ES2134388T5 - Combinaciones de antigenos del virus de la hepatitis c (hcv) para su uso en inmunoensayos para anticuerpos anti-hcv. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN COMBINACIONES DE ANTIGENOS HCV QUE TIENEN UNA GAMA MAS AMPLIA DE REACTIVIDAD INMUNOLOGICA QUE CUALQUIER ANTIGENO HCV SIMPLE. LAS COMBINACIONES CONSTAN DE UN ANTIGENO DEL DOMINANTE C DE LA POLIPROTEINA DEL HCV, Y UN ANTIGENO ADICIONAL DEL HCV DEL DOMINANTE S, OPCIONALMENTE CON UN ANTIGENO ADICIONAL PARA CUALQUIERA DE LOS DOMINANTES NS3, NS4 O NS5, Y TIENEN LA FORMA DE UNA PROTEINA DE FUSION, UNA MEZCLA FISICA SIMPLE, O DE LOS ANTIGENOS INDIVIDUALES COMUNMENTE UNIDOS A UNA MATRIZ SOLIDA.
Description
Combinaciones de antígenos del virus de la
hepatitis C (HCV) para su uso en inmunoensayos para anticuerpos
anti-HCV.
La presente invención se refiere al campo de los
inmunoensayos para el HCV (anteriormente denominado virus de la
hepatitis no A, no B). Más particularmente, se refiere a
combinaciones de antígenos de HCV que permiten una amplia variedad
de inmunoensayos para anticuerpos anti-HCV.
La enfermedad anteriormente conocida como
hepatitis no A, no B (NANBH) se consideró que era una enfermedad o
familia de enfermedades transmisible que se pensaba que eran
inducidas por virus, y que podían ser distinguidas de otras formas
de enfermedades hepáticas asociadas con virus, incluyendo las
causadas por los virus de hepatitis conocidos, es decir, el virus
de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), y el
virus de la hepatitis delta (HDV), así como también la hepatitis
inducida por citomegalovirus (CMV) o el virus de
Epstein-Barr (EBV). El NANBH fue identificado
primeramente en individuos sometidos a transfusiones. La transmisión
desde el hombre al chimpancé y el paso seriado en chimpancés
proporcionó evidencia de que el NANBH era debido a un agente o
agentes infecciosos transmisibles. La evidencia epidemiológica ha
sugerido que pueden existir tres tipos de NANBH: un tipo epidémico
transportado por el agua; un tipo transportado por la sangre o
transmitido por vía parenteral; y un tipo que ocurre
esporádicamente (adquirido comunitariamente). Sin embargo, hasta
épocas recientes, no había sido identificado ningún agente
transmisible responsable del NANBH, y el diagnóstico clínico y la
identificación del NANBH habían sido efectuados por exclusión de
otros marcadores virales. Entre los métodos utilizados para
detectar antígenos y anticuerpos putativos del NANBH estaban la
difusión en gel de agar, la contrainmunoelectroforesis, la
microscopía de inmunofluorescencia, la microscopía
inmunoelectrónica, el radioinmunoensayo y el ensayo
inmunoenzimático. No obstante, ninguno de estos ensayos había
demostrado ser suficientemente sensible, específico y reproducible
para ser utilizado como ensayo de diagnóstico del NANBH.
En 1987, los científicos de la Chiron
Corporation (el propietario de la presente solicitud de patente)
identificaron el primer ácido nucleico definitivamente unido al
NANBH transportado por la sangre. Véase, por ejemplo, EPO Pub. No.
318.216; Houghton et al., Science 244:359 (1989).
Estas publicaciones describen la clonación de un aislado procedente
de una nueva clase viral denominada virus de la hepatitis C (HCV),
denominándose "HCV1" al virus prototípico descrito. El HCV es
un virus semejante a los Flavivirus, con un genoma de RNA. El
documento EP-A-318.216 describe
también la inmunogenicidad del polipéptido C100 expresado desde el
cDNA del HCV y el uso de antígenos de HCV en inmunoensayos de
diagnóstico.
La patente de EE.UU. No. 5.350.671 (Houghton
et al.), describe la preparación de varios polipéptidos de
HCV recombinantes por expresión del cDNA de HCV y la selección de
esos polipéptidos por su reactividad inmunológica con sueros
procedentes de pacientes con HCV. Tal selección limitada puso de
manifiesto que al menos cinco de los polipéptidos ensayados eran
muy inmunógenos; específicamente, los identificados como
5-1-1, C100, C33c, CA279c y CA290a.
De estos cinco polipéptidos, el
5-1-1 está localizado en el dominio
putativo NS4; el C100 abarca los dominios putativos NS3 y NS4; el
C33c está localizado dentro del dominio putativo NS3 y el CA279a y
el CA290a están localizados dentro del dominio putativo C. La
selección mostró también que ninguno de los polipéptidos aislados
ensayado era inmunológicamente reactivo con todos los sueros. Por
tanto, son deseables ensayos mejorados que reaccionen con todas o
más muestras procedentes de individuos HCV positivos. El documento
WO 91/15574, publicado el 17 de Octubre de 1991, describe proteínas
y glicoproteínas de HCV purificadas, útiles en un sistema de
diagnóstico para la detección de antisueros de HCV humanos.
Los Solicitantes han llevado a cabo estudios
serológicos adicionales sobre antígenos de HCV que confirman que
ninguno de los polipéptidos de HCV identificados hasta la fecha, es
inmunológicamente reactivo por sí solo con todos los sueros. Esta
carencia de un polipéptido único que sea universalmente reactivo con
todos los sueros procedentes de individuos con HCV puede ser
debida, entre otras causas, a variaciones de cepa a cepa en los
epítopos del HCV, a variabilidad en la respuesta humoral de
individuo a individuo y/o a variación de la serología con el estado
de la enfermedad.
Estos estudios adicionales han permitido también
a los Solicitantes identificar combinaciones de antígenos de HCV
que proporcionan un detección más eficaz de anticuerpos de HCV que
cualquier polipéptido del HCV por sí solo.
Por consiguiente, un aspecto de esta invención
es una combinación de antígenos de virus de la hepatitis C (HCV) en
uno o más polipéptidos obtenidos mediante síntesis química o
expresión recombinante, que comprende:
- (a)
- un primer antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio C de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
\global\parskip0.880000\baselineskip
- (b)
- un segundo antígeno de HCV seleccionado entre:
- (i)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (ii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (iii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (iv)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
con la condición de que la
combinación no sea el péptido p1 con C100-3, el
péptido p35 con C100-3, el péptido p99 con
C100-3, o un péptido que posea los aminoácidos 9 a
177 de la poliproteína de
HCV-1.
Preferiblemente, el segundo antígeno de HCV
comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de
HCV1 mostrada en la Figura 1 y en este caso, la combinación
comprende preferiblemente, además, al menos un antígeno de HCV
adicional seleccionado entre:
- (i)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (ii)
- un antígeno de HCB que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (iii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
Más preferiblemente, el antígeno adicional
procede del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la
Figura 1.
Otro aspecto de la invención es un método para
detectar anticuerpos contra el HCV en un componente del cuerpo de
un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende
poner en contacto dicho componente del cuerpo con la combinación de
antígenos de HCV anteriormente descrita, en condiciones que permiten
la reacción anticuerpo-antígeno, y detectar la
presencia de inmunocomplejos de dichos anticuerpos u dichos
antígenos.
Otro aspecto de la invención es un método para
detectar anticuerpos contra el HCV en un componentes del cuerpo de
un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende
poner en contacto dicho componente del cuerpo con una combinación
de antígenos de HCV de la invención, en condiciones que permiten la
reacción anticuerpo-antígeno, y detectar la
presencia de inmunocomplejos de dichos anticuerpos y dichos
antígenos.
Otro aspecto de la invención es un estuche (kit)
para llevar a cabo un ensayo para detectar anticuerpos contra el
HCV en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de
contener dichos anticuerpos, que comprende en combinación
empaquetada.
- (a)
- dicha combinación de antígenos de HCV
- (b)
- reactivos testigo estándar; y
- (c)
- instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
En los dibujos:
La Figura 1 es la secuencia de nucleótidos de la
cadena de cDNA en orientación sentido y anti-sentido
de la poliproteína de HCV y la secuencia de aminoácidos codificada
por la cadena en orientación sentido.
La Figura 2 es una representación esquemática de
la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 que muestra los dominios
putativos del polipéptido de HCV.
"Antígeno de HCV" significa un polipéptido
de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, más habitualmente al
menos aproximadamente 8 a 10 aminoácidos, que define un epítopo
encontrado en un aislado de HCV. Preferiblemente, el epítopo es
único para el HCV. Cuando un antígeno se designa mediante un código
alfanumérico, el epítopo procede del dominio de HCV especificado
por la notación alfanumérica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
"Sintético", tal como se usa para
caracterizar un antígeno de HCV, significa que el antígeno de HCV ha
sido hecho por la mano del hombre, por ejemplo mediante síntesis
química o mediante síntesis recombinante.
"Dominios" significa aquellos segmentos de
la poliproteína de HCV que se muestran en la Figura 2 que
corresponden en general a las proteínas putativas estructurales y
no estructurales, del HCV. Las designaciones de los dominios
siguen, en general, la convención empleada para nombrar proteínas
Flavivirales. Las localizaciones de los dominios que se muestran en
la Figura 2 son solamente aproximadas. Las designaciones "NS"
denotan dominios "no estructurales", mientras que "S"
denota el dominio de la cubierta, y "C" denota el dominio de la
nucleocápsida o del núcleo.
"Polipéptido de fusión" significa un
polipéptido en el que el antígeno o antígenos de HCV forman parte de
una cadena continua única de aminoácidos, cuya cadena no se
presenta de modo natural. Los antígenos de HCV pueden estar
conectados directamente unos a otros mediante uniones peptídicas o
estar separados por secuencias de aminoácidos intervinientes. Los
polipéptidos de fusión pueden contener también secuencias de
aminoácidos exógenas respecto al HCV.
"Matriz sólida común" significa un cuerpo
sólido al que los antígenos de HCV individuales o el polipéptido de
fusión compuesto de antígenos de HCV, se unen covalentemente o por
medios no covalentes tales como adsorción hidrófoba.
"Componente del cuerpo de un mamífero"
significa un fluido o un tejido de un mamífero (por ejemplo, un ser
humano) que contiene comúnmente anticuerpos producidos por el
individuo. Tales componentes son conocidos en la técnica e
incluyen, sin limitación, sangre, plasma, suero, líquido
cefalorraquídeo, líquido linfático, secreciones de los tractos
respiratorio, intestinal o genitourinario, lágrimas, saliva, leche,
glóbulos blancos, y mielomas.
"Inmunológicamente reactivo" significa que
el antígeno en cuestión reacciona específicamente con anticuerpos
anti-HCV presentes comúnmente en una proporción
importante de sueros procedentes de individuos infectados con
HCV.
"Inmunocomplejo" significa la combinación o
agregado formados cuando un anticuerpo se une a un epítopo de un
antígeno.
La Figura 2 muestra los dominios putativos de la
poliproteína de HCV. Los dominios desde los que derivan los
antígenos usados en la combinaciones son: C, S (o E), NS3, NS4, y
NS5. Se cree que el dominio C define la proteína de la
nucleocápsida del HCV. Este dominio se extiende desde el extremo N
terminal de la poliproteína hasta aproximadamente el aminoácido 120
de la Figura 1. Se cree que el dominio S de la poliproteína de HCV1
mostrada en la Figura 1 define la proteína de la cubierta del
virión, y posiblemente la proteína (M) de la matriz, y se opina que
se extiende desde aproximadamente el aminoácido 120 hasta el
aminoácido 400 de la Figura 1. El dominio NS3 de la poliproteína de
HCV1 mostrada en la Figura 1 se extiende desde aproximadamente el
aminoácido 1050 hasta el aminoácido 1640 y se cree que constituye la
proteasa viral. El dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada
en la Figura 1 se extiende desde el término del NS3 hasta
aproximadamente el aminoácido 2000. La función de la proteína de
NS4 no se conoce en la actualidad. Finalmente, el dominio NS5 de la
poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 se extiende desde
aproximadamente el aminoácido 2000 hasta el extremo de la
poliproteína y se cree que define la polimerasa viral.
La secuencia mostrada en la Figura 1 es la
secuencia del aislado de HCV1. Es de esperar que las secuencias de
otras cepas del HCV transportado por la sangre difieran de la
secuencia de la Figura 1, en particular en los dominios de la
cubierta (S) y de la nucleocápsida (C).
En general, los antígenos de HCV comprenden
dominios completos o truncados, pudiendo ser seleccionados
fácilmente por su antigenicidad los fragmentos de los dominios, por
los expertos en la técnica. Los antígenos de HCV individuales
usados en la combinación comprenderán, preferiblemente, la parte
inmunodominante (es decir, la parte principalmente responsable de
la reactividad inmunológica del polipéptido) del dominio de que se
trate. En el caso del dominio C, se prefiere que el antígeno del
dominio C comprenda la mayor parte de la secuencia completa del
dominio. El antígeno designado C22 (véase el Ejemplo 4 que figura
más adelante), es particularmente preferido. El antígeno del
dominio S incluye preferiblemente el subdominio hidrófobo situado en
el extremo N terminal del dominio. Este subdominio hidrófobo se
extiende desde aproximadamente el aminoácido 199 hasta el
aminoácido 328 de la Figura 1. El antígeno de HCV designado S2
(véase el Ejemplo 3 que figura más adelante), es particularmente
preferido. La secuencia aguas abajo del subdominio hidrófobo puede
incluirse en el antígeno del dominio S si se desea.
Un antígeno del dominio NS3 preferido es el
antígeno designado C33c. Este antígeno incluye los aminoácidos 1192
a 1457 de la Figura 1. Un antígeno de NS4 preferido es el C100 que
comprende los aminoácidos 1569 al 1931 de la Figura 1. Un antígeno
de NS5 preferido comprende los aminoácidos 2054 al 2464 de la Figura
1.
El antígeno de HCV puede estar en la forma de un
polipéptido constituido enteramente por la secuencia de aminoácidos
del HCV o puede contener una secuencia exógena al HCV (es decir,
puede estar en la forma de una proteína de fusión que incluya la
secuencia exógena). En el caso de antígeno de HCV obtenido
recombinantemente, la producción del antígeno en forma de una
proteína de fusión tal como con SOD, factor alfa o ubiquitina
(véanse la patente de EE.UU. No. 4.751.180, la patente de EE.UU.
No. 4.870.008 y la solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 390.599,
presentada el 7 de Agosto de 1989, de propiedad común, que describen
la expresión de proteínas de fusión de SOD, factor alfa y
ubiquitina) puede aumentar el nivel de expresión y/o aumentar la
solubilidad en agua del antígeno. Las proteínas de fusión tales
como la fusión del factor alfa y la ubiquitina, son procesadas por
el huésped de expresión para separar la secuencia heteróloga. Sin
embargo, el factor alfa es un sistema de secreción mientras que las
fusiones de ubiquitina permanecen en el citoplasma.
Además, la combinación de antígenos puede ser
producida como una proteína de fusión. Por ejemplo, puede
construirse un fragmento continuo de DNA que codifica C22 y C33c,
clonado en un vector de expresión y usado para expresar una
proteína de fusión de C22 y C33c. De un modo similar pueden
prepararse proteínas de fusión de C22 y C100; C22 y S2; C22 y un
antígeno de NS5; C22, C33c, y S2; C22, C100 y S2, y C22, C33c, C100
y S2. También pueden usarse fragmentos alternativos del dominio
ejemplificado.
Los antígenos de HCV de la invención son
producidos recombinantemente o mediante la conocida síntesis química
en fase sólida.
Cuando son producidos mediante técnicas
recombinantes, pueden emplearse procedimientos operatorios estándar
para construir el DNA que codifica el antígeno, clonar el DNA en
vectores de expresión, transformar células hospedantes tales como
bacterias, levaduras, insectos o células de mamífero, y expresar tal
DNA para producir el antígeno. Como se ha indicado anteriormente,
puede ser deseable expresar el antígeno en la forma de una proteína
de fusión para favorecer la expresión, facilitar la purificación, o
mejorar la solubilidad. Ejemplos de procedimientos operatorios
específicos para producir antígenos de HCV representativos están
descritos en los Ejemplos que figuran más adelante, y en la patente
de EE.UU. No. 5.350.671.
Los antígenos de HCV pueden ser combinados
produciéndolos en la forma de una proteína de fusión compuesta de
dos o más de los antígenos, inmovilizándolos individualmente sobre
una matriz común sólida, o mezclándolos físicamente. Las proteínas
de fusión del antígeno pueden ser inmovilizadas también sobre
(unidas a) una matriz sólida. Métodos y medios para unir covalente
o no covalentemente proteínas a matrices sólidas, son conocidos en
la técnica. La naturaleza de la superficie sólida puede variar
dependiendo del formato del ensayo. Para ensayos llevados a cabo en
pocillos de microtitulación, la superficie sólida será la pared del
pocillo o copa. Para ensayos que utilizan bolas pequeñas, la
superficie sólida será la superficie de la bola. En ensayos que
utilizan una varilla de inmersión (dipstick) es decir, un cuerpo
sólido fabricado a partir de un material poroso o fibroso tal como
tela o papel) la superficie será la superficie del material con el
que se ha fabricado la varilla de inmersión. En ensayos de
aglutinación la superficie sólida puede ser la superficie de
partículas de látex o de gelatina. Cuando se unen a la matriz
antígenos individuales, estos pueden distribuirse homogéneamente
sobre la superficie o distribuirse sobre ella según un modelo dado,
tal como bandas, de modo que puede distinguirse el modelo de unión
del antígeno.
Las mezclas simples de los antígenos comprenden
los antígenos en cualquier disolvente o medio de dispersión
adecuado.
Los antígenos de HCV pueden ser empleados en
virtualmente cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno
conocido para detectar anticuerpos. Una característica común de
todos estos ensayos es que el antígeno se ponga en contacto con el
componente del cuerpo sospechoso de contener anticuerpos de HCV, en
condiciones que permitan que el antígeno se una a cualquiera de
tales anticuerpos presentes en el componente. Tales condiciones
son, típicamente, temperatura fisiológica, pH y fuerza iónica,
usando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con la
muestra va seguida de detección de inmunocomplejos que comprenden el
antígeno.
El diseño de los inmunoensayos está sujeto a un
grado grande de variación, y muchos formatos son conocidos en la
técnica. Los protocolos pueden utilizar, por ejemplo, soportes
sólidos, o inmunoprecipitación. La mayor parte de los ensayos
implican el uso de anticuerpos o polipéptidos marcados; los
marcadores pueden ser, por ejemplo, enzimáticos, fluorescentes,
quimiluminiscentes, radiactivos, o moléculas de colorantes. También
son conocidos ensayos que amplifican las señales procedentes del
inmunocomplejo, ejemplos de los cuales son los ensayos que utilizan
biotina y avidina, e inmunoensayos marcados con enzimas y realizados
con mediación de éstas, tales como ensayos ELISA.
Los inmunoensayos pueden tener, sin limitación,
un formato heterogéneo o en un formato homogéneo, y ser de un tipo
estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido se
une, típicamente, a una matriz sólida o un soporte sólido para
facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de
realizar la incubación. Son ejemplos de soportes sólidos que pueden
ser empleados, nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o
de pocillo de microtitulación), policloruro de vinilo (por ejemplo,
en láminas o pocillos de microtitulación), látex de poliestireno
(por ejemplo, en forma de bolas pequeñas o placas de
microtitulación), polifluoruro de polivinilideno (conocido como
Immulon^{TM}), papel diazotado, membranas de nilón, bolas
activadas, y bolas de Proteína A. Por ejemplo, pueden utilizarse en
el formato heterogéneo placas de microtitulación de Dynatech
Immulon^{TM} 1 ó Immulon^{TM} 2, o bolas de poliestireno de 6,4
mm (Precision Plastic Ball). El soporte sólido que contiene los
polipéptidos antigénicos se lava típicamente después de separarlo de
la muestra de ensayo, y antes de la detección de los anticuerpos
unidos. Ambos formatos, estándar y competitivo, son conocidos en la
técnica.
En un formato homogéneo, la muestra de ensayo se
incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo,
puede efectuarse en condiciones que precipitan los complejos
antígeno-anticuerpo que se formen. Ambos formatos,
estándar y competitivo, para estos ensayos, son conocidos en la
técnica.
En un formato estándar, la cantidad de
anticuerpos de HCV que forman el complejo
antígeno-anticuerpo se comprueba directamente. Esto
puede llevarse a cabo determinando si anticuerpos
anti-xenógenos (por ejemplo,
anti-humanos) marcados que reconocen un epítopo
sobre anticuerpos anti-HCV se han unido debido a la
formación de complejo. En un formato competitivo, la cantidad de
anticuerpos de HCV existente en la muestra se deduce comprobando el
efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de
anticuerpo marcado (u otro ligando en competencia) en el
complejo.
Los complejos formados que comprenden anticuerpo
anti-HCV (o, en el caso de ensayos competitivos, la
cantidad de anticuerpo en competencia) son detectados mediante
cualquiera de diversas técnicas conocidas, dependiendo del formato.
Por ejemplo, los anticuerpos de HCV sin marcar existentes en el
complejo pueden ser detectados usando un conjugado de Ig
anti-xenógena complejada con un marcador (por
ejemplo, un marcador enzimático).
En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o
de aglutinación, la reacción entre los antígenos de HCV y el
anticuerpo forma un retículo que precipita desde la solución o
suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si
no se encuentra presente en la muestra de ensayo anticuerpo
anti-HCV, no se forma precipitado visible.
Los antígenos de HCV típicamente pueden
empaquetarse típicamente en la forma de un estuche (kit) para usar
en estos inmunoensayos. El estuche contendrá normalmente, en
recipientes separados, la combinación de antígenos (o bien ya
unidos a una matriz sólida o separados con reactivos para unirlos a
la matriz), formulaciones de anticuerpos testigo (positivos y/o
negativos), anticuerpo marcado cuando el formato de ensayo lo
requiere y reactivos generadores de señal (por ejemplo, un sustrato
enzimático) si el marcador no genera directamente una señal. En el
estuche se incluirán habitualmente instrucciones (por ejemplo, por
escrito, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a
cabo el ensayo.
Los ejemplos que siguen están destinados a
ilustrar la invención y no están destinados a limitar en modo alguno
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El antígeno de HCV C33c contiene una secuencia
procedente del dominio NS3. Específicamente, incluye los aminoácidos
1192-1457 de la Figura 1. Este antígeno ha sido
producido en bacterias en forma de una proteína de fusión con
superóxido dismutasa (SOD) humana del modo siguiente. El vector
pSODcf1 (Steiner et al., J. Virol. 58:9 (1986)) se
sometió a digestión hasta terminación con EcoRI y BamHI y el
fragmento EcoRI,BamHI resultante fue ligado al engarce siguiente
para formar el pcf1EF:
Un clon de cDNA que codifica los aminoácidos
1192-1457 y que tenía extremos EcoRI fue insertado
en el pcf1EF formando el pcf1EF/C33c. Esta construcción de
expresión fue transformada en células de E. coli D1210.
Los transformantes fueron usados para expresar
una proteína de fusión que constaba de SOD en el extremo N terminal
y antígeno de HCV C33c en el marco de lectura, en el extremo C
terminal. La expresión se llevó a cabo por inoculación de 1500 ml
de caldo Luria conteniendo ampicilina (100 microgramos/ml) con 15 ml
de un cultivo de los transformantes realizado durante la noche. Las
células se hicieron crecer hasta una D.O. de 0,3, se añadió IPTG
para obtener una concentración final de 2 mM, y se continuó el
crecimiento hasta que las células alcanzaron una densidad de 1 D.O.
en cuyo momento fueron recolectadas por centrifugación a 3.000 x g,
a 4ºC, durante 20 minutos. Las células empaquetadas pueden ser
mantenidas a -80ºC durante varios meses.
Con objeto de purificar el polipéptido
SOD-C33c las células bacterianas en las que el
polipéptido fue expresado fueron sometidas a choque osmótico y
disrupción mecánica, se aisló la fracción insoluble que contenía al
SOD-C33c y se sometió a extracción diferencial con
una solución de NaCl-compuesto alcalino, y el
polipéptido de fusión existente en el extracto se purificó mediante
cromatografía en columna de S-Sepharose^{(TM)} y
Q-Sepharose^{(TM)}.
El extracto crudo resultante del choque osmótico
y la disrupción mecánica, se preparó mediante el procedimiento
siguiente. Un gramo de las células empaquetadas fue suspendido en 10
ml de una solución que contenía Tris-HCl 0,02 M, pH
7,5, EDTA 10 mM y sacarosa al 20%, y se incubó durante 10 minutos en
hielo. Las células fueron aglomeradas después por centrifugación a
4.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC. Después de separar el
sobrenadante, los aglomerados de células fueron resuspendidos en 10
ml de Tampón A1 (Tris-HCl 0,01M, pH 7,5. EDTA 1 mM,
beta-mercaptoetanol [BME] 14 mM), e incubados en
hielo durante 10 minutos. Las células fueron aglomeradas de nuevo a
4.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC. Después de separar el
sobrenadante claro (fracción periplásmica I), los aglomerados de
células fueron resuspendidos en Tampón A1, incubados en hielo
durante 10 minutos y centrifugados de nuevo a 4.000 x g durante 15
minutos, a 4ºC. El sobrenadante claro (fracción periplásmica II)
fue separado, y el aglomerado de células resuspendido en 5 ml de
Tampón A2 (Tris-HCl 0,02M, pH 7,5, BME 14 mM, EDTA
1 mM, PMSF 1 mM). Con objeto de someter a disrrupción las células,
la suspensión (5 ml) y 7,5 ml de bolas de vidrio lavadas con ácido,
exentas de plomo, Dyno-mill^{TM}
(0,10-0,15 mm de diámetro)(obtenidas de
Glen-Mills, Inc.) fueron colocadas en un tubo
Falcon^{TM}, y sometidas a rotación con formación de vórtice a la
máxima velocidad durante dos minutos, seguido de enfriamiento
durante al menos 2 minutos, en hielo; El procedimiento operatorio
de rotación con formación de vórtice-enfriamiento se
repitió otras cuatro veces. Después de la rotación con formación de
vórtice, la suspensión se filtró a través de un embudo de vidrio
sinterizado usando baja succión; las bolas de vidrio fueron lavadas
dos veces con Tampón A2, y se reunieron el filtrado y los
lavados.
La fracción insoluble del extracto crudo se
recogió por centrifugación a 20.000 x g durante 15 minutos, a 4ºC,
se lavó dos veces con 10 ml de Tampón A2, y se volvió a suspender en
5 ml de agua de MILLI-Q^{(TM)}.
Se aisló del material insoluble una fracción que
contenía el SOD-C33c, añadiendo a la suspensión NaOH
(2 M) y NaCl (2 M), para obtener una concentración final 20 mM de
cada uno, sometiendo la mezcla a rotación con formación de vórtice
durante 1 minuto, centrifugando a 20.000 x g durante 20 minutos a
4ºC, y reteniendo el sobrenadante.
Con objeto de purificar el
SOD-C33c sobre S-Sepharose^{(TM)}
la fracción sobrenadante se ajustó a una concentración final de
urea 6M, Tris-HCl 0,05M, pH 7,5. BME 14 mM y EDTA 1
mM. Esta fracción se aplicó después a una columna de
S-Sepharose^{(TM)} Fast Flow (1,5 x 10 cm) que
había sido equilibrada con Tampón B (Tris-HCl 0,05M,
pH 7,5, BME 14 mM, EDTA 1 mM). Después de la aplicación, la columna
se lavó con dos volúmenes de columna de Tampón B. Se recogieron el
flujo a través de la columna y los lavados. El caudal de aplicación
y los lavados fueron de 1 ml/min; y las fracciones recogidas fueron
de 1 ml. Con objeto de identificar las fracciones que contenían el
SOD-C33c, partes alícuotas de las fracciones fueron
analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al
10% conteniendo SDS seguido de tinción con azul de coomassie. Las
fracciones pueden ser analizadas también mediante transferencias
Western usando un anticuerpo dirigido contra SOD. Se reunieron las
fracciones que contenían SOD-C33c.
La purificación posterior del
SOD-C33c se llevó a cabo en una columna de
Q-Sepharose^{(TM)} (1,5 x 5 cm) equilibrada con
Tampón B. Las fracciones reunidas que contenían el
SOD-C33c, obtenidas de la cromatografía sobre
S-Sepharose, fueron aplicadas a la columna. La
columna se lavó luego con Tampón B, y se eluyó con 60 ml de
solución de NaCl en un gradiente de 0,0 a 0,4 M, en tampón B. El
caudal de aplicación, los lavados y la elución fueron de 1 ml/min;
las fracciones recogidas fueron de 1 ml. Todas las fracciones
procedentes de la columna de Q-Sepharose^{(TM)}
fueron analizadas como se ha descrito para la columna de
S-Sepharose^{(TM)}. El pico de
SOD-C33c eluyó desde la columna en aproximadamente
NaCl 0,2 M.
El SOD-C33c obtenido de la
columna de Q-Sepharose^{(TM)} tenía una pureza
superior al 90%, determinada mediante análisis sobre geles de
poliacrilamida SDS e inmunotransferencia usando un anticuerpo
monoclonal dirigido contra SOD humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El antígeno de HCV C100 contiene secuencias
procedentes de los dominios NS3 y NS4. Específicamente, incluye los
aminoácidos 1569-1931 de la Figura 1. Este antígeno
fue producido en levadura. Se preparó un fragmento de cDNA de 1270
bp que codifica los aminoácidos anteriores y que tenía términos
EcoRI.
La construcción de un vector de expresión de
levadura en el que este fragmento estaba fusionado directamente al
promotor de S. cerevisiae ADH2/GAP se llevó a cabo mediante
un protocolo que incluía amplificación de la secuencia de C100
usando el método de PCR, seguido de ligación de la secuencia
amplificada en un vector de clonación. Después de clonación, la
secuencia C100 fue cortada, y con una secuencia que contenía el
promotor ADH2/GAP, fue ligada a un fragmento grande de un vector de
levadura obteniendo un vector de expresión de levadura.
La amplificación por PCR del C100 se llevó a
cabo usando como molde el vector pS3-56_{C100m},
que había sido linearizado por digestión con SalI. El
pS3-56, que es un derivado del pBR322, contiene una
casete de expresión constituida por el promotor de levadura híbrido
ADH2/GAPDH aguas arriba del gen humano de superóxido dismutasa, y
un terminador de la transcripción de factor alfa aguas abajo.
\newpage
Los cebadores de oligonucleótidos usados para la
amplificación fueron diseñados para facilitar la clonación en el
vector de expresión, y para introducir un codón de terminación de la
traducción. Específicamente, nuevos sitios
5'-HindIII y 3'-SalI fueron
generados con los oligonucleótidos de la PCR. El oligonucleótido que
contiene el sitio SalI codifica también los codones dobles de
terminación, TAA y TGA. El oligonucleótido que contiene el sitio
HindIII contiene también una secuencia conductora sin traducir
derivada del gen pgap63, situada inmediatamente aguas arriba del
codón AUG. El gen pEco63GAPDH ha sido descrito por Holland y Holland
(1980) y por Kniskern et al. (1986). Las secuencias de
cebador de la PCR usadas para la expresión directa de C100m
fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación mediante PCR, utilizando los
cebadores, y el molde, fue realizada con un estuche de PCR Cetus de
Perkin Elmer, y se llevó a cabo según las instrucciones del
fabricante. Las condiciones de la PCR fueron 29 ciclos de 94ºC
durante un minuto, 37ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos,
y la incubación final se efectuó a 72ºC durante 10 minutos. El DNA
puede guardarse a 4ºC ó -20ºC durante la noche.
Después de la amplificación, los productos de la
PCR fueron sometidos a digestión con HindIII y SalI. El producto
principal de 1,1 kb fue purificado mediante electroforesis en gel, y
el producto purificado eluído fue ligado con un fragmento
SalI-HindIII largo de pBR322. Con objeto de aislar
recombinantes correctos, células HB101 competentes fueron
transformadas con los vectores recombinantes, y después de
clonación, los recombinantes deseados fueron identificados en base
al tamaño predicho de los fragmentos de HindIII-SalI
cortados de los clones. Uno de los clones, que contenía el
fragmento de HindIII-SalI del tamaño correcto fue
denominado pBR322/C100^{-}d. La confirmación de que este clon
contenía C100 amplificado se efectuó mediante análisis secuencial
directo del fragmento de HindIII-SalI.
El vector de expresión que contenía C100 fue
construido ligando el fragmento de HindIII-SalI
procedente del pBR322/C100^{-}d a un fragmento de
BamHI-SalI de 13,1 kb de pBS24.1, y un fragmento de
BamHI-HindIII de 1369 bp que contenía el promotor
ADH2/GAP. (El último fragmento figura descrito en el documento EPO
164.556). El fragmento del promotor ADH2/GAP se obtuvo por
digestión del vector pPGAP/AG/HindIII con HindIII y BamHI, seguido
de purificación del fragmento de 1369 bp sobre un gel.
Células HB101 competentes fueron transformadas
con los vectores recombinantes, y los recombinantes correctos
fueron identificados mediante la generación de un fragmento de 2464
bp y un fragmento de 13,1 kb generado por digestión con BamHI y
SalI de los vectores clonados. Uno de los vectores recombinantes
correctos clonados se denominó pC100^{-}dnº3.
Con objeto de expresar al C100, células
competentes de Saccharomyces cerevisiae cepa AB122 (MATa leu2
ura3-53 prb 1-1122
pep4-3
prcl-407[cir-0]) fueron
transformadas con el vector de expresión pC100^{-}dnº3. Las
células transformadas fueron depositadas en placa sobre
URA-sorbitol, y los transformantes individuales
fueron extendidos después por rayado sobre placas de Leu^{-}.
Se cultivaron clones individuales en medio de
Leu^{-}, ura^{-} con glucosa al 2%, a 30ºC, durante
24-36 horas. Un litro de Yeast Extract Peptone
Medium (YEP) (medio peptonado de extracto de levadura) que contenía
glucosa al 2% fue inoculado con 10 ml de cultivo de la noche, y el
cultivo resultante se hizo crecer a 30ºC con una velocidad de
agitación de 400 rpm y una velocidad de aireación de 1 litro de aire
por litro de medio, por minuto, (es decir 1vvm) durante 48 horas.
El pH del medio no se reguló. El cultivo se hizo crecer en un
fermentador BioFlo II fabricado por New Brunswick Science Corp.
Después de fermentación, las células fueron aisladas y analizadas
para determinar la expresión de C100.
El análisis del polipéptido C100 expresado por
las células transformadas se llevó a cabo sobre lisados de células
totales y extractos crudos preparados a partir de colonias de
levadura aisladas obtenidas de las placas de Leu^{-}. Los lisados
de células y los extractos crudos fueron analizados por
electroforesis en geles de poliacrilamida SDS, y mediante
transferencias Western. Las transferencias Western fueron tratadas
empleando como sondas anticuerpos policlonales de conejo dirigidos
contra el polipéptido SOD-C100 expresado en la
levadura. El tamaño del polipéptido C100 esperado es 364
aminoácidos. Mediante análisis en gel el polipéptido expresado
tiene una masa molecular relativa (MW_{r}) de 39,9 K.
\newpage
Ambos métodos analíticos demostraron que el
polipéptido C100 expresado estaba presente en lisados de células
totales, pero estaba ausente de extractos crudos. Estos resultados
sugieren que el polipéptido C100 expresado puede ser insoluble.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El antígeno de HCV S2 contiene una secuencia
procedente del extremo N terminal hidrófobo del dominio S. Incluye
los aminoácidos 199-328 de la Figura 1.
El protocolo de construcción del vector de
expresión que codifica el polipéptido S2 y su expresión en levadura,
fue análogo al usado para la expresión del polipéptido C100,
descrito en el Ejemplo 2.
El molde para la reacción PCR fue el vector
pBR322/Pi14a, que había sido linearizado por digestión con HindIII.
El Pi14a es un clon de cDNA que codifica los aminoácidos
199-328.
Los oligonucleótidos usados como cebadores para
la amplificación mediante la PCR de la secuencia de codificación de
S2 fueron los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador para la región 5' introduce un sitio
HindIII y un codón de iniciación ATG en el producto amplificado. El
cebador para la región 3' introduce codones de terminación de la
traducción y un sitio SalI en el producto amplifi-
cado.
cado.
Las condiciones de realización de la PCR fueron
29 ciclos de 94ºC durante un minuto, 37ºC durante 2 minutos, 72ºC
durante 3 minutos, y la incubación final se realizó a 72ºC durante
10 minutos.
El producto principal de la reacción PCR fue un
fragmento de 413 bp, que se purificó en gel. El fragmento
purificado se ligó al fragmento largo obtenido de pBR322 sometido a
digestión con el fragmento de HindIII y SalI, obteniendo el
plásmido pBR322/S2d.
La ligación del fragmento de S2
HindIII-SalI de 413 bp con el fragmento de
BamHI-HindIII de 1,36 kb que contenía el promotor
ADH2/GAP, y con el fragmento largo de BamHI-SalI del
vector de levadura PBS24.1, proporcionó vectores recombinantes, que
fueron clonados. Los vectores recombinantes correctos fueron
identificados por la presencia de un fragmento de 1,77 kb después
de digestión con BamHI y SalI. Un vector de expresión construido
partiendo de la secuencia amplificada y que contenía la secuencia
que codifica S2, fusionado directamente al promotor ADH2/GAP, se
identificó como pS2dnº9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El antígeno de HCV C22 procede del dominio C.
Este antígeno comprende los aminoácidos 1-122 de la
Figura
1.
1.
El protocolo de construcción del vector de
expresión que codifica el polipéptido C y su expresión en levadura,
fue análogo al utilizado para la expresión del polipéptido C100,
antes descrito en esta memoria, excepto lo siguiente.
\newpage
El molde para la reacción PCR fue el
pBR322/Ag30a que había sido linearizado con HindIII. Ag30 es un clon
de cDNA que codifica los aminoácidos 1-122. Los
oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación
mediante la PCR de la secuencia que codifica C fueron los
siguientes:
El cebador para la región 5' introduce un sitio
HindIII en el producto amplificado, y el cebador para la región 3'
introduce codones de terminación de la traducción y un sitio SalI.
La PCR se llevó a cabo durante 29 ciclos de 94ºC de un minuto, 37ºC
durante 2 minutos y
\hbox{72ºC durante 3 minutos, y la
incubación final se realizó a 72ºC durante 10 minutos.}
El producto principal de la amplificación por
PCR es un polinucleótido de 381 bp. La ligación de este fragmento
con el fragmento SalI-HindIII largo de
SalI-HindIII del pBR322 proporcionó el plásmido
pBR322/C2.
La ligación del fragmento de
HindIII-SalI de 381 bp que codifica C, cortado del
pBR322/C2, con el fragmento de BamHI-HindIII de
1,36 kb que contiene el promotor ADH2/GAP, y con el fragmento de
BamHI-SalI largo del vector de levadura pBS24.1
proporcionó vectores recombinantes, que fueron clonados. Los
vectores recombinantes correctos fueron identificados por la
presencia de un fragmento de 1,74 kb después de digestión con BamHI
y SalI. Un vector de expresión construido a partir de la secuencia
amplificada, y que contenía la secuencia que codifica C, fusionado
directamente con el promotor ADH2/GAP, es identificado como
pC22.
El análisis para el polipéptido C expresado por
las células transformadas se llevó a cabo sobre lisados de células
totales y extractos crudos preparados a partir de colonias de
levadura aisladas, obtenidas de las placas de Leu^{-}. Los
lisados celulares y los extractos crudos fueron analizados mediante
electroforesis en geles de poliacrilamida SDS. Se esperaba que el
polipéptido C tuviera 122 aminoácidos y mediante análisis en gel el
polipéptido expresado tiene una masa molecular relativa de
aproximadamente 13,6 Kd.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Este polipéptido contiene la secuencia
procedente del extremo N terminal del dominio NS5. Específicamente
incluye los aminoácidos 2054 a 2464 de la Figura 1. El protocolo de
construcción del vector de expresión que codifica el polipéptido
NS5 y de su expresión fueron análogos a los utilizados para la
expresión de C33c (véase el Ejemplo 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Los antígenos de HCV de los Ejemplos
1-5 fueron ensayados en un formato RIA para
determinar su aptitud para detectar anticuerpos contra el HCV en el
suero de individuos diagnosticados clínicamente como poseedores del
HCV (No A, No B) y en el suero procedente de sangre proporcionada
por donantes de sangre retribuidos.
El RIA se basó en el procedimiento operatorio de
Tsu y Herzenberg (1980) en SELECTED METHODS IN
CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Frreman and Co.), páginas 373-391. En general, placas de microtitulación (Immulon 2, tiras Removawell) se revisten con antígeno de HCV purificado. Las placas revestidas se incuban con las muestras de suero o testigos apropiados. Durante la incubación, el anticuerpo, si se encuentra presente, se une inmunológicamente al antígeno en la fase sólida. Después de separar el material que no se ha unido y lavar las placas de microtitulación, los complejos de anticuerpo humano-antígeno NANBV son detectados por incubación con inmunoglobulina anti-humana de oveja marcada con ^{125}I. El anticuerpo marcado sin unir se separa por aspiración, y se lavan las placas. Se determina la radiactividad en pocillos individuales; la cantidad de anticuerpo humano anti-HCV unido es proporcional a la radiactividad existente en el pocillo.
CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Frreman and Co.), páginas 373-391. En general, placas de microtitulación (Immulon 2, tiras Removawell) se revisten con antígeno de HCV purificado. Las placas revestidas se incuban con las muestras de suero o testigos apropiados. Durante la incubación, el anticuerpo, si se encuentra presente, se une inmunológicamente al antígeno en la fase sólida. Después de separar el material que no se ha unido y lavar las placas de microtitulación, los complejos de anticuerpo humano-antígeno NANBV son detectados por incubación con inmunoglobulina anti-humana de oveja marcada con ^{125}I. El anticuerpo marcado sin unir se separa por aspiración, y se lavan las placas. Se determina la radiactividad en pocillos individuales; la cantidad de anticuerpo humano anti-HCV unido es proporcional a la radiactividad existente en el pocillo.
Específicamente, alícuotas de cien microlitros
conteniendo 0,1 a 0,5 microgramos del antígeno de HCV en tampón de
borato sódico 0,125 M, pH 8,3, NaCl 0,075 M (BBS), se añadieron a
cada uno de los pocillos de la placa de microtitulación (Dynatech
Immulon 2, Tiras Removawell). La placa fue incubada a 4ºC durante la
noche en una cámara húmeda, después de lo cual, se separó la
solución de antígeno y los pocillos se lavaron 3 veces con BBS que
contenía Triton X-100^{(TM)} al 0,02% (BBST). Para
evitar la unión inespecífica, los pocillos fueron revestidos con
albúmina de suero bovino (BSA) por adición de 100 microlitros de una
solución de 5 mg/ml de BSA en BBS seguido de incubación a
temperatura ambiente durante 1 hora; después de esta incubación se
separó la solución de BSA. Los antígenos existentes en los pocillos
revestidos fueron hechos reaccionar con suero por adición de 100
microlitros de muestras de suero diluidas 1:100 en tampón de fosfato
sódico 0,01M, pH 7,2, NaCl 0,15 M (PBS) conteniendo 10 mg/ml de
BSA, e incubando los pocillos que contenían suero durante 1 hora a
37ºC. Después de incubar, las muestras de suero fueron separadas
mediante aspiración, y los pocillos fueron lavados 5 veces con
BBST. El anticuerpo unido al antígeno se determinó mediante la unión
de IgG anti-humana de oveja F'(ab)_{2}
marcada con ^{125}I, a los pocillos revestidos. Alícuotas de 100
microlitros de la sonda marcada (actividad específica
5-20 microcuries/microgramo) fueron añadidas a cada
uno de los pocillos, y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 1
hora, seguido de separación de la sonda en exceso mediante
aspiración y 5 lavados con BBST. La cantidad de radiactividad unida
existente en cada uno de los pocillos se determinó por recuento en
un contador que detecta la radiación gamma.
La Tabla 1 que figura seguidamente presenta los
resultados de los ensayos realizados sobre el suero de individuos
diagnosticados como poseedores de HCV.
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\vskip1.000000\baselineskip
Según estos resultados, ningún antígeno aislado
reaccionó con todos los sueros. El C22 y el C33c fueron los más
reactivos y el S2 reaccionó con algunos sueros procedentes de
algunos casos putativos de HCV agudos con los que no reaccionó
ningún otro antígeno. Basándose en estos resultados, la combinación
de dos antígenos que podría proporcionar el máximo grado de
detección, es C22 y C33c. Si se desea detectar un máximo de
infecciones agudas, debería incluirse en la combinación S2.
La Tabla 2 que sigue presenta los resultados del
ensayo sobre los donantes de sangre retribuidos.
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Los resultados obtenidos en los donantes
retribuidos confirman, en general, los resultados de los sueros de
individuos infectados.
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Ejemplo
7
Se preparan del modo siguiente placas revestidas
con una combinación de antígenos C22 y C33c. Una solución que
contiene tampón de revestimiento (Borato sódico 50 mM, pH 9,0), 21
ml/placa, BSA (25 microgramos/ml), C22 y C33c (2,50 microgramos/ml
de cada uno), se prepara inmediatamente antes de su adición a las
placas Removeawell Immulon I (Dynatech Corp.). Después de mezclar
durante 5 minutos, se añaden a las placas 0,2 ml/pocillo de la
solución, se tapan y se incuban durante 2 horas a 37ºC, después de
lo cual la solución se retira por aspiración. Los pocillos se lavan
una vez con 400 microlitros de tampón de lavado (fosfato sódico 100
mM, pH 7,4, cloruro de sodio 140 mM, caseína al 0,1% (p/v),
Triton-X-100^{(TM)} al 1% (p/v),
timerosal al 0,01% (p/v)). Después de retirar la solución de lavado
se añaden 200 microlitros/pocillo de solución "Postcoat"
(fosfato sódico 10 mM, pH 7,2, cloruro de sodio 150 mM, caseína al
0,1% (p/v), sacarosa al 3% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)
2 mM. Las placas se tapan flojamente para evitar la evaporación, y
se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los
pocillos se aspiran luego para separar la solución y se somete a
liofilización durante la noche sin dar calor a las bandejas. Las
placas preparadas pueden mantenerse a 2-8ºC en
bolsas de aluminio herméticamente cerradas, con desecante (bolsitas
de 3 g de Sorb-it ^{TM}).
Con objeto de llevar a cabo la determinación
ELISA, se añaden 20 microlitros de muestra de suero o muestra
testigo a un pocillo conteniendo 200 microlitros de diluyente de las
muestras (fosfato de sodio 100 mM, pH 7,4, cloruro de sodio 500 mM,
EDTA 1 mM, caseína al 0,1% (p/v), timerosal al 0,01% (p/v), Triton
X-100^{(TM)} al 1% (p/v), extracto de levadura
100 microgramos/ml). Las placas se cierran herméticamente y se
incuban a 37ºC durante dos horas, después de lo cual la solución se
retira por aspiración, y los pocillos se lavan tres veces con 400
microlitros de tampón de lavado (solución salina tamponada con
fosfato (PBS) conteniendo Tween 20^{(TM)} al 0,05%. Los pocillos
lavados se tratan con 200 microlitros de conjugado de IgG de ratón
anti-humana- peroxidasa de rábano picante (HRP)
contenidos en una solución de diluyente conjugado Orto (fosfato
sódico 10 mM, pH 7,2, cloruro de sodio 150 mM, suero fetal bovino
al 50% (v/v), suero de caballo tratado por calor, al 1% (v/v),
K_{3}Fe(CN)_{6} 1 mM, Tween 20 al 0,05% (p/v),
timerosal al 0,02% (p/v). El tratamiento se lleva a cabo durante 1
hora a 37ºC, se separa la solución mediante aspiración, y los
pocillos se lavan tres veces con 400 ml de tampón de lavado, que
también se retira por aspiración. Para determinar la cantidad de
conjugado enzimático unido, se añaden 200 microlitros de solución de
sustrato (10 mg de dihidrocloruro de
O-fenilenodiamina por 5 ml de solución Reveladora).
La solución Reveladora contiene citrato de sodio 50 mM ajustado a
pH 5,1 con ácido fosfórico, y 0,6 microlitros/ml de H_{2}O_{2}
al 30%. Las placas que contienen la solución de sustrato se incuban
en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente, se detienen
las reacciones mediante la adición de 50 microlitros/ml de ácido
sulfúrico 4N, y se determinan las DOs.
De un modo similar, pueden llevarse a cabo
ensayos ELISA usando proteína de fusión de C22 y C33c, y C22, C33c
y S2 y combinaciones de C22 y C100, C22 y S2, C22 y un antígeno de
NS5, C22, C33c y S2, y C22, C100 y S2.
Las modificaciones de los modos anteriormente
descritos para llevar a cabo la invención, evidentes para los
expertos en los campos de la biología molecular, inmunología y
campos afines, están destinadas a quedar incluidas dentro del
alcance de las reivindicaciones que siguen.
Claims (22)
-
\global\parskip0.930000\baselineskip
1. Un método para detectar anticuerpos contra el virus de la hepatitis C (HCV) en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende poner en contacto dicho componente del cuerpo con una combinación de antígenos de HCV en condiciones que permiten la reacción anticuerpo-antígeno y detectar la presencia de inmunocomplejos de dichos anticuerpos y dichos antígenos, en el que los antígenos están en uno o más polipéptidos obtenidos mediante síntesis química o expresión recombinante, inmovilizados sobre la superficie de una matriz sólida adecuada para la detección de HCV por inmunoensayo, que comprende:- (a)
- un primer antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio C de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (b)
- un segundo antígeno de HCV seleccionado de:
- (i)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (ii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (iii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (iv)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
con la condición de que la combinación no sea el péptido p1 con C100-3, el péptido p35 con C100-3, el péptido p99 con C100-3, o un péptido que tenga los aminoácidos 9 a 177 de la poliproteína de HCV-1. - 2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo antígeno de HCV comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 y cuya combinación comprende, además, al menos un antígeno de HCV adicional seleccionado entre:
- (i)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (ii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (iii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1.
- 3. Un método según la reivindicación 2, en el que el antígeno adicional procede del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.
- 4. Un método según la reivindicación 2, en el que el primer antígeno de HCV es el C22 y el antígeno de HCV adicional es el C33c.
- 5. Un método según la reivindicación 2, en el que el antígeno adicional procede del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.
- 6. Un método según la reivindicación 5, en el que el primer antígeno es el C22 y el segundo antígeno de HCV es el C100.
- 7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el antígeno procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 es el antígeno S2.
- 8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la combinación está en la forma de un polipéptido de fusión.
- 9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la combinación está en la forma de dicho primer antígeno de HCV y dichos antígenos adicionales unidos a una matriz sólida común.
- 10. Un método según la reivindicación 8, en el que la matriz sólida es la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, una bola pequeña o una varilla de inmersión.
- 11. Una combinación de antígenos de virus de la hepatitis C (HCV) en uno o más polipéptidos obtenidos por síntesis química o expresión recombinante, que comprende:
- (a)
- un primer antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio C de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (b)
- un segundo antígeno de HCV seleccionado de
- (i)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (ii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (iii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (iv)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
con la condición de que la combinación no sea el péptido p1 con C100-3, el péptido p35 con C100-3, el péptido 99 con C100-3 ó un péptido que tenga los aminoácidos 9 a 177 de la poliproteína de HCV-1. - 12. Una combinación según la reivindicación 11, en la que dicho segundo antígeno de HCV comprende un epítopo procedente del dominio S de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1 y cuya combinación comprende, además, al menos un antígeno de HCV adicional seleccionado entre:
- (i)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS3 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1;
- (ii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1; y
- (iii)
- un antígeno de HCV que comprende un epítopo procedente del dominio NS5 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1.
- 13. Una combinación según la reivindicación 12, en la que el antígeno adicional procede del dominio NS3 de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1.
- 14. Una combinación según la reivindicación 13, en la que el primer antígeno de HCV es el C22 y el antígeno de HCV adicional es el C33c.
- 15. Una combinación según la reivindicación 14, en la que el antígeno adicional procede del dominio NS4 de la poliproteína de HCV1 mostrada en la Figura 1.
- 16. Una combinación según la reivindicación 15, en la que el primer antígeno de HCV es el C22 y el antígeno de HCV adicional es el C100.
- 17. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en la que el antígeno procedente del dominio S de la poliproteína HCV1 mostrada en la Figura 1 es el antígeno S2.
- 18. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en la que la combinación está en la forma de un polipéptido de fusión.
- 19. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 18, en la que la combinación está en la forma de dicho primer antígeno de HCV y dichos antígenos adicionales unidos a una matriz sólida común.
- 20. Una combinación según la reivindicación 19, en la que dicha matriz sólida es la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, de una bola pequeña o de una varilla de inmersión.
- 21. Una combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en la que la combinación está inmovilizada sobre la superficie de una matriz sólida adecuada para la detección de HCV mediante inmunoensayo.
- 22. Un kit para llevar a cabo un ensayo para detectar anticuerpos contra el antígeno de la hepatitis C (HCV) en un componente del cuerpo de un mamífero sospechoso de contener dichos anticuerpos, que comprende en una combinación empaquetada:
- (a)
- la combinación según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21;
- (b)
- reactivos testigo estándar; e
- (c)
- instrucciones para efectuar el ensayo.
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