JPH08505604A - モジュラーポリマーを合成するための支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチドを包含する、種々のモジュラーポリマーの複数のセットを合成するための支持体。これは活性表面を有する概略環状の部材からなり、保持ロッドによって軸方向に保持される。また、式（Ｉ）の結合したモジュラーポリマーを開示する。ここで、各Ｍは独立してモノマーであり；ｎは２〜100の整数であり；そしてＺは保護基である。

Description

【発明の詳細な説明】 モジュラーポリマーを合成するための支持体 技術分野 本発明はペプチド合成のための固体表面に関し、特に、ペプチドが十分かつ経 済的に合成およびアッセイされ得る、複数の表面を有するロッドまたはピンに関 する。発明の背景 GeysenのEP198855号は、多数の異なるペプチドを同時に合成する方法を開示し た。基本的に、本発明の方法は、ロッドまたはピンの形状に成形され得るポリエ チレンのような固体ポリマー表面上でのペプチド合成に関する。この方法の好ま しい実施態様において、これらのロッドまたはピンは12×８のマトリックスを形 成するようにホルダーの中に位置し、このとき、ロッドまたはピンの間隔は、EL ISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）試験に広く使用されるマイクロタイタープレ ートのウェルの間隔に対応するように位置している。 この先行する明細書に開示される方法は、任意のペプチドの固相合成において 、その合成の殆ど全ての工程が任意のペプチドに関して正確に同じであり、そし て合成されるペプチドの配列に依存しないという認識に基づいていた。従って、 96個がホルダー中にあるような好ましい形で配置されたロッドまたはピンでは、 合成の全ての工程（例えば、洗浄工程、 中和工程、および脱保護工程）が同時に行われ、96種の異なるペプチドが合成さ れ得る。異なるペプチド各々について別個に行わなければならない唯一の工程は 、適切なアミノ酸残基のカップリングである。これらの工程の各々は、活性化し た適切なアミノ酸溶液をマイクロタイタープレートなどの対応するウェルに供給 することにより都合よく行われる。従って、適切なアミノ酸が各ロッドのペプチ ドと結合する。 この方法により固体ポリマー表面と共有結合したペプチドの量は、ペプチドが 、容易に検出される抗体のような特定の結合物質と反応するのに十分である。各 ロッド上で合成されるペプチドの量は比較的少ないが（典型的には、１μモル未 満）、合成ペプチドが試験後に再使用される能力が、ロッド上のペプチドの少な さを補う。しかしながら、いくつかの場合では、さらに多くのペプチドが必要で ある。そのような場合の例としては、ロッドからペプチドを除去して、さらに試 験するために特異的結合物質を回収することが挙げられる。ペプチドの合成およ び試験の変法は、PCT W091/04266号に開示された。 本発明の目的は、異なる配列を有する多くのペプチドを同時に合成し得る利点 を維持しながら、ペプチドまたはそれ以外にも固体支持体上で合成され得る他の 任意のポリマー化合物（例えば、核酸）の量を増大し得る手段を提供することで ある。 初期の方法では、γ線を用いてポリアクリル酸を固体ポリ エチレン支持体の表面にグラフトした。この初期のシステムでは、ペプチドがグ ラフトされるロッド上の領域は、特定のアミノ酸を成長しているペプチドに結合 させるのに使用される試薬の容量により完全に規定され、またはさらに正確には 、ロッドがアミノ酸溶液に浸漬される深さにより完全に規定された。この深さは 合成のサイクルごとに当然少しづつ変化する。その結果、ロッド上の小さな領域 においては、合成されたペプチドには感知できる量の欠失ペプチド（すなわち、 １つまたはそれ以上の残基が欠如していることにより、意図した配列とは異なる 配列のペプチド）が存在していた。なぜなら、１回またはそれ以上のサイクルに おいて、活性化アミノ酸溶液のうちの１つが足りなかったからである。 初期システムのさらなる欠点は、照射プロセスにおいてロッド上にグラフトさ れるポリマー層が、多くの溶媒で容易に溶媒和され、その結果、溶媒が毛細管現 象によりこの層を通って上方に移動することである。このことにより試薬のリザ ーバーが枯渇し、その結果、上記のように、合成の質が不確実な領域がより拡大 する。さらに、これらのロッドを広範囲にわたって洗浄する際に十分な注意を払 わなければ、ポリマー層は合成に使用する溶媒のリザーバーとして作用し、次の 溶液が汚染される結果となる。発明の開示 本発明の一局面は、複数の独立した合成表面を有する、改 良された合成用支持体である。これは、異なるN-またはC-基を有するか、支持体 への異なる結合（例えば、永久的結合（permanent link）、開裂性結合（cleava ble link）など）を有するか、あるいはそうでなければ配列以外の特徴が異なる ペプチド（または他のモジュラーポリマー）の同時合成を可能にする。さらに、 この新しい支持体は、収集したポリマーの複数のコピーを作成するために使用さ れ得る。 本発明の他の局面は、開裂性結合である。これは、本発明の合成用支持体から モジュラーポリマーを開裂し得、モジュラーポリマーの開裂末端にアミドを残す 。図面の要旨 図１は、本発明の活性表面部材の平面図および断面図を示す。 図２は、本発明の支持体ロッドの平面図を示す。 図３は、本発明の方法により調製されるマルチプルエピトープライブラリーを 用いて得られるELISAの結果を示す。 図４は、本発明の方法により調製されるマルチプルエピトープライブラリーを 用いて得られる、ELISAによる結合阻害の結果を示す。本発明を実施する態様 Ａ．定義 用語「モジュラーポリマー」とは、モノマー群から選択さ れる同一でないサブユニットから構成されるポリマーを意味する。モジュラーポ リマーは一般に一度に一つのモノマーで合成される。 本明細書中で用いる用語「モノマー」とは、結合または縮合してオリゴマーを 形成し得る分子を意味する。多様性を提供するために、モノマーは少なくとも４ つの異なるメンバーを含むセットから選択される。適切なモノマーのセットには 、通常のD-およびL-アミノ酸、核酸／ヌクレオチド、炭水化物、通常とは異なる D-およびL-アミノ酸（例えば、シクロヘキシルアラニン、ベンズヒドリルグリシ ン、クロロアラニンなど）、およびW091/19735号（本明細書中に参考として援用 される）に記載される「ペプトイド（peptoids）」が挙げられる。 用語「通常のアミノ酸」とは、アミノ酸である、アラニン（Ａ）、システイン （Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ） 、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロ イシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グル タミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（ Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）を意味する。 用語「通常とは異なるアミノ酸」とは、通常のアミノ酸以外のアミノ酸を意味 する。現在のところ好ましい、通常とは異なるアミノ酸は、以下である： Nle＝L-ノルロイシン； Aabu＝α-アミノ酪酸； Hphe＝L-ホモフェニルアラニン； Nva＝L-ノルバリン； Gabu＝γ-アミノ酪酸； Dala＝D-アラニン； Dcys＝D-システイン； Dasp＝D-アスパラギン酸； Dglu＝D-グルタミン酸； Dphe＝D-フェニルアラニン； Dhis＝D-ヒスチジン； Dile＝D-イソロイシン； Dlys＝D-リジン； Dleu＝D-ロイシン； Dmet＝D-メチオニン； Dasn＝D-アスパラギン； Dpro＝D-プロリン； Dgln＝D-グルタミン； Darg＝D-アルギニン； Dser＝D-セリン； Dthr＝D-トレオニン； Dval＝D-バリン； Dtrp＝D-トリプトファン； Dtyr＝D-チロシン； Dorn＝D-オルニチン： Aib＝アミノイソ酪酸； Etg＝L-エチルグリシン； Tbug＝L-t-ブチルグリシン； Pen＝ペニシラミン； Anap＝α-ナフチルアラニン； Chexa＝シクロヘキシルアラニン； Cpen＝シクロペンチルアラニン； Cpro＝アミノシクロプロパンカルボキシエート； Norb＝アミノノルボルニルカルボキシレート； Mala＝L-α-メチルアラニン； Mcys＝L-α-メチルシステイン； Masp＝L-α-メチルアスパラギン酸； Mglu＝L-α-メチルグルタミン酸； Mphe＝L-α-メチルフェニルアラニン； Mhis＝L-α-メチルヒスチジン； Mile＝L-α-メチルイソロイシン； Mlys＝L-α-メチルリジン； Mleu＝L-α-メチルロイシン； Mmet＝L-α-メチルメチオニン； Masn＝L-α-メチルアスパラギン； Mpro＝L-α-メチルプロリン； Mgln＝L-α-メチルグルタミン； Marg＝L-α-メチルアルギニン； Mser＝L-α-メチルセリン； Mthr＝L-α-メチルトレオニン； Mval＝L-α-メチルバリン： Mtrp＝L-α-メチルトリプトファン； Mtyr＝L-α-メチルチロシン； Morn＝L-α-メチルオルニチン； Mnle＝L-α-メチルノルロイシン； Maabu＝α-アミノ-α-メチル酪酸； Mnva＝L-α-メチルノルバリン； Mhphe＝L-α-メチルホモフェニルアラニン； Metg＝L-α-メチルエチルグリシン； Mgabu＝α-メチル-γ-アミノ酪酸； Maib＝α-メチルアミノイソ酪酸； Mtbug＝L-α-メチル-t-ブチルグリシン； Mpen＝α-メチルペニシラミン； Manap＝α-メチル-α-ナフチルアラニン； Mchexa＝α-メチルシクロヘキシルアラニン； Mcpen＝α-メチルシクロペンチルアラニン； Dmala＝D-α-メチルアラニン； Dmorn＝D-α-メチルオルニチン； Dmcys＝D-α-メチルシステイン； Dmasp＝D-α-メチルアスパラギン酸； Dmglu＝D-α-メチルグルタミン酸； Dmphe＝D-α-メチルフェニルアラニン； Dmhis＝D-α-メチルヒスチジン； Dmile＝D-α-メチルイソロイシン； Dmlys＝D-α-メチルリジン； Dmleu＝D-α-メチルロイシン； Dmmet＝D-α-メチルメチオニン； Dmasn＝D-α-メチルアスパラギン； Dmpro＝D-α-メチルプロリン； Dmgln＝D-α-メチルグルタミン； Dmarg＝D-α-メチルアルギニン； Dmser＝D-α-メチルセリン； Dmthr＝D-α-メチルトレオニン； Dmval＝D-α-メチルバリン； Dmtrp＝D-α-メチルトリプトファン； Dmtyr＝D-α-メチルチロシン； Nmala＝L-N-メチルアラニン； Nmcys＝L-N-メチルシステイン； Nmasp＝L-N-メチルアスパラギン酸； Nmglu＝L-N-メチルグルタミン酸； Nmphe＝L-N-メチルフェニルアラニン； Nmhis＝L-N-メチルヒスチジン； Nmile＝L-N-メチルイソロイシン； Nmlys＝L-N-メチルリジン； Nmleu＝L-N-メチルロイシン； Nmmet＝L-N-メチルメチオニン； Nmasn＝L-N-メチルアスパラギン； Nmchexa＝N-メチルシクロヘキシルアラニン； Nmgln＝L-N-メチルグルタミン； Nmarg＝L-N-メチルアルギニン； Nmser＝L-N-メチルセリン； Nmthr＝L-N-メチルトレオニン； Nmval＝L-N-メチルバリン； Nmtrp＝L-N-メチルトリプトファン； Nmtyr＝L-N-メチルチロシン； Nmorn＝L-N-メチルオルニチン； Nmnle＝L-N-メチルノルロイシン； Nmaabu＝N-アミノ-α-メチル酪酸； Nmnva＝L-N-メチルノルバリン； Nmhphe＝L-N-メチルホモフェニルアラニン； Nmetg＝L-N-メチルエチルグリシン； Nmgabu＝N-メチル-γ-アミノ酪酸； Nmcpen＝N-メチルシクロペンチルアラニン； Nmtbug＝L-N-メチル-t-ブチルグリシン； Nmpen＝N-メチルペニシラミン； Nmanap＝N-メチル-α-ナフチルアラニン； Nmaib＝N-メチルアミノイソ酪酸； Dnmala＝D-N-メチルアラニン； Dnmorn＝D-N-メチルオルニチン； Dnmcys＝D-N-メチルシステイン； Dnmasp＝D-N-メチルアスパラギン酸； Dnmglu＝D-N-メチルグルタミン酸； Dnmphe＝D-N-メチルフェニルアラニン； Dnmhis＝D-N-メチルヒスチジン； Dnmile＝D-N-メチルイソロイシン； Dnmlys＝D-N-メチルリジン； Dnmleu＝D-N-メチルロイシン； Dnmmet＝D-N-メチルメチオニン； Dnmasn＝D-N-メチルアスパラギン； Dnmpro＝D-N-メチルプロリン； Dnmgln＝D-N-メチルグルタミン； Dnmarg＝D-N-メチルアルギニン； Dnmser＝D-N-メチルセリン； Dnmthr＝D-N-メチルトレオニン； Dnmval＝D-N-メチルバリン； Dnmtrp＝D-N-メチルトリプトファン； Dnmtyr＝D-N-メチルチロシン； Nala＝N-メチルグリシン（サルコシン）； Nasp＝N-（カルボキシメチル）グリシン； Nglu＝N-（2-カルボキシエチル）グリシン； Nphe＝N-ベンジルグリシン； Nhhis＝N-（イミダゾリルエチル）グリシン； Nile＝N-（1-メチルプロピル）グリシン； Nlys＝N-（4-アミノブチル）グリシン； Nleu＝N-（2-メチルプロピル）グリシン； Nmet＝N-（2-メチルチオエチル）グリシン； Nhser＝N-（ヒドロキシエチル）グリシン Nasn＝N-（カルバミルメチル）グリシン； Ngln＝N-（2-カルバミルエチル）グリシン； Nval＝N-（1-メチルエチル）グリシン； Narg＝N-（3-グアニジノプロピル）グリシン； Nhtrp＝N-（3-インドリルエチル）グリシン； Nhtyr＝N-（p-ヒドロキシフェネチル）グリシン Nthr＝N-（1-ヒドロキシエチル）グリシン； Ncys＝N-（チオメチル）グリシン；および Norn＝N-（3-アミノプロピル）グリシン； Ncpro＝N-シクロプロピルグリシン； Ncbut＝N-シクロブチルグリシン； Nchex＝N-シクロヘキシルグリシン； Nchep＝N-シクロヘプチルグリシン； Ncoct＝N-シクロオクチルグリシン； Ncdec＝N-シクロデシルグリシン； Ncund＝N-シクロウンデシルグリシン； Ncdod＝N-シクロドデシルグリシン； Nbhm＝N-（2,2-ジフェニルエチル）グリシン； Nbhe＝N-（3,3-ジフェニルプロピル）グリシン； Nnbhm＝N-（N-（2,2-ジフェニルエチル）カルバミルメチル）グリシン； Nnbhe＝N-（N-（3,3-ジフェニルプロピル）カルバミルメチル）グリシン； Nbmc＝1-カルボキシ-1-（2,2-ジフェニルエチルアミノ）シクロプロパン；およ び Naeg＝N-（2-アミノエチル）グリシン 用語「活性表面」とは、誘導体化するか、他の方法でモジュラーポリマー合成 に適応するようにした表面を意味する。これは、モジュラーポリマーが上記の表 面上で効率よく合成され得るならば、モジュラーポリマーの合成における使用に 「適して」いる。活性表面を有する部材は組成物において均一または不均一であ り得る。例えば、活性表面は支持体構造または支持体表面に結合またはグラフト され得る。原則として、活性表面はいかなる支持体構造（例えば、以下に定義す る「不活性表面」であり得る）にも放射線でグラフトされ得る。 用語「不活性表面」とは、モジュラーポリマーの合成条件に対して安定であり 、かつ反応しない表面を意味する。適切な不活性表面としては、ポリエチレン、 ポリオレフィン類、セルロースアセテート、羊毛、綿、キチンなどが挙げられる が、これらに限定されない。 Ｂ．一般方法 本発明の第一の実施態様では、ペプチドまたは他のポリマー化合物をその上で 合成するために使用される複数の支持体が提供される。これらの支持体は不活性 表面および一連の活性表面を有し、各活性表面は合成が行われ得る活性領域を有 する。 不活性表面は、典型的には、複数の活性表面部材のための空間を有する、一般 に円柱形をしたロッドまたはピンの形態で提供される。好ましくは、不活性な支 持体は、２〜20個の活性表面部材を、さらに好ましくは約５個の活性表面部材を 保持し得る。支持体は、円形、長方形、または他の任意の形状の断面を有し得る ：円形および正方形が好ましい。支持体は、さらに、活性表面部材を載置、配置 および保持するのを助ける突出部または突起部を備え得る。さらに、支持体は、 刻み目および／または切り目を備え得、これが活性表面部材がその上に「スナッ プ止め（snapped）」され得るのに十分な可 撓性を支持休に与える。あるいは、活性表面部材は、釘状のピンの上に配置され 得、次いでそのピンを支持配列（array）に装着し得る。ここで、ピンの「頭部 」は全ての活性表面部材を保持するような形状である（活性表面部材は、その後 、ピンを支持体から取り外すか、あるいはピンの頭部を切断または取り外すこと により、取り出され得る）。 支持ロッドは、モジュラーポリマーの合成およびそれらのアッセィの際、同時 並行プロセスを促進するために一群となって配列を形成し得る。現在の好ましい 実施態様では、支持体（「ピン」）は、マイクロウエルアッセイ用プレートのウ ェルの間隔に適合する８×12の配列でブロック上に装着される。好ましくは、ロ ッドは、支持ブロックにドリルで開けられたかまたは成形された穴に、圧入（pr ess-fit）または摩擦止め（friction-fit）により装着される。ロッドは、各ロ ッドがブロック表面から同じ距離だけ突出することを確実にするために、固定フ ランジまたは突出部を備え得る。別の装着方法には、ロッドと穴にネジを切るこ と、接着、一体成形、磁気結合などが挙げられる。他の配置形態もまた本発明の 範囲内であると考えられる。例えば、支持ロッドは、連続したベルトの上に配置 され得るか、またはロボットマニュピレーターにより個々に把持され得、自動操 作を容易にする。 好ましくは、活性表面は、摩擦止めまたはスナップ止めにより不活性支持体の 所定の場所へ容易に取り付け（および取り外し）され得る形態で提供される。し かしながら、接着 （これは、永続的であってもなくてもよい）、熱融合、ネジ ot and key）、および磁気のような他のアタッチメント形態も使用され得る。例 えば、鉄製のコアを有する不活性支持体および活性表面部材が使用され得、そし て電磁気により活性表面部材が保持され得る。この実施態様において、活性表面 への結合反応は、電流を調節してピンの振動を誘起することにより促進され得る 。有効な振動数は、約40Hzから60KHz以上、またはさらに好ましくは約50〜60Hz の範囲である。あるいは、支持ロッドは、作動時に所望の振動数で振動させる圧 電型変換器を用いて作製され得るか、またはそれに固定され得る。活性表面部材 は好ましくは環状であるが、不活性支持体に保持され得る任意の形状で形成され 得る。例えば、活性表面部材は半円状（例えば、約270°で終わっている）であ り得、そしてなお圧入により保持され得る。磁気により保持される活性表面部材 は、完全な環状である必要はない。活性表面部材は、好ましくは、それらの表面 積を増大するような形状であり、従ってそれらは同じ直径の円柱よりも大きな表 面積を有する。本発明の一つの実施態様において、活性表面部材は、それらの表 面積を最大にするために、羽根形または「歯車」形である。内部表面（不活性支 持体と向き合う面）は、不活性支持体の対応する表面とかみ合わせし得るフラン ジ、蛇腹突起（ledge）および／または他の表面部を備え得る。末端の活性表面 部材は異なる形状を有し得る。なぜなら、不活性支持 体は該部材を完全に通り抜ける必要はないからである。例えば、末端の活性表面 部材は半球形であり得る。 図１は、本発明の一つの好ましい実施態様の活性表面部材（１）を例示してい る。図１Ａは、厚さｔが2.5mm、最大外径5.5mm、最小内径（向かい合った内側突 出部（２）の間）2.0mm、および最大内径3.0mmの部材の平面図を示している。図 １Ｂはこの部材の断面を示している。部材はポリエチレンから成形され、対称に 配置された16個の外側の「歯」（３）および４個の内側の歯（２）を有する。 図２は、本発明の一つの好ましい実施態様の、図１の部材（１）と共に使用す るために設計された支持ロッド（10）を例示している。ロッド10は、直径約3.8m mおよび長さ約32.3mmの第１シャフトを備えている。末端12は、支持ブロックへ の挿入を容易にするために丸くなっており、そして均一な挿入を確実にするため にフランジ13を備えている。フランジ13は、末端12から約9.8mmのところに位置 し、寸法は厚さ1.1mmで、外径6.0mmである。第２シャフト（14）は第１シャフト 11と共軸であり、そこから約21.0mm延びている。第２シャフト14は約2.0mmの直 径を有し、複数の突出部15を備えている。これらの突出部は一般に円柱形であり 、約0.5mmの直径を有し、第２シャフト14の表面から約0.85mm延びている。これ らの突出部15は、第２シャフト14上に部材１を設置および配置するのに役立つ。 第２シャフト14は、さらに、最小径約1.0mmおよび最大径約2.4mm、傾斜角約30° の、一般に円錐台形をした（frustroconic al）エンドキャップ16を備えている。エンドキャップ16は、部材１の支持体10へ の取り付けを容易にし、最下部（bottom-most）部材を保持する役目がある。 活性表面は、それらが受ける化学反応に依存して、同一または異なる組成から なり得る。コーティングは、通常の固相ペプチド合成および／または核酸合成に 使用される任意の多孔性樹脂から作製され得る。これらの樹脂は多孔性であるた めに、活性領域の表面積は劇的に増大し、従ってモジュラーポリマーがたいへん 収率良く得られる。さらに、本発明のこの実施態様を用いると、合成に使用する 化学反応を変更することが特に簡便となり、そして実際、活性表面部材をコーテ ィングする適切な樹脂を選択することにより、合成するポリマー化合物のクラス を変更することが簡便となる。このようなコーティングに使用され得る多孔性樹 脂の例としては、ベンズヒドリルアミン-ポリスチレン樹脂、および内部がケイ ソウ土のポリアクリルアミドゲルが挙げられる。他の適切な表面物質としては、 ポリエチレングリコール、セルロースおよび他の天然ポリマー、Merrifield樹脂 、Rink樹脂、ならびにアクリル酸、メチルアクリレート、メタクリル酸、メチル メタクリレート、ジメチルアクリルアミド、スチレン、ヒドロキシエチルアクリ レート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート 、ヒドロキシエチルメタクリルアミド、メチルメタクリレートおよびポリエチレ ングリコールモノメタクリレートなどのポリマー、ならびにそら れの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。活性表面を有する部材 は均一である必要はない。ポリエチレン、 （ポリテトラフルオロエチレン）または他の任意の安定な不活性表面から作製さ れる構造支持体を用いることもまた本発明では好ましい。次いで、活性表面は、 焼結、接着、熱融合などを含む任意の使用可能な手段により、支持体表面に付着 され得る。本発明の好ましい方法は、支持体表面を溶媒および活性表面物質の溶 液に入れ、そしてこの混合物をγ線で照射することによる、グラフト法である。 好ましい溶媒は、水、メタノール（MeOH）、H₂O/MeOH混合液、ジメチルホルムア ミド（DMF）、およびジメチルスルホキシド（DMSO）である。上記混合物は、EP1 38855号に記載されるように調製および照射される（D．Muller-Schulteら、Polv mer Bull （1982）7:77-81もまた参照のこと）。 次いで、所望ならば、選択されたカップリング化学反応のために表面を改変す る。モジュラーポリマーは、「永久的」（すなわち、表面から容易には除かれな い）または「開裂性」（すなわち、容易に開裂されて支持体から除去されるよう に設計されている）であり得る。開裂性モジュラーポリマーは、一般に、モジュ ラーポリマーの合成中には起こり得ない条件下で表面からの開裂が促進されるよ うな活性表面への結合を有している。異なる結合化学反応もまた、異なるN末端 およびＣ末端基（ペプチドの場合）のために使用される。開裂性モジ ュラーポリマーは、検出用の標識基または分離および精製用の結合リガンドを備 え得る。例えば、開裂性モジュラーポリマーは、精製（例えば、ストレプトアビ ジンカラムを用いた）を容易にするためにビオチン化される（または、他の類似 のリガンドが付けられる）か、あるいは結合アッセイにおいて検出を簡単にする ためにフルオレセインまたは放射性原子で標識される。これにより、同時にモジ ュラーポリマーのコレクションまたはライブラリーを作成し得る。ここで、１つ またはそれ以上のセットは、永久的であり、他のセットはビオチン化、フルオレ セイン化、放射性化され、酸性末端基に開裂可能、アミド末端基に開裂可能、お よび中性末端基に開裂可能である。 開裂性結合の１つの形態は、Geysen，WO90/09395号（本明細書に参考として援 用する）に記載されている。これには、ペプチド鎖の支持体からの切り離しに伴 って結合が環化してジケトピペラジン部分を形成することが記載されている。好 ましい実施態様においては、保護された（例えばBOCで）α−アミノ基を有する リジンが、ε−アミノ基を通して支持体にカップリングされる。Pro（このカル ボキシ末端は、直角的（orthogonally）に保護された（例えばFmoc）アミノ基を 有する適切な反応性スペーサー（「Ｘ」）でエステル化されている）は、次いで Lysのカルボキシレート官能基とカップリングされる。次いで、モジュラーポリ マーの合成は、アミノ基の脱保護へ進む： あるいは、まず基を合成して、それからそれをピンにカップリングし得る： 開裂は、Lysのα-アミノ基を保護するBOC（または他の基）を除去し、生成する- NH₃ ⁺を中和することによって効果的に行われる。Lysのα-アミノ基-NH₃ ⁺を-NH₂ に中和すると、アミンがProのカルボニルを攻撃して、Proが（それと共にモジュ ラーポリマーが）離れる。ジケトピペラジン部分は活性表面に結合したまま残る 。あるいは、スペーサー基を活性表面にカップリングして、エステル結合を形成 し得る。適切に保護化さ れたLysをProにカップリングすることにより同様の塩基性リンカーを形成する。 しかし、この配置では、支持体からの開裂後、ジケトピペラジン部分はモジュラ ーポリマーに結合したままになる。 発明者らはまた、新たなリンカーを開発した。これは、モジュラーポリマーの 開裂を容易にして、開裂点においてアミド官能基を生成する。モジュラーポリマ ーは、保護化α-アミノグリシンを介して活性表面に結合されて合成される。モ ジュラーポリマーの合成終了後、保護基がα-アミノ基から除かれる。活性表面 をpH7〜10の水溶液に浸漬すると、以下のスキームに示すように、開裂が起こり 、モジュラーポリマー上の開裂点にアミド官能基が残る： この結合は、あらゆるタイプのモジュラーポリマーに使用 され得る。以下に結合したモジュラーポリマーの一般式を示す： ここで、Ｍはモノマー、ｎは整数（好ましくは２〜30（２と30も含めて））そ してＺは保護基である。スペーサーは任意である。 他の開裂性結合も使用され得る。例えば、公知の光開裂性結合がある。これは 、選択された波長の光に曝されて開裂する。これらの結合および上記結合は、一 般的にペプチドおよびペプトイドベースのモジュラーポリマーと共に用いること に最も適している。しかし、核酸と共にも使用し得る。モジュラーポリマーが核 酸である場合、それは、制限酵素認識部位の形態で開裂性結合を備えることによ って簡便に取り除かれ得る。核酸モジュラーポリマーはまた、ポリメラーゼプロ モーター／結合部位および増幅プライマーハイブリダイゼーション部位を含み、 ２本鎖形成および増幅（例えばPCR）を容易にする。 活性表面はまた、異なるタイプの表面の識別を容易にするための識別特徴を有 し得る。例えば、異なるタイプの活性表面は、異なる色および／または模様、異 なるサイズおよび／または形状、ピンまたはロッドへの異なる接着度（例えば、 ピンから表面を離すのに必要とされる力の量が異なる）、異 なる磁化度などを有し得る。色および／またはパターンで異なる表面は、検分し て手で分けられ得る。着色は、活性表面部材中に（活性表面層またはその下の支 持構造のどちらか、あるいは両方に）染料を含有させることにより達成され得る 。模様は一般に単純であり、そして例えば各部材の半分だけを着色することによ って得られ得る。接着度の異なる表面は、計測された振動または衝撃によりピン または支持体から分けられ得る（緩く付着している表面をまず除き、続いてより 激しく振盪または衝撃を加えてより強く付着している表面を除く）。サイズおよ び／または形状で異なる表面は、小さな部材を通し、大きな部材を残す簡単なス クリーンで分けられ得る。磁化された表面は、磁石、電磁石または鉄合金を用い て非磁化表面から分けられ得ることは明らかである。後の２つの系は、自動化に 適している。よって、１回の操作でいくつかの異なる形態の上記モジュラーポリ マーのコレクションまたはセットを調製し得る。次いで、異なる形態はさらなる 研究のために容易に分けられ得る。 基本単位の（modular）活性表面部材および不活性部材の使用は、いくつかの 利点を有する。まず、各部材の機能に最適の材料を用いて最適条件下で各部材を 調製し得る。例えば、活性表面部材は、モジュラー構築において支持ロッドまた は支持ブロックで所望される剛直性を示す必要はないので、ロッドは剛直な材料 から作成され得、他方、活性表面部材は、合成表面として最適化された柔軟な材 料から作成され得る。 活性領域を分離した物体として備える部品を製造する他の主な利点は、溶液の 相互汚染を最小化することである。EP198855号に記載される照射工程の間にロッ ド上にグラフトされるポリマー層は、多くの溶媒で容易に溶媒和され、その結果 、溶媒が毛細管現象によりこの層を通って上まで移動する。この結果、試薬のリ ザーバーが涸渇し、そして結果として上記のように合成の質の不確実な大きな領 域が生じる。また、これらのロッドを広範に洗浄するときに細心の注意を払わな いと、ポリマー層が合成に使用される溶媒のリザーバーとなり、これは次の溶液 が汚染される結果となる。活性領域を備える部品を、本明細書に記載するように 別々に製造すると、この溶媒および試薬の移動は起こり得ない。 活性領域は、典型的には全ユニットよりずっと小さいため、活性領域を分離し た物体として備える部品を製造する他の主な利点が生じる。従って、活性領域部 材の大部分は同時に処理されて活性領域が生産され、結果として材料と時間を節 約する。 例示のみの目的において、ロッドの活性領域を提供する部分、すなわち、ペプ チドまたは他のポリマー分子が合成されるロッドの領域は、半径２mmおよび高さ ４mmの円柱状であり、この活性領域の表面積は61.8mm²（この円柱の一端のみを 合成に利用し得ると仮定して）である。しかし、このロッド部分の直径方向に１ mm幅のスリットを作ると、表面積は81.8mm²になる（切れ目のない円柱部分の面 積の1.3倍）。活性領域を提 供する部分の表面積は、ロッドのこの部分の形状を改変することによってさらに 増加し得る。例えば、0.4mm幅で１mmの深さを有する８つのスリットを円柱部分 の表面に作ると、合成に利用できる表面積は124mm²に増加する（改変していない シリンダー部分の領域の２倍）。ロッドの活性領域の表面積は、その幾何学的形 状をさらに改変することでさらに増加し得、そして等しくこのような改変は、最 終的に所望な形状にロッドを成形することによって、または成形されたロッドを 最終的に所望な形状に切削加工することによってなされ得ることは明らかである 。 しかし、本発明の好ましい実施態様では、ロッドの活性領域を提供する部分は 、固体材料の小さな粒子を結合すること、例えば、圧力または熱あるいは両方を 用いて焼結することによって作製される。これは、特に過酷な化学反応または腐 食性溶媒を使用する場合、特に有用である。例えば、ガラスは、最も一般的なプ ラスチック材料を不安定にする大部分の溶媒に耐性がある。従って、ガラスの小 さな球状ビーズを焼結することによって活性領域を作製し得る。次いで、これを 、例えば、アミノシランを用いて表面を機能化処理して、その表面をペプチドま たは他のポリマー性化合物が合成され得るベースとしてふさわしくし得る。本実 施例においては、不活性領域は、ポリテトラフルオロエチレンのような特に耐性 のプラスチックから作製される。このようにして、ガラスのような材料（これは 不活性領域には不適である）は利点をもって 活性領域に使用し得る。 本発明のこの特定の実施態様のさらなる利点は、活性領域の（表面積／体積） 率の大きな増加が達成され得ることである。上記の例を用いると、8885個の半径 0.1mmの球状固体粒子を隙間なく充填するとロッドの活性領域を提供する部分の 体積を満たす。これらの球体の表面積は、1116.4mm²であり、切れ目のない円柱 部分の表面積の17.8倍になる。焼結される粒子のサイズを小さくすると、それに 対応して合成に利用できる表面積は増加する。例えば、焼結される剛直な球体の 半径を0.055mmに減らすと、表面積は2233mm²に増加し、切れ目のない円柱の表面 積の35.5倍になる。実際には、粒子を結合する工程により、そして粒子がサイズ および剛直さに関して均一ではないという事実により、表面積の理論通りの増加 は達成されないだろう。しかし、微粒子材料を焼結して固体支持体を作製するこ とによって、合成に利用できる表面積の顕著な増加が達成され得る。 本発明のさらなる特徴が、以下の実施例において例示としてのみ示される。 Ｃ．実施例 下記の実施例は、当業者へのさらなるガイドとして提供され、そして本発明を 限定するものではない。 実施例１ （ペプチド合成） ポリエチレンピンを、図２に示すように成形し、そしてWO91/04266号に記載さ れるようにして8×12ブロックに装着した。 開裂性ペプチド用の取り外し可能な合成表面（「開裂性クラウン」）を、図１ に示すようにポリエチレンを用いて成形し、次いで、EP198855号に記載のように して、メタクリル酸／ジメチルアクリルアミド（10％MA、20％DMAメタノール溶 液）を用いて放射線によりグラフト化した。次に、開裂性クラウンを、WO91/042 66号に従って、t-ブトキシカルボニルヘキサメチレンジアミン（Boc-HMD）、ト リエチルアミン（TEA）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）およびヒドロ キシベンゾトリアゾール（HOBT）（1:1:1:1.2）の60mM DMF溶液に浸漬すること によって、Boc-ヘキサメチレンジアミンで誘導体化した。トリフルオロ酢酸を用 いたBoc脱保護の後、活性表面を、MeOH（２分）、5%TEA MeOH溶液（５分を２回 ）およびMeOH（５分）で洗浄して中和した。予め形成したジケトピペラジンリン カー（Boc-Lys（Fmoc）-Pro-O-HMB）（HMB:ヒドロキシメチル安息香酸）を、DCC /H0BT（1:1:1.2）を用いて60mM濃度で、所望の導入量を得るために決められた時 間カップリングした。130mm²の表面積上に、およそ1.5マイクロモルのリンカー が、90分間以内にカップリングされ得る。表面上の未反応アミノ基をアシル化し て封止する。 非開裂性ペプチド用の取り外し可能な合成表面（「非開裂 性クラウン」）を、図１に示すようにポリエチレンを用いて成形し、次いで、EP 198855号に記載のようにして、ヒドロキシプロピルメタクリレートの30％MeOH溶 液を用いて放射線によりグラフト化した。次いで、表面を、Fmoc-Gly（30mM）、 DCCおよびジメチルアミノピリジン（DMAP）（1:1:0.2）のDMF/ジクロロメタン（ 1:3）溶液を用いて15分間で誘導体化した。表面上の未反応のヒドロキシ基を、 アシル化によって封止する。20％ピペリジン／DMF中でのFmoc脱保護およびDMF（ ２分）およびMeOH（２分を３回）を用いた洗浄の後、コントロールのFmoc-β-Al aカップリングを行い、50〜100ナノモルの全導入量が得られる。Fmoc-β-Ala、D CCおよびHOBT（l:1:1.2、30mM）のDMF溶液を、およそ10分間カップリングし、そ して残ったGlyのアミノ基をアシル化により封止する。 各ピンに４つの非開裂性クラウンを取り付けし、続いて、１つの開裂性クラウ ンを取り付けた。次いで、得られた合成構造を、Neisseria gonorrhea C30株ピ リン（pilin）タンパク質の30〜52位のアミノ酸（RAQVSEAILLAEGQKSAVYEYYLNHGK WP）に由来する１セットの重複オクタペプチドの合成に用いた。よって、あらゆ る所与のピンは、同一のオクタペプチドを有する５個のクラウンを担持し、各ピ ンは、他のピン上に担持されるオクタペプチドと異なるオクタペプチドを担持し た。 実施例２ （ペプチドのアッセイ）非開裂性ペプチドのアッセイ 非開裂性クラウンを５位のピンから除き、そして４つの同一エピトープライブ ラリーを提供するために、１位のピンを保持するブロックの対応位置に置いた（ WO91/04266号を参照のこと）。各ブロックを、1/20,000希釈のウサギ抗ピリン（ anti-pillin）抗血清を用いてELISAにより抗体結合についてテストした。結果（ 図３に示す）は、４セットのペプチドの全てが基本的に同一であることを示す。開裂性ペプチドのアッセイ 次に、開裂性クラウンを、ピンから除き、そしてペプチドを除いた。各クラウ ンを、800μLの開裂用溶液（0.1M NH4HCO₃、40%CH₃CN、pH8.4）で処理した。一 部をアミノ酸分析にかけた。HPLCから高純度であることがわかった。ペプチドの 代表的収量は、約600ナノモル／クラウンであった。 次いで、各ペプチドを、非開裂性ペプチドのセットに対する抗体の結合につい て溶液相競合を例証するために３濃度で用いた。４つの血清調製物をテストした ： 1）1/21,000血清希釈液、添加ペプチドなし（図4A）； 2）1/21,000血清希釈液、35ナノモル/mLでペプチド添加（図4B）； 3）1/21,000血清希釈液、3.5ナノモル/mLでペプチド添加（図4C）； 4）1/21,000血清希釈液、0.35ナノモル/mLでペプチド添加（図4D）。 抗血清およびペプチドを混合し、そして結合（非開裂性） ペプチドのセットを用いてテストする前に室温で１時間インキュベートした。EL ISAの結果を図４に示す：35ナノモル/mL濃度の開裂ペプチド（図4B）が、抗体の 非開裂性ペプチドへの結合をほぼ完全に阻害するのに効果あった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブレイ，アンドリュー エム. オーストラリア国 ビクトリア 3155，ボ ロニア，ウェスタン ロード 48 (72)発明者 バレリオ，ロバート エム. オーストラリア国 ビクトリア 3977，ク ランボーン サウス，ホームステッド ロ ード 17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．モジュラーポリマーの合成に使用する合成支持体であって、該合成支持体は 以下を有する： モジュラーポリマーの固相合成を支持するのに適した活性表面を含む、複数の 概略環状の合成部材、および 該概略環状の合成部材の軸方向に位置し、細長く、不活性な支持ロッド、ここ で該支持ロッドは該概略環状の合成部材を同一線上配置に保持する。 ２．前記不活性支持ロッドが約５つの前記概略環状の合成部材を支えるように設 計されている、請求項１に記載の合成支持体。 ３．前記不活性支持体がポリエチレンまたはポリプロピレンを含む、請求項１に 記載の合成支持体。 ４．前記複数の合成支持体が配列に固定されている、請求項１に記載の合成支持 体。 ５．前記配列が８×12配列である、請求項４に記載の合成支持体。 ６．下式の結合したモジュラーポリマー： ここで、各Ｍは独立してモノマーであり、ｎは２〜100の整数であり、そしてＺ は保護基である。 ７．前記各Ｍがアミノ酸である、請求項６に記載の結合したモジュラーポリマー 。 ８．前記ｎが２〜20の整数である、請求項７に記載の結合したモジュラーポリマ ー。 ９．前記ｎが２〜10の整数である、請求項８に記載の結合したモジュラーポリマ ー。