JPH06213895A - Ｃ型肝炎の急性期の決定方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎の急性期の決定方法Info
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- JPH06213895A JPH06213895A JP4311571A JP31157192A JPH06213895A JP H06213895 A JPH06213895 A JP H06213895A JP 4311571 A JP4311571 A JP 4311571A JP 31157192 A JP31157192 A JP 31157192A JP H06213895 A JPH06213895 A JP H06213895A
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- igm
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、Ｃ型肝炎患者が急性期にあ
るかどうかを決定するための方法を提供することであ
る。 【構成】 この方法は、患者の血液試料中のHCV コア抗
原に対するHCV IgM 抗体の存在を検出することを特徴と
する。
るかどうかを決定するための方法を提供することであ
る。 【構成】 この方法は、患者の血液試料中のHCV コア抗
原に対するHCV IgM 抗体の存在を検出することを特徴と
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎患者が急性期
にあるかどうかを決定するための方法に関する。
にあるかどうかを決定するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】輸血から起こる肝炎の大部分はウイルス
性であり、Ａ型肝炎ウイルス(HAV) やＢ型肝炎ウイルス
（HBV)のような既知の肝炎ウイルスにより引き起こされ
る他の形態のウイルス関連肝臓病と区別することができ
る。前記非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH) の病原物質は、長きに
わたり多数の研究グループによって探索されており、現
在はＣ型肝炎ウイルス(HCV) であると考えられている。
HCV タンパク質はヌクレオキャプシド（コア）抗原タン
パク質（Ｃ）を含む構造タンパク質と非構造タンパク質
(NS1-5) とから成ると考えられている。
性であり、Ａ型肝炎ウイルス(HAV) やＢ型肝炎ウイルス
（HBV)のような既知の肝炎ウイルスにより引き起こされ
る他の形態のウイルス関連肝臓病と区別することができ
る。前記非Ａ非Ｂ型肝炎(NANBH) の病原物質は、長きに
わたり多数の研究グループによって探索されており、現
在はＣ型肝炎ウイルス(HCV) であると考えられている。
HCV タンパク質はヌクレオキャプシド（コア）抗原タン
パク質（Ｃ）を含む構造タンパク質と非構造タンパク質
(NS1-5) とから成ると考えられている。
【０００３】Ｃ型肝炎ウイルス(HCV) は、分子クローニ
ングとそのＲＮＡゲノムの特徴づけによってChooら(Sci
ence 244: 359-362, 1989)により最初に同定された。酵
母中での組換えＤＮＡ法により合成されたC100-3と称す
る前記HCV 抗原を使用することによるHCV 抗体の検出の
ための特異的アッセイも開発された（Science 244: 362
-364）。一方、組換えバクロウイルスにより合成された
前記HCV コアタンパク質(p22) を使うことによるＣ型肝
炎ウイルス(HCV) 感染の血清学的診断のためのエンザイ
ムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA) も、Chib
a ら（Proc. Natil. Acad. Sci. USA 88:4641-4645, 19
91）により開発された。
ングとそのＲＮＡゲノムの特徴づけによってChooら(Sci
ence 244: 359-362, 1989)により最初に同定された。酵
母中での組換えＤＮＡ法により合成されたC100-3と称す
る前記HCV 抗原を使用することによるHCV 抗体の検出の
ための特異的アッセイも開発された（Science 244: 362
-364）。一方、組換えバクロウイルスにより合成された
前記HCV コアタンパク質(p22) を使うことによるＣ型肝
炎ウイルス(HCV) 感染の血清学的診断のためのエンザイ
ムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA) も、Chib
a ら（Proc. Natil. Acad. Sci. USA 88:4641-4645, 19
91）により開発された。
【０００４】典型的な免疫反応では、一次と二次抗原チ
ャレンジ後の抗体応答は異なる。免疫グロブリンＭ(Ig
M) 抗体は一次抗体応答の大部分を占めるが、二次応答
はほとんど全部免疫グロブリンＧ(IgG) から成る。
ャレンジ後の抗体応答は異なる。免疫グロブリンＭ(Ig
M) 抗体は一次抗体応答の大部分を占めるが、二次応答
はほとんど全部免疫グロブリンＧ(IgG) から成る。
【０００５】HCV 感染を診断するための既知方法は、患
者の血液試料中のHCV に対するIgG抗体の検出に基づい
ている。というのは、二次応答におけるIgG 抗体の親和
力と量が一次応答におけるIgM 抗体のものよりずっと大
きいからである。しかしながら、人がHCV に感染する
と、通常はHCV コア抗原によって一次抗体応答が惹起さ
れ、そして前記コア抗原に対するIgM 抗体が生産され
る。従って、患者の血液試料中のHCV コア抗原に対する
IgM 抗体の存在を検出することによって、Ｃ型肝炎患者
が急性期にあるかどうかを決定する方法を確立すること
ができる。
者の血液試料中のHCV に対するIgG抗体の検出に基づい
ている。というのは、二次応答におけるIgG 抗体の親和
力と量が一次応答におけるIgM 抗体のものよりずっと大
きいからである。しかしながら、人がHCV に感染する
と、通常はHCV コア抗原によって一次抗体応答が惹起さ
れ、そして前記コア抗原に対するIgM 抗体が生産され
る。従って、患者の血液試料中のHCV コア抗原に対する
IgM 抗体の存在を検出することによって、Ｃ型肝炎患者
が急性期にあるかどうかを決定する方法を確立すること
ができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、Ｃ型肝炎患者が急性期にあるかどうかを決定するた
めの方法を提供することである。この方法は、患者の血
液試料中のHCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在の検出
によって特徴づけられる。本発明の別の目的は、Ｃ型肝
炎患者が急性期にあるかどうかを決定するためのキット
を提供することである。このキットは、HCV コア抗原タ
ンパク質と抗IgM抗体とを含んで成ることにより特徴づ
けられる。
は、Ｃ型肝炎患者が急性期にあるかどうかを決定するた
めの方法を提供することである。この方法は、患者の血
液試料中のHCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在の検出
によって特徴づけられる。本発明の別の目的は、Ｃ型肝
炎患者が急性期にあるかどうかを決定するためのキット
を提供することである。このキットは、HCV コア抗原タ
ンパク質と抗IgM抗体とを含んで成ることにより特徴づ
けられる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｃ型肝炎患者
が急性期にあるかどうかを決定する方法に関する。この
方法は、患者の血液試料中のHCV コア抗原に対するIgM
抗体の存在を検出することを特徴とする。
が急性期にあるかどうかを決定する方法に関する。この
方法は、患者の血液試料中のHCV コア抗原に対するIgM
抗体の存在を検出することを特徴とする。
【０００８】前記方法は、イムノアッセイまたはウエス
タンブロッティングにより実施することができる。好ま
しい方法は固相イムノアッセイである。イムノアッセイ
を実施する固相の例は、ミクロタイタープレート、ビー
ズおよび半透膜である。標識物質の例としては、酵素、
例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）、同位体、
蛍光物質、直接検出することができる他の任意の物質が
挙げられる。イムノアッセイは、便利にはサンドイッチ
法、特にエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
(ELISA) によって達成される。ELISA は次の３つの形式
で行うことができる。
タンブロッティングにより実施することができる。好ま
しい方法は固相イムノアッセイである。イムノアッセイ
を実施する固相の例は、ミクロタイタープレート、ビー
ズおよび半透膜である。標識物質の例としては、酵素、
例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）、同位体、
蛍光物質、直接検出することができる他の任意の物質が
挙げられる。イムノアッセイは、便利にはサンドイッチ
法、特にエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ
(ELISA) によって達成される。ELISA は次の３つの形式
で行うことができる。
【０００９】Ａ．コアAg（固相上）＋試料＋標識された
抗IgM ： 1) HCV コア抗原タンパク質を固相上にコーティング
し、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記HCV コア抗原タンパク質と共にインキュ
ベートして抗原−抗体複合体を形成せしめ、 3) 標識と接合された抗IgM 抗体を添加し、それによっ
て前記標識が固相に結合した抗原−抗体複合体により捕
捉され、そして 4) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在を検出し、前記患
者が急性期にあるかどうかを決定する。
抗IgM ： 1) HCV コア抗原タンパク質を固相上にコーティング
し、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記HCV コア抗原タンパク質と共にインキュ
ベートして抗原−抗体複合体を形成せしめ、 3) 標識と接合された抗IgM 抗体を添加し、それによっ
て前記標識が固相に結合した抗原−抗体複合体により捕
捉され、そして 4) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在を検出し、前記患
者が急性期にあるかどうかを決定する。
【００１０】Ｂ．抗IgM （固相上）＋試料＋標識された
HCV コアAg： 1) 抗IgM 抗体を固相上にコーティングし、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記抗IgM抗体と共にインキュベートして Ig
M−抗IgM 複合体を形成せしめ、 3) 標識と接合されたHCV コア抗原を添加し、それによ
って前記標識が固相に結合したIgM −抗IgM 複合体によ
り捕捉され、そして 4) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV IgM の存在を検出し、前記患者が急性期にあるかど
うかを決定する。
HCV コアAg： 1) 抗IgM 抗体を固相上にコーティングし、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記抗IgM抗体と共にインキュベートして Ig
M−抗IgM 複合体を形成せしめ、 3) 標識と接合されたHCV コア抗原を添加し、それによ
って前記標識が固相に結合したIgM −抗IgM 複合体によ
り捕捉され、そして 4) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV IgM の存在を検出し、前記患者が急性期にあるかど
うかを決定する。
【００１１】Ｃ．抗IgM （固相上）＋試料＋HCV コアAg
＋標識されたHCV 抗体： 1) 抗IgM 抗体を固相上にコーティングし、 2) HCV IgM 抗体を含む疑いのある試料を前記固相上に
コーティングされた抗IgM 抗体と共にインキュベートし
て抗IgM −IgM 複合体を形成せしめ、 3) HCV コア抗原を添加し、それにより前記HCV コア抗
原が固相に結合した抗IgM −IgM 複合体により捕捉さ
れ、 4) 標識と接合された別のHCV 抗体を添加し、それによ
って前記標識が固相に結合したHCV コア抗原により捕捉
され、そして 5) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV IgM 抗体の存在を検出し、前記患者が急性期にある
かどうかを決定する。
＋標識されたHCV 抗体： 1) 抗IgM 抗体を固相上にコーティングし、 2) HCV IgM 抗体を含む疑いのある試料を前記固相上に
コーティングされた抗IgM 抗体と共にインキュベートし
て抗IgM −IgM 複合体を形成せしめ、 3) HCV コア抗原を添加し、それにより前記HCV コア抗
原が固相に結合した抗IgM −IgM 複合体により捕捉さ
れ、 4) 標識と接合された別のHCV 抗体を添加し、それによ
って前記標識が固相に結合したHCV コア抗原により捕捉
され、そして 5) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV IgM 抗体の存在を検出し、前記患者が急性期にある
かどうかを決定する。
【００１２】患者の試料中にHCV IgM 抗体が検出されれ
ば、その患者はＣ型肝炎の急性期にあるとみなされるだ
ろう。
ば、その患者はＣ型肝炎の急性期にあるとみなされるだ
ろう。
【００１３】本発明はまた、Ｃ型肝炎患者が急性期にあ
るかどうかを決定する本発明の方法を実施するためのキ
ットを提供する。特に、Ｃ型肝炎患者が急性期にあるか
どうかを決定するためのイムノアッセイキットは、HCV
コア抗原、抗IgM 抗体および適当な固相を含んで成る。
るかどうかを決定する本発明の方法を実施するためのキ
ットを提供する。特に、Ｃ型肝炎患者が急性期にあるか
どうかを決定するためのイムノアッセイキットは、HCV
コア抗原、抗IgM 抗体および適当な固相を含んで成る。
【００１４】上記の方法Ａを実施するためのキットは、
HCV 抗原タンパク質がコーティングされた固相、および
標識された抗IgM 抗体を含んで成る。上記の方法Ｂを実
施するためのキットは、抗IgM 抗体がコーティングされ
た固相、および標識されたHCV 抗原タンパク質を含んで
成る。上記の方法Ｃを実施するためのキットは、抗IgM
抗体がコーティングされた固相、HCV 抗原タンパク質、
および標識されたHCV 抗体を含んで成る。下記の実施例
は本発明の理解を促すために提供されるのであって、本
発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
HCV 抗原タンパク質がコーティングされた固相、および
標識された抗IgM 抗体を含んで成る。上記の方法Ｂを実
施するためのキットは、抗IgM 抗体がコーティングされ
た固相、および標識されたHCV 抗原タンパク質を含んで
成る。上記の方法Ｃを実施するためのキットは、抗IgM
抗体がコーティングされた固相、HCV 抗原タンパク質、
および標識されたHCV 抗体を含んで成る。下記の実施例
は本発明の理解を促すために提供されるのであって、本
発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【００１５】
【実施例】Ｉ．材料 (1) HCV コア抗原 本発明において使用するHCV コア抗原は本発明者によっ
て開発されたものである。該タンパク質は台湾特許出願
第81103539号に記載されている。
て開発されたものである。該タンパク質は台湾特許出願
第81103539号に記載されている。
【００１６】(2) HRPO接合体の調製 精製した抗ヒトIgM 、HCV コア抗原またはHCV 抗体を、
NaIO4 を使って西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）と
の接合により標識する。該接合体をクロマトグラフィー
により精製する。
NaIO4 を使って西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）と
の接合により標識する。該接合体をクロマトグラフィー
により精製する。
【００１７】II. ウエスタンブロッティングによるHCV
IgM の検出 精製したコア抗原を標準手順によりSDS 電気泳動にかけ
る。SDS-PAGEゲルを脱イオン水で４℃にて15分間洗浄
し、次にブロッティング緩衝液（0.15M リン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 6.7）で４℃にて20分間洗浄する。次いで
ゲル上のペプチドマップをブロッティング緩衝液のもと
で1.3 A にて 1〜1.5 時間ニトロセルロース紙上に電気
ブロッティングせしめる。この紙を洗浄用緩衝液（PBS-
Tween 20,pH 7.4）で洗浄し、ブロック用緩衝液（0.1M
NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris, pH 7.2-7.4, 0.2%ウシ胎
児血清アルブミン, 0.05% Nonidet p-40, 1M尿素）で一
晩ブロックする。
IgM の検出 精製したコア抗原を標準手順によりSDS 電気泳動にかけ
る。SDS-PAGEゲルを脱イオン水で４℃にて15分間洗浄
し、次にブロッティング緩衝液（0.15M リン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH 6.7）で４℃にて20分間洗浄する。次いで
ゲル上のペプチドマップをブロッティング緩衝液のもと
で1.3 A にて 1〜1.5 時間ニトロセルロース紙上に電気
ブロッティングせしめる。この紙を洗浄用緩衝液（PBS-
Tween 20,pH 7.4）で洗浄し、ブロック用緩衝液（0.1M
NaCl, 5mM EDTA, 50mM Tris, pH 7.2-7.4, 0.2%ウシ胎
児血清アルブミン, 0.05% Nonidet p-40, 1M尿素）で一
晩ブロックする。
【００１８】このニトロセルロース紙を、まず40% NBBS
/Tris-HCl (pH 7.4)で10倍希釈されたＣ型肝炎を有する
／有しない被検者の血清と40℃にて２時間反応させる。
反応後、紙を洗浄用緩衝液で３回洗浄する。次いで抗hI
gM：HRPO接合体（第Ｉ節に記載した通りに調製したも
の）と40℃で２時間反応させる。反応後、紙を洗浄用緩
衝液で３回洗浄し、次いで10 ml の基質溶液（0.01% ４
−エチロロ−１−ナフトール、18% メタノール、0.04M
Tris, pH 7.2-7.4, 0.1M NaCl および0.01% H2O2）と20
分間反応させる。
/Tris-HCl (pH 7.4)で10倍希釈されたＣ型肝炎を有する
／有しない被検者の血清と40℃にて２時間反応させる。
反応後、紙を洗浄用緩衝液で３回洗浄する。次いで抗hI
gM：HRPO接合体（第Ｉ節に記載した通りに調製したも
の）と40℃で２時間反応させる。反応後、紙を洗浄用緩
衝液で３回洗浄し、次いで10 ml の基質溶液（0.01% ４
−エチロロ−１−ナフトール、18% メタノール、0.04M
Tris, pH 7.2-7.4, 0.1M NaCl および0.01% H2O2）と20
分間反応させる。
【００１９】III. HCV IgM抗体についてのELISA （タイ
プＡ） (1) ミクロタイタープレートの処理 ミクロタイタープレートを適当な濃度の精製HCV 抗原タ
ンパク質でコーティングし、そしてウシ血清アルブミン
を含む緩衝液でブロックする。処理済ミクロタイタープ
レートを２〜８℃で保存する。 (2) 抗hIgM：HRPO接合体の調製 NaIO4 を使って精製抗ヒトIgM を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（HRPO）と接合させる。該接合体をクロマトグラ
フィーにより精製する。
プＡ） (1) ミクロタイタープレートの処理 ミクロタイタープレートを適当な濃度の精製HCV 抗原タ
ンパク質でコーティングし、そしてウシ血清アルブミン
を含む緩衝液でブロックする。処理済ミクロタイタープ
レートを２〜８℃で保存する。 (2) 抗hIgM：HRPO接合体の調製 NaIO4 を使って精製抗ヒトIgM を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（HRPO）と接合させる。該接合体をクロマトグラ
フィーにより精製する。
【００２０】(3) 試薬の成分 (a) 洗浄液：0.9% NaCl とチメロサールを含むリン酸緩
衝液。 (b) 抗hIgM：HRPO接合体溶液：タンパク様安定剤と防腐
剤を含むTris緩衝液中に溶解された抗hIgM：HRPO接合
体。 (c) 試料希釈剤：タンパク様安定剤と防腐剤を含むTris
緩衝液。 (d) OPD 基質溶液：H2O2を含むクエン酸−リン酸緩衝液
中に溶解されたｏ−フェニレンジアミン(OPD) 。（溶液
がオレンジ色になったら、この溶液は汚染されており、
もう使用できないことを意味する。） (e) 停止溶液：2N H2SO4溶液。 (f) 正／負の対照：タンパク様安定剤と防腐剤を含むリ
ン酸緩衝液で適当な濃度に希釈された、Ｃ型肝炎の急性
期にある／ない人の血清試料。
衝液。 (b) 抗hIgM：HRPO接合体溶液：タンパク様安定剤と防腐
剤を含むTris緩衝液中に溶解された抗hIgM：HRPO接合
体。 (c) 試料希釈剤：タンパク様安定剤と防腐剤を含むTris
緩衝液。 (d) OPD 基質溶液：H2O2を含むクエン酸−リン酸緩衝液
中に溶解されたｏ−フェニレンジアミン(OPD) 。（溶液
がオレンジ色になったら、この溶液は汚染されており、
もう使用できないことを意味する。） (e) 停止溶液：2N H2SO4溶液。 (f) 正／負の対照：タンパク様安定剤と防腐剤を含むリ
ン酸緩衝液で適当な濃度に希釈された、Ｃ型肝炎の急性
期にある／ない人の血清試料。
【００２１】(4) Ｃ型肝炎の急性期の診断のためのキッ
ト（96試験用） このキットは次のものを含む： (a) (1) に記載のようなHCV 抗原タンパク質がコーティ
ングされている96ウエルのミクロタイタープレート； (b) 抗hIgM：HRPO接合体溶液のビン(12 ml) ； (c) 試料希釈剤で適当な濃度に希釈された正／負の対照
のビン(2 ml)； (d) 試料希釈剤のビン(100 ml)； (e) 濃縮洗浄液のビン(10 倍、40 ml)； (f) OPD 基質 ６錠； (g) H2O2を含むクエン酸−リン酸緩衝液のビン(32 ml)
；および (h) 停止溶液のビン(12 ml) 。
ト（96試験用） このキットは次のものを含む： (a) (1) に記載のようなHCV 抗原タンパク質がコーティ
ングされている96ウエルのミクロタイタープレート； (b) 抗hIgM：HRPO接合体溶液のビン(12 ml) ； (c) 試料希釈剤で適当な濃度に希釈された正／負の対照
のビン(2 ml)； (d) 試料希釈剤のビン(100 ml)； (e) 濃縮洗浄液のビン(10 倍、40 ml)； (f) OPD 基質 ６錠； (g) H2O2を含むクエン酸−リン酸緩衝液のビン(32 ml)
；および (h) 停止溶液のビン(12 ml) 。
【００２２】(5) アッセイ手順 (a) 試料希釈剤で希釈された(1:500〜1:1000）試験試料
150μl および正／負の対照を、処理済ミクロタイター
プレートのウエルに入れる。幾つかのウエルは基質ブラ
ンクとして保持しておかなければならない。 (b) プレートを振盪によって穏やかに混合し、37〜40℃
にて１時間インキュベートする。 (c) 洗浄器によりプレートをウエルあたり0.3 mlの洗浄
液で３回洗浄する。 (d) 各ウエルに 100μl の抗hIgM：HRPO接合体溶液を添
加する。 (e) プレートを振盪により37〜40℃にて30分間インキュ
ベートする。 (f) プレートを５回洗浄する。 (g) 各ウエルに 100μl のOPD 基質溶液を添加し、プレ
ートを遮光下で15〜30℃にて30分間インキュベートす
る。 (h) 各ウエルに 100μl の停止溶液を添加し、穏やかに
混合して反応を停止させる。 (i) ウエルごとのOD値を分光光度計により492 nmで測定
する。
150μl および正／負の対照を、処理済ミクロタイター
プレートのウエルに入れる。幾つかのウエルは基質ブラ
ンクとして保持しておかなければならない。 (b) プレートを振盪によって穏やかに混合し、37〜40℃
にて１時間インキュベートする。 (c) 洗浄器によりプレートをウエルあたり0.3 mlの洗浄
液で３回洗浄する。 (d) 各ウエルに 100μl の抗hIgM：HRPO接合体溶液を添
加する。 (e) プレートを振盪により37〜40℃にて30分間インキュ
ベートする。 (f) プレートを５回洗浄する。 (g) 各ウエルに 100μl のOPD 基質溶液を添加し、プレ
ートを遮光下で15〜30℃にて30分間インキュベートす
る。 (h) 各ウエルに 100μl の停止溶液を添加し、穏やかに
混合して反応を停止させる。 (i) ウエルごとのOD値を分光光度計により492 nmで測定
する。
【００２３】(6) 判定 各ウエルのOD492nm 値からブランクの読みの平均値（バ
ックグラウンド）を差し引く。正の対照の読みの平均値
(PCx) と負の対照の読みの平均値(NCx) との差（PCx −
NCx）は0.5 に等しいかまたはそれより大きい。カット
オフ値(CO)は次式により算出する： CO ＝ PCx ×0.15＋NCx
ックグラウンド）を差し引く。正の対照の読みの平均値
(PCx) と負の対照の読みの平均値(NCx) との差（PCx −
NCx）は0.5 に等しいかまたはそれより大きい。カット
オフ値(CO)は次式により算出する： CO ＝ PCx ×0.15＋NCx
【００２４】試験試料の読みがCO値よりも小さい時、試
料は陰性であると見なされる（すなわち、試料中にHCV
IgM 抗体が検出できない）。試験試料の読みがCO値と等
しいかまたはそれより大きい時、その試料は陽性である
と予想される。しかしながら、二重反復試験試料につい
てアッセイを繰り返すことが必要である。二重反復試験
試料もまたカットオフ値より大きいかまたは等しい場
合、その試料は陽性であろう。HCV IgM が試料中に検出
された場合、被検者は急性期にあるとみなされる。
料は陰性であると見なされる（すなわち、試料中にHCV
IgM 抗体が検出できない）。試験試料の読みがCO値と等
しいかまたはそれより大きい時、その試料は陽性である
と予想される。しかしながら、二重反復試験試料につい
てアッセイを繰り返すことが必要である。二重反復試験
試料もまたカットオフ値より大きいかまたは等しい場
合、その試料は陽性であろう。HCV IgM が試料中に検出
された場合、被検者は急性期にあるとみなされる。
【００２５】IV. Ｃ型肝炎患者が急性期にあるかどうか
を決定するためのHCV IgM の検出 23人の患者をHCV 検出キット（Abott's Laboratoriesに
より製造）により試験し、被検者がHCV に感染している
ことを確かめた。それらの患者の血液試料を、第III 節
に記載したELISA によりHCV IgM を分析することによっ
て試験した。各患者の肝機能をGPT 試験により観察し
た。HCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在についてのイ
ムノアッセイにより得られた結果を下の表に示す。
を決定するためのHCV IgM の検出 23人の患者をHCV 検出キット（Abott's Laboratoriesに
より製造）により試験し、被検者がHCV に感染している
ことを確かめた。それらの患者の血液試料を、第III 節
に記載したELISA によりHCV IgM を分析することによっ
て試験した。各患者の肝機能をGPT 試験により観察し
た。HCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在についてのイ
ムノアッセイにより得られた結果を下の表に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】試料G214, USB9およびUSB29 においてHCV
IgM 抗体が検出されることが示唆され、従ってG214, US
B9およびUSB29 患者はＣ型肝炎の急性期にあると考えら
れる。
IgM 抗体が検出されることが示唆され、従ってG214, US
B9およびUSB29 患者はＣ型肝炎の急性期にあると考えら
れる。
【００２８】本発明の一態様のみを記載してきたが、当
業者が容易にそれに変更（その幾つかは上記に言及され
ている）を行い得ることは認識されるだろう。従って、
明細書中に言及された変更並びに本発明の精神および範
囲内に入る他のいずれの変更も、本発明の特許請求の範
囲内に含まれる。
業者が容易にそれに変更（その幾つかは上記に言及され
ている）を行い得ることは認識されるだろう。従って、
明細書中に言及された変更並びに本発明の精神および範
囲内に入る他のいずれの変更も、本発明の特許請求の範
囲内に含まれる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年２月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】このニトロセルロース紙を、まず40% NBBS
/Tris-HCl (pH 7.4)で10倍希釈されたＣ型肝炎に感染し
た人および／または感染していない人の血清と40℃にて
２時間反応させる。反応後、紙を洗浄用緩衝液で３回洗
浄する。次いで抗hIgM：HRPO接合体（第Ｉ節に記載した
通りに調製したもの）と40℃で２時間反応させる。反応
後、紙を洗浄用緩衝液で３回洗浄し、次いで10 ml の基
質溶液（0.01％４−エチロロ−１−ナフトール、18％メ
タノール、0.04M Tris, pH 7.2-7.4, 0.1M NaCl および
0.01％H2O2）と20分間反応させる。
/Tris-HCl (pH 7.4)で10倍希釈されたＣ型肝炎に感染し
た人および／または感染していない人の血清と40℃にて
２時間反応させる。反応後、紙を洗浄用緩衝液で３回洗
浄する。次いで抗hIgM：HRPO接合体（第Ｉ節に記載した
通りに調製したもの）と40℃で２時間反応させる。反応
後、紙を洗浄用緩衝液で３回洗浄し、次いで10 ml の基
質溶液（0.01％４−エチロロ−１−ナフトール、18％メ
タノール、0.04M Tris, pH 7.2-7.4, 0.1M NaCl および
0.01％H2O2）と20分間反応させる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】(5) アッセイ手順 (a) 試料希釈剤で希釈された(1:500〜1:1000) 試験試料
150μl および正／負の対照を、処理済ミクロタイター
プレートのウエルに入れる。幾つかのウエルは基質ブラ
ンクとして保持しておかなければならない。 (b) プレートを振盪によって穏やかに混合し、37〜40℃
にて１時間インキュベートする。 (c) 洗浄器によりプレートをウエルあたり0.3 mlの洗浄
液で３回洗浄する。 (d) 各ウエルに 100μl の抗hIgM：HRPO接合体溶液を添
加する。 (e) プレートを振盪によって穏やかに混合し、37〜40℃
にて30分間インキュベートする。 (f) プレートを５回洗浄する。 (g) 各ウエルに 100μl のOPD 基質溶液を添加し、プレ
ートを遮光下で15〜30℃にて30分間インキュベートす
る。 (h) 各ウエルに 100μl の停止溶液を添加し、穏やかに
混合して反応を停止させる。 (i) ウエルごとのOD値を分光光度計により492 nmで測定
する。
150μl および正／負の対照を、処理済ミクロタイター
プレートのウエルに入れる。幾つかのウエルは基質ブラ
ンクとして保持しておかなければならない。 (b) プレートを振盪によって穏やかに混合し、37〜40℃
にて１時間インキュベートする。 (c) 洗浄器によりプレートをウエルあたり0.3 mlの洗浄
液で３回洗浄する。 (d) 各ウエルに 100μl の抗hIgM：HRPO接合体溶液を添
加する。 (e) プレートを振盪によって穏やかに混合し、37〜40℃
にて30分間インキュベートする。 (f) プレートを５回洗浄する。 (g) 各ウエルに 100μl のOPD 基質溶液を添加し、プレ
ートを遮光下で15〜30℃にて30分間インキュベートす
る。 (h) 各ウエルに 100μl の停止溶液を添加し、穏やかに
混合して反応を停止させる。 (i) ウエルごとのOD値を分光光度計により492 nmで測定
する。
Claims (21)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎患者が急性期にあるかどうかを
決定する方法であって、患者の血液試料中のHCV コア抗
原に対するHCV IgM 抗体の存在を検出することを特徴と
する方法。 - 【請求項２】 プローブとしてHCV コア抗原を使うこと
により前記試料中のHCV IgM 抗体を検出することを特徴
とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 イムノアッセイまたはウエスタンブロッ
ティングにより実施することができる、請求項１または
２に記載の方法。 - 【請求項４】 イムノアッセイにより実施される、請求
項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 次の段階： 1) HCV コア抗原タンパク質を固相上にコーティング
し、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記HCV コア抗原タンパク質と共にインキュ
ベートして抗原−抗体複合体を形成せしめ、 3) 標識と接合された抗IgM 抗体を添加し、それによっ
て前記標識が固相に結合した抗原−抗体複合体により捕
捉され、そして 4) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV コア抗原に対するIgM 抗体の存在を検出し、そして
前記患者が急性期にあるかどうかを決定する を含んで成る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 次の段階： 1) 抗IgM 抗体を固相上にコーティングし、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記抗IgM 抗体と共にインキュベートして I
gM−抗IgM 複合体を形成せしめ、 3) 標識と接合されたHCV コア抗原を添加し、それによ
って前記標識が固相に結合したIgM −抗IgM 複合体によ
り捕捉され、そして 4) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV IgM の存在を検出し、そして前記患者が急性期にあ
るかどうかを決定する を含んで成る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 次の段階： 1) 抗IgM 抗体を固相上にコーティングし、 2) HCV IgM 抗体を含む疑いのある試料を前記固相上に
コーティングされた抗IgM 抗体と共にインキュベートし
て抗IgM −IgM 複合体を形成せしめ、 3) HCV コア抗原を添加し、それによって前記HCV コア
抗原が固相に結合した抗IgM −IgM 複合体により捕捉さ
れ、 4) 標識と接合された別のHCV 抗体を添加し、それによ
って前記標識が固相に結合したHCV コア抗原により捕捉
され、そして 5) 捕捉された標識を測定することにより前記試料中の
HCV IgM 抗体の存在を検出し、そして前記患者が急性期
にあるかどうかを決定する を含んで成る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 固相としてミクロタイタープレートを使
うことにより実施することができる、請求項４，５，６
または７に記載の方法。 - 【請求項９】 標識として酵素または同位体物質を使う
ことを特徴とする、請求項４，５，６または７に記載の
方法。 - 【請求項１０】 標識として酵素を使うことを特徴とす
る、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 標識として西洋ワサビペルオキシダー
ゼを使うことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｃ型肝炎患者が急性期にあるかどうか
を決定するためのエンザイム−リンクドイムノソルベン
トアッセイ(ELISA) であって、前記患者の血液試料中の
HCV IgM 抗体の存在を検出することを特徴とし、次の段
階： 1) HCV コア抗原タンパク質をミクロタイタープレート
上にコーティングし、 2) HCV コア抗原に対するIgM 抗体を含む疑いのある患
者の試料を前記HCV コア抗原タンパク質と共にインキュ
ベートして抗原−抗体複合体を形成せしめ、 3) 西洋ワサビペルオキシダーゼと接合された抗IgM 抗
体を添加し、それによって前記ペルオキシダーゼが固相
に結合した抗原−抗体複合体により捕捉され、そして 4) 固相に結合した前記西洋ワサビペルオキシダーゼの
活性を測定することにより前記試料中のHCV コア抗原に
対するIgM 抗体の存在を検出し、そして前記患者が急性
期にあるかどうかを決定する を含んで成るELISA 。 - 【請求項１３】 Ｃ型肝炎患者の血液試料中のHCV IgM
抗体の存在を検出することにより前記患者が急性期にあ
るかどうかを決定するためのキットであって、HCV コア
抗原タンパク質および抗IgM 抗体を含んで成るキット。 - 【請求項１４】 試料中のHCV IgM 抗体の検出がイムノ
アッセイによって行われる、請求項１３に記載のキッ
ト。 - 【請求項１５】 試料中のHCV IgM 抗体の検出が固相イ
ムノアッセイによって行われる、請求項１４に記載のキ
ット。 - 【請求項１６】 1) HCV 抗原タンパク質がコーティン
グされた固相、および 2) 標識された抗IgM 抗体 を含んで成る、請求項１５に記載のキット。 - 【請求項１７】 1) 抗IgM 抗体がコーティングされた
固相、および 2) 標識されたHCV 抗原タンパク質 を含んで成る、請求項１５に記載のキット。 - 【請求項１８】 1) 抗IgM 抗体がコーティングされた
固相、 2) HCV 抗原タンパク質、および 3) 標識されたHCV 抗体 を含んで成る、請求項１５に記載のキット。 - 【請求項１９】 前記標識が酵素である、請求項１６，
１７または１８に記載のキット。 - 【請求項２０】 前記標識が西洋ワサビペルオキシダー
ゼである、請求項１６，１７または１８に記載のキッ
ト。 - 【請求項２１】 Ｃ型肝炎患者の血液試料中のHCV IgM
抗体の存在を検出することにより前記患者が急性期にあ
るかどうかを決定するためのELISA キットであって、ミ
クロタイタープレート上にコーティングされたHCV コア
抗原、および西洋ワサビペルオキシダーゼと接合された
抗IgM 抗体を含んで成るELISA キット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4311571A JPH06213895A (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎の急性期の決定方法 |
| EP93308188A EP0593291A3 (en) | 1992-10-16 | 1993-10-14 | Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96298992A | 1992-10-16 | 1992-10-16 | |
| JP4311571A JPH06213895A (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎の急性期の決定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06213895A true JPH06213895A (ja) | 1994-08-05 |
Family
ID=26566802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4311571A Pending JPH06213895A (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎の急性期の決定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06213895A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001517797A (ja) * | 1997-09-22 | 2001-10-09 | カイロン コーポレイション | サンプル中の抗体を検出する方法 |
-
1992
- 1992-11-20 JP JP4311571A patent/JPH06213895A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001517797A (ja) * | 1997-09-22 | 2001-10-09 | カイロン コーポレイション | サンプル中の抗体を検出する方法 |
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