PT1021719E

PT1021719E - Método para detecção de anticorpos numa amostra

Info

Publication number: PT1021719E
Application number: PT98948398T
Authority: PT
Inventors: David Y Chien; Phillip Arcangel; Stephen Tirell; Ziegler Wanda
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2007-03-30
Also published as: JP2001517797A; CY1107621T1; CA2303123A1; DE69837155T2; DK1021719T3; WO1999015898A1; JP4124961B2; ES2281934T3; AU9497998A; EP1021719B1; EP1021719A1; CA2303123C; DE69837155D1; ATE354800T1; US6391540B1

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS NUMA AMOSTRA"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a detecção/quantificação de anticorpos contra antigénios numa amostra. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Os ensaios de captura de anticorpos são utilizados geralmente para a detecção de anticorpos dirigidos para determinados antigénios numa amostra. A detecção de tais anticorpos proporciona informação no que diz respeito, não apenas à exposição a determinados antigénios, mas pode igualmente proporcionar informação no que diz respeito à progressão da doença. Contudo, os ensaios de captura de anticorpos que utilizam antigénios de fase sólida, não permitem a medição de títulos verdadeiros de anticorpos numa amostra. Foram descritos ensaios para a detecção e/ou quantificação de, pelo menos, duas substâncias diferentes numa amostra de teste. A patente U.S. N.° 5395752 (a patente '752) descreve compostos quimioluminescentes como marcadores detectáveis para utilização na detecção de, pelo menos, duas substâncias numa amostra de teste. São utilizados compostos quimioluminescentes que emitem luz a diferentes comprimentos de onda com sobreposição mínima. Contudo, os marcadores detectáveis, í. e., compostos 1 quimioluminescentes, são específicos para a substância particular a ser detectada/quantifiçada na amostra de teste. 0 documento WO-A-97/44496, relevante para o n.° 3 do Artigo 54 da EPC, divulga um teste de captura de anticorpos, em que um antigénio de fusão multi-cópia é directamente ligado a biotina, sob a forma de um marcador detectável e indirectamente ligado a DMAE por meio de uma ligação biotina-estreptavidina-DMAE. 0 documento WO-A-94/24560 refere-se a um sistema de detecção de anticorpos utilizando um anticorpo capaz de se ligar a um antigénio e um segundo anticorpo capaz de se ligar ao primeiro anticorpo. Contudo, este sistema não envolve um conjugado antigénio-ligando. 0 documento WO-A-95/27702 descreve um imunoensaio para alergénio envolvendo um anticorpo anti-IgE ligado a uma fase sólida e um alergénio ligado ao marcador de detecção DMAE. Contudo, este sistema não compreende um anticorpo anti-ligando marcado. Um teste semelhante envolvendo três etapas de incubação e lavagem é divulgado no documento FR-A-2556840. É necessário um método para a análise de anticorpos numa amostra de teste que facilite a medição de títulos verdadeiros, possa acomodar a detecção de diferentes espécies de anticorpos dirigidos contra a mesma fonte numa amostra de teste, bem como acomodar a detecção de diferentes anticorpos contra diferentes fontes numa amostra de teste.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Num aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a detecção/quantificação de anticorpos para um determinado antigénio alvo numa amostra, numa única etapa de incubação. 2

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a detecção/quantificação de anticorpos para, pelo menos, dois antigénios provenientes da mesma fonte, numa única amostra de teste, numa única etapa de incubação, utilizando um único marcador detectável.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a detecção/quantificação de anticorpos para, pelo menos, dois antigénios provenientes da mesma fonte, numa única amostra de teste, numa única etapa de incubação, utilizando, pelo menos, dois reagentes luminescentes que emitem luz a diferentes comprimentos de onda, como marcadores detectáveis.

Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a detecção de antigénios provenientes de mais de uma fonte, numa única amostra de teste, numa única etapa de incubação, utilizando reagentes luminescentes que emitem luz a diferentes comprimentos de onda, como marcadores detectáveis. Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a determinação de um perfil de anticorpo e título verdadeiro de anticorpo de uma determinada fonte, em amostras de teste provenientes de um único indivíduo utilizando um único marcador detectável.

Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a kits de teste para realizar os métodos de acordo com a invenção. Nos kits de acordo com a invenção, a fase sólida e marcador detectável podem ser armazenados no mesmo compartimento. 3

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa um formato de teste exemplificativo de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de virologia, imunologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas de ADN recombinante dentro do estado da técnica. Tais técnicas encontram-se totalmente explicadas na literatura. Ver, e. g., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I & II (D. Glover, ed.); Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., Blackwell Scientific Publications); e Fundamental Virology, 2a Edição, Vols. I & II (B.N. Fields e D.M. Knipe, eds.).

Descrevem-se ensaios para a detecção de anticorpos contra um único antigénio alvo, contra múltiplos antigénios alvo provenientes da mesma fonte ou contra múltiplos antigénios alvo provenientes de diferentes fontes, numa única amostra de teste, que podem ser realizados numa única etapa de incubação (i. e., simultaneamente). Os ensaios podem ser realizados num sistema automatizado de elevado rendimento e, deste modo, permitir a renormalização de dados. Os ensaios de acordo com a invenção exibem elevada sensibilidade (100%) e especificidade (99,5 - 99,7% em amostras de dadores de sangue). São empregues fases sólidas universais e/ou marcadores detectáveis universais. 4 São aqui empregues as seguintes definições. 0 termo "antigénio alvo" como aqui utilizado inclui antigénios de epitopo único ou de múltiplos epitopos, bem como haptenos. 0 termo "fonte" como aqui utilizado em referência aos antigénios alvo inclui, sem limitação, virus, bactérias, tumores, fungos, etc. As diferentes fontes podem ser, por exemplo, diferentes subtipos de um vírus, diferentes vírus, ou um vírus e uma bactéria. 0 termo "ligando" como aqui utilizado refere-se a um agente de ligação. Em formas de realização preferidas, os ligandos são superóxido dismutase ("SOD") e ubiquitina. 0 termo "marcador detectável" como aqui utilizado inclui mas não está limitado a um cromóforo, uma enzima, um composto reactivo enzimático cujo produto de clivagem seja detectável, rodamina, biotina, estreptavidina, um composto fluorescente, um composto quimioluminescente e derivados e/ou combinações destes marcadores. Nos exemplos proporcionados, foi utilizado o composto quimioluminescente éster dimetílico de acridínio de (DMAE, Ciba Corning Diagnostics Corp.) A marcação com qualquer marcador é efectuada sob condições para a obtenção de detecção e ligação óptimas do anticorpo. 0 modo de detecção dos marcadores detectáveis dependerá do marcador utilizado. 0 meio e condições apropriadas podem ser facilmente determinados por alguém com conhecimentos gerais na técnica. Como exposto nos exemplos abaixo, quando DMAE é o 5 marcador detectável num ensaio, o conjugado anti-ligando-DMAE resultante é o localizador, com DMAE detectável por emissão luminosa quando reagido com Na0H/H202. Nos ensaios envolvendo dois ou mais reagentes luminescentes, devem ser utilizados, pelo menos, dois tubos fotomultiplicadores para obter as medições. A marcação de antigénios individuais com marcadores detectáveis pode ser muito fastidiosa e, adicionalmente, a marca resultante pode não ser estável. A presente invenção proporciona um marcador detectável universal. Na presente invenção, os antigénios são conjugados com um ligando, e. g., uma proteína de fusão antigénio/ligando. Esta proteína de fusão é emparelhada com um marcador detectável compreendendo um anticorpo dirigido contra o ligando. 0 anticorpo dirigido contra o ligando é conjugado com o marcador detectável. Podem ser fundidos ao mesmo ligando muitos antigénios diferentes. Desta forma, podem ser detectados numerosos antigénios com um único marcador universal. 0 termo "indivíduo" como aqui utilizado refere-se à fonte da amostra de teste, e inclui, sem limitação, humanos e outros vertebrados. Numa forma de realização preferida, o indivíduo é humano. 0 termo "amostra de teste" como aqui utilizado refere-se a qualquer fluido biológico proveniente de um indivíduo em que podem estar presentes anticorpos contra os antigénios alvo incluindo mas não limitado a soro e plasma. "Anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo" refere-se a anticorpos dirigidos contra imunoglobulinas provenientes do indivíduo em geral. Numa forma de realização preferida, os anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo são imunoglobulina (Ig) de rato anti-humano. Numa forma de realização mais preferida, os anticorpos humanos anti-indivíduo são IgG de rato 6 anti-humano. Os anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo são conjugados com a fase sólida proporcionando, deste modo, uma fase sólida universal para a detecção/quantificação de anticorpos numa amostra de teste. A fase sólida pode ser de micropartículas paramagnéticas ("PMP"), partículas magnéticas de látex ("MLP"), ou placas de microtitulação. De um modo preferido, as partículas possuem menos de aproximadamente 10 ym de diâmetro.

Os kits de teste de acordo com a invenção incluem, igualmente, calibradores ou controlos. Como acima registado, em formas de realização preferidas, os antigénios alvo são conjugados com os ligandos como proteínas de fusão. Por exemplo, os antigénios podem ser expressos como antigénios internos no interior da levedura S. cerevisiae como fusões C-terminais com SOD humana utilizando métodos descritos anteriormente para a geração do antigénio cl00-3 (NS4, 363 aa) do vírus da Hepatite C, Kuo et al., Science, 1989, 244, 362-364 e Cousens et al., Gene, 1987, 61, 265-275. O antigénio c33c (NS3, 363 aminoácidos) foi igualmente expresso como polipeptídeo de fusão de SOD interno em E. coli através de métodos descritos para a síntese do antigénio 5-1-1, Choo et al., Science, 1989, 244, 359-362. Os antigénios recombinantes de HCV foram purificados como descrito em Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 89, 10011-10015. Nos exemplos específicos abaixo detalhados, todos os antigénios foram preparados como proteínas de fusão de SOD. Contudo, podem ser preparadas outras proteínas de fusão adequadas dependendo da disponibilidade de anticorpos apropriados que reconheçam o ligando do agente de fusão. 7 MEFA-6 é um antigénio de múltiplos epitopos e contém epitopos do núcleo, envelope, das regiões NS3, NS4 e NS5 da poliproteína da hepatite C, incluindo determinantes antigénicos equivalentes de estirpes 1, 2 e 3 de HCV. Os diversos segmentos de ADN codificando para os epitopos de HCV foram construídos por amplificação de PCR ou por oligonucleotídeos sintéticos. 0 antigénio MEFA-β inclui múltiplas cópias de epitopos de HCV do núcleo e da região NS5; epitopos de diferentes serotipos da região NS4 5-1-1; uma única cópia de epitopos principais lineares das regiões C-terminais de clOO, regiões El e E2, bem como da região NS3 (c33c) de HCV. A fórmula estrutural geral para a proteína de fusão MEFA-6 é hSOD-EI-E2-c33c-5-l-l (tipo 1)-5-1-1 (tipo 3)-5-1-1 (tipo 2)-C100-NS5(2 cópias)-núcleo(2 cópias). Este antigénio tem um nível de expressão muito elevado em levedura, purifica-se a um elevado nível de homogeneidade, e exibe elevada sensibilidade e elevada selectividade nos imunoensaios abaixo descritos. 0 MEFA-6 foi preparado como descrito no pedido PCT US97/08950 apresentado a 23 de Maio de 1997.

Foi utilizado anti-SOD-DMAE como o marcador detectável universal. 0 anticorpo anti-SOD foi marcado com DMAE por reacção de cadeias laterais de aminoácidos (e. g., cadeia lateral ε de lisina ou tiol de cisteína) com um grupo reactivo ligado covalentemente a DMAE (ver documento WO 95/27702, publicado a 19 de Outubro de 1995, Ciba Corning Diagnostics Corp.). Os tióis de cadeias laterais de aminoácidos podem ser marcados utilizando DMAE-ED-MCC ou NSP-DMAE-PEG-BrAc (Ciba Corning). Os procedimentos de marcação foram geralmente como descrito no documento WO 95/27702 com variações nas condições, conforme necessário para cada antigénio, para proporcionar detecção e antigenicidade óptimas. A sensibilidade foi apresentada como a densidade óptica da amostra de teste dividida pela detecção de corte do ensaio em unidades de densidade óptica (s/co) . Todas as amostras negativas conhecidas exibiram valores s/co inferiores a 1.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Ensaio Manual

Para o ensaio manual é utilizado um Magic Lite Analyzer System II (MLA II). Parâmetros tais como volume, concentração, tempo e temperatura são proporcionados para orientação, mas podem ser ajustados conforme as circunstâncias. Resumidamente,

uma aliquota de 10 pL de amostra de teste foi adicionada a cinco tubos de ensaio separados de 75 x 12 mm para a obtenção de um perfil de anticorpo para HCV. A cada tubo de ensaio foram adicionados, 100 pL de diluente de amostra ou tampão, 100 pL de tampão de fase sólida contendo partículas paramagnéticas (PMP) conjugadas com anticorpos IgG de rato anti-humano (PMP/IgG anti-humano, 30 pg/ensaio), 50 pL de antigénio de HCV/proteínas de fusão de SOD (núcleo (c22-3, 50 ng), NS3 (c33c, 100 ng), NS4 (c-100-3 100 ng) , NS4 (5-1-1 100 ng) , e NS5 (100 ng), e 100 pL de anti-SOD conjugado com DMAE (30 milhões de unidades luminosas relativas, "RLU") em diluente de reagente de ligando (LR), e incubados durante 18 minutos a 37 °C. O tampão diluente de fase sólida/reagente Lite compreendeu Tris a 50 mM, KC1 a 0,5 M, EDTA dissódico a 1 mM, 3,75% de BSA, 0, 003% de Levedura, 0,05 g/L de extracto de E. coli, 0,5% de Tween 20, 2 mg/L de Anfotericina B, 24 mg/L de Sulfato de Gentamicina, 30 pg/Fase Sólida de teste e 45 x 106 de Reagente Lite de teste (anticorpos anti-SOD*DMAE). O 9 tampão diluente original compreendeu Tris a 50 mM, KC1 a 0,5 M, EDTA dissódico a 1 mM, 3,75% de BSA, 0,003% de Levedura, 0,05 g/L de E. coli, 0,5% de Tween 20, 2 mg/L de Anfotericina B, 24 mg/L de Sulfato de Gentamicina, 0,05 g/L de IgGl de Ascites e 0,1 g/L de IgG2A de Ascites (anticorpos bloqueantes). O reagente de lavagem compreendeu PBS/Tween 20. O reagente ácido compreende 0,5% de H2O2/HNO3 a 0,1 N. O reagente alcalino compreende NaOH a < 0,25 N com tensioactivo.

Os tubos da amostra foram colocados sobre um magneto durante o tempo suficiente para sedimentar as partículas PMP. As amostras foram decantadas utilizando um magneto para reter as partículas PMP. As partículas PMP foram lavadas duas vezes com agitação por vórtice em 1 mL de PBS. A solução de lavagem foi PBS, 0,1% de Tween 20, 0,09% de NaN3, e EDTA a 1 mM. As etapas de mistura, incubação, sedimentação e decantação podem ser repetidas pelo menos uma vez. A cada tubo foram adicionados 100 yL de água para ressuspender as partículas PMP. Os tubos foram em seguida colocados num instrumento MLA-II e a emissão luminosa medida durante 2 segundos.

Os resultados, utilizando amostras pagas de dadores de sangue crónicos, são apresentados na Tabela 1.

Exemplo 2: Comparação do Ensaio Automatizado com Outros Ensaios Comerciais O ensaio manual anti-HCV acima descrito foi adaptado para utilização automatizada utilizando um aparelho ACS:Centaur. Foi utilizado o seguinte procedimento. Resumidamente, o sistema ACS:Centaur realiza automaticamente as seguintes etapas: 1) 10 doseia 10 pL de amostra para dentro de uma cuveta; 2) doseia 100 pL de tampão diluente adjuvante, 100 pL de Reagente

Lite/Fase Sólida, 50 pL de reagente de antigénio 2 (e. g., MEFA-6), 50 pL de reagente de antigénio 1 (e. g., c33c) e incuba a mistura durante 18 minutos a 37 °C; 3) separa a fase sólida da mistura e aspira o reagente não ligado; 4) lava a cuveta com reagente de lavagem 1; 5) doseia 300 pL de cada reagente ácido e reagente alcalino, para iniciar a reacção de quimioluminescência; e 6) apresenta os resultados de acordo com a opção seleccionada, como descrito nas instruções de funcionamento do sistema ou no sistema de ajuda ligado à rede. O tampão diluente de fase sólida/reagente Lite compreendeu Tris a 50 mM, KC1 a 0,5 M, EDTA dissódico a 1 mM, 3,75% de BSA, 0,003% de Levedura, 0,05 g/L de extracto de E. coli, 0,5% de Tween 20, 2 mg/L de Anfotericina B, 24 mg/L de Sulfato de

Gentamicina, 30 pg/Fase Sólida de teste e 45 x 106 de Reagente Lite de teste (anticorpos anti-SOD*DMAE) . O tampão diluente original compreendeu Tris a 50 mM, KC1 a 0,5 M, EDTA dissódico a 1 mM, 3,75% de BSA, 0, 003% de Levedura, 0,05 g/L de E. coli, 0,5% de Tween 20, 2 mg/L de Anfotericina B, 24 mg/L de Sulfato de Gentamicina, 0,05 g/L de IgGl de Ascites e 0,1 g/L de IgG2A de Ascites (anticorpos bloqueantes). O reagente de lavagem compreendeu PBS/Tween 20. O reagente ácido compreende 0,5% de H2O2/HNO3 a 0,1 N. O reagente alcalino compreende NaOH a < 0,25 N com tensioactivo.

Os resultados foram comparados com os testes Ortho 3.0, Abbott 3.0, e RIBA® 3.0 utilizando painéis de seroconversão disponíveis comercialmente e estão representados na Tabela II. Os resultados dos testes Ortho, Abbott, e RIBA® são proporcionados pelos vendedores dos painéis de seroconversão: 11 ΒΒΙ (ΒΒΙ) refere-se a Boston Biomedica Incorporated e BCP refere-se a BioClinical Partners. PHV é um prefixo para designar o nome do painel. Os Lotes n° 1 até n° 4 referem-se a múltiplos lotes de reagentes provenientes de dits (compartimento de reagente mais fase sólida). 0 ensaio de acordo com a presente invenção permitiu a detecção de anticorpo, vários sangramentos antes de Ortho 3.0 e Abbott 3.0, como resulta claramente dos resultados. O ensaio RIBA® confirma a invenção de HCV.

Exemplo 3: Sensibilidade do Ensaio Automatizado A sensibilidade do ensaio de acordo com a presente invenção foi comprovada numa população de teste de 510 doentes que deram positivo no ensaio Ortho 3.0. As condições de ensaio foram como acima descrito. Os resultados dos testes estão representados na Tabela III. Na tabela, "IVDA" refere-se a consumo de drogas IV, "STD" refere-se a doenças sexualmente transmissíveis, "N" refere-se ao número de amostras em cada grupo testado, e "RR" refere-se a Repetidamente Reactivo. As amostras que são inicialmente reactivas (positivas) no ensaio são re-testadas; se a amostra for reactiva (positiva) após repetição dos testes é considerada "Repetidamente Reactiva".

Como ressalta da Tabela III, todas as amostras que testaram positivo para HCV no ensaio RIBA® 3.0 deram Repetidamente Reactivo utilizando o ensaio de acordo com a presente invenção. 12

Exemplo 4: Ensaio para Múltiplos Virus numa Única Amostra

As condições de ensaio são como descrito no Exemplo 3 acima, com a excepção que, para cada antigénio, são utilizados um ligando diferente e um reagente luminoso diferente. 0 MEFA-6-SOD é utilizado e detectado com anti-SOD-DMAE; a c33c-ubiquitina é utilizada e detectada com anti-ubiquitina-LEAE (éster de acridinio de emissão de longo comprimento de onda).

Ensaio Multi-Antigénico de HCV: formato anti-SOD*DMAE no MLA II

Antigénios recombinantes de Fusão de SOD de HCV 50 ng/ ensaio 100 ng/ ensaio 100 ng/ ensaio 100 ng/ ensaio 100 ng/ ensaio Núcleo (c22-3) NS-3 (c33c) NS-4 (c-100-3) NS-4 (5-1-1) NS-5 s s s s s Amostras LL57385 111604 nd 2156 1709 nd pagas de 96727 54993 385524 6622 2880 74921 dadores HCV FF2594 32848 264803 59829 162193 2880 crónicos FF2589 509909 nd 7330 20174 nd FF2587 20913 nd 5159 2094 nd negativos rl 8100 1001 2079 1032 2526 aleatórios r2 7839 1232 1958 955 2649 r3 5606 1032 1833 1201 3018 r4 7099 1170 1432 1155 2402 7161 1109 1826 1086 2649 s/co s/co s/co s/co s/co LL57385 5,2 nd 0,4 0,5 nd 96727 2,6 115,9 1,2 0,9 9,4 FF2594 1,5 79,6 10, 9 49,8 0,4 FF2589 23,7 nd 1,3 6,2 nd FF2587 1,0 nd 0,9 0,6 nd exclusão igual ou maior que 1,0 é positivo

TABELA I 13 Ω O Crt ωωΖΖΖθΟΟ ZZ — — - oufi-α· O Q Q V) z ω 5 s 2 O O O Q Udl (O 7 Z Z Z - & x i 3

Ensaio de Sensibilidade de Seroconversão de ACS:Centaur (Detecção Precoce) 90ipui ε oN aio! 99ipUJ I oM 3101 λ • ^ 0 I I I I t I I I </”> co Z CM m CO u o o 0 ri q 1 u < o n S°.§ t 1 ' • 1 1 1 1 I + + + + + + Tf t ·« ι -1- + + + + + 1 | + 1 1 + ΓΊ Tf Tf + ” + ϊ <Ν t | 1 • 47 + «M <N r> ON <N SC Tf O d O d Ò o O ΓΛ Λ d O d *ri Λ o o CM NO o m VO Ον o «n O O Ο Ο Ο Ον d o d O T*-M rí *<J· Λ d O d -* »Λ Λ d d Ο Ο Ο Ό n « co T d d 90ipui fr oN 3}0Ί 99ipUJ z oN s'101

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Lisboa, 15 de Março de 2007 15

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para detecção/quantificação de anticorpos para um antigénio alvo numa amostra de teste proveniente de um indivíduo, o referido método compreendendo: a) incubação simultânea da referida amostra de teste com i) anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii) uma proteína de fusão compreendendo o antigénio alvo conjugado com um ligando, e iii) um anticorpo anti-ligando conjugado com um marcador detectável para efectuar uma reacção entre iv) anticorpos anti-antigénio alvo na amostra de teste proveniente do indivíduo, i) os anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii) a proteína de fusão compreendendo o antigénio alvo conjugado com um ligando, e iii) o anticorpo anti-ligando conjugado com um marcador detectável; e b) detecção do marcador detectável por um meio apropriado.
2. Método da reivindicação 1, em que o referido antigénio alvo é, pelo menos, um epitopo do vírus da Hepatite C.
3. Método da reivindicação 2, em que o referido antigénio alvo contém, pelo menos, dois epitopos do vírus da Hepatite C.
4. Método da reivindicação 2, em que o referido antigénio alvo é um antigénio NS3 do vírus da Hepatite C. 1
5. Método da reivindicação 3 ou 4, em que o referido ligando é a superóxido dismutase.
6. Método da reivindicação 3 ou 4, em que o referido marcador detectável é um reagente quimioluminescente.
7. Método da reivindicação 6, em que o referido reagente quimioluminescente é um éster de acridinio.
8. Método para detecção/quantificação de anticorpos para dois ou mais antigénios alvo numa amostra de teste proveniente de um indivíduo, em que os referidos antigénios alvo provêm da mesma fonte, o referido método compreendendo a) incubação simultânea da referida amostra de teste com i) anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii(a) uma proteína de fusão compreendendo um primeiro antigénio alvo conjugado com um ligando, ii (b) pelo menos, uma segunda proteína de fusão compreendendo um segundo antigénio alvo conjugado com o referido ligando, e iii) anticorpos anti-ligando conjugados com um marcador detectável para efectuar uma reacção entre iv) anticorpos anti-primeiro antigénio alvo na amostra de teste proveniente do indivíduo, i) os referidos anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii (a) a proteína de fusão compreendendo o primeiro antigénio alvo conjugado com um ligando, e iii) o anticorpo anti-ligando conjugado com um marcador detectável e entre v) anticorpos anti-segundo antigénio alvo na amostra de teste proveniente do indivíduo, i) os referidos anticorpos 2 anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii(b) a, pelo menos uma, segunda proteína de fusão compreendendo o segundo antigénio alvo conjugado com o referido ligando, e iii(a) o anticorpo anti- ligando conjugado com um marcador detectável; e b) detecção do marcador detectável por um meio apropriado.
9. Método da reivindicação 8, em que a referida fonte é o vírus da Hepatite C.
10. Método da reivindicação 8, em que o referido primeiro antigénio alvo é um antigénio NS3 do vírus da Hepatite C.
11. Método da reivindicação 8, em que o referido pelo menos um segundo antigénio alvo é um antigénio do núcleo do vírus da Hepatite C.
12. Método da reivindicação 10 ou 11, em que o referido ligando é a superóxido dismutase.
13. Método da reivindicação 10 ou 11, em que o referido marcador detectável é um reagente quimioluminescente.
14. Método da reivindicação 13, em que o referido reagente quimioluminescente é um éster de acridínio.
15. Método da reivindicação 9, em que os referidos primeiro e segundo antigénios alvo conjugados com os referidos primeiro e segundo ligandos são proteínas de fusão. 3
16. Método para detecção/quantificação de anticorpos para dois ou mais antigénios alvo numa amostra de teste proveniente de um indivíduo, em que os referidos antigénios alvo provêm de fontes diferentes, o referido método compreendendo a) incubação simultânea da referida amostra de teste com i) anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii(a) uma proteína de fusão compreendendo um primeiro antigénio alvo conjugado com um primeiro ligando, ii (b) pelo menos uma segunda proteína de fusão compreendendo um segundo antigénio alvo conjugado com um segundo ligando, iii(a) anticorpos anti-primeiro ligando conjugados com um primeiro reagente luminescente, e iii (b) pelo menos um anticorpo anti-segundo ligando conjugado com um segundo reagente luminescente para efectuar uma reacção entre iv) anticorpos anti-primeiro antigénio alvo na amostra de teste proveniente do indivíduo, i) os referidos anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii (a) a proteína de fusão compreendendo o primeiro antigénio alvo conjugado com um primeiro ligando, e iii(a) o anticorpo anti-primeiro ligando conjugado com um primeiro reagente luminescente e entre v) anticorpos anti-segundo antigénio alvo na amostra de teste proveniente do indivíduo, i) os referidos anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, ii(b) a, pelo menos uma, segunda proteína de fusão compreendendo o segundo antigénio alvo conjugado com um segundo ligando, e iii (b) o anticorpo anti-segundo ligando conjugado com um segundo reagente luminescente, em que os referidos primeiro e pelo 4 menos, o referido segundo reagentes luminescentes emitem luz de comprimentos de onda detectavelmente diferentes; e b) detecção do sinal de emissão de cada um dos referidos reagentes luminescentes.
17. Método da reivindicação 16, em que as referidas diferentes fontes são subtipos do mesmo vírus.
18. Método da reivindicação 16, em que as referidas diferentes fontes são diferentes vírus.
19. Método da reivindicação 16, em que o referido primeiro ligando é a superóxido dismutase.
20. Método da reivindicação 16, em que o referido segundo ligando é a ubiquitina.
21. Método da reivindicação 16, em que o referido reagente quimioluminescente é um éster de acridínio.
22. Método da reivindicação 16, em que os referidos primeiro e segundo antigénios alvo conjugados com os referidos primeiro e segundo ligandos são proteínas de fusão.
23. Kit de teste para a detecção de anticorpos dirigidos para um ou mais antigénios alvo numa amostra de teste numa única etapa de incubação, em que os referidos antigénios alvo provêm da mesma fonte, o referido kit de teste compreendendo anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, uma proteína de fusão compreendendo pelo 5 menos um primeiro antigénio alvo conjugado com um primeiro ligando, um anticorpo anti-primeiro ligando conjugado com um marcador detectável, e um meio para a detecção do referido marcador detectável.
24. Kit de teste da reivindicação 23, em que o referido ligando é a superóxido dismutase.
25. Kit de teste da reivindicação 23, em que o referido marcador detectável é um reagente quimioluminescente.
26. Kit de teste da reivindicação 23, em que o referido marcador detectável é um éster de acridínio.
27. Kit de teste da reivindicação 23, em que os referidos anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida e o marcador detectável são armazenados no mesmo compartimento.
28. Kit de teste da reivindicação 23, compreendendo ainda um segundo antigénio alvo conjugado com o referido primeiro ligando.
29. Kit de teste para a detecção de anticorpos dirigidos para dois ou mais antigénios alvo numa amostra de teste numa única etapa de incubação, em que os referidos antigénios alvo provêm de fontes diferentes, o referido kit de teste compreendendo anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida, uma proteína de fusão compreendendo um primeiro antigénio alvo conjugado com um primeiro ligando, pelo menos uma segunda proteína de fusão compreendendo um segundo antigénio alvo conjugado com um segundo ligando, um 6 anticorpo anti-primeiro ligando conjugado com um primeiro reagente luminescente, pelo menos um anticorpo anti-segundo ligando conjugado com um segundo reagente luminescente, em que os referidos primeiro e pelo menos o referido segundo reagentes luminescentes emitem sinais de emissão luminosa de comprimentos de onda detectavelmente diferentes, e um meio para a detecção do sinal de emissão de cada um dos referidos reagentes luminescentes.
30. Kit de teste da reivindicação 29, em que o referido marcador detectável é um reagente quimioluminescente.
31. Kit de teste da reivindicação 29, em que o referido marcador detectável é um éster de acridínio.
32. Kit de teste da reivindicação 29, em que o referido primeiro ligando é a superóxido dismutase.
33. Kit de teste da reivindicação 29, em que os anticorpos anti-imunoglobulinas do indivíduo em fase sólida e o marcador detectável são armazenados no mesmo compartimento. Lisboa, 15 de Março de 2007 7