ribonucleósido 1'-C-ramifiçado. A síntese de um ribonucleósido é apresentada no Esquema 1. Alternativamente, é desejado um desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o ribonucleósido pode ser opcionalmente protegido através de métodos bem conhecidos para os especialistas na técnica, como ensinado por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991 e, depois o 2'-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. Opcionalmente, o 2'-OH pode ser activado para facilitar a redução, como, por exemplo, via a redução de Barton. 86

Esquema 1

j ^Ligação jjDesproteção Opcional

Protecção 10' D Op cional 2)

Redução Opcional

OH OH

Desprotecção

Opcional

Método Alternativo para a Preparação de Nucleósidos 1'-C-ramificados 0 material de partida chave para este processo é uma hexose, apropriadamente, substituída. A hexose pode ser adquirida ou pode ser preparada através de qualquer meio, incluindo meios de epimerização convencional (como, por exemplo, via tratamento alcalino), técnicas de substituição e ligação. A hexose pode ser protegida selectivamente para proporcionar a hexofuranose 87 apropriada, como ensinado por Townsend, Chemistry of Nucleósidos and Nucleotides, Plenum Press, 1994. 0 l'-OH pode ser activado, opcionalmente, num grupo de saída adequado, tais como um grupo acilo ou um halogéneo via acilação ou halogenação, respectivamente. 0 açúcar opcionalmente activado pode ser associado à base através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Townsend, Chemistry of Nucleósidos and Nucleotides, Plenum Press, 1994. Por exemplo, um açúcar acilado pode ser associado a uma base sililada com um ácido de Lewis, tais como um tetraclorero de estanho, tetracloreto de titânio ou trimetilsililtriflato num solvente apropriado a uma temperatura adequada. Alternativamente, pode ser associado um halo-açúcar a uma base sililada na presença de trimetilsililtriflato. 0 l'-CH2-0H, se protegido, selectivamente, pode ser desprotegido através de métodos bem conhecidos na técnica. 0 hidroxilo primário resultante pode ser reduzido para proporcionar o metilo, utilizando um agente de redução adequado. Alternativamente, o hidroxilo pode ser activado antes da redução para facilitar a reacção, i. e., via a redução de Barton. Numa forma de realização alternativa, o hidroxilo primário pode ser oxidado no aldeído, depois, ligado a um nucleófilo de carbono, tal como reagente de Grignard, um organolítio, dialquilcobre e lítio ou R6-SiMe3, em TAF com um solvente não prótico apropriado, a uma temperatura adequada.

Numa forma de realização particular, é desejado o ribonucleósido 1'-C-ramifiçado. A síntese de um ribonucleósido é apresentada no Esquema 2. Alternativamente, é desejado um desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o ribinucleósido formado pode, opcionalmente, ser protegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Greene et al. , Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991, e, depois, o 2'-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. Opcionalmente, o 2'-OH pode ser activado para facilitar a redução como, por exemplo, via a redução de Barton.

Esquema 2

OBj 01½

jj Desoxigenação 2) Desprotecção

Além disso, os L-enantiómeros correspondentes aos compostos da invenção podem ser preparados a partir dos mesmos métodos 89 gerais (1 ou 2), começando com o L-açúcar ou nucleósido L-enantiómero correspondente como o material de partida.

Sintese Geral dos Nucleósidos 2'-C-ramifiçados

Os ribonucleósidos 2r-C-ramifiçados das seguintes estruturas:

em que R, R1, R1', R2, R2', R3, R3 , X, X* e a Base são todos como descrito acima, podem ser preparados de acordo com os Esquemas 3 ou 4 abaixo.

Glicosilação da nucleobase com um açúcar modificado apropriadamente 0 material de partida chave para este processo é um açúcar substituído, apropriadamente, com um 2'-OH e 2'-H, com um grupo de saída apropriado (LG), tal como um grupo acilo ou halogéneo, por exemplo. 0 açúcar pode ser adquirido ou pode ser preparado através de qualquer meio conhecido, incluindo epimerização convencional, técnicas de substituição, oxidação e/ou redução. 0 açúcar substituído pode ser, depois, oxidado com um aqente de 90 oxidação apropriado num solvente compatível a uma temperatura adequada para proporcionar o açúcar 2'-modificado. Os agentes de oxidação possíveis são o reagente de Jones (uma mistura de ácido crómico e sulfúrico), reagente de Collins (dipiridina óxido de Cr(VI)), reagente de Corey (clorocromato de piridínio), dicromato de piridínio, dicromato ácido, permanganato de potássio, Mn02, tetróxido de ruténio, catalisador de transferência de fase, tal como ácido crómico ou permanganato suportado num polímero, Cl2-piridina, molidato de amónio-H202, Nar02-CAN, NaOCl em HOAc, cromato de cobre, óxido de cobre, níquel de Raney, acetato de paládio, reagente de Meerwin-Pondorf-Verley (t-butóxido de alumínio com outra cetona) e IV-bromossuccinimida.

Depois, a ligação de um nucleófilo de carbono organometálico, tal como um reagente de Grignard, um organolítio, dialquilcobre e lítio ou R6-SiMe3 em TAF com a cetona e um solvente não prótico apropriado a uma temperatura adequada, proporciona o açúcar 2'-alquilado. 0 açúcar alquilado pode, opcionalmente, ser protegido com um grupo de protecção adequado, de um modo preferido, com um grupo acilo ou sililo, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Greene et al. , Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. 0 açúcar opcionalmente protegido pode ser, depois, associado à base através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Townsend, Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Plenum Press, 1994. Por exemplo, um açúcar acilado pode ser associado a uma base sililada com ácido de Lewis, tais como tetracloreto de estanho, tetracloreto de titânio ou trimetilsililtriflato, num solvente apropriado a uma 91 temperatura adequada. Alternativamente, pode ser associado um halo-açúcar a uma base sililatada na presença de trimetilsililtriflato.

Subsequentemente, o nucleósido pode ser desprotegido por métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al. , Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991.

Numa forma de realização particular, é desejado o ribonucleósido 2'-C-ramifiçado, a síntese do qual é apresentada no Esquema 3. Alternativamente, é desejado um desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o ribonucleosido formado pode, opcionalmente, ser protegido através de métodos bem conhecidos na técnica, como por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991 e depois, o 2'-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. Opcionalmente, o 2'-OH pode ser activado para facilitar a redução, tal como, por exemplo, através de redução de Barton. 92

Esquema 3

Modificação de um nucleósido pré-formado 0 principal material de partida para este processo é um nucleósido substituído, apropriadamente, com um 2'-OH e 2'-H. 0 nucleósido pode ser adquirido ou pode ser preparado através de qualquer meio adequado, incluindo técnicas de ligação convencionais. 0 nucleósido pode, opcionalmente, ser protegido com grupos de protecção adequados, de um modo preferido, com grupos acilo ou sililo, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como descrito em Greene et al., 93

Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. 0 nucleósido protegido, apropriadamente, pode depois ser oxidado com um agente de oxidação apropriado num solvente compatível, a uma temperatura adequada, para proporcionar o açúcar 2'-modificado. Os agentes de oxidação possíveis incluem o reagente de Jones (uma mistura de ácido crómico e sulfúrico), reagente de Collins (óxido de Cr(VI) de dipiridina), reagente de Corey (clorocromato de piridínio), dicromato de piridínio, dicromato ácido, permanganato de potássio, Mn02, tetróxido de ruténio, catalisado de transferência de fase, tais como ácido crómico ou permanganato suportado num polímero, Cl2-piridina, molibdato de amónio-H202, Nar02~CAN, NaOCl em HOAc, cromato de cobre, óxido de cobre, niquel de Raney, acetato de paládio, reagente de Meerwin-Pondorf-Verley (t-butóxido de alumínio com outra cetona) e N-bromossuccinimida.

Subsequentemente, o nucleósido pode ser desprotegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991.

Numa forma de realização particular, é desejado um ribonucleósido 2'-C-ramifiçado, a síntese do qual é apresentada no Esquema 4. Alternativamente, pode ser desejado o desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o ribonucleósido formado pode, opcionalmente, ser protegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et ai., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991 e, depois, o 2'-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. 94

Opcionalmente, o 2'-OH pode ser activado para facilitar a redução tal como, por exemplo, através da redução de Barton.

Esquema 4

jjProtecção Opcional 2)Redução Opcional t

Noutra forma de realização da invenção, são desejados os L-enantiómeros. Estes L-enantiómeros, correspondendo aos compostos da invenção, podem ser preparados através dos mesmos métodos gerais apresentados acima, mas começando com o L-açúcar 95 ou nucleósido L-enantiómero correspondente, como o material de partida. C. Síntese Geral dos Nucleósidos 3’-C-ramifiçados

Os ribonucleósidos 3'-C-ramifiçados das seguintes estruturas:

em que R, R1, R1', R2, R2', R3, R3', X, X* e a Base são todos como descrito acima, podem ser preparados de acordo com os Esquemas 5 ou 6 abaixo.

Glicosilação da nucleobase com um açúcar modificado, apropriadamente, (Esquema 5) 0 material de partida chave para este processo é um açúcar substituído, apropriadamente, com um 3'-OH e um 3'-H, com um grupo de saída apropriado (LG), tais como, por exemplo, um grupo acilo ou um halogéneo. 0 açúcar pode ser adquirido ou pode ser preparado através de qualquer meio conhecido, incluindo a epimerização convencional, técnicas de substituição, oxidação e/ou redução. 0 açúcar substituído pode, depois, ser oxidado 96 através de um agente de oxidação apropriado, num solvente compatível a uma temperatura adequada, para proporcionar o açúcar 3'-modificado.

Os agentes de oxidação possíveis incluem o reagente de Jones (uma mistura de ácido crómico e sulfúrico), Reagente de Collins (óxido de Cr(VI) de dipiridina), reagente de Corey (clorocromato de piridinio), dicromato de pirídinio, dicromato ácido, permanganato de potássio, Mn02, tetróxido de ruténio, catalisador de transferência de fase, tais como ácido crómico ou permanganato suportado num polímero, Cl2-piridina, molibdato de amónio-H202, NarCq-CAN, NaOCl em HOAc, cromato de cobre, óxido de cobre, níquel de Raney, acetato de paládio, reagente de Meerwin-Pondorf-Verley (t-butóxido de alumínio com outra cetona) e IV-bromossuccinimida.

Depois, a ligação de um nucleófilo de carbono organometálico, tal como um reagente de Grignard, um organolítio, dialquilcobre e lítio ou R6-SiMe3 em TAF com a cetona e um solvente não prótico apropriado a uma temperatura adequada, proporciona o açúcar 3'-C-ramifiçado. 0 açúcar 3'-C-ramificado pode, opcionalmente, ser protegido com um grupo de protecção adequado, de um modo preferido, com um grupo acilo ou sililo, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. 0 açúcar opcionalmente protegido pode, depois, ser ligado à base através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado em Townsend, Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Plenum Press, 1994. Por exemplo, um açúcar acilado pode ser associado a uma base sililatada com um ácido de Lewis, 97 tais como tetracloreto de estanho, tetracloreto de titânio ou trimetilsililtriflato, num solvente apropriado, a uma temperatura adequada. Alternativamente, um açúcar halo pode ser associado a uma base sililatada na presença de trimetilsililtriflato.

Subsequentemente, o nucleósido pode ser desprotegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991.

Numa forma de realização particular, é desejado o ribonucleósido 3'-C-ramifiçado, a síntese do qual é apresentada no Esquema 5. Alternativamente, é desejado um desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o ribonucleósido formado pode, opcionalmente, ser protegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991, e, depois, o 2'-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. Opcionalmente, o 2'-OH pode ser activado para faciliar a redução, tal como, por exemplo, através da redução de Barton. 98

Esquema 5

1) Protecção Opcional 2) Redução Opcional t

OH

Modificação de um nucleósido pré-formado. 0 material de partida chave para este processo é nucleósido substituído, apropriadamente, com um 3'-0H e 3'-H nucleósido pode ser adquirido ou pode ser preparado através meios conhecidos, incluindo técnicas de ligação convencionais nucleósido pode ser opcionalmente protegido com grupos protecção adequados, de um modo preferido, com grupos acilo sililo, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas um 0 de 0 de ou na 99 técnica, como ensinado por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. 0 nucleósido protegido, apropriadamente, pode, depois, ser oxidado com o agente de oxidação apropriado, num solvente compatível a uma temperatura adequada, para proporcionar o açúcar 2'-modificado. Os agentes de oxidação possíveis incluem um reagente de Jones (uma mistura de ácido crómico e sulfúrico), Reagente de Collins (óxido de Cr(VI) de dipiridina), Reagente de Corey (clorocromato de piridínio), dicromato de pirídinio, dicromato ácido, permanganato de potássio, Mn02, tetróxido de ruténio, catalisadores de transferência de fase, tais como ácido crómico ou permanganato suportado num polímero, Cl2-piridina, molibdato de amónio-H202, Nar02-CAN, NaOCl em HOAc, cromato de cobre, óxido de cobre, níquel de Raney, acetato de paládio, reagente de Meerwin-Pondorf-Verley (t-butóxido de alumínio com outra cetona) e N-bromossuccinimida.

Subsequentemente, o nucleósido pode ser desprotegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al. , Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991.

Numa forma de realização particular, é desejado o ribonucleósido 3'-C-ramifiçado, a síntese do qual é apresentada no Esquema 6. Alternativamente, é desejado um desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o ribonucleósido formado pode ser opcionalmente protegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991 e, depois, o 2'-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. Opcionalmente, o 100 2'-OH cpode ser activado para faciliar a redução, tal como, por exemplo, através da redução de Barton.

Esquema 6

51)Protecção Opcional » '2)Redução Opcional I I t

Noutra forma de realização da invenção, são desejados os L-enantiómeros. Os L-enantiómeros correspondentes aos compostos da invenção podem ser preparados a partir dos mesmos métodos gerais apresentados acima, mas começando com o L-açúcar ou 101 L-enantiómero do nucleósido correspondente, como o material de partida. Síntese Geral dos Nucleósidos 4'-C-ramifiçados

Os ribonucleósidos 4'-C-ramifiçados das seguintes estructuras:

em que R, R1, R1', R2, R2', R3, R3', X, I* e Base são todos como descrito acima, podem ser preparados de acordo com os seguintes métodos gerais.

Modificação a partir de pentodialdo-furanose.

0 material de partida chave para este processo é uma pentodialdo-furanose, apropriadamente, substituída. A pentodialdo-furanose pode ser adquirida ou pode ser preparada através de qualquer meio conhecido, incluindo técnicas de epimerização, substituição e ciclização convencionais.

Numa forma de realização preferida, a pentodialdo-furanose é preparada a partir de hexose, apropriadamente, substituída. A 102 hexose pode ser adquirida ou pode ser preparada através de meios conhecidos, incluindo técnicas de epimerização (para, e. g., via tratamento alcalino), substituição e ligação convencionais. A hexose pode estar quer na forma de furanose ou ciclizada através de quaisquer meios conhecidos na técnica, tal como a metodologia ensinada por Townsend em Chemistry of Nucleósidos and Nucleotides, Plenum Press, 1994, de um modo preferido, através da protecção selectiva da hexose, para proporcionar a hexafuranose apropriada. 0 4'-hidroximetileno da hexafuranose pode depois ser oxidado com um agente de oxidação apropriado num solvente compatível, a uma temperatura adequada, para proporcionar o açúcar 4'-aldo-modifiçado. Os agentes de oxidação possíveis são reagentes de Swem, reagente de Jones (uma mistura de ácido crómico e sulfúrico), Reagente de Collins (óxido de Cr(VI) de dipiridina), Reagente de Corey (clorocromato de piridinio), dicromato de piridinio, dicromato ácido, permanganato de potássio, Mn02, tetróxido de ruténio, catalisadores de transferência de fase, tais como ácido crómico ou permanganato suportado num polímero, Cl2-piridina, molibdato de amónio-H202, Nat02-CAN, NaOCl em HOAc, cromato de cobre, óxido de cobre, níquel de Raney, acetato de paládio, reagente de Meerwin-Pondorf-Verley (t-butóxido de alumínio com outra cetona) e N-bromosucinimida, embora seja preferido utilizar H3PO4, DMSO e DCC numa mistura de benzeno/piridina à temperatura ambiente.

Depois, a pentodialdo-furanose pode, opcionalmente, ser protegida com um grupo de protecção adequado, de um modo preferido, com um grupo acilo ou sililo, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Greene et al. , Protective Groups in Organic Synthesis, John 103

Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. Na presença de uma base, tal como hidróxido de sódio, a pentodialdo-furanose protegida pode ser depois ligada com um alquilo, halogeno-alquilo (tal como CF3) , alcenilo ou alcinilo electrofílico adequado (i. e., alilo), para obter o açúcar 4'-alquilado. Alternativamente, a pentodialdo-furanose protegida pode ser ligada com um carbonilo correspondente, tal como formaldeído, na presença de uma base como o hidróxido de sódio e com um solvente polar apropriado como o dioxano, a uma temperatura adequada e, depois reduzida com um agente de redução apropriado, para proporcionar o açúcar 4'-alquilado. Numa forma de realização, a redução é efectuada utilizando PhOC(S)Cl e DMAP em acetonitrilo, à temperatura ambiente, seguida por tratamento por refluxo com ACCN e TMSS em tolueno. 0 açúcar opcionalmente activado pode ser ligado à base através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como ensinado por Townsend in Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Plenum Press, 1994. Por exemplo, um açúcar acilado pode ser associado a uma base sililatada com um ácido de Lewis, tais como tetracloreto de estanho, tetracloreto de titânio ou trimetilsililtriflato, num solvente apropriado, à temperatura ambiente.

Subsequentemente, o nucleósido pode ser desprotegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al. , Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991.

Numa forma de realização particular, é desejado o ribonucleósido 4'-C-ramifiçado. Alternativamente, é desejado um desoxirribonucleósido. Para obter estes nucleósidos, o 104 ribonucleósido formado pode ser opcionalmente protegido, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991 e, depois, o 2 '-OH pode ser reduzido com um agente de redução adequado. Opcionalmente, o 2’-OH pode ser activado para facilitar a redução, tal como, por exemplo, através da redução de Barton.

Noutra forma de realização da invenção, são desejados os L-enantiómeros. Estes L-enantiómeros correspondendo aos compostos da invenção, podem ser preparados seguindo os mesmos métodos gerais apresentados acima, mas começando com o L-açúcar ou nucleósido L-enantiómero correspondente, como o material de partida. Métodos para a Síntese de Ribofuranosil-2-azapurina

Preparação de 1'-C-metil-ribofuranosil-2-azapurina via 6-amino-9- (1-desoxi-beta-D-psicofuranosil)purina.

Como um método alternativo de preparação, o composto do título pode ser preparado de acordo com o processo publicado de Farkas e Sorm (J. Farkas e F. Sorm, "Nucleic acid components and their analogues. XCIV. Synthesis of 6-amino-9-(1-deoxy-beta-D-psicofuranosyl)purine", Collect. Czech. Chem. Commun., 1967, 32:2663-7; e J. Farkas, Collect. Czech. Chem. Commun., 1966, 31:1535 (Esquema 7).

De um modo semelhante, mas utilizando o açúcar apropriado e a base 2-azapurina correspondente ao composto produto desejado, 105 podem ser preparados vários compostos de Fórmula (I) e/ou Fórmula (II).

Esquema 7

HO OH 106 Métodos Alternativos para a Síntese de Análogos de Ribofuranosil-Purina

Preparaçao de análogos de ribofuranosil-purina: compostos derivados de 2-aza-3, 7-dideazaadenosina.

Preparação de derivados de 2-aza-3,7-dideazaadenosina, os compostos podem ser preparados de acordo com a síntese publicada de L.Towsend et al., Bioorganic & Med Chem. Letters, 1991, 1(2):111-114, onde o material de partida, etil-3-cianopirnole-2-carboxilato 4 foi sintetizado por Huisgen & Laschtuvka, de acordo com o processo proporcionado em Chemische Berichte, 1960, 93:65-81, como apresentado no Esquema 8: 107

Esquema 8

ÇXfcCjH* co

I

CN

,CN

CN

BzO

fj CQ*EI fx <nr rlç-O-^c, NjH, CHjCN N cOjEt NaOEl/EíOH N^COjB5X “^Γ*01^ Ϊ^ΠΤ HOTVj^yl

Rendimento 96%

OBz OBz Rendimento 77% OH OH

Rendimento 73% BCb, çh2ci^

KOH. BnBr refluxo, 21 h

.___,CH __.CNn. N^CHO ΒηΟΊ^-Ο-^Ι UAltCHjhOOlÍH BnO' 0®diglime, -78 2C II 1,5 h «CN (C0C1)2 i» Cd tolueno

BnO' 08n OBn refluxo, 16 h QBn OBn 9 8

OBn OBn 11

Rendimento 33% 3 passos

HjNNHjlHO ElOH refluxo, 20 h

Preparaçao de análogos ribofuranosil-purina: compostos derivados da 2-aza-3~deataadenosina.

Preparação de derivados de 2-aza-3-deazaadenosina, os compostos podem ser preparados de acordo com a síntese publicada 108 de B. Otter et al., J.Heterocyclic Chem., 1984, 481-89 apresentado no Esquema 9. 0 material de partida disponível comercialmente utilizado é a 4,5-dicloro-6-piridazona 12.

Esquema 9

BnOH + HC1 + HCHO o cu Ç nh CT Rendimento 58% 12

αΧβη NaNOj.OMF HO/fOBn NH|. MeOH ______ HCt OzN^N -- <vNA*N OBft HCt Rendimento 93%

OzN' Rendimento 80% Rendimento 85% \ *

Rendimento 48%

BzO'

BzO^-O^OAc OSiMea O 0 OBSJBz ,N>^N^OBn HMDS ^V^N^OBn HC(OEt)3, ACjO M^nH„ Rendimento 95%

SnCU «... «

Rendimento 95% OBz OBz

CCS OBn BCb Rendimento 79% <"ΛΗ N^N «<,· Rendimento 60% OBz OBz 'W ΟΒΖΟβζ çór

CHjl. NaOH

EtOH Rendimento 94%

150*0 Rendimento 30% NH3

BzO w OBz OBz SMe

Uma preparação alternativa dos compostos derivados de 2-aza-3-deazaadenosina que utiliza um passo de clorinação é uma de acordo com R.Panzica, J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1989, 1769-1774 e J. Med. chem., 1993, 4113-4120, apresentado no Esquema 10: 109

Esquema 10 HO' OH OH 12

piridina AcO Π.2Η Rendimento 100% w OAc O Ac 13 N,N-dietilanilina (Bu)4N+,-C1 90 2C, 1 h Rendimento 86%

α POCb.CHjCN

OAC OAc 14 N>b> MoOH NH? :ώ HOlÇO^ OH OH B

Preparação de análogos de Purina para nucleósidos: compostos derivados de 2,8-diaza-3. 7-dideazaadenina opcionalmente substituído.

Preparação de certos derivados de 2,8-diaza-3,7-dideazaadenosina, os compostos podem ser preparados de acordo com a síntese publicada por Oda et ai. em J.Heterocyclic Chem., 1984, 21:1241-55 e Chem. Pharm. Buli., 1984, 32(11):4437-46, como apresentado no Esquema 11. 0 material de partida está disponível comercialmente como 4,5-dicloro-6-piridazona 12. 110

Esquema 11 ΟaV<'NH ο,Λ^ν NHzCHa

Rendimento -85% u

CHzO

Rendimento 77% 0¾

O

CH3

Rendimento 7 7 %

Preparação dos análogos de purina para nucleósidos: compostos derivados de 2,8-diaza-3-deazaadenosina.

Preparação de determinados derivados de 2,8-diaza-3-deazaadenosina, os compostos podem ser preparados de acordo com a síntese publicada por Panzica et al. em J. Heterocyclic Chem., 1982, 285-88, J. Med. Chem., 1993, 4113-20 e Bioorg. & Med Chem. Letters., 1996, 4(10):1725-31, como proporcionado no Esquema 12. O intermediário chave 27 foi preparado via uma reacção de cicloadição 1,3-dipolar entre a azida de 2,3,5-tri-0-benzoil^-D-ribofuranosilo 26 e metil-hidroxi-2-butilnoato 25. A síntese da azida de ribofuranosilo 26 foi descrita por A. Stimac et al., Carbohydrate Res., 1992, 232(2):359-65, utilizando a azidólise 111 catalisada por SnCl4 de l-O-Acetil-2,3,5-tri-0-benzoil-p-D-ribofuranose com Me3SiN3 em CH2CÍ2,à temperatura ambiente.

Esquema 12 CHi|i CHjOH 21

THP 2* C^MgBr.THF CKX>£H3,TH? 9^CH> ||| CMjOTPH 2SPC,2,5h. rn~OTPH *1CPC,2,5h. ,-mj nnu 25*C, 1,5h. Ct 22 CMgBr||| CHaOTPH 23 COjCH3 CHjOTPH rendimento 65%

CHzOH 24 3 passos 25 tolueno 55 ac 7 dias molço^,· 23 OBzOBz rendimento 60%

29 dia para o outro Rendimento 90% Ac20/plrldlna t.a., de um dia para o outro rendimento 99% 28 27 O Ac O Ac 30 70 =C, 12 h rendimento 78%

Rendimento 96%

AcO

I ν-ΛηVU*

Preparação de análogos de purina para nucleósidos: preparação alternativa de compostos derivados de 2, 8-diaza-3-deazaadenina.

Os compostos derivados de 2,8-diaza-3-deazaadenina podem ser preparados (ver Esquema 13), de acordo com a síntese publicada 112 por Chen et al. in J.Heterocyclic Chem., 1982, 285-88; no entanto, não se verificou condensação destes compostos com ribofuranose.

Esquema 13

H2S04 91%

P2s5; piridina » refluxo, 1,5 h 33

CH3I; KOH t.a. , 5 h

O H2N H2N

SMe 35

NHtj/MeOH H 32 93% P2S5; KOH refluxo 5 h S CH3I; KOH SMe ifS rt, 20hr H*N' 38 75% 37 NaNOg/AcOH 0*C,3h. 81%

160®C

Preparação de ribofuranosil-2-azapurinas via utilização de grupos de protecção.

Como um método alternativo de preparação, os compostos da presente invenção podem também ser preparados através de métodos sintéticos bem conhecidos pelos especialistas na técnica de nucleósidos e química de nucleótidos, tal como ensinado por Townsend in Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Plenum Press, 1994. É proporcionado um método sintético geral representativo no Esquema 14. 0 material de partida é um ribofuranósido 113 beta-D-alquilo 3,5-is-0-protegido, mas será entendido que qualquer posição 2', 3' ou 5' pode suportar um grupo de protecção para o proteger da reacção. 0 2'-C-0H é depois oxidado com um agente de oxidação adequado, num solvente compatível, a uma temperatura adequada para proporcionar o açúcar 2'-ceto-modifiçado. Os agentes de oxidação possíveis são os reagentes de Swern, reagente de Jones (uma mistura de ácido crómico e sulfúrico), Reagente de Collins (óxido de Cr(VI) de dipiridina), Reagente de Corey (clorocromato de piridínio), dicromato de pirídinio, dicromato ácido, permanganato de potássio, Mn02, tetróxido de ruténio, catalisadores de transferência de fase, tais como ácido crómico ou permanganato, suportado num polímero, Cl2-piridina, molibdato de amónio-H202, Nar02-CAN, NaOCl em HOAc, cromato de cobre, óxido de cobre, níquel de Raney, acetato de paládio, reagente de Meerwin-Pondorf-Verley (t-butóxido de alumínio com outra cetona) e IV-bromossuccinimida.

De seguida, a adição de um reagente de Grignard, tal como, por exemplo, um halogeneto de alquilo-, alcenilo- ou alcinilo-magnésio, tais como CH3MgBr, CH3CH2MgBr, vinilMgBr, alilMgBr e etinilMgBr ou um alquilo-, alcenilo- ou alcinilo-lítio, tal como CH3Li, num solvente orgânico adequado, tal como, por exemplo, éter dietílico ou THF, através da ligação dupla do grupo 2'-carbonilo, proporciona um álcool terciário nesta posição. A adição de um halogenetos de hidrogénio num solvente adequado, tal como, por exemplo, Hr em HOAc, no passo subsequente, proporciona um grupo de saída (LG), tais como, por exemplo, um cloro, bromo ou iodo, no carbono C-l anomérico do anel de açúcar que mais tarde, produz uma ligação nucleosídica. Outros LG adequados, incluem C-l sulfonatos, tais como, por exemplo, metanossulfonato, trifluorometanossulfonato e/ou p-toluenossulfonato. 114 A introdução no próximo passo de um sal metálico (Li, Na ou K) de uma 2-azapurina, apropriadamente, substituída num solvente orgânico adequado, tais como, por exemplo, THF, acetonitrilo ou DMF, resulta na formação da ligação nucleosídica desejada e adição da base 2-azapurina desejada. Esta reacção de substituição pode ser catalizada através de um catalisador de transferência de fase, como TDA-1 ou cloreto de trietilbenzilamónio. A introdução de um substituinte "Z" em qualquer uma das Fórmulas base (i)-(vi) pode ser, opcionalmente, efectuada, subsequentemente, à adição inicial dos grupos de protecção. Por exemplo, a introdução de um grupo amino para "Z" é efectuada pela adição de uma amina apropriada num solvente apropriado no intermediário 2'-C-halo, mesmo antes do último passo da remoção dos grupos de protecção. As aminas apropriadas incluem amónia alcoólica ou líquida para produzir uma amina primária (-NH2) , uma alquilamina para produzir uma amina secundária (-NHR), ou uma dialquilamina para produzir uma amina terciária (-NRR').

Finalmente, o nucleósido pode ser desprotegido através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica, como por Greene et ai., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edição, 1991. É para ser notado que este esquema reaccional pode ser utilizado para ligar qualquer uma das bases análogas do nucleósido purina proporcionadas nos Esquemas 8-13 com uma porção ribofuranosilo. 115

Esquema 14

A presente invenção é descrita através de ilustração nos exemplos seguintes. Será entendido pelos especialistas na técnica, que estes exemplos não são, de modo algum, limitativos e essas variações de detalhes podem ser efectuadas sem se afastar do espírito e âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS

Os compostos de teste foram dissolvidos em DMSO numa concentração inicial de 200 série em meio de cultura. μΜ e, depois, foram diluídos em 116 A menos que indicado de outro modo, as células do rim de hamster bay (HK-21) (ATCC CCL-10) e bosTaurus (T) (ATCC CRL 1390) foram crescidas, a 37 °C , numa atmosfera de CO2 humidificada a (5%) . As células HK-21 foram passadas em MEM Eagle adicionado de L-glutamina 2 mM, soro bovino fetálico a 10% (FS, Gibco) e SS Earle ajustado, para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e aminoácidos não essenciais 0,1 mM. As células T foram passadas em meio Eagle Modificado por Dulbecco com L-glutamina 4 mM e soro de cavalo a 10% (HS, Gibco) , ajustado para conter bicarbonato de sódio a 1,5 g/L, glucose a 4,5 g/L e piruvato de sódio 1,0 mM. A estirpe de vacina 17D (YFV-17D) (Stamaril®, Pasteur Merieux) e virus da Diarreia Virai Bovina (BVDV) (ATCC VR-534) foram utilizados para infectar as células HK e T, respectivamente, em garrafas de 5 cm2. Após um período de incubação de 3 dias a 37 °C, foi observado um efeito citopático acentuado. As culturas foram liofilizadas três vezes, os detritos celulares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi dividido em aliquotas e armazenado a -70 °C. O YFV-17D e VDV foram titulados em células HK-21 e T, respectivamente, que foram crescidas até à confluência em placas de 24 poços.

Os seguintes exemplos surgiram por selecção de um açúcar apropriado, opcionalmente substituído ou anel ciclopentano ligado com uma base 2-azapurina opcionalmente substituída e preparados de acordo com os seguintes Esquemas sintéticos: 117

Exemplo 1: Síntese de 1'-C-ramificado-ribofuranosilo, -sulfonilo, -tiofenilo ou ciclopentanil-2-azapurinas opcionalmente substituídos;

Exemplo 2: Síntese de 2'-C-ramificado-ribofuranosilo, -sulfonilo, -tiofenilciclopentanil-2-azapurinas opcionalmente substituídos; de 3'-C-ramificado-ribofuranosilo, ou ciclopentanil-2-azapurinas de 4'-C-ramificado-ribofuranosilo, ou ciclopentanil-2-azapurinas

Exemplo 3: Síntese -sulfonilo, -tiofenilo opcionalmente substituídos;

Exemplo 4: Síntese -sulfonilo, -tiofenilo opcionalmente substituído;

Exemplos 5-13: Síntese de compostos específicos da presente invenção; e

Exemplos 14-18: Resultados os testes biológicos dos exemplos representativos dos compostos da presente invenção.

Exemplo 1. Ribofuranosilo, -sulfonilo ou ciclopentanil-2-azapurina 1' -C-ramifiçados, opcionalmente substituídos. 0 composto do título é preparado de acordo com os Esquemas 1, 2, ou 7. De um modo semelhante, mas utilizando o açúcar apropriado ou anel ciclopentanose e base 2-azapurina opcionalmente substituída, podem ser preparados os seguintes nucleósidos das Fórmulas (I) ou (II): 118

em que: a base pode ser qualquer das Fórmulas (A)-(G), como aqui descrito, onde R, em cada exemplo, pode existir na forma mono-, di- ou trifosfato.

Alternativamente, o rearranjo de Dimroth pode ser utilizado para preparar 2-azapurinas a partir da base purina correspondente. Nesta reacção, um heterociclo imino N-alquilado ou N-arilatado sofre rearranjo no seu heterociclo alquilamino or arilamino correspondente.

Exemplo la: 1'-C-hidroximetil-2-azaadenosina

Passo 1: 2-azaadenina, NaH, ACN, ta, 24 h; Passo 2: MeONa/MeOH. 119 0 material de partida 2-azaadenina pode ser preparado a partir do malonitrilo através da síntese ensinada por D. W. Wooley, Journal of Biological Chemistry, (1951), 189:401.

Exemplo 2. Ribofuranosilo, -sulfonilo ou ciclopentanil-2-azapurina 2'-C-ramifiçados, opcionalmente substituídos. O composto do título é preparado de acordo com os Esquemas 3, 4, ou através da protecção dos grupos substituintes seleccionados, apropriadamente, nos Esquemas 7 ou 8. De um modo semelhante, mas utilizando o açúcar ou anel ciclopentano apropriado e base 2-azupurina opcionalmente substituída, podem ser preparados os seguintes nucleósidos das Fórmulas (I) ou (II):

em que: a base pode ser qualquer das Fórmulas (A)-(G), como aqui descrito, onde R, em qualquer exemplo, pode existir na forma mono-, di- ou trifosfato.

Alternativamente, o rearranjo de Dimroth pode ser utilizado para preparar 2-azapurinas a partir da base purina correspondente. Nesta reacção, um heterocíclo imino N-alquilado 120 ou N-arilatado sofre rearranjo no seu heterociclo alquilamino ou arilamino correspondente.

Exemplo 2: 2'-C-metil-2-azaadenosina NHs

R = 2—C—metil—p—D— ribofuranosilo

OH OH

4 (Síntese de acordo com o processo de J. A. Montgomery, Nucleic Acid Chemistry, 1978, Part II, 681-685 começando com a 2'-C-metiladenosina.)

Passo 1: H202, AcOH, 80%; NaOH, H20, EtOH, 30%, Passo 4: Passo 5: H2/Pd/C, 3 atm, MeOH, 50%.

Passo 2: BnBr, DMAc , Passo 3: NH3/MeOH, 80 °C, 2 dias, 60%; 30% Passo 6: NaN02, AcOH, H20, 4-Amino-7-(2-C-metil-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]-v-triazina (2'-C-metil-2-azaadenosina) : RMN de ΤΗ (DMSO-dg) δ 8,82 (s, 1H, H8), 7,97 (br, 2H, NH2) , 6,12 (s, 1H, Hl') , 5,22-5,51 (m, 3H, 30H), 3,70-4,17 (m, 4H, H3 ', H4 ' , 2H5'), 0,80 (s, 3H, CH3) . RMN de 13C (DMSO-d6) δ 153, 146, 142, 116, 92, 83, 79, 72, 60, 20. m/ z (FAB>0) 565 (2M+H)+, 283 (M+H) +, (FAB<0) 563 (2M-H) . 121

Alternativamente, a 2-azaadenosina apresentada como o produto final no Exemplo 2. a. pode ser preparada começando com adenosina, de acordo com o processo de J. A. Montgomery, Nucleic Acid Chemistry, 1978, Part II, 681-685, começando com 2'-C-metiladenosina ou via 2-azainosina num processo sintético ensinado por R. P. Panzica, Journal of Heterocyclic Chemistry, 1972, 9:623- 628, começando pelo ribósido AICA.

Exemplo 2b: 2'-C-metil-pirrolo-4-amino-l,2,3-triazina

R = 2-C-metil-p-D-ribofuranosilo Passo 4

HO

Passo 6 OH OH

Passo 5

,OBn

Passo 1: NCS, DMF; Passo 2: mcPBA, AcOH; Passo 3: a) BnBr, DMAc; b) NaOH, H20, EtOH, Passo 4: NH3/MeOH, 80 °C, Passo 5: H2/Pd/C, MeOH; Passo 6: NaN02, AcOH, H20.

Exemplo 3. Ribofuranosilo, -sulfonilo ou ciclopentanil-2-azapurina 3'-C-ramifiçados, opcionalmente substituídos. O composto do título é preparado de acordo com os Esquemas 5, 6, ou através da protecção dos grupos substituintes, apropriadamente, seleccionados no Esquema 8. De um modo 122 semelhante, mas utilizando o açúcar apropriado ou anel ciclopentano e base 2-azapurina opcionalmente substituída, podem ser preparados os seguintes nucleósidos das Fórmulas (I) e (II):

em que: a base pode ser qualquer das Fórmulas (A)-(G) como aqui descrito, onde R, em qualquer situação, pode existir na forma mono-, di- ou trifosfato.

Alternativamente, pode ser utilizado o rearranjo de Dimroth para preparar as 2-azapurinas a partir da base purina correspondente. Nesta reacção, um heterociclo imino N-alquilado ou N-arilatado sofre rearranjo no seu heterociclo alquilamino ou arilamino correspondente.

Exemplo 4. Ribofuranosilo, -sulfonilo ou ciclopentanil-2-azapurina 4'-C-ramifiçados, opcionalmente substituídos. 0 composto do título é preparado de acordo com modificação a partir da pentodialdo-furanose correspondente. De um modo semelhante, mas utilizando o açúcar ou anel ciclopentano apropriado e base 2-azapurina opcionalmente substituída, podem ser preparados os seguintes nucleósidos das Fórmulas (I) ou (II): 123

em que: a base pode ser qualquer das Fórmulas (A)-(G) como aqui descrito, onde R, em cada situação, pode existir na forma mono-, di- ou trifosfato.

Alternativamente, o rearranjo Dimroth pode ser utilizado para preparar 2-azapurinas a partir da base purina correspondente. Nesta reacção, um heterociclo imino N-alquilatado ou N-arilatado sofre o rearranjo no seu heterociclo alquilamino ou arilamino correspondente. 4-amino-l-(D-D-

Exemplo 5: Síntese de ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazina

Passo D \

HO OH 124

Passo A: 1-(2,3,5-tri-0-benzoil-p-D-ribofuranosil)-5- benziloximetilimidazo[4,5-d]piridazin-4-ona: A 5-benziloximetilimidazo[4,5-d]piridazina (500 mg, 1,95 mmol) [para preparação ver Journal of Heterocyclic Chemistry, 1984, Vol 21, 481] foi aquecida a refluxo, em hexametildissilazano (6 mL) durante 1 hora. A mistura foi evaporada até à secura para proporcionar um xarope amarelo claro que foi dissolvido em 1,2-dicloroetano seco (20 mL) . A 1-O-acetil-2,3,5-tri-0-benzoil^-D-ribofuranose (1,04 g, 2,06 mmol) e o cloreto estânico (0,4 mL, 3,44 mmol) foram adicionados, a 20 °C e a mistura foi agitada durante 3 horas. A mistura reaccional foi vertida numa solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio, filtrada através de uma almofada de celite e lavada por diclorometano. A camada orgânica foi evaporada até à secura para proporcionar uma espuma amarela. O produto em bruto foi purificado em sílica gel utilizando n-hexano/acetato de etilo (3/2) como eluente, para proporcionar o composto do título (703 mg) como um pó branco. RMN de ΧΗ (DMSO-de) δ ppm: 4,39 (s, 2H, CH2) , 4,60 (m, 2H), 4, 73 (m, 1H), 5,34 (dd, 2H, CH2 ), 5,77-5,88 (m, 2H, H2 ' and H3'), 6, 56 (m, 1H, Hl'), 6,98 -7, 10 (m, 5H), 7, 23-7,32 (m, 6H) , 7,41-7, 51 (m, 3H), 7,68-7,73 (m, 2H) , 7,74-7,8 (m, 4H) , 8,51 (s, 1H), 8, 52 (s, 1H) .

Passo B: 1-(2,3,5-tri-Q-benzoil^-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazin-4-ona: A uma solução contendo o composto do Passo B (500 mg, 0,7 mmol), em diclorometano seco (25 mL) foi adicionada uma 125 solução pré-arrefecida (-78 °C) de tricloreto de boro 1 M (5 mL) a -78 °C e foi agitada durante 2 horas, a -78 °C. Foi adicionada uma mistura de metanol/diclorometano (1/1) à mistura, a -78 °C e, depois, a 20 °C. A mistura reaccional foi evaporada até à secura para proporcionar um pó amarelo. O produto em bruto foi purificado em sílica gel utilizando n-hexano/acetato de etilo (3/2) como eluente, para proporcionar o composto do título (400 mg) como um pó amarelo. RMN de ΤΗ (DMSO-de) δ ppm: 4, 77-4.98 (m, 3H, H4' , 2H5' ) , 5,95-6,12 (m, 2H, H2' e H3' ) , 6,65 (m, 1H, Hl'), 7, 39-7, 76 (m, 9H), 7, 84-8, 06 (m, 6H) , 8,64-5, 79 (m, 2H, H3 e H8), 12,84 (br, 1H, NH).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 581 (M+H)+, (FAB<0) 579 (M-H)~

Passo C: 4-cloro-l-(2,3.5-tri-0-benzoil-3-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina:

Uma solução contendo o composto do Passo B (1,32 g, 2,27 mmol), a N,N-dietilanilina (365 pL), cloreto de tetrabutilamónio (1,2 g) , cloreto fosforoso destilado de fresco (1,3 pL) e acetonitrilo anidro (17 mL) , foi agitada, a 90 °C, durante 1 hora. A mistura reaccional foi vertida sobre gelo picado/água. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 60 mL). A camada orgânica foi lavada com hidrogenocarbonato de sódio a 5%, água e foi evaporada até à secura. O produto em bruto foi purificado em sílica gel utilizando n-hexano/acetato de etilo (3/1) como eluente, para proporcionar o composto do titulo (404 mg) como um pó amarelo. 126 m, 2H) , 4,9-6,95 (m, 1H) 6,90 (d, 1H, J= 5,2 Hz i, 6H), , 9,10 (s, 1H, H8) RMN de (DMSO-dg) δ ppm: 4,82-6,87 6,0-6,08 (m, 1H), 6,12-6,19 (m, 1H)

Hl'), 7, 47-7, 73 (m, 9H) , 7,88-8,12 9,90 (s, 1H, H3).

Passo D: 4-amino-l-(β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazina: O composto do Passo C (420 mg, 0,7 mmol) foi adicionado a uma solução de amónia em metanol e foi agitada, numa bomba de aço até à secura, a 150 °C ,durante 6 horas. A mistura reaccional foi evaporada até à secura para proporcionar um óleo castanho que foi purificado em coluna (C18) de fase reversa em sílica gel, utilizando água como eluente, para proporcionar o composto do título (50 mg) como um pó amarelo. RMN de (DMSO-de) δ ppm: 3,58-4, 48 (m, 5H, H2', H3', H4', 2H5'), 5,14-5,68 (m, 3H, 3xOH), 5,90 (s, 1H, Hl'), 6,61 (br, 2H, NH2), 8,59 (s, 1H, H8), 9,12 (s, 1H, H3)

Exemplo 6. Síntese de 1-(3-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazin-4-ona o

Baí CBl o

A 1-(2,3,5-tri-0-benzoil^-D-ribofuranosilo)imidazo[4,5 — d]piridazin-4-ona (555 mg, 0,9 mmol) foi adicionada a uma 127 solução de metilato de sódio (205 mg) em metanol (25 mL) e agitado, a 20 °C, durante 2 horas. A mistura reaccional foi evaporada até à secura. O resíduo foi dissolvido em água e lavado com acetato de etilo. A camada aquosa foi concentrada sob pressão. O produto em bruto foi purificado em coluna (C18) de fase reversa de sílica gel, utilizando água como eluente, para proporcionar o composto do título (220 mg) como um pó branco. RMN de ΧΗ (DMSO-de) δ ppm: 3,59-3,62 (m, 2H), 4,02 \—1 e (m, 1H), 4.22 (m, 1H ), 5,16-5,72 (m, 3H, 3xOH) , 5,91 (s, Hl') , 8,52 (s, 1H, H8) , 8,68 (s, 1H, H3) , 12,75 (br, 1H, NH).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 537 (2M+H)+, 269 (M+H)+, (FAB<0) 535 (2M+H)+, 26 7 (M-H)~~

Exemplo_7_._Síntese_de_4-amino-l- (2-C-metil-P~D- ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina

Passo A: 1-(2-C-metil-2,3,5-tri-0-benzoil-3-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazin-4-ona A uma suspensão de imidazo[4,5-d]piridazina (3,48 g, 25,5 mmol) [para preparação ver Journal of Heterocyclic Chemistry, 1969, Vol 6, 93] em acetonitrilo seco (35 mL) , foi 128 adicionada 1,2,3,5-tetra-0-benzoil-2-C-metil-p-D-ribofuranose (14,48 g, 25,0 mmol), a 20 °C e agitada durante 15 min. Foi adicionado DBU (11,5 mL, 76,3 mmol) a 0 °C e a solução foi agitada durante 15 min a 0 °C. Foi adicionada TMSOTf (24,7 mL, 127,8 mmol) a 0 °C e a mistura foi aquecida a 80 °C durante 20 horas. A mistura reaccional foi vertida numa solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi evaporada até à secura para proporcionar um pó amarelo. O produto em bruto foi purificado em sílica gel utilizando diclorometano/metanol (99,3/0,7) como eluente, para proporcionar um pó ligeiramente amarelo que foi cristalizado a partir de isopropanol para proporcionar o composto do título (2,45 g) como um pó branco. RMN de ΧΗ (DMSO-dê) δ ppm: 1,48 (s, 3H, CH3) , 4, 75-4, 96 (m, 3H, H4', 2H5'), 5,81 (d, 1H, J= 5,5 Hz, H3' ) , 6,99 (s, 1H, Hl'), 7, 39-7, 72 (m, 9H), 7, 92-8, 08 (m, 6H) , 8,64 (s, 1H, H8), 8,71 (s, 1H, H3), 12,89 (br, 1H, NH).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 1189 (2M+H)+, 585 (M+H)+, (FAB<0) 593 (M-H)~~

Passo B: 4-cloro-l-(2-C-metil-2,3,5-tri-Q-benzoil-ft-D-ribofuranosilo)imidazo[4,5-d]piridazina:

Uma solução contendo o composto do Passo A (300 mg, 0,50 mmol), a N,N-dietilanilina (1,2 mL) e cloreto fosforoso destilado de fresco (24 mL), foi agitada, a refluxo, durante 1 hora. A mistura reaccional foi evaporada até à secura. Foi adicionado diclorometano ao resíduo e a camada organica foi vertida sobre gelo picado/água. A camada aquosa foi extraída com 129 diclorometano. A camada orgânica foi lavada com hidrogenocarbonato de sódio a 5%, água e foi evaporada até à secura. 0 produto em bruto foi purificado em sílica gel utilizando éter dietílico/éter de petróleo (1/1) como eluente, para proporcionar o composto do título (295 mg) como um pó branco . RMN de ΧΗ (DMS0-d6) δ ppm: 1,5 (s, 3H, CH3) , 4,8-5,0 (m, 3H, H4', 2H5'), 5,85 (d, 1H, J= 5,5 Hz, H3'), 7.15 (s, 1H, Hl'), 7,38-8,08 (m, 15H), 9,15 (s, 1H, H8), 9,90 (s, 1H, H3)

Passo C: 4-amino-l-(2-C-metίΙ-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazina: O composto do Passo B (590 mg, 0,96 mmol) foi adicionado a uma solução de amónia em metanol e agitada numa bomba de aço, a 150 °C, durante 6 horas. A mistura reaccional foi evaporada até à secura para remover o metanol. O produto em bruto foi purificado em coluna (C18) de fase reversa em sílica gel, utilizando água como eluente, para proporcionar o composto do título (35 mg) como um pó branco. RMN de XH (DMSO-d6) δ ppm: 0, 70 (s, 3H, CH3), 3,64-3,98 (m, 4H, H3', H4', 2H5'), 5, 23-5,44 (m, 3H, 30H), 5,98 (s, 1H, Hl'), 6,63 (br, 2H, NH2), 8,68 (s, 1H, H 8) , 9,05 (s, 1H, H3) RMN de 13C (DMSO-d6) δ ppm: 155, 143, 132 , 131, 129, 93, 83, 79, 72, 20 .

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 282 (M+H) , (FAB<0) 280 (M-H) 130

Exemplo 8: Síntese de 4-substituída-l-(2-C-metil-p-D- ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina w

V * BJD 06Z w

Hff ÍH

w Passo A produtos OH NaOMe, MeOH 100°C, 24 h OH „ „ VU* HOW \_Í-CH3 HQ CH Cl NH3/MeOH 20 °C, 48 h ¢0 H$ %H 1-(2-C-metil-β-D-ribofuranosilo)imidazo[ 4,5-d]piridazin-4- ona: RMN de ΤΗ (DMSO-de) δ ppm: 1,17 (s, 3H, CH3) , 3,44-3,59 (m, 1H) , 3,68-3,78 (m, 1H), 3,86-3,94 (m, 1H), 4,11-4,21 (m, 1H), 4,8-5,4 (m, 3H, 30H), 6,05 (s, 1H, Hl'), 8,35 (s, 1H, H8), 8,37 (s, 1H, H3), 12,67 (br, 1H, NH).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 283 (2M+H)+, 281 (M+H)+ 131 4-cloro-l-(2-C-metil-p-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina RMN de (DMSO-dg) δ ppm: 0.72 (s, 3H, CH3) , 3,69-4, 06 (m, 4H, H3', H4', 2H5'), 5,34-5,51 (m, 3H, 30H), 6,19 (s, 1H, Hl'), 9,18 (s, 1H, H8), 9,87 (s, 1H, H3).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 301 (M+H)+, (FAB<0) 299 (M-H)“

Exemplo 9: Síntese dos derivados nucleósidos de 4,7-diamino-imidazo[4,5-d]piridazina B& Ó8z

<'TB CN

Passo A

BjS CBz

N-^CN

HO OH

nh2

Passo A: A uma suspensão de 4,5-dicianoimidazole (1 eq.) [para preparação ver Journal of Organic Chemistry, 1976, Vol 41, 713J_ em DMF seca (0,2 M) foram adicionados os derivados β-D-ribofuranose protegida (1 eq.), a 20 °C. Foi adicionado DBU (3 eq.) a 0 °C. A solução foi agitada durante 20 min, a 0 °C. Foi adicionado TMSOTf (4 eq.), a 0 °C e a mistura foi aquecida a 60 °C, durante 1 hora. A mistura reaccional foi vertida numa solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio e extraída com diclorometano. A camada orgânica foi evaporada até à secura para proporcionar um pó amarelo. O produto em bruto foi purificado em sílica gel, utilizando éter dietílico/éter de petróleo como o 132 eluente, para proporcionar o composto do título (ver a seguinte tabela 1).

Passo B: 0 composto do Passo A (1 eq. ) foi agitado com mono-hidrato de hidrazina (20 eq.) e ácido acético (1,4 eq.), a 75 °C, durante várias horas (ver a seguinte tabela 1). A mistura reaccional foi vertida em água. A camada aquosa foi lavada com diclorometano e evaporada sob pressão. O resíduo foi purificado em coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (ver a seguinte tabela 1).

Tabela 1:

R produtos do Passo A rendimento (Passo A) experiências (Passo B) produtos do Passo B rendimento (Passo A) H 63% 75 °C durante 1,5h. 58% (pó branco) NMj KC? OH „jA» ~Tf BlÕ 3βι ch3 62% 75 °C durante 20h. 15% (pó branco) <-X νλοι “TC»,, tucT ΐβι NHj {tf, HO 'SH 133 4,7-diamino-l-g-D-ribofuranosiloimidazo[4,5-d]piridazina: RMN de 3H (DMSO-d6) δ ppm: 3,58-4,32 (m, 5H, H2', H3', H4', 2H5'), 5,10-5,90 (br, 7H, 2NH2, 30H), 6,11 (s, 1H, Hl'), 8,50 (s, 1H, H8) RMN de 13C (DMSO-d6) δ ppm: 151, 144, 142, 132, 122, 89, 86, 75, 70,61.

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 283 (M+H)+, (FAB<0) 281 (M-H)“ 4,7-diamino-l-(2-C-metil-ft-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazina: RMN de 1H (DMSO-de) δ ppm: 0,75 3,84-3,94 (m, 3H), 5,32 (m, 3H (br, 1H, NH2), 6,21 (s, 1H, Hl') RMN de 13C (DMSO-de) δ ppm: 151, 71, 59, 20. Espectro de massa: m/z (FAB>0) 295 (M-H)“ (s, 3H, CH3), 3,67-3, 76 (m, 1H) , 30H) , 5,43 (br, 1H, NH2), 5,71 8,78 (s, 1H, H8) 144, 142, 132, 123, 92, 83, 78, 593 (2M+H) +, 297 (M+H)+, (FAB<0) 134

Exemplo 10: Síntese de nucleósidos 4, 7-disubstituído- imidazo[4,5-d]piridazina α

OCHsfNjj) "^N N30OCHJ)

Passo A: Processo típico para a preparaçao de nucleósidos de 4,7-dicloroimidazo[4,5-d]piridazina protegidos: A 4,7-dicloroimidazo[4,5-d]piridazina [para preparação ver Journal of Heterocyclic Chemistry, 1968, Vol 5, 13J_ (1 eq. ) foi aquecida a refluxo em hexametildisilazano durante 12 horas. A mistura foi evaporada até à secura para proporcionar um sólido que foi dissolvido em 1,2-dicloroetano. Os derivados β-D-ribofuranose protegidos (1.1 eq.) e o cloreto estânico (1,4 eq.) foram adicionados, a 20 °C e a solução foi agitada durante 3 horas. A mistura reaccional foi vertida em solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio, filtrada através de uma almofada de celite e lavada com diclorometano. A camada orgânica foi evaporada até à secura. O produto em bruto foi purificado em sílica gel, utilizando diclorometano/acetona (40/1) como 135 eluente, para proporcionar o composto do título (ver a seguinte tabela 2).

Passo B: Processo típico para a preparaçao de nucleósidos de 4,7-dicloroimidazo[4,5-d]piridazina: 0 composto do Passo A (1 eq.) foi agitado com metóxido de sódio (0,1 eq.) em metanol durante várias horas. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão. Foi adicionada água ao resíduo. A camada aquosa foi lavada com acetato de etilo e foi evaporada sob pressão. O resíduo foi purificado em coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (ver a seguinte tabela 2).

Passo C: Processo típico para a preparaçao de nucleósidos de imidazo[4,5-d]piridazina:

Uma mistura do composto do Passo A (1 eq.), paládio em carvão (10%), acetato de sódio (4.2 eq.) em acetato de acetilo, foi agitada sob hidrogénio até o composto do Passo A ter sido consumido. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão e foi purificada em sílica gel para proporcionar o composto do título protegido que foi agitado com metóxido de sódio (3.3 eq.) em metanol. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão. Foi adicionada água ao resíduo. A camada aquosa foi lavada com acetato de etilo e foi evaporada sob pressão. O resíduo foi purificado em coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título (ver a seguinte tabela 2). 136

Passo D: Processo típico para a preparação de nucleósidos cloro-metoxi-imidazo[4,5-d]piridazina: 0 composto do Passo A (1 eq.) foi agitado com metóxido de sódio (3,3 eq.) em metanol 0,3 M, a 20 °C, durante várias horas, a mistura reaccional foi evaporada sob pressão. Foi adicionada água ao resíduo. A camada aquosa foi lavada por acetato de etilo e foi evaporada sob pressão. O resíduo foi purificado em coluna de fase reversa para proporcionar um composto cuja regiosselectividade não é apresentada (ver a seguinte tabela 2).

Passo E: Processo típico para a preparação de nucleósidos metoxi-imidazo[4,5-d]piridazina:

Uma mistura do composto do Passo D (1 eq.), paládio em carvão (10%), acetato de sódio (4.2 eq.) em água/etanol (1/1) foi agitada sob hidrogénio até o composto do Passo A ter sido consumido. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão reduzida e foi purificada em coluna de fase reversa para proporcionar o composto do título cuja regiosselectividade não é apresentada (ver a seguinte tabela 2).

Passo F: Processo típico para a preparaçao de nucleósidos 4,7-diazidoimidazo[4,5-d]piridazina protegidos; O composto do Passo A (1 eq.) foi tratado, a 50 °C, com azida de sódio (1.5 eq.) em DMF. Foi adicionada água à mistura. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi evaporada sob pressão. O produto em bruto foi purificado em sílica gel utilizando éter dietílico/éter de 137 petróleo (7/3) como eluente, para proporcionar o composto do título (ver a seguinte tabela 2).

Passo G: Processo típico para a preparação de nucleósidos azido-metoxi-imidazo[4,5-d]piridazina: 0 composto do Passo F (1 eq.) foi agitado, a 50 °C, com metóxido de sódio (1 eq.) em metanol. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão reduzida. Foi adicionada água ao resíduo. A camada aquosa foi lavada com acetato de etilo e foi evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado em coluna de fase reversa utilizando água/acetonitrilo como eluente, para proporcionar o composto do título cuja regiosselectividade não foi apresentada (ver a seguinte tabela 2).

Passo H: Processo típico para a preparaçao de nucleósidos amino-azido-imidazo[4,5-d]piridazina:

Uma mistura do composto do Passo F (1 eq.), paládio em carvão (10%), acetato de sódio (4.2 eq.) em acetato de etilo foi agitada, sob hidrogénio, até o composto do Passo F ter sido consumido. A mistura reaccional foi filtrada sobre celite e foi evaporada sob pressão reduzida. O produto em bruto foi purificado em sílica gel para proporcionar o composto do título protegido, cuja regiosselectividade não é apresentada (ver a seguinte tabela 1). Estes compostos foi agitado com metóxido de sódio (3 eq.) em metanol. A mistura reaccional foi evaporada sob pressão reduzida. Foi adicionada água ao resíduo. A camada aquosa foi lavada com acetato de etilo e foi evaporada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado em coluna de fase 138 do título cuja seguinte tabela 2). reversa para proporcionar o composto regiosselectividade não é apresentada (ver a

Tabela 2 : experiências produtos rendimento Passo A θδ B7°xy° BíO C8í 60% (pó branco) Passo A a “Υ&Τ* Bk? CSz 34% (pó branco) Passo B HÒ" CH (pó branco) Passo C vo KÍ CH 71% (pó branco) Passo D OCH,(CI) ^ TY a(ocHj) h5 ch 55% (pó branco) 139 (continuação) experiências produtos rendimento Passo E OCHs(H) . O N H° ”(0C>W H$ Sh 55% (pó branco) Passo F BzO OBz 50% (pó amarelo) Passo F Ϊ* 0 «Ϊ “W BfcÕ OBZ 50% (pó amarelo) Passo G NafOCHJ * o N HO\^CH3OCH3<N3) HÕ OH 36% (pó beige) Passo H NHs(NsJ A O Bt°\XcH3 BzÕ OBz 98% (pó branco) Passo H N^(N3) A O N'VN H0\Ích,n^ HÕ OH 49% (pó branco) 140

4,7-Dicloro-l-(2,3,5-tri-0-benzoil-p-D ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de XH (DMSO-d6) δ ppm: 4,8-5,0 (m, 3H, H4', 2H5'), 6,05 (s, 1H, H3 ' ) , 6,25 (s, 1H, H2'), 7,1 (d, 1H, J = 4 Hz, Hl'), 7,4-8,0 (m, 15H), 9,25 (s, 1H, H8).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 633 (M+H)+ 4, 7-dicloro-l-(2-C-metil-2,3,5-tri-O-benzoí1-β-Ρ-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de (DMSO-d6) δ ppm: 1,65 (s, 3H, CH3) , 4,9-5,0 (m, 3H, H4', 2H5'), 5,8 (s, 1H, H3'), 7,35-8,05 (m, 16H incluindo Hl'), 9,3 (s, 1H, H8) . 4,7-dicloro-l-(2-C-metil-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazina: RMN de XH (DMS0-d6) δ ppm: 0,84 (s, 3H, CH3) , 3,77 (m, 1H) , 3,88-4,04 (m, 3H), 5,30-5,60 (m, 3H, OH), 6,5 (s, 1H, Hl'), 9,44 (s, 1H, H8) . 1-(2-C-metil-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de (DMSO-d6) δ ppm: 0,80 (s, 3H, CH3) , 3.75 (m, 1H) , 3, 80-4, 00 (m, 3H) , 5.40 (br, 3H, OH), 6,2 (s, 1H, Hl'), 9,0 (s, 1H), 9,65 (s, 1H), 9,85 (s, 1H). 141 7-cloro-4-metoxi-l-3-D-ribofuranosiloimidazo[4.5-d]piridazina ou 4-cloro-7-metoxi-l-3-D-ribofuranosiloimidazo[4, 5-d]piridazina: RMN de 3H (DMSO-d6) δ ppm: 3,6-4,5 (m, 8H, 2H5 ', H4 ', H3 ', H2 ', OCH3), 5,40 (m, 3H, oh; ), 6,2 (s, 1H, Hl'), 9,0 (s, 1H, H8) . 675 (2M+H)+, Espectro de massa: m/z (FAB>0) 317 (M+H)+, (FAB<0) 315 (Μ-ΗΓ 4-metoxi-l-p-D-ribofuranosiloimidazo[4,5-d]piridazina_ou 7-metoxi-l^-D-ribofuranosilimidazo[4,5-d]piridazina: RMN de TH (DMSO-de) δ ppm: 3,54-3,79 (m, 2H), 3,95 (m, 1H), 4,15 (m, 1H, H3 ' ) , 4,2 (s, 3H, OCH3), 4,4 (m, 1H, H2 ' ) , 5,05-5,70 (m, 3H, OH) , 6,2 (d, 1H, J = 4,8 Hz, Hl'), 8,95 (s, 1H), 9,3 (s, 1H) . RMN de 13C (DMSO-d6 ) δ ppm: 154, 145, 143, 142, 121 , 90, 85, 75, 70, 61, 55.

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 283 (M+H)+, (FAB<0) 281 (M-H) 4, 7-diazido-l-(2,3,5-tri-0-benzoil-p-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de 3H (DMSO-d6) δ ppm: 4,81-5,1 (m, 3H, H4', 2H5'), 6,24-6,49 (m, 2H, H2', H3 ' ), 7,2 (d, 1H, J = 5 Hz, Hl'), 7,4-8,0 (m, 15H), 9,12 (s , 1H, H8). 142

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 647 (M+H) 4,7-diazido-l-(2-C-metil-2.3.5-tri-0-benzoil-p-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: 3H NMR (DMSO-d6) δ ppm: 1,6 (s, 3H, ch3) , 4,96 (m, 3H, H4 ' , 2H5'), 6,02 (m, 1H, H3'), 7,24 (s, 1H, Hl ' ) , 7,40-7,52 (m, 6 H) , 7,60-7,71 (m, 3H) , 7,93-8,1 (m, 6H), 9,10 (s, 1H, H8).

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 661 (M+H) 4-azido-7-metoxi-(2-C-metίΙ-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5- d] piridazina_ou_7-azido-4-metoxi-l- (2-C-metil-β-Ρ- ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de 3Η (DMSO-de) δ ppm: 0,75 (s, 3H, CH3), 3, 70-3,98 (m, 2H) , 4,05 (m, 2H), 4,2 (s, 3H, OCH3) , 5,32-5,61 (br, 3H, OH), 6,36 (d, 1H, J = 5,7 Hz, Hl'), 9,18 (s, 1H, H8), RMN de 13C (DMSO-d6) δ ppm: 156, 143, 136, 129, 123, 94, 83, 79, 71, 59, 57, 20.

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 675 (2M+H)+, 338 (M+H)+, (FAB<0) 673 (2M-H)“, 336 (M-H) 143 4-amino-7-azido-l-(2-C-metil-2,3,5-tri-O-benzoí1-β-Ρ-ribofuranosil)imidazo[4,5-d] piridazina ou 7-amino-4-azido-l-(2-C-metil-2,3,5-tri-O-benzoíΙ-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de ΤΗ (DMSO-d6) δ ppm: 01,64 (s, 3H, CH3), 4,95 (m, 3H) , 6,06 (m, 1H, H3 ' ) , 7,18 (s, 1H, Hl'), 7, 40-7,52 (m, 6H) , 7,63-7,74 (m, 5H, incluindo NH2) , 7,91-8,04 (m, 6H) , 8,96 (s, 1H, H8),

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 1269 (2M+H)+, 635 (M+H)+, (FAB<0) 633 (Μ-ΗΓ 4-amino-7-azido-(2-C-metίΙ-β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5- d] piridazina_ou_7-amino-4-azido-l- (2-C-metil-β-Ρ- ribofuranosil)imidazo[4,5-d]piridazina: RMN de ΤΗ (DMSO-dõ) δ ppm: 0,75 (s, 3H, CH3), 3,65-4,15 (m, 4H) , 5,30-5, 55 (br, 3H, 3xOH), 6,27 (s, 1H, Hl'), 7,63 (br, 2H, NH2) , 9,03 (s, 1H, H8), Espectro de massa: m/z (FAB>0) 323 (M+H)+, (FAB<0) 321 (M-H) 144

Exemplo 11: Síntese de nucleósidos 4-amino-6-substituído-imidazo[4,5-d]-v-triazina <'

HO OH

N

Passo A: 4-amino-6-bromo-7- (/3-D-ribof uranosil) imidazo [4, 5-d] -v-triazina: A 2-azaadenosina [para preparação ver Patente WO 01/16149, 2001] (70 mg, 0,26 mmol) foi adicionada a uma solução de acetato de sódio 0,5 M (1,4 mL). A solução foi aquecida até a 2-azaadenosina ter sido solubilizada. Foi adicionada uma solução de brometo (100 pL de Br2 em 10 mL de água) (6,3 mL, 1,22 mmol) e a mistura foi agitada, a 20 °C, durante 3 dias. Foi adicionada uma segunda porção de solução de brometo (6,3 mL, 1,22 mmol) e a mistura foi agitada, a 20 °C, durante 3 horas. A mistura reaccional foi evaporada até à secura. O produto em bruto foi purificado por coluna (C18) de fase reserva em sílica gel, utilizando água/acetonitrilo (9/1) como eluente, para proporcionar o composto do título com um pó amarelo. RMN de ΧΗ (DMSO-de) δ ppm: 3,55 (m, 1H, H5 ’ ) , 3,71 (m, 1H, H5 ’ ) , 4,01 (m, 1H, H4’), 4,31 (m, 1H, H3 ’ ) , 5,17 (m, 1H, H2 ’ ) , 5,19 (m, 1H, OH), 5,36 (m, 1H, OH), 5,58 (m, 1H, OH), 5,93 (d, 1H, J=6,47 Hz, Hi’), 8,08 (br, 2H, NH2) .

Espectro de massa: m/z (FAB>0) 349 (M+2H)+, m/z (FAB<0) 345 (M-2H)”. 145

Passo B : 4-amino-6-meti 1-7- (/3-D-ribofuranosil) imidazo [4, 5- d] -v-triazina: 0 composto do Passo A (112 mg, 0,3 mmol) foi aquecido até refluxo em hexametildisilazano (15 mL) durante 16 horas. A mistura foi evaporada até à secura para proporcionar um xarope que foi dissolvido em THF seco (12 mL) . Foi adicionado PPh3 (10 mg; 0,04 mmol), PdCl2 (3,5 mg; 0,02 mmol) e Α1Μβ3 (100 pL; 0,94 mmol). A mistura foi apresentada em refluxo, durante 5 horas. A mistura foi evaporada até à secura. O produto em bruto foi dissolvido em metanol (30 mL) na presença de cloreto de amónio. A mistura foi evaporada até à secura e o resíduo foi purificado em coluna (Cl 8) de fase reversa em sílica gel, utilizando água/acetonitrilo (de 9/1 a 6/4) como eluente, para proporcionar o composto do título (35 mg) como um pó amarelo. RMN de ΤΗ (DMSO-de) δ ppm: 2,67 (s, 3H, CH3) , 3,60 (m, 1H, Hs' ) , 3,72 (m, 1H, Hs' ) , 4,03 (m, 1H, H4'), 4,24 (m, 1H, H3' ) , 4,93 (m, 1H, H2'), 5,48 (m, 3H, OH), 5,92 (d, 1H, J=6,82 Hz, Hi' ) , 7,78 (br, 2H, NH2) .

Espectro de massa: m/z (FAB>0) (FAB>0) 283 (M+H)+, m/z (FAB<0) 281 (M-H)“. 146 ττνρτηρίο 12: Síntese de nucleósidos imidazo[4,5-d]-v-triazin- 4-ona

Passo A : 7-(3-D-ribofuranosilo)imidazo[4,5-d]-v-triazin-4- ona: 0 AICAR [para preparação ver Synthesis, 2003, No 17, 2639] (1 g, 3,87 iranol) foi adicionado a uma solução de ácido clorídrico 6 N (25 mL) , a -30 °C. Foi adicionada uma solução de nitrito de sódio 3 M (4 mL, 11,62 mmol) e a mistura foi agitada, a -30 °C, durante 2 horas. Foi adicionada uma solução pré-arrefecida (-30 °C) de etanol (25 mL) . Foi adicionada uma solução de amónia (28%) a -20 °C para pH=7. A mistura reaccional foi evaporada até à secura. 0 produto em bruto foi purificado em coluna (C18) de fase reversa em sílica gel, utilizando água como eluente, para proporcionar o composto do título (0,81 g) como um pó branco. RMN de TH (DMSO-de) δ ppm: 3, 58 (d, 1H , J=11,8 5 Hz, Hs'), 3,70 (d, 1H, J= 11, 85 Hz, H5' ) , 4, 00 (dd, 1H, J=3,92 Hz, 4, 02 Hz, H4'), 4,18 (dd, 1H, J=4,27 Hz, 4, 78 Hz, H3' ) , 4,54 (dd, 1H, J=4,86 Hz, 5, 19 Hz, H2') , 5, 18 (br, 1H, OH), 5, 35 (br, 1H, OH) , 5,73 (br, 1H, OH) , 6 , 08 (d, 1H , J=5 , 11 H z, Hi'), 8 ,65 (s, 1H, r Hs) . 147

Passo B: 7-(2,3, 5-Tri-O-acetil-β-Ρ-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]-v-triazin-4-ona: 0 composto do Passo A (1,68 g, 6,24 mmol) foi agitado em piridina (20 mL). O acético anidrido (2,3 mL, 25 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada, a 20 °C, durante 16 horas. A mistura foi evaporada até à secura para proporcionar um xarope que foi dissolvido em água. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi evaporada até à secura para proporcionar o composto do título (1,5 g) como uma espuma castanha. RMN de ΧΗ (DMSO-de) 8 ppm: 2,04 (s, 3H, COCH3) , 2,09 (s, 3H, COCH3) , 2,10 (s, 3H, COCH3) , 4,39 (m, 3H, 2xH5' et H4'), 5,53 (dd, 1H, J=4,39 Hz, 5,4 Hz, H3' ) , 5,80 (t, 1H, J=5,4 Hz, H2' ) , 6,26 (d, 1H, J=5,4 Hz, Hi'), 8,15 (s, 1H, H8) .

Exemplo 13: Métodos Alternativos para a Síntese de Análogos de Ribofuranosil-Purina I. Preparaçao de 4-metilamino-7- (f.3-D- ribofuranosil)imidazo[4,5-d]-v-triazina: A 4-metilamino-7-(β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]-v- triazina Va pode ser preparada de acordo com a seguinte síntese, onde o material de partida utilizado é o AICAR I. O AICAR pode ser preparado de acordo com a síntese publicada de Y. Yamamoto e N. Kohyama, Synthesis, 2003, 17:2639-2646. 148 A outra síntese de 4-metilamino-7-(β-D-ribofuranosil)imidazo[4,5-d]-v-triazina Va foi descrita de 2-azainosina II, de acordo com a síntese publicada por L.Towsend e Co, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2000, 19 (1&2) :39-68.

NaNfVHgO.HCI 6N KO GH I O NH Ac20/piridina -►

AcS QAC 01

KO OH Π

NHM

h5 CH Va poci3 α

AcÕ OAc IV II. Preparação de compostos derivados de 4-substituido-7-(2, 3-didesoxi-β-D-glicero-pentofuranosil)-imidazo-[4,5-d]-v-triazina:

Os compostos 4-substituídos-7-(2,3-didesoxi-p-D-glicero-pentofuranosil)imidazo[4,5-d]-v-triazina IXa, IXb and IXc podem ser preparados de acordo com a seguinte síntese, de acordo com a síntese publicada de R. Panzica e Co, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1999, 7:2373-2379. 149

X

Ησ OH X = OH ο Η Β NHj Vb R = NHCH, V·

S X a OH Vle X a OH Vllc R = NH, Vlb RsNM2 viib Rn NHCH, Via Rn NHCH, vila

X

X β OH Kc X a OH VI Dc RbNH2 Kb RbNH2 vmb Rb NHCH, IXa Rb NHCH, Vllla III. Preparação de compostos derivados de 4-substituida-7-(2, 3-didesoxi-fi-D-glicero-pent-2-eno-furanosil)-imidazo-[4, 5-d]-v-triazina:

Os compostos derivados de 4-substituída-7-(2,3-didesoxi-p-D-gIicero-pent-2-eno-furanosil)imidazo[4,5-d]-v-triazina Xla, Xlb e XIc podem ser preparados de acordo com a seguinte síntese: x

1,3-dimetil-2-fenil—1,3— diazafosfolidina s Xo OH viie RcNHj Vllb Ra NHCH} VII·

X

XaQH Xe R a NH2 Xb RnNHCHj Xa

X

X=OH XIc RbNH2 Xlb RoNHCHs xia 150

Exemplo 14: Ensaio de Fosforilagão do Nucleósido em Trifosfato Activo

Para determinar o metabolismo celular dos compostos, são obtidas células HepG2 da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e são crescidas em frascos de 225 cm2 de cultura celular em meio essencial mínimo, suplementado com aminoácidos não-essenciais, penicilina-estreptomicina a 1%. 0 meio é renovado a cada três dias e as células são sub-cultivadas, uma vez por semana. Após descolamento da monocamada aderente com uma exposição mínima de 10 minutos a 30 mL de tripsina-EDTA e três lavagens consecutivas com meio, as células HepG2 confluentes são semeadas a uma densidade de 2,5 x 106 células por poço numa placa de 6 poços e expostos a 10 μΜ de composto activo marcado com [3H] (500 dpm/pmol) durante períodos de tempo especificados. As células são mantidas a 37 °C, sob uma atmosfera de CO2 a 5%. Nos pontos de tempo seleccionados, as células são lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PS) gelado. O composto activo intracelular e os seus respectivos metabolitos são extraídos por incubação do sedimento celular, de um dia para o outro, a -20 °C, com metanol a 60%, seguido por extracção com mais 20 pL de metanol frio durante uma hora, em banho de gelo. Os extratos são, depois, combinados, secos sob fluxo de ar filtrado suavemente e armazenados a -20 °C, até análise por HPLC.

Exemplo 15: Ensaio de Biodisponibilidade em Macacos

Cynomolgus

No período de 1 semana antes do início do estudo, o macaco cynomolgus é cirurgicamente implantado com um cateter venoso 151 crónico e porta de acesso venosa sucutânea (VAP), para facilitar a recolha de sangue, e submetido a uma avaliação física incluindo hematologia, e avaliações químicas do soro e o peso corporal foi registado. Cada macaco (seis no total) recebeu, aproximadamente, 250 pCi de actividade de 3H com cada dose de composto activo a um nível de dose de 10 mg/kg, a uma concentração de dose de 5 mg/mL, via um bolus intravenoso (3 macacos, IV) , ou via sonda oral (3 macacos, PO) . Cada seringa de dosagem é pesada antes da dosagem para determinar gravimetricamente a quantidade de formulação administrada. As amostras e urina são recolhidas via pan-catch em intervalos designados (aproximadamente 18-0 horas pré-dose, 0-4, 4-8 e 8-12 horas após-dosagem) e processado. São também recolhidas amostras de sangue, bem como (pré-dose, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6, 8, 12 e 24 horas após-dosagem) via o cateter venoso crónico e VAP ou a partir de um vaso periférico se o processo de cateter venoso crónico não for possível. As amostras de sangue e urina são analisadas para a concentração máxima (Cmáx) , tempo ao qual a concentração maxima é atingida (Tmáx) , área sob a curva (AUC) , tempo de meia vida da concentração de dosagem (iq) , eliminação (CL), volume no estado estável e distribuição (Vss) e biodisponibilidade (F).

Exemplo 16: Ensaio de Toxicidade da Medula Óssea

As células da medula óssea humana são recolhidas a partir de voluntários saudáveis normais e a população mononuclear é separada por centrifugação em gradiente Ficoll-Hypaque como descrito por Sommadossi J-P, Carlisle R. "Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hematopoietic progenitor cells in vitro" 152

Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1987; 31:452-454; e

Sommadossi J-P, Schinazi RF, Chu CK, Xie M-Y. "Comparison of cytotoxicity of the (-)- and (+)-enantiomer of 2 ' ,3'-dideoxy-3'-thiacytidine in normal human one marrow progenitor cells" Biochemical Pharmacology 1992; 44:1921-1925. Os ensaios de cultura para CFU-GM e FU-E são efectuados utilizando método de bicamada em agar mole ou metilcelulose. Os fármacos são diluídos em meio de cultura celular e filtrados. Após 14 a 18 dias a 37 °C, numa atmosfera humidificada de CO2 a 5% em ar, são contadas as colónias com mais de 50 células utilizando um microscópio invertido. Os resultados são apresetados como a percentagem de inibição da formação de colónia na presença de fármaco em comparação com culturas de controlo de solvente.

Exemplo 17: Ensaio de Toxicidade de Mitocôndria

As células HepG2 são cultivadas em placas de 12 poços como descrito acima e expostas a várias concentrações de fármacos como ensinado por Pan-Zhou X-R, Cui L, Zhou X-J, Sommadossi J-P, Darley-Usmer VM. "Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrial function in HepG2 cells" Antimicro Agents Chemother 2000; 44:496-503. Os niveis de ácido láctico no meio de cultura após 4 dias de exposição ao fármaco são determinados utilizando um kit de ensaio de ácido láctico da Boehringer. Os níveis de ácido láctico são normalizados através do número de células como determinado pela contagem do hemacitómetro. 153

Exemplo 18: Ensaio de Citotoxicidade

As células são semeadas numa taxa de entre 5 x 103 e 5 x 104/poço em placas de 96 poços, em meio de crescimento, de um dia para o outro a 37 °C numa atmosfera de C02 (5%) humidificada. É depois adicionado novo meio de crescimento contendo diluições em série dos fármacos. Após incubação durante 4 dias, as culturas são fixas em TCA a 50% e coradas com sulforodamina. A densidade óptica foi lida a 550 nm. A concentração citotóxica foi expressa como a concentração necessária para reduzir o número de células em 50% (CC5o). Os resultados preliminares são tabulados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3: MDK versus Hepatoma Humano

Composto CC50, μΜ MDK β-ϋ-4'-CH3-riboG >250 β-Ό-4'-CH3-ribo4-tioU >250 β-ϋ-4'-CH3-riboC >250 β-ϋ-4'-CH3-ribo-5-fluoroU >167 β-Ό4,-CH3-riboT >250 β-ϋ-4'-CH3-riboA >250 154

Esta invenção foi descrita com referência às suas formas de realização preferidas. As variações e modificações da invenção ir da todas desta serão óbvias para os especialistas na técnica, a part descrição detalhada anterior da invenção. Pretende-se que estas variações e modificações estejam incluídas no âmbito invenção.

Lisboa, 18 de Outubro de 2010 155

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto da estrutura geral da Fórmula (I):

   ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: R é H; mono-, di- ou trifosfato; ou fosfonato; X é 0; R1 e R1' são cada, independentemente, H, alquilo, azido, ciano, alcenilo, alcinilo, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) , -C (0) N (alquilo) 2/· -C(H)=N-NH2, C(S)NH2, C(S)NH(alquilo) ou C(S)N(alquilo)2; em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo pode ser opcionalmente substituído; R2 e R1 são cada um, independentemente, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, I, CN, N02, -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) , -C(0)N(alquilo)2, N3, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0-(alcenilo), 1 -C(Ο)0-(alcinilo), -O(acilo), -O(alquilo), -O(alcenilo) , -O(alcinilo), -0C(0)NH2, NC, C(0)0H, SCN, OCN, -S(alquilo), -S(alcenilo) , -S(alcinilo) , -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), um resíduo ou derivado de aminoácido, ou um anel heterociclo com 3 a 7 membros opcionalmente substituído com 0, S e/ou N, independentemente, com um Heteroátomo considerado sozinho ou em combinação; R2' é alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; halogéneo, azido ou ciano; R3' é H; alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo), -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -O(acilo), -O(alquilo), -0(alcenilo), halogéneo, azido, ciano, N02, -S(alquilo), S(alcenilo), -S(alcinilo), NH2, -NH(alquilo), N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), -NH(acilo) ou -N(acilo)2; e A Base é seleccionada do grupo consistindo de:

   2

   em que cada R' e R' ' é, independentemente, H, alquiloCi-6, alceniloC2-6, alciniloC2-6, halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxiCi_4carbonilo, NH2, alquilCi-4amino, di (alquilCi-4) amino, alcoxiloCi-6, alquilCi_6Sulfonilo ou (alquilCi-4) 0-2 aminometilo; cada W é, independentemente, Cl, Br, I, F, alquilo halogenado, alcoxilo, OH, SH, O-alquilo, S-alquilo, O-alcenilo, O-alcinilo, S-alcenilo, S-alcinilo, -0C(0)NR4R4, O-acilo, S-acilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2f NH-cicloalquilo, NH-acilo, N=NH, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi_6; e 3 cada Z é, independentemente, 0, S, NH, N-OH, N-NH2, N(alquilo), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, N=NH, C0NH2, CONH (alquilo) OU CON(alquilo)2.
2. 2. Composto da estrutura geral da Fórmula (I):

   ou um seu sal farmacologicamente aceitável, em que: R é H; mono-, di- ou trifosfato; ou fosfonato; X é 0; R1 e R1' são cada, independentemente, H, alquilo, azido, ciano, alcenilo, alcinilo, -C(0)0-(alquilo), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), alquilo halogenado, -C(0)NH2, -C(0)NH(alilo), -C(0)N(alquilo)2, -C(H)=N-NH2, C(S)NH2, C ( S ) NH (alquilo) ou C(S)N(alquilo)2; em que alquilo, alcenilo e/ou alcinilo pode ser opcionalmente substituído; R2 e R3 são cada, independentemente, OH, NH2, SH, F, Cl, Br, I, CN, N02, -C(0)NH2, -C (0) NH (alquilo) ; -C(0)N(alquilo)2, N3, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcenilo opcionalmente substituído, 4 C(Ο)0-(alquilo), -C(0)0-(alcenilo), -C(0)0-(alcinilo), -O(acilo), -O(alquilo), -0(alcenilo), -0(alcinilo), - 0C(0)NH2, NC, C(0)0H, SCN, OCN, -S(alquil), S(alcenilo), -S(alcinilo), -NH(alquilo), -N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), um resíduo de aminoácido ou derivado, ou um anel heterociclo com 3 a 7 membros opcionalmente substituído com 0, S e/ou N, independentemente, com um heteroátomo considerado sozinho ou em combinação; R2 é H; alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; -C(0)0(alquilo), -C(0)0(alcenilo), -C(0)0(alcinilo) , -C(0)NH2, -C(0)NH(alquilo), -C(0)N(alquilo)2, -O(acilo), -O(alquilo), -0(alcedilo), halogéneo, azido, ciano, N02, -S(alquilo), S(alcenilo), -S(alcinilo), NH2, -NH(alquilo), N(alquilo)2, -NH(alcenilo), -NH(alcinilo), -NH(acilo) ou -N(acilo)2; R3' é alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; halogéneo, azido ou ciano; e a Base é seleccionada do grupo consistindo de:

   5

   em que cada R' e R' ' é, independentemente, H, alquiloCi-6/· alceniloC2-6»· alciniloC2_6, halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxiCi_4alcoxicarbonilo, NH3, alquilaminoCi_4, di (alquilCi_4) amino, alcoxiloCi_6, alquilCi_6Sulfonilo de (alquilCi_4) 0-2aminometilo; cada W é, independentemente, Cl, Br, I, F, alquilo halogenado, alcoxilo, OH, SH, O-alquilo, S-alquilo, O-alcenilo, O-alcinilo, S-alcenilo, S-alcinilo, -0C(0)NR4R4, O-acilo, S-acilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, NH-cicloalquilo, NH-acilo, N=NH, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi-6; e cada Z é, independentemente, 0, S, NH, N-OH, N-NH2, N(alquilo), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, 6 SCN, OCN, N02, N3, N=NH, CONH2, CONH (alquilo) ou CON(alquilo)2.
3. 3. Composto da estrutura geral da Fórmula (III):

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitáve, em que: R, R2 e R3* são cada, independentemente, H; mono-, di-ou trifosfato; ou fosfonato; alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, acilo, -C(0)-(alquilo), -C(0)-(alcenilo), -C(0)-(alcinilo), lípido, fosfolípido, hidrato de carbono, péptido, colesterol ou um resíduo de aminoácido ou derivado; X é 0; R2 é alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; halogéneo, azido ou ciano; e a Base é seleccionada do grupo consistindo de: 7

   em que cada R' e R' ' é, independentemente, H, alquiloCi_6, alceniloC2-61 alciniloC2-6/· halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxicarboniloCi-4, NH2, alquilCi_4amino, di (alquilCi-4) amino, alcoxiloCi_6, alquilCi_6Sulfonilo ou (alquilCi_4) 0-2 aminometilo; cada W é, independentemente, Cl, Br, I, F, alquilo halogenado, alcoxilo, OH, SH, O-alquilo, S-alquilo, O-alcenilo, O-alcinilo, S-alcinilo, S-alcenilo, -0C(0)NR4R4, O-acilo, S-acilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, NH2, NH(alquilo), N(alquilo)2, NH-cicloalquilo, NH-acilo, N=NH, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; 8 cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi_6; e cada Z é, independentemente, 0, S, NH, N-OH, N-NH2, N(alquilo), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, N=NH, CONH2, CONH (alquilo) ou CON(alquilo)2.
4. 4. Composto da reivindicação 1 ou 3, em que R2 é alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; ou halogéneo.
5. 5. Composto da reivindicação 4, em que R2 é CH3 ou CF3.
6. 6. Composto da estrutura geral de Fórmula (IV):

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: R, R2* e R3* são cada um, independentemente, H; mono-, di- ou trifosfato; ou fosfonato; alquilo opcionalmente substituído, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído, acilo, -C(0)-(alquilo), -C(0)-(alcenilo), -C(0)-(alcinilo), lípido, fosfolípido, hidrato de carbono, péptido, colesterol ou um resíduo ou derivado de aminoácido; X é 0; 9 R3' é alquilo, alcenilo ou alcenilo opcionalmente substituído; halogéneo, azido ou ciano; e a Base é seleccionada do grupo consistindo de:

   em que cada R' e R' ' é, independentemente, H, alquiloCi_6, alceniloC2-6, alciniloC2_6, halogéneo, alquilo halogenado, OH, CN, N3, carboxilo, alcoxiC4_4carbonilo, NH2, alquilCi_4amino, di (alquilC4_4) amino, alcoxiloCi_6, alquilC4-6Sulf onilo ou (alquiloC4-4) o-2aminometilo; 10 cada W é Cl, Br, I, F, alquilo halogenado, alcoxilo, OH, SH, O-alquilo, S-alquilo, O-alcenilo, O-alcinilo, S-alcenilo, S-alcinilo, -0C(0)NR4R4, O-acilo, S-acilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, NH2, NH (alquilo), N (alquilo) 2, NH-cicloalquilo, NH-acilo, N=NH, CONH2, CONH(alquilo) ou CON(alquilo)2; e cada R4 é, independentemente, H, acilo ou alquiloCi-6; e cada Z é 0, S, NH, N-OH, N-NH2, N(alquil), N(alquilo)2, N-cicloalquilo, alcoxilo, CN, SCN, OCN, N02, N3, N=NH, C0NH2, CONH (alquilo) ou CON (alquilo) 2.
7. 7. Composto da reivindicação 2 ou 6, em que R3 é alquilo, alcenilo ou alcinilo opcionalmente substituído; ou halogéneo.
8. 8. Composto da reivindicação 7, em que R3 é CH3 ou CF3. ~ 2 *
9. 9. Composto de qualquer das reivindicações 3 a 8, em que R, R e R3* são cada, independentemente, H, mono-, di- ou trifosfato ou fosfonato.
10. 10. Composto de qualquer uma das reivindicações 3 a 9, em que R, R2* e R3* são cada, independentemente, H. ~ 2*
11. 11. Composto de qualquer das reivindicações 3 a 8, em que R, R e R3* são cada, independentemente, H, acilo ou um resíduo de aminoácido acilo. 11
12. 12. Composto de qualquer das reivindicações 1 a 11, em que a Base é seleccionada do grupo consistindo de:
13. 13. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz anti-viral de um composto de qualquer das reivinidicações 1 a 12, opcionalmente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
14. 14. Composição farmacêutica da reivindicação 13, em que a composição está na forma de uma unidade de dosagem.
15. 15. Composição farmacêutica da reivindicação 14, em que a unidade de dosagem contém desde cerca de 0,01 a cerca de 50 mg do composto.
16. 16. Composição farmacêutica da reivindicação 14 ou 15, em que a unidade de dosagem é um comprimido ou cápsula. 12
17. 17. Composição farmacêutica de qualquer das reivindicações 13 a 16, compreendendo também um ou mais agentes anti-virais eficazes adicionais.
18. 18. Composição farmacêutica da reivindicação 17, em que o agente anti-viral adicional é seleccionado do grupo consistindo de um interferão, ribavirina, interleucina, inibidor da protease NS3, inibidor da protease de cisteína, derivado de tiazolidina, tiazolidina, benzanilida, fenantrenoquinona, um inibidor da helicase, inibidor da polimerase, análogo nucleótido, glitoxina, cerulenina, oligodesoxinucleótido anti-sentido, inibidor da translação dependente de IRES e ribozima.
19. 19. Composição farmacêutica da reivindicação 17 ou 18, em que o agente anti-viral eficaz adicional é um interferão.
20. 20. Composição farmacêutica de qualquer das reivindicações 17 a 19, em que o agente anti-viral eficaz adicional é seleccionado do grupo consistindo de interferão alfa 2a peguilado, interferão alfacon-1, interferão natural, albuferão, interferão beta-la, interferão omega, interferão alfa, interferão gama, interferão tau, interferão delta e interferão gama-lb.
21. 21. Composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 13 a 20, em que o composto está na forma substancialmente pura.
22. 22. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o composto é, pelo menos, 90% em peso do β-D-isómero. 13 23. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em composto é, pelo menos, 95% em peso do β-D-isómero. que ο 24. 25. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o composto é, pelo menos, 90% em peso do β-L-isómero. Composição farmacêutica da reivindicação 21, em que o composto é, pelo menos, 95% em peso do β-L-isómero.
23. 26. Utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, na preparação de um medicamento para o tratamento de um hospedeiro infectado com Flaviviridae.
24. 27. Utilização da reivindicação 26, em que o hospedeiro é um mamífero.
25. 28. Utilização da reivindicação 27, em que o mamífero é um humano.
26. 29. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para utilização no tratamento de um hospedeiro infectado com Flaviviridae, em que o hospedeiro é, opcionalmente, como apresentado na reivindicação 27 ou reivindicação 28. Lisboa, 18 de Outubro de 2010 14