ES2281934T3 - Procedimiento para la deteccion de anticuerpos en una muestra. - Google Patents

Procedimiento para la deteccion de anticuerpos en una muestra. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra un antígeno diana en una muestra de ensayo procedente de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento: a) incubar simultáneamente dicha muestra de ensayo con i) anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii) una proteína de fusión que comprende el antígeno diana acoplado a un ligando, y iii) un anticuerpo antiligando acoplado a un marcador detectable para llevar a cabo una reacción entre iv) anticuerpos antiantígeno diana en la muestra de ensayo procedente del sujeto, i) los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii) la proteína de fusión que comprende el antígeno diana acoplado a un ligando, y iii) el anticuerpo antiligando acoplado a un marcador detectable; y b) detectar el marcador detectable por unos medios adecuados.

Description

Procedimiento para la detección de anticuerpos en una muestra.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la detección/cuantificación de anticuerpos contra antígenos en una muestra.
Antecedentes de la invención
Los ensayos de captura de anticuerpos se utilizan generalmente para la detección de anticuerpos dirigidos a antígenos particulares presentes en una muestra. La detección de estos anticuerpos no sólo proporciona información con respecto a la exposición a antígenos particulares, sino que puede proporcionarla con respecto al progreso de la enfermedad. Sin embargo, los ensayos de captura de anticuerpos que utilizan antígenos en fase sólida no permiten la medición de tituladores reales de anticuerpos en una muestra. Se han descrito ensayos para la detección y/o cuantificación de, por lo menos, dos sustancias diferentes en una muestra de ensayo. El documento US 5.395.752 (la patente '752) describe compuestos quimioluminiscentes como marcadores detectables para su utilización en la detección de, por lo menos, dos sustancias en una muestra de ensayo. Se utilizan compuestos quimioluminiscentes que emiten luz con longitudes de onda diferentes, con un solapamiento mínimo. Sin embargo, los marcadores detectables, es decir, los compuestos quimioluminiscentes, son específicos para la sustancia particular que se debe detectar/cuantificar en la muestra de ensayo.
El documento WO-A-97/44496, relevante bajo el Artículo 54(3) EPC, da a conocer un ensayo de captura de anticuerpos en el que un antígeno de fusión multicopia está directamente enlazado a biotina como marcador detectable, e indirectamente enlazado a DMAE a través de un enlace biotina-estreptavidina-DMAE. El documento WO-A-94/24560 se refiere a un sistema de detección de anticuerpos que utiliza un anticuerpo capaz de enlazarse a un antígeno y un segundo anticuerpo capaz de enlazarse al primer anticuerpo. Sin embargo, este sistema no comprende un conjugado antígeno-ligando. El documento WO-A-95/27702 describe un inmunoensayo de alérgeno que comprende un anticuerpo antiIgE unido a una fase sólida y un alérgeno unido al marcador de detección DMAE. Sin embargo, este sistema no comprende un anticuerpo antiligando marcado. En el documento FR-A-2 556 840 se da a conocer un ensayo similar que comprende tres etapas de incubación y lavado.
Existe la necesidad de un procedimiento para analizar anticuerpos en una muestra de ensayo que facilite la medición de tituladores reales, que pueda integrar la detección de diferentes especies de anticuerpos dirigidos contra la misma fuente en una muestra de ensayo, así como que pueda integrar la detección de diferentes anticuerpos contra diferentes fuentes en una muestra de ensayo.
Sumario de la invención
En un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra un antígeno diana particular en una muestra en una única etapa de incubación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra por lo menos dos antígenos procedentes de la misma fuente en una única muestra de ensayo y en una única etapa de incubación, utilizando un único marcador detectable.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra, por lo menos, dos antígenos procedentes de la misma fuente en una única muestra de ensayo y en una única etapa de incubación, utilizando, por lo menos, dos reactivos luminiscentes que emiten luz con diferentes longitudes de onda como marcadores detectables.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de antígenos procedentes de más de una fuente en una única muestra de ensayo, en una única etapa de incubación, utilizando reactivos luminiscentes que emiten luz con diferentes longitudes de onda como marcadores detectables. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de un perfil de anticuerpos y un titulador real de anticuerpos para una fuente particular en muestras de ensayo procedentes de un único sujeto, utilizando un único marcador
detectable.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a kits de ensayo para llevar a cabo los procedimientos según la invención. En los kits según la invención, la fase sólida y el marcador detectable pueden almacenarse en el mismo compartimiento.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa, a título de ejemplo, un formato de ensayo según la invención.
Descripción detallada
A menos que se indique lo contrario, la puesta en práctica de la presente invención utiliza procedimientos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante, dentro del estado de la técnica. Estas técnicas están descritas con mayor detalle en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I y II (D. Glover, ed.); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); y Fundamental Virology, 2ª edición, Vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.).
Se han descrito ensayos para la detección de anticuerpos contra un único antígeno diana, múltiples antígenos diana procedentes de la misma fuente, o múltiples antígenos diana procedentes de fuentes diferentes en una única muestra de ensayo, los cuales pueden llevarse a cabo en una única etapa de incubación (es decir, simultáneamente). Los ensayos pueden llevarse a cabo en un sistema automatizado de capacidad elevada, permitiendo de este modo la renormalización de los datos. Los ensayos según la invención exhiben una sensibilidad (100%) y una especificidad (99,5 - 99,7% en muestras de donantes de sangre) elevadas. Se utilizan fases sólidas universales y/o marcadores detectables universales.
En el presente documento se utilizan las siguientes definiciones.
El término "antígeno diana", tal como se utiliza en el presente documento, comprende antígenos de un epítope y de múltiples epítopes, así como haptenos.
El término "fuente", tal como se utiliza en el presente documento haciendo referencia a antígenos diana, incluye, sin limitación alguna, virus, bacterias, tumores, hongos, etc. Las diferentes fuentes pueden ser, por ejemplo, diferentes subtipos de un virus, diferentes virus, o bien un virus y una bacteria.
El término "ligando", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una pareja de enlace. En las formas de realización preferidas, los ligandos son la superóxido dismutasa ("SOD") y la ubiquitina.
El término "marcador detectable", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, aunque sin limitarse a los mismos, un cromóforo, una enzima, un compuesto reactivo enzimático cuyo producto de descomposición sea detectable, rodamina, biotina, estreptavidina, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente y derivados y/o combinaciones de estos marcadores. En los ejemplos proporcionados, se utilizó el compuesto quimioluminiscente dimetiléster de acridinio (DMAE, Ciba Corning Diagnostics Corp.). La marcación con un marcador se lleva a cabo bajo condiciones que permiten obtener una detección y una unión óptimas del anticuerpo.
Los medios para detectar los marcadores detectables dependen del marcador utilizado. Los medios y las condiciones apropiados pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia. Tal como se describe en los ejemplos siguientes, cuando el DMAE es el marcador detectable en un ensayo, el conjugado antiligando-DMAE es el indicador, siendo detectable el DMAE por emisión de luz cuando reacciona con NaOH/H_{2}O_{2}. En los ensayos que incluyen dos o más reactivos luminiscentes, deben utilizarse por lo menos dos tubos fotomultiplicadores a efectos de obtener las mediciones.
La marcación de antígenos individuales con marcadores detectables puede resultar muy trabajosa y, además, la marcación resultante puede no ser estable. La presente invención da a conocer un marcador detectable universal. En la presente invención, los antígenos se acoplan a un ligando, por ejemplo, una proteína de fusión antígeno/ligando. Esta proteína de fusión está apareada con un marcador detectable que comprende un anticuerpo dirigido contra el ligando. El anticuerpo dirigido contra el ligando está acoplado al marcador detectable. Pueden fusionarse muchos antígenos diferentes en el mismo ligando. De este modo, pueden detectarse numerosos antígenos con un marcador único y universal.
El término "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la fuente de la muestra de ensayo, e incluye, sin limitación alguna, humanos y otros vertebrados. En una forma de realización preferida, el sujeto es humano. El término "muestra de ensayo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier fluido biológico procedente de un sujeto en el que pueden estar presentes anticuerpos contra los antígenos diana, incluyendo, aunque sin limitarse a los mismos, suero y plasma.
El término "anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto" se refiere a anticuerpos dirigidos contra las inmunoglobulinas del sujeto en general. En una forma de realización preferida, los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto son antiinmunoglobulina humana (Ig) de rata. En una forma de realización más preferida, los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto son antiIgG humana de rata. Los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto se acoplan a la fase sólida, proporcionándose de este modo una fase sólida universal para la detección/cuantificación de anticuerpos en una muestra de ensayo.
La fase sólida puede estar constituida por micropartículas paramagnéticas ("PMP"), partículas de látex magnéticas ("MLP"), o placas de microtitulación. Preferentemente, las partículas tienen un diámetro inferior a aproximadamente 10 \mum.
Los kits de ensayo según la invención asimismo incluyen calibradores o controles. Tal como se ha indicado anteriormente, en las formas de realización preferidas los antígenos diana se acoplan a los ligandos en forma de proteínas de fusión. Por ejemplo, los antígenos pueden expresarse como antígenos internos dentro de la levadura S. cerevisiae como fusiones C terminales con SOD humano utilizando procedimientos descritos anteriormente para la generación del antígeno c100-3 (NS4, 363 aa) del virus de la hepatitis C, Kuo y otros, Science, 1989, 244, 362-364 y Cousens y otros, Gene, 1987, 61, 265-275. El antígeno c33c (NS3, 363 aminoácidos) también se ha expresado como un polipéptido de fusión interno de SOD en E. coli mediante procedimientos descritos para la síntesis del antígeno 5-1-1, Choo y otros, Science, 1989, 244, 359-362. Los antígenos HCV recombinantes se purificaron tal como se describe en Chien y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 89, 10011-10015. En los ejemplos específicos detallados a continuación, todos los antígenos se prepararon en forma de proteínas de fusión de SOD. Sin embargo, pueden prepararse otras proteínas de fusión adecuadas en función de la disponibilidad de anticuerpos apropiados que reconozcan el ligando de la pareja de fusión.
El MEFA-6 es un antígeno de múltiples epítopes y contiene epítopes del núcleo, de la envoltura, y de las regiones NS3, NS4 y NS5 de la poliproteína de hepatitis C, incluyendo determinantes antigénicos equivalentes procedentes de cepas 1, 2 y 3 del HCV. Los diversos segmentos de ADN que codifican los epítopes del HCV se construyeron mediante amplificación PCR o mediante oligonucleótidos sintéticos. El antígeno MEFA-6 incluye múltiples copias de epítopes HCV del núcleo y de la región NS5; epítopes de diferentes serotipos de la región NS4 5-1-1; una única copia de epítopes lineales principales de las regiones C terminales de c100, las regiones E1 y E2, así como la región NS3 (c33c) del HCV. La fórmula estructural general para la proteína de fusión MEFA-6 es hSOD-E1-E2-c33c-5-1-1(tipo 1)-5-1-1(tipo 3)-5-1-1(tipo 2)-c100-NS5(2 copias)-núcleo(2 copias). Este antígeno tiene un nivel de expresión muy alto en levadura, purifica hasta un grado elevado de homogeneidad y exhibe una sensibilidad elevada y una selectividad elevada en los inmunoensayos descritos a continuación. El MEFA-6 se preparó tal como se describe en la solicitud PCT US97/08950 presentada el 23 de mayo de 1997.
Se utilizó antiSOD-DMAE como marcador detectable universal. El anticuerpo antiSOD se marcó con DMAE por reacción de cadenas laterales de aminoácido (por ejemplo, la cadena lateral \varepsilon de lisina o cisteína tiol) con un resto reactivo unido mediante enlace covalente a DMAE (véase WO 95/27702, publicada el 19 de octubre de 1995, Ciba Corning Diagnostics Corp.). Los tioles de cadenas laterales de aminoácidos pueden marcarse utilizando DMAE-ED-MCC o NSP-DMAE-PEG-BrAc (Ciba Corning). En general, los procedimientos de marcación fueron tal como se describen en el documento WO 95/27702, con variaciones en las condiciones tal como requiere cada antígeno para proporcionar detección y antigenicidad.
La sensibilidad se registró como la densidad óptica de la muestra de ensayo dividida por el límite de detección del ensayo en unidades de densidad óptica (s/co). Todas las muestras conocidamente negativas dieron valores de s/co inferiores a 1.
Ejemplos
Ejemplo 1
Ensayo manual
Para el ensayo manual se utiliza un Magic Lite Analyzer System II (MLA II). Los parámetros tales como volumen, concentración, tiempo y temperatura se indican como guía, aunque pueden ajustarse correspondientemente. En resumen, se añadió una alícuota de 10 \mul de muestra de ensayo a cinco tubos de ensayo de 75 x 12 mm separados con el fin de obtener un perfil de anticuerpos para HCV. A cada tubo, se le añadieron 100 \mul de disolvente o amortiguador de muestra, 100 \mul de amortiguador de fase sólida que contenía partículas paramagnéticas (PMP) conjugadas con anticuerpos antiIgG humana de rata (PMP/antiIgG humana, 30 \mug/ensayo), 50 \mul de proteínas de fusión antígeno HCV/SOD (núcleo (c22-3, 50 ng), NS3 (c33c, 100 ng), NS4 (c-100-3 100 ng), NS4 (5-1-1 100 ng), y NS5 (100 ng), y 100 \mul antiSOD conjugado con DMAE (30 millones de unidades relativas de luz, "RLU") en disolvente de reactivo de ligando (LR), y se incubaron durante 18 minutos a 37ºC. El amortiguador disolvente de fase sólida/reactivo Lite comprendía Tris 50 mM, KCl 0,5 M, EDTA disódico 1 mM, 3,75% de BSA, 0,003% de levadura, 0,05 g/l de extracto de E. coli, 0,5% de Tween-20, 2 mg/l de anfotericina B, 24 mg/l de sulfato de gentamicina, 30 \mug/ensayo de fase sólida y 45 x 10^{6} de reactivo Lite de ensayo (anticuerpos antiSOD*DMAE). El amortiguador disolvente auxiliar comprendía Tris 50 mM, KCl 0,5 M, EDTA disódico 1 mM, 3,75% de BSA, 0,003% de levadura, 0,05 g/l de E. coli, 0,5% de Tween-20, 2 mg/l de anfotericina B, 24 mg/l de sulfato de gentamicina, 0,05 g/l de Ascites IgG1 y 0,1 g/l de Ascites IgG2A (anticuerpos de bloqueo). El reactivo de lavado comprendía PBS/Tween-20. El reactivo ácido comprende 0,5% de H_{2}O_{2}/HNO_{3} 0,1 N. El reactivo básico comprende < NaOH 0,25 N con tensioactivo.
Los tubos de muestra se colocaron sobre un imán durante un tiempo suficiente para que sedimentaran las partículas PMP. Las muestras se decantaron utilizando un imán con el fin de retener las partículas PMP. Las partículas PMP se lavaron dos veces con agitación vorticial en 1 ml de PBS. La solución de lavado consistía en PBS, 0,1% de Tween-20, 0,09% NaN_{3} y EDTA 1 mM. Las etapas de mezclado, incubación, sedimentación y decantación pueden repetirse, por lo menos, una vez. A cada tubo se le añadieron 100 \mul de agua a efectos de resuspender las partículas PMP. A continuación, se colocaron los tubos en un instrumento MLA-II y se midió la emisión de luz durante 2 segundos.
Los resultados utilizando muestras de donantes crónicos remunerados se indican en la tabla 1.
Ejemplo 2
Comparación del ensayo automatizado con otros ensayos comerciales
El ensayo antiHCV manual descrito anteriormente se adaptó para uso automatizado utilizando un dispositivo ACS:Centaur. Se utilizó el siguiente procedimiento. En resumen, el sistema ACS:Centaur lleva a cabo automáticamente las etapas siguientes: 1) suministra 10 \mul de muestra a una cubeta; 2) suministra 100 \mul de amortiguador disolvente auxiliar, 100 \mul de reactivo Lite/fase sólida, 50 \mul de reactivo de antígeno 2 (por ejemplo, MEFA-6), 50 \mul de reactivo de antígeno 1 (por ejemplo, c33c), e incuba la mezcla durante 18 minutos a 37ºC; 3) separa la fase sólida de la mezcla y aspira el reactivo no enlazado; 4) lava la cubeta con reactivo de lavado 1; 5) suministra a cada uno 300 \mul de reactivo ácido y reactivo básico con el fin de iniciar la reacción quimioluminiscente; y 6) registra los resultados en función de la opción seleccionada, tal como se describe en las instrucciones de operación del sistema o en el sistema de ayuda en línea.
El amortiguador disolvente de fase sólida/reactivo Lite comprendía Tris 50 mM, KCl 0,5 M, EDTA disódico 1 mM, 3,75% de BSA, 0,003% de levadura, 0,05 g/l de extracto de E. coli, 0,5% de Tween-20, 2 mg/l de anfotericina B, 24 mg/l de sulfato de gentamicina, 30 \mug/ensayo de fase sólida y 45 x 10^{6} de reactivo Lite de ensayo (anticuerpos antiSOD*DMAE). El amortiguador disolvente auxiliar comprendía Tris 50 mM, KCl 0,5 M, EDTA disódico 1 mM, 3,75% de BSA, 0,003% de levadura, 0,05 g/l de E. coli, 0,5% de Tween-20, 2 mg/l de anfotericina B, 24 mg/l de sulfato de gentamicina, 0,05 g/l de Ascites IgG1 y 0,1 g/l de Ascites IgG2A (anticuerpos de bloqueo). El reactivo de lavado comprendía PBS/Tween-20. El reactivo ácido comprende 0,5% de H_{2}O_{2}/HNO_{3} 0,1 N. El reactivo básico comprende < NaOH 0,25 N con tensioactivo.
Se compararon los resultados con los ensayos Ortho 3.0, Abbott 3.0, y RIBA® 3.0 utilizando paneles de seroconversión comercialmente disponibles, y se indican en la tabla II. Los resultados para los ensayos Ortho 3.0, Abbott 3.0, y RIBA® 3.0 fueron facilitados por los proveedores de los paneles de seroconversión: BBI (BBI) se refiere a Boston Biomedica Incorporated y BCP se refiere a Bio-Clinical Partners. PHV es un prefijo que designa el nombre del panel. Los lotes \alm{1}1 a \alm{1}4 se refieren a lotes múltiples de reactivos a partir de dits (compartimiento de reactivo más fase sólida).
Tal como se desprende de los resultados, el ensayo según la presente invención permitió la detección de anticuerpos con diversos sangrados de antelación con respecto a Ortho 3.0 y Abbott 3.0. El ensayo RIBA® confirma la invención de HCV.
Ejemplo 3
Sensibilidad del ensayo automatizado
La sensibilidad del ensayo según la presente invención se determinó en una población de ensayo de 510 pacientes que dieron positivo en el ensayo Ortho 3.0. Las condiciones de ensayo fueron tal como se han descrito anteriormente. Los resultados del ensayo se indican en la tabla III. En la tabla, "IVDA" se refiere a toxicomanía de drogas intravenosas, "STD" se refiere a enfermedad de transmisión sexual, "N" se refiere al número de muestras en cada grupo analizado, y "RR" se refiere a "repetir reactivo".
Tal como se desprende de la tabla III, todas las muestras que dieron positivo para HCV en el ensayo RIBA® 3.0 dieron "repetir reactivo" utilizando el ensayo según la presente invención.
Ejemplo 4
Ensayo para múltiples virus en una única muestra
Las condiciones de ensayo son tal como se han descrito en el ejemplo 3 anterior, con la excepción de que se utilizan un ligando diferente y un reactivo luminiscente diferente para cada antígeno. Se utiliza MEFA-6 y se detecta con antiSOD-DMAE; se utiliza c33c-ubiquitina y se detecta con antiubiquitina-LEAE (éster de acridinio emisor de longitud de onda larga).
TABLA I
1
2
TABLA III Sensibilidad del ensayo ACS:Centaur HCV 4.0 utilizando poblaciones (n=510) que dan positivo con Ortho HCV 3.0
3

Claims (33)

1. Procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra un antígeno diana en una muestra de ensayo procedente de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento:
a) incubar simultáneamente dicha muestra de ensayo con i) anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii) una proteína de fusión que comprende el antígeno diana acoplado a un ligando, y iii) un anticuerpo antiligando acoplado a un marcador detectable para llevar a cabo una reacción entre iv) anticuerpos antiantígeno diana en la muestra de ensayo procedente del sujeto, i) los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii) la proteína de fusión que comprende el antígeno diana acoplado a un ligando, y iii) el anticuerpo antiligando acoplado a un marcador detectable; y
b) detectar el marcador detectable por unos medios adecuados.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno diana es por lo menos un epítope del virus de la hepatitis C.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho antígeno diana contiene por lo menos dos epítopes del virus de la hepatitis C.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho antígeno diana es un antígeno NS3 del virus de la hepatitis C.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho ligando es superóxido dismutasa.
6. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho marcador detectable es un reactivo quimioluminiscente.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho reactivo quimioluminiscente es un éster de acri-
dinio.
8. Procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra dos o más antígenos diana en una muestra de ensayo procedente de un sujeto, en el que dichos antígenos diana proceden de la misma fuente, comprendiendo dicho procedimiento:
a) incubar simultáneamente dicha muestra de ensayo con i) anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii(a) una proteína de fusión que comprende un primer antígeno diana acoplado a un ligando, ii(b) por lo menos una segunda proteína de fusión que comprende un segundo antígeno diana acoplado a dicho ligando, y iii) anticuerpos antiligando acoplados a un marcador detectable para llevar a cabo una reacción entre iv) anticuerpos antiprimer antígeno diana en la muestra de ensayo procedente del sujeto, i) dichos anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii(a) la proteína de fusión que comprende el primer antígeno diana acoplado a un ligando, y iii) el anticuerpo antiligando acoplado a un marcador detectable, y entre v) anticuerpos antisegundo antígeno diana en la muestra de ensayo procedente del sujeto, i) dichos anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii(b) dicha por lo menos segunda proteína de fusión que comprende el segundo antígeno diana acoplado a dicho ligando, y iii(a) el anticuerpo antiligando acoplado a un marcador detectable; y
b) detectar el marcador detectable por unos medios adecuados.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha fuente es el virus de la hepatitis C.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho primer antígeno diana es un antígeno NS3 del virus de la hepatitis C.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho por lo menos un segundo antígeno diana es un antígeno nuclear del virus de la hepatitis C.
12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho ligando es la superóxido dismutasa.
13. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho marcador detectable es un reactivo quimioluminiscente.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho reactivo quimioluminiscente es un éster de acridinio.
15. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dichos primer y segundo antígenos diana acoplados a dichos primer y segundo ligandos son proteínas de fusión.
\newpage
16. Procedimiento para la detección/cuantificación de anticuerpos contra dos o más antígenos diana en una muestra de ensayo procedente de un sujeto, en el que dichos antígenos diana proceden de fuentes diferentes, comprendiendo dicho procedimiento:
a) incubar simultáneamente dicha muestra de ensayo con i) anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii(a) una proteína de fusión que comprende un primer antígeno diana acoplado a un primer ligando, ii(b) por lo menos una segunda proteína de fusión que comprende un segundo antígeno diana acoplado a un segundo ligando, iii(a) anticuerpos antiprimer ligando acoplados a un primer reactivo luminiscente, y iii(b) por lo menos, un anticuerpo antisegundo ligando acoplado a un segundo reactivo luminiscente para llevar a cabo una reacción entre iv) anticuerpos antiprimer antígeno diana en la muestra de ensayo procedente del sujeto, i) dichos anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii(a) la proteína de fusión que comprende el primer antígeno diana acoplado a un primer ligando, y iii(a) el anticuerpo antiprimer ligando acoplado a un primer reactivo luminiscente, y entre v) anticuerpos antisegundo antígeno diana en la muestra de ensayo procedente del sujeto, i) dichos anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, ii(b) dicha por lo menos segunda proteína de fusión que comprende el segundo antígeno diana acoplado a un segundo ligando, y iii(b) el anticuerpo antisegundo ligando acoplado a un segundo reactivo luminiscente, en el que emitiendo dicho primer y por lo menos dicho segundo reactivos luminiscentes emiten luz con longitudes de onda detectablemente diferentes; y
b) detectar la señal de emisión de cada uno de dichos reactivos luminiscentes.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichas fuentes diferentes son subtipos del mismo
virus.
18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichas fuentes diferentes son virus diferentes.
19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho primer ligando es la superóxido dismutasa.
20. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho segundo ligando es la ubiquitina.
21. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho reactivo quimioluminiscente es un éster de acri-
dinio.
22. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichos primer y segundo antígenos diana, acoplados a dichos primer y segundo ligandos, son proteínas de fusión.
23. Kit de ensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra uno o más antígenos diana en una muestra de ensayo en una única etapa de incubación, en el que dichos antígenos diana proceden de la misma fuente, comprendiendo dicho kit de ensayo anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, una proteína de fusión que comprende por lo menos un primer antígeno diana acoplado a un primer ligando, un anticuerpo antiprimer ligando acoplado a un marcador detectable, y unos medios para la detección de dicho marcador detectable.
24. Kit de ensayo según la reivindicación 23, en el que dicho ligando es la superóxido dismutasa.
25. Kit de ensayo según la reivindicación 23, en el que dicho marcador detectable es un reactivo quimioluminiscente.
26. Kit de ensayo según la reivindicación 23, en el que dicho marcador detectable es un éster de acridinio.
27. Kit de ensayo según la reivindicación 23, en el que los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida y el marcador detectable se almacenan en el mismo compartimiento.
28. Kit de ensayo según la reivindicación 23, que comprende además un segundo antígeno diana acoplado a dicho primer ligando.
29. Kit de ensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra dos o más antígenos diana en una muestra de ensayo en una única etapa de incubación, en el que dichos antígenos diana proceden de fuentes diferentes, comprendiendo dicho kit de ensayo anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida, una proteína de fusión que comprende un primer antígeno diana acoplado a un primer ligando, por lo menos una segunda proteína de fusión que comprende un segundo antígeno diana acoplado a un segundo ligando, un anticuerpo antiprimer ligando acoplado a un primer reactivo luminiscente, por lo menos un anticuerpo antisegundo ligando acoplado a un segundo reactivo luminiscente, en el que dicho primer y por lo menos dicho segundo reactivos luminiscentes emiten señales de emisión de luz con longitudes de onda detectablemente diferentes, y unos medios para la detección de la señal de emisión de cada uno de dichos reactivos luminiscentes.
30. Kit de ensayo según la reivindicación 29, en el que dicho marcador detectable es un reactivo quimioluminiscente.
31. Kit de ensayo según la reivindicación 29, en el que dicho marcador detectable es un éster de acridinio.
32. Kit de ensayo según la reivindicación 29, en el que dicho primer ligando es la superóxido dismutasa.
33. Kit de ensayo según la reivindicación 29, en el que los anticuerpos antiinmunoglobulina del sujeto en fase sólida y el marcador detectable se almacenan en el mismo compartimiento.
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