CN1078478C - 活性抗病毒聚合物的组成及应用方法 - Google Patents

活性抗病毒聚合物的组成及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明合成出了具有2’-O-(3-氟-4，6-二硝基苯基)基团和/或2’-O-(24-二硝基苯基)基团的新型多聚腺苷酸(5’)衍生物，并发现它可当作病毒逆转录酶的突变-不敏感和功能-特异性抑制剂。本发明公开了这些新型化合物的结构组成、制备程序和用于治疗携带有或感染有AIDS病毒或其它RNA病毒的人类患者、或携带有RNA病毒的其它哺乳动物的方法。

Description

活性抗病毒聚合物的组成及应用方法
这一申请是1993年2月24日提出的、编号为08/022,055、有待审批的申请的部分延续。
本发明涉及一些用于治疗由RNA病毒引起的疾病(如AIDS)的新型组合物及方法。本发明也提供了一种制备此类疾病的疫苗的方法。此外，该组合物还可用于抑制核糖核酸酶。
尽管世界范围的努力，对于人类免疫缺陷病毒(HIV)，迄今为止，所有试图求助超突变的有规立构聚合物研制出一种有效的抗-AIDS药物或疫苗的努力均告失败。突变的有规立构聚合物至今也同样妨碍着试图研制出抗-其它RNA病毒所致疾病(诸如白血病和流感)的有效疫苗的努力。
对付诸如HIV AIDS(获得性免疫缺陷综合征)病毒等RNA病毒的方法之一，是灭活HIV的逆转录酶(HIV RT)。遗憾的是，由于此病毒的突变率很高，至今仍无法研制出一种有效的抗-HIV的药物或疫苗。此高度可变的HIV能迅速对所有已知的小分子量(Mr＜1000道尔顿)抑制剂(如，叠氮胸苷(AZT)、2′，3′-双脱氧胞苷(ddc)、2′，3′-双脱氧肌苷(ddI)及nevirapine等)产生耐受性[Larder，etal.，seience243，1731(1989)；Larder and kemp，science246，1155(1989)；st.Clair，et al.，science 253，1557(1991)；shih，et al.，proc.Natl.Acad.sci.USA88，9878(1991)]。
已知(chuan and wang，J.Biol.Chem.263，13003(1981))，亲和剂3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ADP醚及3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ATP醚能够标记线粒体F1-ATP酶的活性位点并抑制该ATP酶。然而，3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ADP醚及相应的ATP醚需要上百万倍高的摩尔浓度，才能抑制HIV的逆转录酶(HIV RT)，它们均不能以突变-不敏感的方式抑制HIV RT或其它RNA病毒。
也已知(Fukui and De Clercq，Biochem J 203，755-760及shannon，Ann.N.Y.Acad.sci.284，472-507)抗病毒化合物，如聚(2-氟腺苷酸)、聚(2-溴腺苷酸)、聚(2-碘腺苷酸)及1-(4-氟苄氧基)腺苷聚腺苷酸等，可抑制逆转录酶。所有这些化合物都是通过将卤素原子或其它基团连接到聚合物中的腺嘌呤残基上衍生而来。这些化合物中最好的是(fl2A)n，它可抑制鼠白血病逆转录酶，其IC50为0.04μg/ml。本发明的FDNP-poly[A]能抑制此相同的RT(逆转录酶)，IC50为0.0017μg/m[l(浓度低23倍)。
本发明的一个实施方案提出了一种组合物，该组合物含有Y-poly[A]，它可用公式Mn(Y)m Xi[A]n表示，其中：
[A]n＝含有n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，
Y＝FDNP，DNP，或部分为FDNP和部分为DNP，
FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个
      2′羟基的m个上，
DNP＝2，4-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个2′-羟
     基的m个上，
x＝一个酰基，
i＝0或1，
M＝一个阳离子，用来为该组合物提供所需的溶解度，而且具有如下之一的一般结构：
Figure C9419180800081
或
Figure C9419180800091
并且其Y基团与腺嘌呤单位的比例至少为约1∶5；其中的n足够大，使得Y-poly[A]能完全彻底地填充RNA病毒逆转录酶的活性位点裂口，从而有效地灭活逆转录酶，和/或能有效地灭活核糖核酸酶。
本发明的另一个实施方案包括一种治疗一种由RNA病毒所致疾病的哺乳动物的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效治疗剂量的Y-poly[A]。
本发明的另一个实施方案是一种暂时性地保护一种健康哺乳动物免受RNA病毒感染的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效预防剂量的Y-poly[A]。
本发明的另一个实施方案包括制备抗-RNA-病毒疫苗的方法及接种疫苗以提供对RNA病毒所致疾病的预防的方法。该方法包括，向一个病人引入一种抗原，此抗原包括一种已被Y-poly[A]不可逆地灭活的RNA病毒，其中的Y至少部分为FDNP，从而使病人产生一种或多种抗该抗原的抗体，这些抗体也包括抗RNA病毒的抗体。
本发明的另一个实施方案包括一种在用于输注的血液等分样品中消除RNA病毒的方法。该方法包括，向此血液等分样品中加入有效消毒剂量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分为FDNP。
本发明的另一个实施方案包括一种从溶液中去除核糖核酸酶的方法。该方法包括，将此溶液通过一个含有固相化FDNP-poly[A]或DNP-poly[A]的亲和柱。
核糖核酸酶也能通过在核糖核酸酶溶液中加入有效量的Y-poly[A]被不可逆地抑制，其中Y至少部分为FDNP。
根据本发明的一个实施方案的另一个有用的方法是不可逆地灭活RNA病毒。该方法包括将该RNA病毒与一种灭活此RNA病毒有效剂量的FDNP-poly[A]接触。
本文提出了一种新型的聚合物抑制剂，它能紧紧地结合到并完全彻底地填充HIV逆转录酶(HIV RT)活性位点上的长结合裂口上。我们合成了这种新型抑制剂，并且发现它可迅速灭活溶液中的HIVRT，而且，如果其Y-poly[A]中的Y至少部分不可逆地是FDNP时，它能使易感性淋巴细胞在往培养皿中加入活的HIV后仍能继续它们的正常生长。该抑制剂中，DNP-和/或FDNP-基团共价结合到聚合物的核糖残基上。这些抑制剂是功能-特异性的，因此其毒性低，但不是种属-特异性的，因而被认为是突变-不敏感性的(mutation-insensitive)。本文公开了这种组合物和其在五种不同的药学和生物技术学应用中这些新型化合物的使用方法。基于以下的基本原理，我们研制出了一组突变-不敏感性的抑制剂。
最近的晶体学研究表明：HIV RT中的聚合酶位点包含一个开放末端裂口(open-end cleft)，此裂口的长度足以容纳一个长度为25至30个残基的RNA片断[K＜i，et al.，science 256，1783(1992)；Arnold，et al.，Nature 357，85(1992)]。可以推测，此活性裂口优先地结合多聚腺苷酸(5′)(以下简称“poly[A]”)，因为poly[A]-[dT]12复合物已被成功地而且相当频繁地作为模板-启动子(template-promoter)使用于体外逆转录实验中。因此，将疏水基团连接到poly[A]的2′-OH位置上，以改善与RT的结合亲和性，而不影响其模板功能。所得的poly[A]衍生物能够结合到HIV RT上，完全彻底地填充其活性位点裂口，并可作为一种多功能亲和剂。
鉴于惯常使用sanger试剂1-氟-2，4-二硝基苯基来标记蛋白质的亲核基团，我们把亲电子的3-氟-4，6-二硝基苯基(FDNP)基团通过醚键结合到poly[A]的2′-OH位置上，方法参照已发表的用于单核苷酸的程序[chuan and wang，J.Bi0l.Chem.263，13003(1981)，其内容引入本文作为参考]。这些亲电子的FDNP基团不可逆地与逆转录酶活性位点裂口的亲核基团反应并与其结合，因此可阻断逆转录酶的作用。所获得的聚合物衍生物(称为FDNA-poly[A])的结构，可用如下所示的结构式表示，其通式为：Mn(FDNP)mXi[A]n，其中：
[A]n＝含有n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，
FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个
      2′-羟基的m个上，
x＝一个酰基，
i＝0或1，
M＝一个阳离子，用来为该组合物提供一个所需的溶解度，并且具有如下之一的一般结构：
Figure C9419180800121
或
Figure C9419180800122
我们进一步发现，DNP-poly[A]在灭活逆转录酶及核糖核酸酶中也有效。事实上，虽然DNP-poly[A]的作用是可逆的，发现，如果每1.5个腺嘌呤残基结合一个DNP-基团，此DNP-poly[A]的效率约是FDNP-poly[A]的12倍(也就是说，其十二分之一的剂量具有相同的效率)。此聚合物衍生物(称为DNP-poly[A])具有如下所示的结构式。用通式表示：Mn(DNP)mXi[A]n，其中：
[A]n＝含有n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，
DNP＝2，4-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个2′-羟
     基的m个上，
x＝一个酰基，
i＝0或1，
M＝一个阳离子，用来为该组合物提供一个所需的溶解度，并且具有如下之一的一般结构：
Figure C9419180800131
或
Figure C9419180800141
在这两种情况中，n都足够大，使得Y-poly[A](其中Y＝DNP、FDNP或部分为DNP另一部分为FDNP)能完全彻底地填充RNA病毒逆转录酶的活性位点裂口，从而有效地灭活逆转录酶和/或能有效地灭活核糖核酸酶。一般最好n相对较大，以20或更大为合适，25或更大则更优。下面陈述的实验用于制备一个相对较高分子量的Y-poly[A](h-Mr)、n≈270、m≈69、Mr≈1.1×105(其中Mr代表分子量)以及用于制备一个相对较低分子量的Y-poly[A](l-Mr)、n≈28、m≈9、Mr≈1.2×104
FDNP基团一般能以FDNP基/[A]不超过1∶4的比例结合到poly[A]上，DNP基团则能以一个相当高的比例(约1∶1.5)结合到poly[A]上。也能合成混合型的FDNP/DNP-poly[A]聚合物。一般地，首先使1，3-二氟-2，4-二硝基苯(DFDB)与poly[A]起反应，所得产物的FDNP/[A]的比例为约1∶4～约1∶10。然后，使此产物与1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)起反应。如此获得的合成物就有一个尽可能高的(FDNP＋DNP基团)/[A]的总比例，一般能大于l∶4，更优的能大于1∶2。
阳离子(M)可以是任何一种阳离子，只要它能使该合成物达到一个足够的浓度以完成预期的目的，如灭活核糖核酸酶、治疗一种由RNA病毒引起的疾病、生产可用于接种的灭活(死的)病毒、消毒贮存的血液等等。在此报告的实验中用的是钾盐，不过，也可用例如铵盐、铷盐、铯盐或其它盐来替代。
一个重要的因素是Y基团与[A](腺嘌呤)单位的摩尔比。一般地说，单个Y-poly[A]化合物的效率随着Y/[A]的摩尔比的增加而增加。因此，理想的是，此比例能相当高。一般，此比例至少应为约1∶10，如果比例能更高些，如1∶5或更高，则更优。在此报告的实验则是用比例为1∶1.5、1∶3.9及1∶4.8的Y-poly[A]化合物进行的。更高的比例将更理想。
我们发现，在纳摩尔浓度时，Y-poly[A]即是一种逆转录酶的有效抑制剂，因而它似乎是一种有效的抗-RNA病毒的治疗药物(而且也是一种有效的和，当Y至少部分为FDNP时，不可逆的核糖核酸酶的抑制剂)，而即使在微摩尔浓度下，它也不会抑制主要的宿主细胞酶(是在体外试验中进行检测的)，包括RNA-聚合物II、cAMP-依赖的蛋白激酶、丙酮酸激酶、己糖激酶及腺苷酸激酶。因此，可制定出既能有效地、不可逆地抑制RNA病毒中的逆转录酶，又不会抑制基本的细胞酶的剂量配方。Y-poly[A]能与核糖核酸酶结合，此功能可用来灭活和/或去除溶液中的核糖核酸酶。例如，可把Y-poly[A](其中至少有一部分Y是FDNP)加到核糖核酸酶的溶液中，从而不可逆地抑制核糖核酸酶。另一种方法，也是更可取的一种方法是将Y-poly[A]与一种亲和材料结合(一般常与亲和柱相连)，然后将含核糖核酸酶的溶液流过该柱，其中的核糖核酸酶被吸附到柱上，从柱中流出的溶液即为无核糖核酸酶的溶液。当使用此柱技术时，Y-poly[A]最好是DNP-poly[A]，因为FDNP-poly[A]中的FDNP基团在柱上会被水解，而一个DNP-poly[A]柱则能经洗涤后再次使用。所用的柱材料并不严格，实际上只要是Y-poly[A]能被结合上去的任何柱材料都行。例如，我们曾用过一个纤维素柱。
一个长的抑制剂分子(诸如Y-poly[A]，其FDNP基团的多个点可与HIV RT活性位点处的许多特定的氨基酸残基共价结合，或其DNP基团的多个点可与HIV RT活性位点处的许多特定的氨基酸残基非共价结合)，可选择作为一种可能的突变-不敏感性抑制剂，因为某一次随机突变极不可能改变所有这些特定的氨基酸残基，以致此突变型的酶不能再结合Y-poly[A]，但仍能结合模板poly[A]。为了能继续生存，这种高度可变性的HIV必须含有一种保持着一个长的活性位点裂口的RT。这种存活的突变型HIV RT要避免与此种抑制剂的结合，将是非常困难的。这一推论已被以下的观察所证实：尽管HIV RT、禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV RT)及莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MLV RT)的一级结构有极大的差别，但这三种逆转录酶在25℃下，在10分钟或更短的时间内，均被纳摩尔浓度的FDNP-poly[A]所灭活。
经我们要求，由美国国立癌症研究所(NCI)癌症治疗部(theDivision of Cancer Treatment)在治疗开发计划中(the Develop-mental Therapeutics program)，对Y-poly[A](h-Mr)和Y-poly[A](1-Mr)作为可能的抗-HIV药物，与易感的淋巴细胞和HIV一起进行体外试验。结果发现，这些活性聚合物能有效地保持HIV中的淋巴细胞的存活(见下文实施例5)。
由于这些聚合物是被设计用来灭活所有的逆转录酶的，因此它们也能被用来治疗由RNA病毒所致的其它疾病，例如：成人T细胞白血病/淋巴瘤，甲-、丙-、丁-、戊-型肝炎，流感，副流感(parainfluenza)，婴儿细支气管炎和肺炎，普通感冒，麻疹，流行性腮腺炎等等。因此，由以下的RNA病毒(并不局限于所列举的)引起的疾病都可用本发明进行控制，如HTLV(成人T细胞白血病/淋巴瘤病毒)、HAV(甲型肝炎病毒)、HAC(丙型肝炎病毒)、HDV(丁型肝炎病毒)、HAC(戊型肝炎病毒)、HEV(流感病毒)、副流感病毒、RSV(呼吸合胞体病毒)、引起普通感冒的冠病毒(coronavirus)和鼻病毒、麻疹病毒、以及流行性腮腺炎病毒。其它RNA病毒所致的疾病也同样可用本发明控制。
为了使本发明被更好地理解，可参看以下实施例。
实施例1
Y-poly[A](h-Mr)的制备程序1：
将10毫克多聚腺嘌呤钾盐(购自Sigma，Mr～1.1×105)溶于含0.5ml水和1.6ml 0.2M K2CO3＋1.5M KHCO3的溶液(pH9.2)中。搅拌下，将0.8ml含10倍过量的1，3-二氟-2，4-二硝基苯(DFDB的丙酮溶液分三次等量加入上述溶液，每次间隔十二小时。室温下反应48小时后，用7∶1(V/v)的二氯甲烷和二甲基亚砜混合溶剂多次萃取过剩的DFDB。所获得的水溶液用Sephadex G-25-80进行离心凝胶过滤，然后冻干。产物中3-氟-4，6-二硝基苯基与腺嘌呤基的摩尔比可以通过分别观测330nm及259nm处的吸光率计算而得：摩尔比为1/3.9，其中以3-氟-4，6-二硝基苯基乙醚(ε259＝3900，ε330＝6300)和一磷酸腺苷(AMP)(ε259＝15400)作为标准品。这样，聚合物抑制剂平均每分子中含有270个腺嘌呤残基和69个2′-O-FDNP基团。当pH值从9降低至5后，FDNP-poly[A](h-Mr)稀释溶液的吸光率降低并不显著(＜5％)。这一观察表明，在制备过程中已被水解成不反应的3-羟基-4，6-二硝基苯基基团的3-氟-4，6-二硝酸苯基基团部分，在产物中所占的比例小于5％。产量＝3mg。程序2：
将10毫克的多聚腺嘌呤钾盐(购自Sigma，Mr～1.1×105)溶于0.5ml水和0.1ml 0.1M K2CO3＋2.0M KHCO3的溶液(PH＝8.8)中。搅拌下，将0.4ml含5倍过量的1，3-二氟-2，4-二硝基苯的丙酮溶液分四次等量加入上述溶液中，每次间隔6小时。在反应过程中，检测反应混合液的pH，并加入K2CO3和KHCO3以调整pH至8.8。并通过对反应混合液的薄层层析分析(TLC分析)监测反应的进程(它是时间的函数)：将混合液滴在含有荧光指示剂的柯达纤维素平板上，用(20mM K2HPO4＋20mM KH2PO2)∶CH3CN＝2∶1(V/V)作为展开剂。最后，所有来自polyA的在Rf＝0.38处的带都变弱，而在Rf＝0.77处一条新的FDNP-polyA的带变强。继续反应直至在Rf＝0.38处的带消失后，一般是在室温下进行24小时以后，过剩的DFDB用7∶1(v/v)的二氯甲烷和二甲基亚砜多次萃取移去。所得的水溶液用SephadexG-50-80凝胶过滤或进行透析，然后冻干。产物中的3-氟-4，6-二硝基苯基与腺嘌呤基团的摩尔比，可以从330nm和259nm处分别观察到的吸光率计算而得，为1/4.8，其中，用3-氟-4，6-二硝基苯基乙醚(ε259＝3900，ε330＝6300)和一磷酸腺苷(ε259＝15400)作为标准品。此1/4.8的FDNP/腺嘌呤比例已被19F-NMR和31P-NMR两种核磁共振证实。
尽管与程序2相比，程序1所得产物的FDNP基与腺嘌呤基团的比率比较高、比较理想，但我们发现，反应48小时后，约有5％的5-氟基团被水解成羟基。当反应被限定在24小时时，则并没有发现水解作用。由于水解产物不能与产物分离，因此，程序2更优。
用1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)代替DFDB，可按程序2相似的方法合成DNP-poly A。在合成DNP-poly A时，让poly A与过量的FDNB在室温下反应48小时，产物DNP-poly A中DNP基团与腺嘌呤残基的摩尔比为1/1.5。该比率高于FDNP-poly[A]中获得的比例，因为后者为了避免5-氟基团发生明显的水解作用，于48小时后终止了反应。
实施例2
FDNP-poly[A](l-Mr)的制备
将867mg二磷酸腺苷(ADP，钾盐)、25mg一磷酸腺苷(AMP，游离酸)和393mg K2CO3溶于4ml水中，制得摩尔比为28∶1的ADP和AMP的混合液。不断添加固体K2CO3，使溶液的pH值从8.2变到9.05。然后把该溶液与20μl含有1M MgCl2和8单位多聚核苷酸磷酸化酶(购自Sigma，从大肠杆菌中制得)的溶液混合。将混合液在37℃下孵育48小时后，通过Sephadex G-25-80进行离心凝胶过滤以除掉所有ADP、AMP及分子量低于5000的寡聚核苷酸。测定259nm处的吸光率，显示滤液中含有63mg产物FDNP-poly[A](l-Mr)。取1小份该FDNP-poly[A](l-Mr)溶液，过sephadex G-50-80柱进行第二次凝胶过滤，表明用这种方法制得的寡聚物中，有99.7％分子量Mr＜10000。随后，用与前面所述相似的方法，使该FDNP-poly[A](l-Mr)与FDNB发生反应，以生成FDNP-poly[A](l-Mr)，FDNP基团/腺嘌呤残基的摩尔比＝1/3.9。
按上述程序2也合成了FDNP-poly[A](l-Mr)，得到的产物其FDNP/腺嘌呤的摩尔比为1/4.8。DNP-poly[A](l-Mr)的制备方法相似，产物的DNP/腺嘌呤的摩尔比为1/1.5。
实施例3
用FDNP-poly[A]对溶液中的病毒逆转录酶的不可逆性抑制
将来自HIV的逆转录酶(HIV RT)样本、来自莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶(MLV RT)样本、以及来自禽类成髓细胞瘤病毒的逆转录酶(AMV RT)样本，分别与FDNP-poly[A]一起，在内含1mM MgCl2和125mM KCl的Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH8.2)中，25℃下孵育，并测定RT的活性。每次实验中，所选的酶都在25℃下与给定浓度的抑制剂的钾盐孵育10分钟。10分钟后，将孵育混合液迅速注入一测定液中，并在37℃下再孵育10分钟，然后用三氯乙酸沉淀。经洗涤后，用闪烁计数法测定生成的放射性多聚核苷酸。测定混合液内含125mM Tris-HCl(pH 8.2)、1mM MgCl2、125mM KCl、250μM[3H]dTTP(作为底物)、和23nM poly[A]-[dT]12(作为模板)。
将每一种逆转录酶与FDNP-poly[A]在25℃下预孵育l0分钟所观测到的残留酶活性的百分率作为抑制剂浓度的函数作图，并从图中确定出抑制50％酶活性时所需的抑制剂浓度(IC50)。结果总结如下。用DNP-poly[A]也得到相似的结果。
  酶           抑制剂          IC50(nM)
HIV RT    FDNP-poly[A](h-Mr)     6pM
HIV RT    FDNP-poly[A](1-Mr)   400nM
MLV RT    FDNP-poly[A](h-Mr)    15pM
AMV RT    FDNP-poly(A](h-Mr)    12pM
观测所得的IC50值显示，DNP-poly[A](h-Mr)、FDNP-poly[A](h-Mr)和FDNP-poly[A](l-Mr)在水溶液中均是逆转录酶的强抑制剂。动力学测定表明，DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]都是与模板-引物多聚腺苷酸-十二胸苷酸(poly[A]-[dT]12)竞争HIV RT分子中的相同结合位点。将孵育后的混合液加到纤维素-寡聚[dt]柱上然后用洗脱层析分离，结果显示，FDNP-poly[A]与逆转录酶是以共价键相连。因此，它对酶的灭活作用是不可逆的。
上面的数据也显示了，尽管在一级结构上有显著的差异，这三种病毒逆转录酶(HIV RT、MLV RT及AMV RT)均被亚纳摩尔浓度的FDNP-poly[A]在25℃下作用10分钟后所灭活。这有力地说明了FDNP-poly[A]是突变-不敏感性的。
实施例4
DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]对不同HIV逆转录酶的抑制DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]对不同的突变型HIV RT的抑制作用由Joe C.wu博士免费测定，其中逆转录酶来自4株不同的人类病毒：HIV-1 RT(野生型)、HIV-2(野生型)、HIV-145,215RT(AZT-耐受突变型，Thr(苏氨酸)215→Tyr(酪氨酸)，Met(甲硫氨酸)41→Leu(亮氨酸))、及HIV-1181CRT(Nevirapine-耐受突变型)，用poly C-[dG]12-18作为模板、[3H]dGTP作为底物。检测条件与实施例3中的相同。观测到的IC50值总结如下表：抑制剂                          逆转录酶的IC50(nm)
                     HIV-1(野生型)        HIV-2(野生型)DNP-poly[A]                3.8±0.5             1.6±0.2poly[A]                    --------             --------FDNP-poly[A]               1.5±0.6             1.1±0.2HIV-1141，215        HIV-2181CDNP-poly[A]                2.2±0.3             0.34±0.07poly[A]                    --------             --------FDNP-poly[A]               1.2±0.3             0.65±0.11
从这些实验，我们发现，DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]两者都是所有这四种逆转录酶的强有力的抑制剂，而poly[A]本身并没有抑制作用。
实施例5
DNP-、FDNP-poly[A](h-Mr)和FDNP-poly[A](l-Mr)对易感的淋巴细胞的抗HIV防护
由美国国立癌症研究所(NCI)癌症治疗部的治疗开发计划对FDNP-poly[A](h-Mr)、DNP-poly[A](h-Mr)及FDNP-poly[A](1-Mr)作为可能的抗-HIV药物，使其与敏感的淋巴细胞与HIV在一起，作了体外试验检测。确认这三种抑制剂均是有效的。国立癌症研究所草案中包括：在微培养板中，把各种不同浓度的FDNP-poly[A](h-Mr)、DNP-poly[A](h-Mr)或FDNP-poly[A](l-Mr)与易感的T4淋巴细胞(CEM-SS细胞系)混合，其中含或不含HIV，将这些培养板孵育6天，然后用比色终点法测定剩下的活细胞数(方法参考Weislow，et al.，J.Natl.Cancer Inst.81，577-586(1989))。
试验结果显示，在HIV存在的情况下，FDNP-poly[A]和DNP-poly[A]均可有效地保持淋巴细胞的存活力。观测到的有效浓度(EC50)为：FDNP-poly[A](h-Mr)为2.65±0.15μg/ml或24±2nM，DNP-poly[A](h-Mr)为0.2±0.1μg/ml或2±1nM。因此，这些聚合物都是有效的抗病毒试剂。两种聚合物的可溶性盐，均可直接用来治疗被HIV感染的哺乳动物。其施药方式为配成适当的溶液经非肠胃给药，或制成药丸口服给药。
实施例6
在37℃下，0.01M HCl中并存在胃蛋白酶时Y-poly[A](h-Mr)的稳定性
人体胃液中含有胃蛋白酶和大约0.01M的HCl。为了模拟人体胃内的酸性环境，我们将FDNP-poly[A]在0.01M HCl中37℃下孵育，结果发现0.01M HCl中孵育4小时以后，它作为HIV RT的一种不可逆性抑制剂，其功效仅下降50％。并发现DNP-poly[A]在同样的条件下具有更高的稳定性。有关FDNP-poly[A]的结果列于下表。
37℃下孵育时间(小时)    0    1/2    1     2    4
IC50(nM)              27    22    22    2l    34
在另一个单独的实验中，将FDNP-poly[A](h-Mr)(34nM)在37℃下、内含1.0mg/ml胃蛋白的0.01M HCl溶液中进行孵育。发现2小时后抑制剂的功效并不受影响，但孵育4小时后，其功效下降到65％。这些观察结果提示，在胃液环境中，FDNP-poly[A]的抗HIV能力在2小时之内不会被破坏。因此，FDNP-poly[A]的固体盐可以与适当的掺入物混合，压成药丸或包装成胶囊，用于口服给药。
实施例7
FDNP-poly[A]在37℃下人血清中的稳定性
一份正常人血清冷冻标本(男性，AB型，购自Sigma)，解冻后用来溶解FDNP-poly[A](h-Mr)(34nM)。HIV RT的这种抑制剂的相对抑制效力，可以以37℃下，作为孵育时间的一个函数来确定，并列于下表：
孵育时间(小时)     0    0.5    1.0    2.0    4.0
相对于效力(％)    100    95     91     93     80
由于人血清中的FDNP-poly[A]在37℃下，孵育4小时后，其效力减少不超过20％，因此，该化合物可溶于适当的溶液中，用于非肠道给药。
实施例8
使用FDNP-poly[A]完全而有效地灭活HIV：用于研制有效的抗-HIV疫苗
被FDNP-poly[A](或Y-poly[A]，其中Y部分为FDNP)完全而不可逆地灭活的HIV，也可以用作一种完全抗原，用于研制一种有效的抗-AIDS疫苗。
全世界都在致力于发现一种预防AIDS的有效疫苗，至今尚未成功。用AIDS病毒的基因工程片段研制而成的疫苗，不能提供对AIDS的充分防护，其主要原因是病毒具有极高的突变率。最后报道了一种活的HIV减毒疫苗，在其nef基因中有一缺失，这种疫苗具有令人鼓舞的保护性作用[Daniel，et al.，science 258，1938(1992)]。这一新发现提醒了以往实践中的研究人员，可利用完整病毒的减弱变形体(weakened version)来触发保护性的免疫反应。例如，活病毒可用甲醛处理，使其减弱，这种减弱的病毒可以用作抗原以触发免疫反应。但是，这是一个具有危险的程序，因为在醛和氨基之间形成席夫碱的反应是可逆的，该缩合反应的逆转将会重新产生全活性病毒，这对于病人来说是致命的。
由于Y-poly[A](其中Y至少部分为FDNP)可以使HIV发生100％有效和不可逆的失活，因此可利用Y-poly[A](其中Y至少部分为FDNP)为人类研制出一种真正有效的抗-AIDS疫苗-把灭活的HIV作为抗原导入病人体内，例如注射给病人。
实施例9
对贮存的输注用血液中可能存在的痕量活HIV的灭活
由于捐献的血液中有可能存在即使是痕量的活HIV，对受血者(同样地也对血液输注人员)构成一种长期性威胁。那么可在存入血库之前，往捐献的血液中加入很少但足够量的Y-poly[A](其中Y至少部分是FDNP)。由于不可逆性抑制剂的IC50会随时间的延长而减小[Kang and Wang，J.Biol.Chem.，in press，May 1994]，当作为一种安全措施时，该加入的Y-poly[A]能把在贮存过程中可能存在的痕量HIV灭活。
为了检测Y-poly[A]的有效性，把HIV RT(57nM)与不同浓度的抑制剂(FDNP-poly[A](h-Mr))在25℃下孵育10分钟。孵育后所剩的原始酶活性的百分率列于下表：
抑制剂浓度(nm)    酶活性(％)
    0                100
   1.6                89
   4.8                72
  16.7                54
   25                 42
   33                 29
   42                 15
   50                  6
   55                  2
   60                  0
实施例10
FDNP-poly[A]对核糖核酸酶的不可逆性抑制
在生物技术工业及相关的研究室里，经常需要分离未受损的RNA大片段。为了避免RNA产物被痕量外源性核糖核酸酶作用，发生偶然裂解，常需要加入焦碳酸二乙酯(DEPC)把所有溶液预先煮一下，或者加入一种核糖核酸酶的抑制剂，通常是用可买到的商品RNasin(可购自Promega)。对于大规模操作来说，这两种程序都是很昂贵的。我们发现，Y-poly[A](其中Y至少部分为FDNP)是核糖核酸酶的有效且不可逆的抑制剂，加入少量但已足够量的这种Y-poly[A]既能不可逆地灭活可能存在于加工处理过程中所用的溶液或容器中的痕量核糖核酸酶。这种Y-poly[A]作为核糖核酸酶的有效抑制剂，其有效性可以从下面的实验中看出来。
核糖核酸酶A(RNase A)的催化活性是通过监测300nm处的吸光率(A300)随时间而减少来确定，因为在25℃下，溶液中的胞苷-2′，3′-环一磷酸(cCMP)被不断催化水解。检测液为内含1.9mMcCMP(钠盐)的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)。无FDNP-poly[A]的对照反应是将10μl 54.4μM的RNase A贮液注入到2.000ml检测液中，混匀并监测A300随时间的减小。做抑制研究时，则先把RNase与各种不同浓度的FDNP-poly[A](h-Mr)预孵育1.0分钟，然后注入到cCMP溶液中开始检测。结果总结如下。所有RNase的最终总浓度均为268nM，抑制剂浓度为54μM。FDNP-poly[A]的总      0     0.5   0.8   1.3   1.7  2.3预孵育浓度(μM)混均后1分钟所剩的    100     89    73    48    25    0起始RNase活力(％)
这些数据表明，即使是在亚微摩尔浓度，每个FDNP-poly[A]分子都能迅速灭活很多外源性RNase分子。
实施例11
双螺旋DNP-polyA-poly[dT]的有效性
双螺旋DNP-polyA-poly[dT]已被发现是比DNP-polyA更有效的HIV-1 RT的抑制剂。这种双螺旋DNP-poly[A]-poly[dT]可以通过混合两种组分并在90℃下加热5分钟而生成。
以poly C-[dG]12-18作为模板-启动子，[3H]TTP作为HIV-1 RT的底物，得到下表中所列的数据。抑制剂浓度                            5nM  10nM  20nM被DNP-poly[A]抑制的百分率             44    81    94被DNP-poly[A]-poly[dT]抑制的百分率    93    98    100很明显，双螺旋DNP-poly[A]-poly[dT]是比单链DNP-poly[A]更好的HIV-1 RT的抑制剂。
实施例12
DNP-poly[A]向人细胞的自发迁移
将100μl成人淋巴细胞样本(2×106个细胞)与100μl RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基和60μlDNP[14C]poly[A](1.3mg/ml，比放为120cpm/pmole)混合。将混合液在37℃下孵育，并且每隔一段时间取出50μl等分液，经过滤、洗涤后测定其放射性：将每一等分液点在一片滤膜上(FA1.0μm，Millipore)，抽滤，并用100mM KCl水溶液洗涤8次。最后每个已干燥的附有细胞的滤膜用液体闪烁计数系统作放射性检测。下面是来自一个典型实验的数据。孵育时间(小时)     0.1    0.5     3      24     48每分钟计数(cpm)    800    900    1300   1800   2200这些数据表明，通过扩散作用或细胞内吞作用，疏水的DNP[14C]poly[A]能自发地迁移到成人的淋巴细胞中。而在相同条件下，[14C]poly[A]则根本不能进入这些淋巴细胞中。
实施例13
DNP-poly[A]向鼠白血病病毒的自发性迁移
在一模型实验中，用莫洛尼鼠白血病病毒和DNP-poly[A]来演示抑制剂能自发迁移到逆转录病毒(retrovirus)中。每次实验中，5μl的病毒悬浮液与37.5nMDNP-poly[A]一起在冰上孵育。一段时间后，混合液经100,000g离心10分钟。小心移除上清液并将沉淀(实际上看不见)用200μl Tris缓冲液(50nM Tris-HCl，pH7.8)洗涤。将沉淀在检测缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.8，60mMKCl、2mM DTT和0.6mM醋酸锰)中搅匀，然后与0.02 poly[A]-寡[dT]、1.5mM[3H]dTTP及0.1％Triton-100一起在37℃下孵育60分钟。用10％的TCA终止反应。测定所沉淀的放射性产品[3H]poly[dT]的cpm，以计算逆转录酶的催化活性(A)。实验数据总结于下表中，其中A°代表与抑制剂一起孵育前的原始催化活性。孵育时间(小时)    0    0.16    0.5     1.0      24      48A/A°             1    0.54    0.50    0.45    0.25    0.16这些数据显示，DNP-poly[A]可以穿透鼠白血病病毒的包膜并且抑制其中的逆转录酶。这些数据表明，FDNP-poly[A]也能穿透HIV的包膜(envelop)并且产生一种永久性灭活的HIV，此灭活的HIV适合于用作抗-AIDS疫苗的一个理想的抗原。而在相同的条件下，[3H]poly[dT]则根本不能进入此病毒。工业上的实用性：
本发明提供了一种组合物，该物质可用于治疗RNA病毒引起的病(如AIDS)；可用于贮存的输注用血液中的HIV的消毒；并可提供针对RMA病毒所致疾病的疫苗。
在描述了本发明及其特殊的实施方案之后，我们将了解到，本发明还可作进一步的修改，并且本申请的目的旨在覆盖凡遵循本发明原理的各种变化、应用、改编，并包括根据本发明所属技术领域里公知和习惯方法、和使用上文提出的实质特征、和落入本发明和所附权利要求范围内的所有变化。

Claims (28)

1、一种组合物，包含公式Mn(Y)mXi[A]n表示的Y-poly[A]，其中：[A]n＝含n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，Y＝FDNP，DNP，或部分为FDNP部分为DNP，FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基基团，通过醚键共价结合到[A]n的n个2′-OH羟基的m个羟基上，DNP＝2，4-二硝基苯基基团，通过醚键共价结合到[A]n的n个2′-OH的m个羟基上，X＝一个酰基，i＝0或1，M＝一个阳离子，用来为此组合物提供一个所需的溶解度，并有如下之一的一般结构：
Figure C9419180800021
或并且其Y基团与腺嘌呤单位的比率至少为1∶5，其中的n足够大，使得Y-poly[A]能完全彻底地填充RNA病毒逆转录酶的活性位点裂口，从而可有效地灭活逆转录酶和/或能有效地灭活核糖核酸酶。
2、如权利要求1所述的组合物，其中n至少为20。
3、如权利要求1所述的组合物，其中Y至少部分包括FDNP。
4、如权利要求1所述的组合物，其中Y包括DNP。
5、如权利要求1所述的组合物，其中n至少为25。
6、权利要求1的组合物在制备用于治疗患有RNA病毒所致疾病的哺乳动物的药物中的应用。
7、如权利要求6所述的应用，其中所述药物为非肠道注射的药物。
8、如权利要求6所述的应用，其中所述药物为口服的药物。
9、如权利要求6所述的应用，其中所述RNA病毒是HIV，所述疾病是获得性免疫缺陷综合征。
10、如权利要求6所述的应用，其中所述RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，该疾病分另4是：获得性免疫缺陷综合征、成人T细胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、婴儿细支气管炎和婴儿肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。
11、如权利要求6所述的应用，其中Y至少部分包括FDNP。
12、如权利要求6所述的应用，其中的Y包括DNP。
13、权利要求1的组合物在制备用于暂时性地保护健康哺乳动物免受RNA病毒感染的药物中的应用。
14、如权利要求13所述的应用，其中所述药物为非肠道注射的药物。
15、如权利要求13所述的应用，其中所述药物为口服的药物。
16、如权利要求13所述的应用，其中所述RNA病毒是HIV，所述疾病是获得性免疫缺陷综合征。
17、如权利要求13所述的应用，其中所述RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，该疾病分另是：获得性免疫缺陷综合征、成人T细胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、婴儿细支气管炎和婴儿肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。
18、如权利要求13所述的应用，其中的Y至少部分包括FDNP。
19、如权利要求13所述的应用，其中的Y包括DNP。
20、权利要求1的组合物在制备用于给病人接种一种针对RNA病毒所致疾病的疫苗中的应用，其中所述疫苗为内含已被Y-poly[A]灭活的RNA病毒的抗原，Y至少部分为FDNP。
21、如权利要求20所述的应用，其中所述RNA病毒是HIV，所述疾病是获得性免疫缺陷综合征。
22、如权利要求20所述的应用，其中所述RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，该疾病分别是：获得性免疫缺陷综合征、成人T细胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、婴儿细支气管炎和婴儿肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。
23、一种对存在于用于输注的血液等份样品中的RNA病毒进行消毒的方法，包括向此血液等份样品中加入有效消毒剂量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分为FDNP。
24、一种如权利要求23所述的方法，其中的RNA病毒是HIV，该疾病是获得性免疫缺陷综合征。
25、一种如权利要求23所述的方法，其中的RNA病毒是HIV、HTLV、HAV、丙型肝炎病毒、流感病毒、副流感病毒、RSV、冠病毒或鼻病毒、麻疹病毒或流行性腮腺炎病毒，该疾病分别是获得性免疫缺陷综合征、成人T细胞白血病/淋巴瘤、甲型肝炎、丙型肝炎、流感、副流感、婴儿细支气管炎和婴儿肺炎、普通感冒、麻疹或流行性腮腺炎。
26、一种不可逆地灭活溶液中的核糖核酸酶的方法，包括向溶液中加入灭活此核糖核酸酶有效剂量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分为FDNP。
27、一种从含有核糖核酸酶的溶液中去除核糖核酸酶的方法，包括将此溶液与一种含有固相化FDNP-poly[A]或DNP-poly[A]的亲和材料相接触，然后把此溶液从此亲和材料中分离出来。
28、一种不可逆地灭活RNA病毒的方法，包括将此RNA病毒与一灭活此RNA病毒有效剂量的Y-poly[A]相接触，其中的Y至少部分为FDNP。
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