FR2991322A1 - Complexes de lanthanides(iii) comprenant des fonctions 1,2,3-triazole : applications a la resolution structurale d'entites proteiques par diffraction des rayons x - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation en cristallographie, pour la résolution de la structure tridimensionnelle d'une entité protéique, par diffraction des rayons X, d'un complexe de lanthanide (III) de formule (I) : dans laquelle R et Ln sont tels que définis à la revendication 1, ainsi que les composés de formule (I) et (II) tels que définis aux revendications 18 et 21 respectivement.

Description

La présente invention concerne le domaine technique de la cristallographie, et en particulier de la résolution structurale d'entités protéiques telles que les protéines ou les capsides de virus. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation en 5 cristallographie de complexes de lanthanide (III) comprenant des groupes 1,2,3-triazole, pour la résolution structurale de différents édifices protéiques (proteines, capsides de virus). Dans le cadre de l'invention, un complexe de lanthanide (III) est utilisé pour introduire un atome lourd diffuseur anomal pour l'aide à la détermination structurale d'une entité telle qu'une protéine, 10 par une méthode de nova Les complexes utilisés dans le cadre de l'invention présentent, notamment, une forte affinité pour des sites particuliers de protéines. L'invention a également pour objet certains de ces complexes de lanthanide, ainsi que les intermédiaires de synthèse utiles pour leur préparation. 15 Les complexes de lanthanides à l'état d'oxydation +III sont utilisés dans de nombreuses applications, notamment dans le secteur solaire photovoltaïque, le domaine de l'éclairage, de l'affichage, de la traçabilité et notamment du marquage anti-contrefaçon, ou en biologie. De nombreux travaux portent donc sur l'élaboration de tels complexes. Certains travaux 20 décrivent également l'utilisation de lanthanides dans la résolution structurale de protéine. La détermination de la structure d'une protéine est essentielle dans de nombreux domaines scientifiques et particulièrement pour l'industrie pharmaceutique qui cherche bien souvent des molécules inhibitrices de leur 25 activité. La détermination exacte et à haute résolution de leur structure tridimensionnelle est donc essentielle en amont de ces études. Une telle détermination se fait grâce à la cristallographie qui a pour but de déterminer en chaque point de l'espace la densité électronique correspondant à une entité. Cette connaissance permet alors de constituer 30 un modèle en 3D de l'entité étudiée. Le calcul de la densité électronique repose sur une transformée de Fourier qui fait intervenir un nombre 2 991 3 2 2 2 complexe appelé facteur de structure, qui possède donc un module et une phase. La cristallographie permet de remonter à la valeur du module (l'intensité diffractée étant proportionnelle au carré du module du facteur de structure,) mais pas à la phase qui est donc perdue. Il n'est donc pas possible de calculer la transformée de Fourier et il n'est donc pas possible de connaître la densité électronique en chaque point de l'espace. Pour retrouver l'information concernant la phase, différentes méthodes ont été proposées. Les méthodes classiquement utilisées en cristallographie des protéines pour déterminer leur structure sont les méthodes de phasage de novo. Ces 10 méthodes se servent des données obtenues expérimentalement, sans utiliser d'information extérieure supplémentaire sur la structure de l'entité à étudier. Ces méthodes sont dénommées SIR/MIR (pour Single/Multiple Isomorphous Replacement) ou SAD/MAD (pour Single-/Multiple-wavelength Anomalous Diffraction) ou encore SIRAS/MIRAS lorsqu'il s'agit d'une combinaison des 15 méthodes précédentes. Pour plus de détails sur ces techniques bien connues de l'homme du métier, on pourra se référer à Taylor, G. (2003). The Phase problem. Acta D Volume 59, chap. 11. L'ensemble de ces méthodes repose sur l'introduction d'une sous-structure (que l'on dénomme aussi atome lourd) dans la structure de la 20 protéine que l'on cherche à déterminer. L'ajout de cette sous-structure induit des modifications de l'intensité des réflexions, par rapport à l'intensité obtenue lorsque la sous-structure n'est pas présente. C'est cette différence qui va être exploitée pour déterminer les coordonnées dans l'espace de la sous-structure, puis, une fois la sous-structure connue, déterminer les 25 phases et donc la structure de la protéine étudiée. La sous-structure doit ainsi apporter un nombre d'électrons importants (atomes à Z élevés) pour induire des différences, que l'on qualifie d'isomorphe, exploitées par les méthodes SIR et MIR, ou apporter une contribution particulière appelée diffusion anomale exploitée par les 30 méthodes SAD et MAD. Ce phénomène de diffusion anomale est, en particulier, important lorsque l'énergie du rayonnement X est proche d'un des seuils d'absorption de l'atome. Ainsi, parmi les atomes qui présentent les bonnes caractéristiques, on peut citer Se, Pt, Hg, Au, Ta etc..., ainsi que les lanthanides. Dans le domaine des études cristallographiques de protéines sur monocristal, une des méthodes les plus performantes de résolution structurale consiste à utiliser les lanthanides qui possèdent, en particulier, des propriétés de diffusion anomale facilitant la résolution du problème de phase. Pour comprendre l'intérêt des lanthanides, une manière est de les comparer au sélénium (Se) qui est l'atome lourd le plus utilisé actuellement pour la détermination des structures de protéines. Le sélénium est incorporé dans les protéines en substituant les méthionines (et les cystéines), acide aminé qui contient un atome de soufre, par des séleno-méthionines. Or, la production et la cristallisation de protéines séléniées peuvent se révéler difficiles voire impossibles à réaliser. Dans ce cas, obtenir des cristaux dérivés est un travail souvent long, parfois aléatoire, ce qui nécessite de multiples essais. Cela implique de produire des cristaux en nombre suffisant pour obtenir un dérivé. Pour cela, certains complexes de lanthanides ont été proposés pour être une alternative importante à l'incorporation de la séléniométhionine dans les protéines. De plus, si l'on compare le nombre d'électrons, les atomes de lanthanide présentent environ 64 électrons, alors que le sélénium n'en compte que 34. Du point de vue de la contribution anomale, les atomes de lanthanides ont une contribution de l'ordre de 30 électrons (Seuil d'absorption L111) comparée à 10-15 électrons pour le sélénium (Seuil d'absorption K). Il a d'ailleurs été montré que comparé au Se et à taux d'occupation équivalent, un atome de lanthanide va permettre de déterminer la structure d'une protéine de masse moléculaire 4 à 9 fois supérieure sur la base de sa contribution anomale (Girard et al., Acta D, 2003, D59, 1914- 1922 ; Talion et al., JSR 2011, 18, 74-78).

La difficulté pour incorporer des lanthanides au sein des protéines provient de leur coordination particulière que les protéines ne peuvent pas 2 991 3 2 2 4 complètement satisfaire, à l'exception des protéines possédant un site de fixation naturel pour le calcium. Pour pallier ces problèmes, des trisdipicolinates de lanthanide non fonctionnalisés ont été décrits pour se fixer aux protéines, produisant ainsi des cristaux avec un fort signal anomal 5 dû à l'atome de lanthanide. Ces complexes de lanthanides sont donc un outil puissant pour insérer et fixer des diffuseurs anomaux dans les cristaux de protéines tout en étant d'utilisation facile. Le mode de fixation des trisdipicolinates de lanthanide est dû à l'établissement d'interactions électrostatiques entre les fonctions carboxylates des complexes chargés 10 négativement et des arginines ou des lysines chargées positivement l'intérieur et à la surface de la protéine. Néanmoins, les complexes de lanthanides utilisés en cristallographie et décrits dans la littérature présentent une faible affinité pour les biomolécules, principalement les protéines. Ceci amène à l'utilisation de hautes concentrations en complexes ce qui peut être 15 incompatible avec les méthodes de cristallogenèse actuelles. Il en résulte que plusieurs sites de fixation peuvent apparaître (pour le lysozyme de blanc d'oeuf de poule voir: Pompidor et al. Angew. Chem., Int Ed. 47, 3388) avec des taux d'occupation difficilement prévisibles et parfois même aléatoires. Dans la publication Angew. Chem., Int Ed. 2-- , il est montré 20 également qu'une forte teneur en complexe est de nature à modifier le groupe d'espace dans lequel la protéine cristallise naturellement. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs proposent d'utiliser des complexes particuliers de lanthanide dans lesquels le ligand présent va permettre d'obtenir la coordination à l'atome de lanthanide et d'assurer 25 l'interaction avec la protéine ou avec d'autres entités protéiques du type capside de virus. Un des objectifs est de proposer des complexes qui présentent une meilleure affinité pour certains sites protéiques. Dans ce contexte, la présente invention concerne l'utilisation en cristallographie, pour la résolution par diffraction des rayons X de la structure 30 tridimensionnelle d'une entité protéique telle que les protéines et les capsides de virus, d'un complexe de lanthanide (III) de formule (I): dans laquelle R représente un groupe -COO- ou un groupe -A-X avec A qui représente une chaîne -(CH2)n- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH, -COO- ou -NH3+ ; ou bien R représente un groupe [(CH2)mNRIR2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4 et R1 et R2 identiques ou différents qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et Ln représente un lanthanide.

De manière préférée, on utilisera un composé de formule (I) dans lequel R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 ou bien R représente un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4, tel que -[CH2N(CH3)2CH2CH2OH]+.

L'invention consiste à utiliser un complexe de formule (I) présentant une très bonne affinité pour des sites particuliers de protéines notamment, en établissant de nouvelles interactions hydrophobes de type CH-Tc ou empilement n (également nommé n-stacking) via l'hétérocycle 1,2,3-triazole présent sur les ligands coordinés à l'ion lanthanide, et également grâce aux interactions possibles entre l'entité protéique cible et les groupements R portés par l'hétérocycle 1,2,3-triazole qui comporte un groupement établissant des liaisons hydrogène, tels que les groupes hydroxyles. 2 9913 2 2 6 L'invention apporte donc un outil supplémentaire pour associer un atome de lanthanide à une macromolécule biologique et obtenir des phases expérimentales lors d'une étude de diffraction des rayons X. Par entité protéique, on entend un enchainement d'acides aminés 5 naturels ou modifiés d'une taille suffisante pour former une structure tridimensionnelle définie. Il peut notamment s'agir d'une protéine naturelle ou modifiée ou encore d'une capside de virus. Le terme « entité protéique » désigne donc un enchaînement de plusieurs acides aminés, le plus souvent d'au moins 50 acides aminés, liés entre eux par des liaisons peptidiques. 10 Dans le cadre de l'invention, le terme général « acide aminé » désigne les acides aminés naturels et les acides aminés non naturels, que sont les acides aminés non conventionnels et les dérivés chimiques d'acides aminés. Les acides aminés présents au sein d'une entité protéique, peuvent être des acides aminés naturels : Leucine (Leu), Glycine (Gly), alanine (Ala), 15 Isoleucine (Ile), Valine (val), Sérine (Ser) Thréonine (Thr), Phénylalanine (Phe), Tryptophane (Trp), Tyrosine (Tyr), Proline (pro), Cystéine (Cys), Méthionine (Met), Asparagine (Asn), Glutamine (Gin), Arginine (Arg), Lysine (Lys), Histidine (His), Acide Aspartique (Asp), Acide glutamique (Glu) qui sont de conformation L, ou des dérivés phosphatés sur la chaîne latérale de 20 la serine, la thréonine, ou la tyrosine , ou bien des acides aminés non naturels, nommés acides aminés non conventionnels tels que notamment les acides aminés ci-dessous : Nle = L-norleucine ; Aabu = acide a-aminobutyrique ; Hphe = Lhomophénylalanine ; Nva = L-norvaline ; Gabu = acide g-aminobutyrique ; 25 Dala = D-alanine ; Dcys = D-cysteine; Dasp = acide D-aspartique; Dglu = acide D-glutamique ; Dphe = D-phénylalanine ; Dhis = D-histidine ; Dile = D-isoleucine ; Dlys = D-lysine ; Dieu = D-leucine ; Dmet = D-méthionine ; Dasn = D-asparagine ; Dpro = D-proline ; Dgln = D-glutamine ; Darg = Darginine ; Dser = D-serine ; Dthr = D-thréonine ; Dval = D-valine ; Dtrp = D- 30 tryptophan ; Dtyr = D-tyrosine ; Dom = D-ornithine ; Aib = acide aminoisobutyrique ; Etg = L-éthylglycine ; Tbug = L-t-butylglycine ; Pen = pénicillamine ; Anap = a-naphthylalanine ; Chexa = cyclohexylalanine ; Cpen = cyclopentylalanine ; Cpro = aminocyclopropane carboxylate ; Norb = aminonorbornylcarboxylate ; Mala = L-a-méthylalanine ; Mcys = L-améthylcysteine ; Masp = acide L-a-méthylaspartique ; Mglu = acide L-a- méthylglutamique ; Mphe = L-a-méthylphénylalanine ; Mhis = L-a- méthylhistidine ; Mile = L-a-méthylisoleucine ; Mlys = L-a-méthyllysine ; Mleu = L-a-méthylleucine ; Mmet = L-a-méthylméthionine ; Masn = L-améthylasparagine ; Mpro = L-a-méthylproline ; Mgln = L-a-méthylglutamine ; Marg = L-a-méthylarginine ; Mser = L-a-méthylsérine ; Mthr = L-a- méthylthréonine ; Mval = L-a-méthylvaline ; Mtrp = L-a-méthyltryptophan ; Mtyr = L-a-méthyltyrosine ; Morn = L-a-méthylornithine ; Mnle = L-améthylnorleucine ; Maabu = acide a-amino-a-méthylbutyrique ; Mnva = L-améthylnorvaline ; Mhphe = L-a-méthylhomophénylalanine ; Metg = L-améthyléthylglycine ; Mgabu = acide a-méthyl-g-aminobutyrique ; Maib = acide a-méthylaminoisobutyrique ; Mtbug = L-a-méthy14-butylglycine ; Mpen = a-méthylpenicillamine; Manap = a-méthyl-a-naphthylalanine ; Mchexa = améthylcyclohexylalanine ; Mcpen = a-méthylcyclopentylalanine ; Dmala = Da-méthylaianine ; Dmorn = D-a-méthylornithine ; Dmcys = D-améthylcystéine ; Dmasp = acide a-méthylaspartique ; Dmglu = acide D-a- méthylglutamique ; Dmphe = D-a-méthylphénylalanine ; Dmhis = D-a- méthylhistidine ; Dmile = D-a-méthylisoleucine ; Dmlys = D-a-méthyllysine ; Dmleu = D-a-méthylleucine ; Dmmet = D-a-méthylméthionine ; Dmasn = Da-méthylasparagine ; Dmpro = D-a-méthylproline; Dmgln = D-améthylglutamine ; Dmarg = D-a-méthylarginine; Dmser = D-a-méthylserine ; Dmthr = D-a-méthylthréonine ; Dmval = D-a-méthylvaline ; Dmtrp = D-a- méthyltryptophan ; Dmtyr = D-a-méthyltyrosine ; Nmala = L-Nméthylalanine ; Nmcys = L-N-méthylcystéine ;Nmasp = acide L-Nméthylaspartique ; Nmglu = acide L-N-méthylglutamique ; Nmphe = L-Nméthylphénylalanine ; Nmhis = L-N-méthylhistidine ; Nmile = L-N- méthylisoleucine ; Nmlys = L-N-méthyllysine ; Nmleu = L-N-méthylleucine ; Nmmet = L-N-méthylméthionine ; Nmasn = L-N-méthylasparagine; Nmchexa = N-méthylcyclohexylalanine ; Nmgln = L-N-méthylglutamine ; Nmarg = LN-méthylarginine ; Nmser = L-N-méthylsérine ; Nmthr = L-Nméthylth réonine ; N mva I = L-N-méthylvaline; Nmtrp = L-Nméthyltryptophan; Nmtyr = L-N-méthyltyrosine ; Nmorn = L-N- méthylornithine ; Nmnle = L-N-méthylnorleucine ; Nmaabu = acide N-aminoa-méthylbutyrique ; Nmnva = L-N-méthylnorvaline ; Nmhphe = L-Nméthylhomophénylalanine ; Nmetg = L-N-méthyléthylglycine ; Nmgabu = acide N-méthyl-g-aminobutyrique ; Nmcpen = N-méthylcyclopentylalanine ; Nmtbug = L-N-méthyl-t-butylglycine ; Nmpen = N-méthylpénicillamine ; Nmanap = N-méthyl-a-naphthylalanine ; Nmaib = acide Nméthylaminoisobutyrique ; Dnmala = D-N-méthylalanine; Dnmorn = D-Nméthylornithine ; Dnmcys = D-N-méthylcystéine ; Dnmasp = D-Nméthylaspartique acide ; Dnmglu = acide D-N-méthylglutamique ; Dnmphe = D-N-méthylphénylalanine ; Dnmhis = D-N-méthylhistidine ; Dnmile = D-N- méthylsérine ; Dnmthr = D-N-méthylthréonine ; Dnmval = D-N-méthylvaline; Dnmtrp = D-N-méthyltryptophan ; Dnmtyr = D-N-méthyltyrosine ; Nala = Nméthylglycine (sarcosine) ; Nasp = N-(carboxyméthyl)glycine ; Nglu = N-(2- carboxyéthyl)glycine ; Nphe = N-benzylglycine ; Nhhis = N(imidazolyléthyl)glycine ; Nile = N-(1-méthylpropyl)glycine ; Nlys = N-(4- aminobutyl)glycine ; Nleu = N-(2-méthylpropyl)glycine ; Nmet = N-(2- méthylthioéthyl)glycine ; Nhser = N-(hydroxyéthyl)glycine ; Nasn = N- (carbamylméthyl)glycine ; Ngln = N-(2 carbamyléthyl)glycine ; Nval = N-(1- méthyléthyl)glycine ; Narg = N-(3-guanidinopropyl)glycine ; Nhtrp = N-(3- indolyléthyl)glycine ; Nhtyr = N-(phydroxyphénéthyl)glycine ; Nthr = N-(1- hydroxyéthyl)glycine ; Ncys = N-(thiométhyl)glycine ; and Nom = N-(3- 30 aminopropyl)glycine ; Ncpro = N-cyclopropylglycine ; Ncbut = Ncyclobutyg lyci ne ; Nchex = N-cyclohexylglycine ; Nchep = N- méthylisoleucine ; Dnmlys = D-N-méthyllysine ; Dnmleu = D-N- méthylleucine ; Dnmmet = D-N-méthylméthionine ; Dnmasn = D-N- méthylasparagine ; Dnmpro = D-N-méthylproline ; Dnmgln = D-N- méthylglutamine ; Dnmarg = D-N-méthylarginine ; Dnmser = D-N- cycloheptylglycine ; Ncoct = N-cyclooctylglycine ; Ncdec = Ncyclodécylglycine ; Ncund = N-cycloundécylglycine ; Ncdod = Ncyclododécylglycine ; Nbhm = N-(2,2-diphényléthyl)glycine ; Nbhe = N-(3,3- diphénylpropyl)glycine ; Nnbhm = N-(N-(2,2- diphényléthyl)carbamylméthyl)glycine ; Nnbhe = N-(N-(3,3- diphénylpropyl)carbamylméthyl)glycine ; Nbmc = 1-carboxy-1-(2,2- diphényléthylamino)cyclopropane ; et Naeg = N-(2-aminoéthyl)glycine. Par dérivés chimiques d'acides aminés, on entend un acide aminé dont au moins l'une des fonctions est modifiée chimiquement. A titre d'exemple, on peut citer l'acylation ou l'acétylation de l'extrémité amino-terminale, ou l'amidation ou l'estérification de l'extrémité carboxy-terminale de l'entité protéique. Selon des modes de réalisation particuliers de l'invention, cette dernière sera appliquée à des protéines constituées exclusivement d'acides aminés naturels. Les entités protéiques comportent le plus souvent au moins un acide aminé chargé positivement, et notamment au moins une arginine ou une lysine. De tels acides aminés vont pouvoir interagir avec les charges négatives portées par le complexe de formule (I) (charge carboxylate).

Selon un premier mode de réalisation, l'entité protéique comporte au moins un acide aminé capable d'établir des intéractions du type CH-n ou empilement 71 avec l'un des hétérocycles 1,2,3-triazole du complexe (I). De tels acides aminés sont notamment choisis parmi le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine. Dans ce cas, on pourra utiliser tous les complexes de formule (I), et notamment ceux dans lesquels R représente un groupe -(CH2)n0H avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4, ou bien encore ceux dans lesquels R représente un groupe -[(CH2),,N(CH3)2(CH2)p0Hr avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4. Notamment, on pourra utiliser les complexes de formule (I) dans lesquels R représente un groupe -[CH2N(CH3)2CH2CH20H].

Selon un autre mode de réalisation, l'entité protéique ne comporte pas au moins un acide aminé capable d'établir des interactions de type CH-Tc ou empilement n avec l'un des hétérocycles 1,2,3-triazole du complexe (I). Dans ce cas, on utilisera, de préférence, un complexe de formule (I) dans lequel R représente un groupe -A-X avec A qui représente une chaine -(CH2)n- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH ou -COO-, et en particulier un complexe de formule (I) dans lequel R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4.

Dans les complexes de formule (I), le lanthanide Ln se trouve dans son état d'oxydation le plus stable Ln(III), correspondant à l'état ionique Ln3+ Son environnement de coordination correspond aux neuf atomes des ligands qui viennent se placer dans la première sphère de coordination du lanthanide. Les trois ligands viennent se positionner autour de l'ion lanthanide pour former une cage, ce qui confère une bonne stabilité aux complexes. Par exemple, dans les cas où R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4, les complexes de formule (I) sont chargés trois fois négativement et présentent une charge globale 3-. Dans les cas où R représente un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4, les complexes de formule (I) se trouvent, par contre, sous une forme zwitérionique et sont globalement neutres. Le choix du complexe, et en particulier du groupement R sera fonction de l'entité d'intérêt dont on cherche à déterminer la structure tridimensionnelle. On pourra notamment utiliser tout complexe (I), où R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 ou un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4, pour la résolution structurale d'entité porteuse d'acides aminés accessibles capables d'établir des interactions n-stacking, également nommées empilement n avec l'un des hétérocycles 1,2,3-triazole du complexe (I), tel que des acides aminés comprenant un groupement aromatique que sont le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine, par exemple. En général, les entités protéiques possèdent des charges positives de surface. Aussi, dans le cas d'entité protéique ne possédant pas de tels acides 5 aminés capables d'établir des interactions 7t-stacking avec l'un des hétérocycles 1,2,3-triazole du complexe (I) tel que le tryptophane, les complexes (I) chargés négativement dans lesquels R représente un groupe -(CH2)n0H avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4, seront préférés, afin de cibler spécifiquement les surfaces chargées positivement, présentes notamment 10 au niveau des acides aminés correspondant à une arginine ou une lysine, ou encore à une histidine, si le pH de la solution utilisée lors de la cristallisation est inférieure à son pKa. La longueur du groupement R pourra également être ajustée, en fonction de l'entité d'intérêt, pour que l'ion lanthanide soit placé au sein du 15 cristal de manière à permettre le phasage. De préférence, Ln représente Sm, Eu, Gd, Lu, Tb, Ho, Er, Tm ou Yb. Les complexes de formule (I) présentent une bonne stabilité, sont compatibles avec la plupart des conditions physicochimiques de cristallisation classiquement utilisées lors de la cristallisation de protéines ou de capside de 20 virus, que sont notamment le pH, l'agent précipitant et/ou le tampon utilisé(s). On évitera néanmoins d'utiliser des tampons phosphates qui entraineraient une précipitation des complexes, ainsi que des solutions de cristallisation qui utiliseraient des ions divalents du type Zn2+, Cd2+ notamment, qui pourraient s'échanger avec l'ion lanthanide. 25 En particulier, la stabilité des complexes de formule (I) sur une gamme pH de l'ordre de 3,5 à 9 est compatible avec les conditions de cristallisation rencontrées pour les protéines, notamment. Ils sont donc très simples utiliser et il est aisé de les introduire dans des cristaux de protéine notamment soit par co-cristallisation, soit par trempage. 30 Le complexe de formule (I) est inséré dans les cristaux de l'entité protéique d'intérêt.

Dans le cadre de l'invention, l'entité dont la structure est à déterminer peut notamment cristalliser en présence d'un complexe de formule (I) qui vient se fixer sur ladite entité et se trouve donc inséré dans le cristal formé. Une co-cristallisation est, de préférence, réalisée avec un rapport molaire complexe de formule (I)/entité de 2,3 à 18. Les conditions d'obtention des cristaux intégrant un complexe de formule (I) correspondent, le plus souvent, aux conditions avec lesquelles les cristaux natifs de l'entité d'intérêt sont usuellement obtenus, avec un ajout de la quantité sélectionnée de complexe dans la goutte de cristallisation. De manière connue, un agent précipitant et un pH adapté seront utilisés. L'agent précipitant sera fonction de l'entité d'intérêt. Le trempage sera privilégié lorsque l'on disposera de cristaux natifs de l'entité d'intérêt, mais que d'une petite quantité de l'entité d'intérêt. Dans ce cas, les cristaux natifs seront mis en présence d'une solution du complexe, contenant également, de préférence l'entité en solution. En fonction de la quantité d'entité d'intérêt disponible, on ajustera le temps de trempage et la quantité d'agent précipitant pour éviter une dissolution des cristaux natifs. Le trempage pourra durer de 1 minute à 10 heures, par exemple. De préférence, un trempage, avec un rapport molaire complexe de formule (I) dans la solution de trempage/entité protéique dans le cristal natif de 2 à 3, sera utilisé. La résolution structurale est, en particulier, réalisée selon une technique de phasage de novo, et notamment selon une technique SIR, MIR, SAD, MAD, SIRAS ou MIRAS. Les techniques de phasage utilisant la diffusion 25 anomale sont particulièrement préférées. La diffraction des rayons X pourra être réalisée à une longueur d'onde correspondant au seuil d'absorption L111 du lanthanide présent dans le complexe (I) afin d'exploiter le phénomène de diffusion anomale de manière optimale, ou bien à une longueur d'onde ne correspondant pas au seuil 30 d'absorption Lm du lanthanide, afin d'obtenir des données à haute résolution qui permettent de décrire finement l'interaction.

La diffraction des rayons X réalisée sur le cristal de l'entité d'intérêt incorporant une certaine quantité de complexe de formule (I) pourra donc aussi bien être menée dans un synchrotron au seuil LIII du Ln considéré afin d'exploiter en particulier la contribution anomale de manière optimale, qu'avec un générateur de laboratoire, type anode tournante, au rayonnement du Cuivre ( CuKa ). La présente invention a également pour objet les complexes de lanthanide (III) de formule (I) : (I) dans laquelle R représente un groupe -COO- ou un groupe -A-X avec A qui représente une chaîne -(CH2)n- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH, -COO- ou -NH3+, étant entendu que lorsque X = -OH, A ne peut pas être égal à -CH2- ; ou bien R représente un groupe -[(CH2)mNR1R2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4 et R1 et R2 identiques ou différents qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et Ln représente un lanthanide et est, de préférence, choisi parmi Pr, Nd, Eu, Gd, Tb, Ho, Er, Tm ou Yb. De préférence, dans les composés de formule (I), 20 R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 2, 3 ou 4 ou bien R représente un groupe un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CN2)p0N]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à , 2, 3 ou 4, tel que -[CH2N(CH3)2CH2CH2OH]+. Font également partie intégrante de l'invention, les composés de formule (II) : dans laquelle R représente un groupe -COOH ou un groupe -A-X avec A qui représente une chaine -(CH2)n- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH, -COOH ou -NH2r étant entendu que lorsque X = -OH, A ne peut pas être égal à -CH2- ; ou bien R représente un groupe -[(CH2)B,NR1R2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4 et R1 et R2 identiques ou différents qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, ainsi que leurs sels. Les composés de formule (II) sont des intermédiaires pour la préparation des composés de formule (I). De préférence, dans les composés de formule (II), R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 2, 3 ou 4 ou bien R représente un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4, tel que -[CH2N(CH3)2CH2CH2OH]+. En particulier, lorsque R représente un groupe -(CH2)nOH, le composé (II) peut se trouver sous la forme d'un sel avec un acide, par exemple sous une forme chlorhydrate, la nature du sel étant fonction des réactifs utilisés lors de sa synthèse. Le complexe (I) et le composé (II) dans lesquels R=-CH2OH sont décrits dans Dalton 2010, 39, 7091. Dans cette publication, le complexe de lanthanide est uniquement décrit en relation avec son activité luminescente. Dans le cadre de l'invention, cette propriété est très secondaire et nullement essentielle. Elle est seulement exploitée, afin de vérifier que le complexe est 2 9 9 1 3 2 2 15 bien incorporé dans le cristal qui va être étudié par diffraction des rayons X. En effet, la détection de la fixation est facilitée grâce aux propriétés de luminescence intrinsèques des complexes sous irradiation ultra-violette. Dans le cadre de l'invention, l'important est que des interactions 5 puissent s'établir entre le complexe de lanthanide de formule (I) et des sites bien définis, notamment de protéines. Il est possible, grâce au groupement 1,2,3-triazole et/ou à la présence du groupement R spécifique porté par les ligands de fixer les complexes intimement sur une partie spécifique d'une entité protéique d'intérêt telle qu'une protéine ou une capside de virus, dans 10 une cavité particulière du réseau cristallographique, ce qui permet de faciliter, par la même, la détermination de la structure de ladite entité, par diffraction des rayons X. Les complexes (I) possèdent une forte affinité pour des sites protéiques, qui dépendra du substituant R positionné sur l'hétérocycle 15 triazole. Ils apportent un gain supérieur à un ordre de grandeur en terme d'affinité, observé par rapport aux données de la littérature sur les complexes trisdipicoliniques notés [Ln(Dpa)3]3-. Par exemple, pour le lysozyme de blanc d'oeuf de poule, la littérature fait état d'un Kd = 420 1.C11 pour de [Ln(Dpa)3]3-, alors que le complexe (I) avec R=-(CH2)n0H, n = 1 et 20 Ln = Eu ou Tb présente un Kci de 30 p.M. Ceci offre potentiellement une plus large gamme d'interactions spécifiques avec des sites bien définis dans la protéine et permet de travailler à de basses concentrations en complexe. Ces fortes affinités et l'utilisation de faibles concentrations amènent à de forts taux d'occupation des sites de fixation et donc à une résolution simplifiée des 25 structures par les méthodes de phasage de nova Cette augmentation d'affinité résulte de l'établissement d'interactions supplémentaires et nouvelles entre le complexe et l'entité d'intérêt, notamment des interactions de type CH-Tc et empilement TC (7r-stacking) entre la partie triazole du complexe et les bicycles indoliques des résidus tryptophanes de la protéine (tout en conservant les interactions de type liaison hydrogène avec les arginines). De plus, la faible concentration en complexe n'amène pas la protéine à cristalliser dans un groupe d'espace différent de celui qu'elle adopte naturellement. Les exemples présentés ci-dessous qui n'ont aucun caractère limitatif, permettent en référence aux Figures annexées, de mieux comprendre l'invention et donnent une illustration des synthèses qui pourront être mises en oeuvre. L'homme du métier sera à même d'y apporter les modifications adéquates, en fonction des complexes et applications qu'il souhaite réaliser. Les 7: Jr__ 1 et 2 présentent des exemples de structure protéique résolue avec deux complexes différents de formule (I). _[II mples Dans les analyses RMN, s = singulet, se = singulet élargi, t = triplet et m = multiplet. Procédures générales pour la préparation des composés II Les composés (II) sont synthétisés en deux étapes à partir du 4- azidopyridine-2,6-dicarboxylate de diméthyle (Dalton Transactions 2010, 39, 7091 ): formation de l'hétérocycle triazole par réaction de CuAAC, puis réaction de saponification des fonctions esters. Procédure générale pour la formation des 4-triazolylpyridine-2,6- 20 dicarboxylate de diméthyle par réaction de CuAAC : A une suspension de 4-azidopyridine-2,6-dicarboxylate de diméthyle (1,0 mmol) dans le Me0H (10 mL) est ajouté 1,3 à 2,0 équivalents d'alcyne vrai. Le tout est placé sous agitation avant addition de 1 à 5 mol % de catalyseur [(SIMes)(4.7dichloro 1,10-phenanthroline)CuCl]. En général, la 25 réaction est laissée sous agitation pendant 3 heures et les produits formés précipitent dans le milieu. Une filtration permet d'isoler directement le produit. Afin d'éliminer toute trace de solvant, ce dernier est séché sous vide de la pompe à palettes (rendement : 85%-95%).

Procédure générale pour les réactions de saponification des esters précédents : A une suspension de diester (1,0 mmol, préparé selon la procédure générale pour les réactions de CuAAC) dans de l'eau (5 mL) sont ajoutés 6 5 mL d'une solution aqueuse de NaOH 1M. Le mélange est chauffé à 80°C jusqu'à dissolution complète du solide, puis 2 heures supplémentaires. Le milieu réactionnel est alors refroidi à température ambiante. Une solution d'acide chlorhydrique 3,5 M est alors ajoutée jusqu'à pH = 2 et le diacide souhaité précipite sous sa forme de chlorhydrate. Une filtration permet de 10 l'obtenir sous forme de solide blanc avec généralement un rendement quantitatif (>98 %). Comr~:.é (II.1), HCI dans lenuc: [=-(CH2)'C:1 ; s_c n=1. Il est obtenu en deux étapes au départ du 4-azidopyridine-2,615 dicarboxylate de diméthyle selon les modes opératoires décrits dans Dalton Transactions 2010, 39, 7091. Composé (II.2), I,CI dans IegL 1 .=-(CH2)' OH avec n=2 Il est obtenu par saponification du diester correspondant (décrit dans Eur. J. Org. Chem., 2010, 3507). 1H RMN (400 MHz, D20+Na0D) b 9.18 (s, 20 1H), 8.75 (s, 2H), 3.59 (t, J=7Hz, 2H), 2.73 (t, J=7Hz, 2H). Co--dosé HCI _'-ns [-quel R=-(CH2)nC; vr c n=3 1H RMN (400 MHz, D2O+NaOD) b 9.12 (s, 1H), 8.72 (s, 2H), 3.49 (t, J=7Hz, 2H), 2.43 (t, J=7Hz, 2H), 1.79 (m, 2H). Comrasé (II..), l.ÿ1 dans I_.u_. (CH2)nC.1 n= 4 25 1H RMN (400 MHz, D2O+NaOD) b 9.08 (s, 1H), 8.74 (s, 2H), 3.50 (t, J=7Hz, 2H), 2.42 (t, J=7Hz, 2H), 1.60 (m, 4H). (II.5) d..ns lequel L = -[CH2N(CH3)2CHk-H2OH]+ 1H RMN (400 MHz, D20) b 9.12 (s, 1H), 8.55 (s, 2H), 4.90 (s, 2H), 4.18 (se, 2H), 3.61 (se, 2H), 3.25 (s, 6H). 30 Synthèse des complexes (II.1 à a Méthode I. A une suspension de 0,2 mmol (3,0 équivalents) de diacide (II.1 à I) dans 10,0 mL d'eau sont ajoutées 0,27 mmol (4,5 équivalents) de Na2CO3. On ajoute alors 1,0 équivalent de sel de lanthanide (III) (sous forme 5 de trichlorure hexa hydraté). Le mélange réactionnel est agité au moins une heure, puis concentré sous pression réduite et à une température inférieure à 40°C au tiers de son volume initial. L'addition d'éthanol (environ 15 20mL) complète la précipitation du complexe attendu qui est filtré, lavé l'éthanol, puis séché sous pression réduite (Rendements 75-87%). 10 Méthode IL Pour des raisons de commodités, les complexes peuvent également être préparés directement dans une solution aqueuse selon la méthode I pour être utilisés comme solution stock en cristallographie. Complexe (i.1) dans IequE r.=-(CH2)n0H avec n=1 t Ln=Eu décrit dans Dalton Transactions 2010, 39, 7091. 15 Complexe (I.2) 'Jans leqr: R=-(CH2)n0H avec n=2 Ln= Eu: 1h1 NMR(500 MHz, D20) 5 (ppm) :7.4 (1H, se), 4.9 (2H, se), 3.6 (2H, se), 2.5 (2H, se). Ccmplexe (1.3) Ons lequel R=-(CIJ2)nCH avec n=3 Ln= Eu: 1h1 NMR(500 MHz, D20) 8 (ppm) :7.4 (1H, se), 4.9 (2H, se), 20 3.5 (2H, se), 2.4 (2H, se), 1.9 (2H, se). Complexe (1.4) dans lequel R=-(C.J2)n0H avec n=4 Ln= Eu: 1h1 NMR(500 MHz, D20) 8 (ppm) :7.4 (1H, se), 4.9 (2H, se), 3.5 (2H, se), 2.4 (2H, se), 1.7 (4H, se). Complexe (1.5) (11-is F-uel R= -[CH2N(CH3)2CH2CH20H] 25 Ln= Eu: NMR(500 MHz, D20) 8 (ppm) :7.4 (1H, se), 4.9 (2H, se), 4.0 (2H, se), 3.9 (2H, se), 3.4 (2H, se), 3.3 (6H, se). De la même manière, des complexes avec le Terbium à la place de l'Europium ont également été préparés. 30 2 991 3 2 2 19 Technique de co-cristallisation utilisée Conditions de co-cristallisation par la méthode de la goutte pendante, méthode qui consiste à mettre en équilibre, dans un espace hermétique, une goutte de faible volume au-dessus d'une solution de volume important (réservoir) contenant un agent précipitant (le rapport de volume entre la goutte et le réservoir est de l'ordre de 1000). La goutte est formée par le mélange d'une solution contenant la protéine purifiée, de la solution réservoir et de la solution de complexe. Cette dilution conduit à une diminution de la concentration en agent précipitant dans la goutte. Un phénomène de diffusion en phase vapeur des agents volatiles se produit entre la goutte et le réservoir et conduit à la diminution du volume de la goutte et à l'augmentation de la concentration des composants de la goutte, jusqu'à retour à l'équilibre avec le réservoir. Si des conditions adéquates sont atteintes, les cristaux de protéine apparaissent.

Lysozyme de blanc d'oeuf de poule: Trois solutions sont préparées : [P] : Solution de protéine dans l'eau à 20 mg.m1:1 (1,4 mM) ou à 30 mg.m1:1 (2,1 mM) [C] : Solution de complexe dans l'eau entre 30 et 75 mM [R] : Solution de cristallisation du réservoir : 0,1 M d'acétate de sodium pH 4,6 et comprenant entre 0,9 et 1,5 M de NaCI. On forme une goutte par ajout de 1,5 pl_ solution [P] + 1,5 pl_ solution [C] + 1,5 pL solution [R].

On place la goutte ainsi formée sur un puits contenant 1000 pL de solution réservoir [R]. La cristallisation a lieu entre 5 jours ([NaCI] = 1,5 M) et 15 jours ([NaCI] = 0,9 M) en maintenant la température à 293K (20°C). L'inclusion du complexe de lanthanide dans le cristal formé est révélée par irradiation ultra-30 violette.

Thaumatine de Thaumatococcus danielli : Trois solutions sont préparées : [. ] : [Protéine] = protéine dans l'eau à une concentration de 40 mg/mL (1,8 mM) [C] : [Complexe] = complexe dans l'eau 30 mM [R] : solution Réservoir : Tampon bis-tris propane 0,1 M pH 6,5 et entre 0,3 et 0,9 M en tartrate double de potassium et de sodium. On forme une goutte par ajout de 1,5 pL solution [P] + 1,5 il solution [C] + 1,5 pl_ solution [R].

On place la goutte ainsi formée sur un puits contenant 1000 pL de solution réservoir. La cristallisation a lieu entre 5 jours ([tartrate] = 0,9 M) et 10 jours ([tartrate] = 0,3 M) en maintenant la température à 293K (20°C). L'inclusion du complexe de lanthanide dans le cristal formé est révélée par irradiation ultra-violette. Technique de trempage utilisée Etape 1: préparation d'un cristal natif selon la littérature (ex lysozyme : Ducruix A. and Giegé R., Eds. (1999). Crystallization of Nucleic Acids and Proteins: A Practical Approach (second edition); thaumatine : Charron, C., Giegé, R., and Lorber, B. (2004) Structure of thaumatin in a hexagonal space group : comparison of packing contacts in four crystal lattices. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 60 : 8389).

Etape 2: Un cristal natif ainsi obtenu est trempé dans une goutte de solution dont la composition correspond à celle du réservoir (R) du puits, où le cristal a été obtenu, à laquelle un des complexes (I) a été ajouté afin d'assurer un rapport [complexe dans la solution de trempage] / [protéine dans le cristal] au minimum de 2 à 3.

Etape 3 : les cristaux sont retirés de la solution de trempage après un temps de quelques minutes et avant toute apparition visible de dégradation 2 991 3 2 2 21 du cristal. Les cristaux sont ensuite lavés dans une solution de réservoir (R) ne contenant pas de complexe (I) afin d'éliminer ceux non fixés (Back soaking technique, Garman E, Murray 3W (2003) Heavy-atom derivatization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59:1903-1913).

5 Méthodes utilisées pour résoudre la structure protéique L'enregistrement des données de diffraction est effectué sur les lignes de lumière FIP-BM30A et PROXIMA1 des centres de rayonnement synchrotron ESRF et SOLEIL, respectivement. Ces deux lignes de lumière 10 sont dîtes accordables dans le sens ou l'énergie du rayonnement X peut être modifié. Les données de diffraction sont mesurées : - soit en dehors du seuil d'absorption Lm du lanthanide (longueur d'onde du rayonnement X à 0,98 A), afin d'obtenir des données à haute 15 résolution qui permettent de décrire finement l'interaction mais sans exploiter au maximum le phénomène de diffusion anomale ; - soit au seuil d'absorption L111 du lanthanide afin d'exploiter le phénomène de diffusion anomale de manière optimale. Pour cela, un spectre de fluorescence X est mesuré sur une solution concentrée en complexe ou 20 directement sur le cristal afin de déterminer avec précision l'énergie du rayonnement incident qui permettra d'exploiter le signal anomal au maximum. Les conditions expérimentales usuelles (choix des énergies, complétude et redondance des mesures ...) ont été appliquées afin d'utiliser les méthodes de détermination de phase SAD et MAD.

25 Les données de diffraction sont enregistrées selon la méthode classique dite méthode de la rotation en utilisant des détecteurs de type CCD. Les données sont enregistrées sur des cristaux congelés et maintenus à une température de 100K. Les intensités mesurées sont mises à l'échelle selon des méthodes classiques et en utilisant des programmes classiquement 30 utilisés en cristallographie des protéines (XDS, suite de programmes CCP4). La position des atomes de lanthanide est déterminée à l'aide des programmes SHELXD ou PHENIX.HYSS (suite de programme PHENIX) et la détermination des phases expérimentales par les méthodes SAD ou MAD est effectuée à l'aide du programme SHARP, puis ces phases sont améliorées par les méthodes usuelles (aplatissement de solvant, correspondance d'histogramme...) avec les programmes DM ou SOLOMON. Les phases expérimentales ainsi obtenues permettent de construire un premier modèle de la protéine et du complexe. Ce modèle est ensuite amélioré et affiné (programmes PHENIX.REFINE et COOT) pour conduire à la structure définitive permettant l'analyse du mode d'interaction du complexe sur la protéine. Un exemple de structure résolue de la protéine lysozyme de blanc d'oeuf de poule comportant le complexe (1.1) dans lequel Ln = Eu(III) et R=-(CH2)n0H avec n=1 est présentés en Figure 1. On remarquera, Figure 1, les interactions du complexe avec deux tryptophanes (interactions CH-TE et empilement it) ainsi que les interactions supplémentaires avec des résidus chargés positivement (Arginine et lysine) avec les carboxylates du ligand. Un deuxième exemple de structure résolue de la protéine lysozyme de blanc d'oeuf de poule comportant le complexe (1.5) dans lequel Ln = Eu, 20 R=-[(CH2)mN(Me)2(CH2)p0Hr avec m=1 et p=2 est présenté en . ._rJ 2. La modulation de la charge portée par les complexes grâce à l'introduction d'une fonction ammonium amène une propriété supplémentaire. Lors des différents essais réalisés, il a été mis en évidence que les complexes dans lesquels R.(CH2)n0H qui sont donc chargés négativement se fixent sur les 25 sites chargés positivement des protéines lysozyme et thaumatine, le complexe (1.5) dans lequel R= -[CH2N(CH3)2CH2CH20H] n'est fixé que sur la protéine lysozyme qui possède des résidus tryptophane établissant des interactions hydrophobes de type it-stacking, comme illustré Figure 2. On remarquera, Figure 2, les interactions du complexe avec deux 30 tryptophanes (empilement it), ainsi que les interactions supplémentaires avec des résidus chargés positivement (Arginine et lysine) avec les carboxylates du ligand, et également une interaction supplémentaire de type liaison H avec le groupement hydroxyle de R avec un glutamate. Dans le cas de la protéine thaumatine, l'absence de tryptophane amène à une absence de fixation du complexe (I.5) dans lequel n=1 et m=2 alors que les autres complexes (I.1) à (I.4), que Ln soit Eu ou Tb, s'y fixent. Il y a donc ici un phénomène de discrimination entre complexes chargés et complexes neutres.

Claims (22)

1. REVENDICATIONS1. Utilisation en cristallographie, pour la résolution par diffraction des rayons X de la structure tridimensionnelle d'une entité protéique, d'un compiexe de lanthanide (III) de formule (I) : (I) dans laquelle R représente un groupe -000- ou un groupe -A-X avec A qui représente une chaine -(CH2)n- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH, -COO- ou -NH3; ou bien R représente un groupe -[(CH2)n,NRIR2(CH2)p0Hr avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4 et R1 et R2 identiques ou différents qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et Ln représente un atome de lanthanide.
2. 2. Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que Ln représente Sm, Eu, Gd, Lu, Tb, Ho, Er, Tm ou Yb.
3. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'entité protéique est choisie parmi les protéines ou les capsides de virus.
4. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que l'entité protéique comporte au moins un acide aminé chargé 20 positivement.
5. 5. Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que l'entité protéique comporte au moins une arginine ou une lysine.
6. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'entité protéique comporte au moins un acide aminé capable d'établir des interactions CH-TE ou empilement n avec l'un des hétérocycles 1,2,3triazole du complexe (I).
7. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'entité protéique comporte au moins un acide aminé choisi parmi le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine.
8. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4 10 ou bien R représente un groupe -[(CH2)R,N(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4.
9. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que R représente un groupe -[CH2N(CH3)2CH2CH2OH]+.
10. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en 15 ce que l'entité protéique ne comporte pas au moins un acide aminé capable d'établir des interactions n-stacking avec l'un des hétérocycles 1,2,3-triazole du complexe (I) et en ce que l'on utilise un complexe de formule (I) dans lequel R représente un groupe -A-X avec A qui représente une chaine -(CH2)'- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH ou -COO-.
11. 11 - Utilisation selon la revendications 10 caractérisée en ce que R représente un groupe -(CH2)n0H avec n qui est égal à 1, 2, 3 ou 4.
12. 12 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisée en ce que la résolution structurale est réalisée selon une technique de phasage 25 de novo.
13. 13 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisée en ce que la résolution structurale est réalisée selon une technique SIR, MIR, SAD, MAD, SIRAS ou MIRAS.
14. 14 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisée en 30 ce que la résolution structurale est réalisée selon une technique de phasage utilisant la diffusion anomale.
15. 15 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisée en ce que l'entité dont la structure est à déterminer est co-cristallisée en présence d'un complexe de formule (I) ou cristallisée seule puis mise en présence du complexe par trempage, le complexe de formule (I) venant se fixer sur ladite entité et se trouvant donc inséré dans le cristal.
16. 16 - Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'une co-cristallisation, avec un rapport molaire complexe de formule (I)/entité de 2,3 à 18, est utilisée.
17. 17 - Utilisation selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'un trempage, avec un rapport molaire complexe de formule (I) dans la solution de trempage/entité protéique dans le cristal natif de 2 à 3, est utilisé.
18. 18 - Complexes de lanthanide (III) de formule (I) : dans laquelle R représente un groupe -000" ou un groupe -A-X avec A qui représente une chaine -(CH2)n- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH, -COO- ou -NH3+, étant entendu que lorsque X = -OH, A ne peut pas être égal à -CH2- ; ou bien R représente un groupe -[(CH2)n,NR1R2(CH2)p0Hr avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4 et R1 et R2 identiques ou différents qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et Ln représente un lanthanide.
19. 19 - Complexes selon la revendication 18 caractérisés en ce que R représente un groupe -(CH2)' OH avec n qui est égal à 2, 3 ou 4, ou bien R représente un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4.
20. 20 - Complexes selon la revendication 18 ou 19 caractérisés en ce que Ln représente Sm, Eu, Gd, Lu, Tb, Ho, Er, Tm ou Yb.
21. 21 - Composés de formule (II) : dans laquelle R représente un groupe -000H ou un groupe -A-X avec A qui représente une chaine -(CH2)'- éventuellement substituée par un ou deux groupes méthyle, dans laquelle n est égal à 1, 2, 3 ou 4 et X qui représente -OH, -COOH ou -NH2, étant entendu que lorsque X = -OH, A ne peut pas être égal à -CH2- ; ou bien R représente un groupe -[(CH2)mNRIR2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4 et R1 et R2 identiques ou différents qui représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, ainsi que leurs sels.
22. 22 - Composés de formule (II) selon la revendication 21 caractérisés en ce que R représente un groupe -(CH2)nOH avec n qui est égal à 2, 3 ou 4 ou bien R représente un groupe -[(CH2)mN(CH3)2(CH2)pOH]+ avec m et p, identiques ou différents, qui sont égaux à 1, 2, 3 ou 4, ainsi que leurs sels.