JP4124961B2 - サンプル中の抗体を検出する方法 - Google Patents
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Description
本願は、出願番号第60/059,703号および同第60/083,921号に対して米国特許法第119条の下で優先権の利益を主張し、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、サンプル中の抗原に対する抗体の検出/定量に関する。
【0003】
(発明の背景)
抗体捕獲アッセイは一般的に、サンプル中の特定の抗原に対する抗体の検出に使用される。このような抗体の検出は、特定の抗原に対する曝露に関する情報を提供するだけでなく、疾患の進行に関する情報をも提供し得る。しかし、固相抗原を利用する抗体補足アッセイは、サンプル中の実際の抗体価の測定を可能にしない。試験サンプル中の少なくとも2つの異なる基質の検出および/または定量に関するアッセイが記述されている。本明細書中に参考として援用される米国特許第5,395,752号(’752特許)は、試験サンプル中の少なくとも2つの基質の検出中の使用に関する検出マーカーとして化学発光化合物を記載する。最小の重複を伴って、異なる波長での光を発する化学発光化合物が利用される。しかし、検出マーカー、すなわち化学発光化合物は、この試験サンプル中で検出/定量されるべき特定の基質に特異的である。
【0004】
実際の力価の測定を容易にし、試験サンプル中の同じ供給源に対して指向される異なる抗体種の検出に適用し得、ならびに試験サンプル中の異なる供給源に対する異なる抗体の検出に適用し得る試験サンプル中の抗体をアッセイする方法が必要である。
【0005】
(発明の要旨)
1つの局面において、本発明は単回インキュベーション工程におけるサンプル中の特定の標的抗原に対する抗体の検出/定量の方法に関する。
【0006】
別の局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において単一の検出マーカーを使用する、単一試験サンプル中の同じ供給源由来の少なくとも2つの抗原に対する抗体の検出/定量の方法に関する。
【0007】
なお別の局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において、検出可能マーカーとして異なる波長で光を発する少なくとも2つの光試薬を使用する、単一試験サンプル中の同じ供給源由来の少なくとも2つの抗原に対する抗体の検出/定量の方法に関する。
【0008】
さらなる局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において検出マーカーとして異なる波長で光を発する光試薬を使用する、単一試験サンプル中の1つより多い供給源由来の抗原の検出方法に関する。さらなる局面において、本発明は、単一の検出マーカーを使用する単一被験体由来の試験サンプル中の特定の供給源に関する抗体プロフィールおよび実際の抗体価を測定する方法に関する。
【0009】
さらなる局面において、本発明は本発明による方法を実施するための試験キットに関する。本発明によるキットにおいて、固相および検出マーカーは同じコンパートメントに格納され得る。
【0010】
(詳細な説明)
本発明の実施には、他に示されなければ、当業者内でウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技術の従来の方法を使用する。このような技術は、この文献中に完全に説明される。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989);DNA Cloning:A Practical Approach,IおよびII巻(D.Glover編);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan編,Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology,I〜IV巻(D.M.Weir and C.C.Blackwell編,Blackwell Scientific Publications);およびFundamental Virology,第2版,IおよびII巻(B.N.Fields and D.M. Knipe,編)を参照のこと。
【0011】
単回インキュベーション工程中に(すなわち同時に)行われ得る、単一標的抗原、同じ供給源由来の複数標的抗原、または単一試験サンプル中異なる供給源由来の複数標的抗原に対する抗体の検出に関するアッセイが記載される。このアッセイは高処理能力自動システムで行われ得、従ってデータ繰り込みを可能にする。本発明によるアッセイは、高い感受性(100%)および特異性(献血者サンプルで99.5〜99.7%)を示す。汎用固相および/または汎用検出マーカーが使用される。
【0012】
以下の定義が本明細書中で使用される。
【0013】
本明細書中で使用する用語「標的抗原」には、単一エピトープおよび複数エピトープ抗原、ならびにハプテンが含まれる。
【0014】
本明細書中の標的抗原に関して使用する用語「供給源」には、ウイルス、細菌、腫瘍、真菌、などが含まれるがこれらに限定されない。異なる供給源は、例えばウイルス、異なるウイルス、あるいはウイルスおよび細菌の異なるサブタイプであり得る。
【0015】
本明細書で使用する用語「リガンド」とは、結合パートナーをいう。好ましい実施態様において、このリガンドはスーパーオキシドジスムターゼ(「SOD」)およびユビキチンである。
【0016】
本明細書で使用する用語「検出マーカー」には、発色団、酵素、その切断産物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物、およびこれらのマーカーの誘導体ならびに/または組合せがあるがこれらに限らない。提供した実施例において、化学発光化合物ジメチルアクリジニウムエステル(DMAE,Ciba Corning Diagnostics Corp.)を使用した。任意のマーカーを使用した標識は、至適検出を得るためおよび抗体の結合のための条件下で実施した。
【0017】
検出マーカーを検出する手段は、使用されるマーカーに依存する。この適切な手段および状況は当業者により容易に決定され得る。以下の実施例中に示すように、アッセイ中DMAEが検出マーカーである場合、得られる抗リガンドDMAE結合体は、NaOH/H2O2と反応した場合発光により検出可能なDMAEを備えるトレーサーである。2つ以上の光試薬を含むアッセイにおいて、少なくとも2つの光電子増倍管は測定結果を得るために利用されねばならない。
【0018】
個々の抗原の検出マーカーでの標識は、非常に退屈であり得、さらに得られる標識は安定でないかもしれない。本発明は、汎用検出マーカーを提供する。本発明において、この抗原はリガンド、例えば抗原/リガンド融合タンパク質と結合している。この融合タンパク質は、このリガンドに対して指向される抗体を含む検出マーカーと対合する。このリガンドに対して指向される抗体はこの検出マーカーと結合している。多くの異なる抗原は、同じリガンドに融合し得る。この様式において、多くの抗原は、単一の汎用マーカーで検出され得る。
【0019】
本明細書中に使用される用語「被験体」とは、この試験サンプルの供給源をいい、そしてヒトおよび他の脊椎動物を含むがこれらに限定されない。好ましい実施態様において、被験体はヒトである。本明細書で使用される用語「試験サンプル」とは、この標的抗原に対する抗体が存在し得る被験体由来の任意の生物学的液体をいい、血清および血漿を含むがこれらに限定されない。
【0020】
「抗被験体免疫グロブリン抗体」とは一般に、この被験体由来の免疫グロブリンに対して指向される抗体をいう。好ましい実施態様において、抗被験体免疫グロブリン抗体は、ラット抗ヒト免疫グロブリン(Ig)である。より好ましい実施態様において、抗被験体ヒト抗体はラット抗ヒトIgGである。従って、この抗被験体免疫グロブリン抗体は、試験サンプル中抗体を検出/定量するための汎用固相を提供する固相と結合している。
【0021】
この固相は、常磁性微粒子(「PMP」)、磁性ラテックス微粒子(「MLP」)、またはマイクロタイタープレートであり得る。好ましくはこの微粒子は、直径約10μm未満である。
【0022】
本発明に従う試験キットはまた、標準物質または対照を含む。上述のとおり、好ましい実施態様において、この標的抗原は、融合タンパク質としてそのリガンドと結合している。例えば、この抗原は、c100−3(NS4,363aa)C型肝炎ウイルス抗原の生成について以前に記載した方法を使用するヒトSODとのC末端融合のように、酵母S.cerevisiae内での内部の抗原として発現され得る。Kuoら,Science,1989,244,362−364、その全体が本明細書中で参考として援用される;およびCousensら,Gene,1987,61,265−275、その全体が本明細書中で参考として援用される。このc33c抗原(NS3,363アミノ酸)はまた、5−1−1抗原の合成について記載される方法によりE.coli中に、内部SOD融合ポリペプチドとして発現した。Chooら,Science,1989,244.359−362、その全体が本明細書中で参考として援用される。この組換えHCV抗原は、Chienら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,89,10011−10015に記載されるとおり精製した。以下に詳述した特定の実施例において、全ての抗原はSOD融合タンパク質として調製した。しかし他の適切な融合タンパク質は、融合パートナーリガンドを認識する適切な抗体の入手可能性に依存して作製され得る。
【0023】
MEFA−6は複数エピトープ抗原であり、そしてC型肝炎ポリタンパク質のコア、エンベロープ、NS3、NS4、およびNS5領域由来のエピトープを含み、1、2、および3型のHCV株由来の等価な抗原決定基を含む。HCVエピトープをコードする多様なDNAセグメントは、PCR増幅によるか、または合成オリゴヌクレオチドにより構築した。MEFA−6抗原は、このコアおよびNS5領域由来のHCVエピトープの複数コピー;NS4 5−1−1領域由来の異なる血清型エピトープ;c100C末端領域、E1、およびE2領域、ならびにHCV NS3(c33c)領域由来の主要な線状エピトープの単一のコピーを含む。MEFA−6融合タンパク質の一般的な構造式は、hSOD−E1−E2−c33c−5−1−1(1型)−5−5−1(3型)−5−1−1(2型)−c100−NS5(2コピー)−コア(2コピー)である。この抗原は、酵母中で非常に高い発現レベルを有し、高程度の均質性まで精製し、そして以下に記載のイムノアッセイにおいて高い感受性および高い選択性を示す。MEFA−6は、本明細書中にその全体が参考として援用される1997年5月23日に出願したPCT出願US97/08950に記載されるとおり調整した。
【0024】
抗SOD−DMAEは汎用検出マーカーとして使用された。抗SOD抗体はDMAEに共有結合した反応部分を有するアミノ酸側鎖(例えば、リジンε側鎖またはシステインチオール)の反応によりDMAEで標識した(その全体が本明細書中に参考として援用される1995年10月19日に公開したWO95/27702,Ciba Corning Diagnostics Corpを参照のこと)。アミノ酸側鎖のチオールは、DMAE−ED−MCCまたはNSP−DMAE−PEG−BrAc(Ciba Corning)を使用して標識され得る。標識手順は一般的に、本明細書中に参考として援用されるWO95/27702に記載されるとおりであり、最適な検出および抗原性を提供するために各抗原について必要な場合、条件において変更を伴う。
【0025】
感受性は光学密度ユニット(s/co)においてカットオフされたアッセイ検出により分割されたアッセイサンプルの光学密度として報告された。全ての公知のネガティブサンプルは1未満のs/co値を示した。
【0026】
【実施例】
(実施例1:手動アッセイ)
Magic Lite Analyzer SystemII(MLAII)を手動アッセイに使用する。容積、濃度、時間、および温度のようなパラメーターをガイダンスのために提供するが、適宜調製し得る。簡単には、試験サンプルの10μlアリコートを、HCVについての抗体プロフィールを得るための5つの別々の75×12mm試験管に添加した。各試験管に、100μlのサンプル希釈液または緩衝液、ラット抗ヒトIgG抗体と結合した常磁性微粒子(PMP)(PMP/抗ヒトIgG,30μg/アッセイ)を含む100μlの固相緩衝液、50μlHCV抗原/SOD融合タンパク質(コア(c22−3,50ng),NS3(c33c,100ng),NS4(c−100−3 100ng),NS4(5−1−1 100ng),およびNS5(100ng))、ならびにリガンド試薬(LR)希釈液中にDMAE(3千万の相対光単位「RLU」)と結合した100μl抗SODを添加し、そして37℃で18分間インキュベートした。この固相/光試薬希釈緩衝液は、50mMTris、0.5M KCl、1mM EDTA二ナトリウム、3.75% BSA、0.003% 酵母、0.05g/L E.coli抽出物、0.5% Tween−20、2mg/L アンホテリシンB、24mg/L 硫酸ゲンタマイシン、30μg/試験固相および45×106試験光試薬(抗SOD*DMAE抗体)を含んだ。補助的な希釈緩衝液は、50mMTris、0.5M KCl、1mM EDTA二ナトリウム、3.75% BSA、0.003% 酵母、0.05g/L E.coli抽出物、0.5% Tween−20、2mg/L アンホテリシンB、24mg/L 硫酸ゲンタマイシン、0.05g/L 腹水IgG1および0.1g/L 腹水IgG2A(ブロッキング抗体)を含んだ。洗浄試薬はPBS/Tween−20を含んだ。酸性試薬は、0.5% H2O2/0.1N HNO3を含む。塩基性試薬は界面活性剤を有する<0.25N NaOHを含む。
【0027】
この試験管を、そのPMP粒子を沈降するに充分な時間、磁石上に静置した。このサンプルを、そのPMP粒子を保持するために磁石を使用してデカンテーションした。このPMP粒子を1mlのPBS中でボルテックスしながら2回洗浄した。この洗浄溶液は、PBS、0.1% Tween−20、0.09% NaN3、および1mM EDTAであった。混合、インキュベート、沈降、およびデカンテーションの工程を、少なくとも1回繰り返し得る。各試験管に、100μlの水を添加しPMP粒子を再懸濁した。次にこの試験管をMLA−II器具中に置き、そして2秒間発光を測定した。
【0028】
慢性の有償提供者サンプルを使用する結果を表1中に示した。
【0029】
(実施例2:自動アッセイと他の商業的なアッセイとの比較)
上述の手動抗HCVアッセイを、ACS:Centaur装置を使用する自動使用について適用した。以下の手順を使用した。簡単には、このACS:Centaurシステムは自動的に以下の工程を行う:システム作業指示書中に、またはオンラインヘルプシステム中に記述されるとおり、1)10μlのサンプルをキュベットに施す;2)100μlの補助的な希釈緩衝液、100μlの光試薬/固相、50μlの抗原試薬2(例えば、MEFA−6)、50μlの抗原試薬1(例えば、c33c)を施し、そしてこの混合物を37℃で18分間インキュベートする;3)この固相を混合物から分離し、そして結合していない試薬を吸引する;4)キュベットを洗浄試薬1で洗浄する;5)各々300μlの酸性試薬および塩基性試薬を施して、化学発光反応を開始する;そして6)選択による結果を報告する。
【0030】
この固相/光試薬希釈緩衝液は、50mM Tris、0.5M KCl、1mM EDTA二ナトリウム、3.75% BSA、0.003% 酵母、0.05g/L E.coli抽出物、0.5% Tween−20、2mg/L アンホテリシンB、24mg/L 硫酸ゲンタマイシン、30μg/試験固相、および45×106試験光試薬(抗SOD*DMAE抗体)を含んだ。この補助的な希釈緩衝液は、50mM Tris、0.5M KCl、1mM EDTA二ナトリウム、3.75% BSA、0.003% 酵母、0.05g/L E.coli、0.5% Tween−20、2mg/L アンホテリシンB、24mg/L 硫酸ゲンタマイシン、0.05g/L 腹水IgG1および0.1g/L 腹水IgG2A(ブロッキング抗体)を含有した。洗浄試薬はPBS/Tween−20を含んだ。酸性試薬は0.5% H2O2/0.1N HNO3を含む。塩基性試薬は界面活性剤を有する<0.25N NaOHを含む。
【0031】
結果を市販のセロコンバージョンパネルを使用するOrtho3.0、Abbott3.0、およびRIBA(登録商標)3.0アッセイと比較した。そしてこの結果を表IIに示す。Ortho、Abbott、およびRIBA(登録商標)アッセイの結果は、以下のセロコンバージョンパネルについてのこれらの販売者により提供される;BBI(BBI)とは、Boston Biomedica Incorporatedをいい、そしてBCPとはBioClinical Partnersをいう。PHVはそのパネル名を命名する接頭辞である。ロット番号1〜4とは、ディッツ(dits)由来の試薬(試薬コンパートメントおよび固相)複数ロットをいう。
【0032】
この結果から明らかであるように、本発明によるアッセイは、Ortho3.0、およびAbbott3.0よりも何回かの採決回数分抗体の検出を可能にした。早いRIBA(登録商標)アッセイは、HCV発明を確認する。
【0033】
(実施例3:自動アッセイの感受性)
本発明のによるアッセイの感受性は、Ortho3.0アッセイにおいて陽性とスクリーニングされた510人の患者の試験集団において確かめた。アッセイ条件は上述のとおりであった。試験の結果を表IIIに示す。表中で、「IVDA」とはIV薬物乱用をいい、「STD」とは性行為感染症をいい、「N」とは試験した各グループのサンプル数をいい、ならびに「RR」とは繰り返し反応性を言う。このアッセイにおいて初期に反応性(陽性)であるサンプルを再試験した;このサンプルが繰り返し試験の上で反応性(陽性)である場合、「繰り返し反応性」とみなす。
【0034】
表IIIから解るとおり、RIBA(登録商標)3.0アッセイにおいてHCVについて陽性であると試験された全てのサンプルは、本発明に従うアッセイを使用して繰り返し陽性であった。
【0035】
(実施例4:単一サンプル中の複数ウイルスについてのアッセイ)
アッセイ条件は、異なるリガンドおよび異なる光試薬を各抗原について使用することを除いて、上述の実施例3に記載のとおりである。MEFA−6−SODは抗−SOD−DMAEを用いて使用および検出する;c33cユビキチンは抗ユビキチン−LEAE(長い波長を発するアクリジニウムエステル)を用いて使用および検出する。
【0036】
上述の実施例は、本発明を例示することを意味し、そしていかなる場合においても本発明を限定すると解釈されない。当業者は、本発明の精神と範囲内である修飾を認める。本明細書中に引用した全ての参考文献はその全体が参考として援用される。
【0037】
【表1】
【0038】
【表2】
【0039】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、本発明に従う例示のアッセイフォーマットを示す。
Claims (32)
- 被験体由来の試験サンプル中の標的抗原に対する抗体を検出/定量する方法であって、該方法は以下:
a)該試験サンプルを、
i)固相抗被験体免疫グロブリン抗体、
ii)リガンドに結合した該標的抗原を含む融合タンパク質、および
iii)検出マーカーに結合した抗リガンド抗体
と同時にインキュベートして、該被験体由来の該試験サンプル中の抗標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、リガンドに結合した該標的抗原と、検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間の反応を行う工程;ならびに
b)該検出マーカーを適切な手段により検出する工程、
を包含し、該標的抗原がC型肝炎ウイルスの少なくとも1つのエピトープである、方法。 - 前記標的抗原がC型肝炎ウイルスの少なくとも2つのエピトープを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的抗原がC型肝炎ウイルス由来のNS3抗原である、請求項1に記載の方法。
- 前記リガンドがスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)である、請求項2または3に記載の方法。
- 前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項2または3に記載の方法。
- 前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求項5に記載の方法。
- 被験体由来の試験サンプル中の2つ以上の標的抗原に対する抗体を検出/定量する方法であって、ここで該標的抗原は同じ供給源由来であり、該方法は以下:
a)該試験サンプルを、
i)固相抗被験体免疫グロブリン抗体、
ii)リガンドに結合した第1標的抗原を含む融合タンパク質、
iii)該リガンドに結合した少なくとも第2標的抗原、および
iv)検出マーカーに結合した抗リガンド抗体
と同時にインキュベートして、該被験体由来の該試験サンプル中の抗第1標的抗原抗体、
該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、リガンドに結合した該第1標的抗原と、検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間、ならびに該被験体由来の該試験サンプル中の抗第2標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、該リガンドに結合した該少なくとも第2標的抗原と、検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間の反応を行う工程;ならびに
b)該検出マーカーを適切な手段により検出する工程、
を包含する、方法。 - 前記供給源がC型肝炎ウイルスである、請求項7に記載の方法。
- 前記第1標的抗原がC型肝炎ウイルス由来のNS3抗原である、請求項7に記載の方法。
- 前記少なくとも第2標的抗原がC型肝炎ウイルス由来のコア抗原である、請求項7に記載の方法。
- 前記リガンドがSODである、請求項9または10に記載の方法。
- 前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項9または10に記載の方法。
- 前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求項12に記載の方法。
- 被験体由来の試験サンプル中の2つ以上の標的抗原に対する抗体を検出/定量する方法であって、ここで該標的抗原は異なる供給源由来であり、該方法は以下:
a)該試験サンプルを、
i)固相抗被験体免疫グロブリン抗体、
ii)第1リガンドに結合した第1標的抗原を含む融合タンパク質、
iii)第2リガンドに結合した少なくとも第2標的抗原、
iv)第1光試薬に結合した抗第1リガンド抗体、および
v)第2光試薬に結合した少なくとも抗第2リガンド抗体
と同時にインキュベートして、該被験体由来の該試験サンプル中の抗第1標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、第1リガンドに結合した該第1標的抗原と、第1光試薬に結合した抗第1リガンド抗体との間、ならびに該被験体由来の該試験サンプル中の抗第2標的抗原抗体と、該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、第2リガンドに結合した該少なくとも第2標的抗原と、第2光試薬に結合した該抗第2リガンド抗体との間の反応を行う工程であって、ここで該第1および少なくとも該第2光試薬は検出可能に異なる波長の光を発する、工程;ならびに
b)各々の該光試薬の発光シグナルを検出する工程、
を包含する、方法。 - 前記異なる供給源が同じウイルスのサブタイプである、請求項14に記載の方法。
- 前記異なる供給源が異なるウイルスである、請求項14に記載の方法。
- 前記第1リガンドがSODである、請求項14に記載の方法。
- 前記第2リガンドがユビキチンである、請求項14に記載の方法。
- 前記光試薬の少なくとも1つがアクリジニウムエステルである、請求項14に記載の方法。
- 前記第1リガンドに結合した前記第1標的抗原および前記第2リガンドに結合した前記第2標的抗原が、融合タンパク質である、請求項14に記載の方法。
- 単回インキュベーション工程における試験サンプル中の1つ以上の標的抗原に関する抗体の検出用のための試験キットであって、ここで該標的抗原は同一供給源由来であり、該試験キットは、コンパートメント、固相抗被験体免疫グロブリン抗体、第1リガンドに結合した少なくとも第1標的抗原を含む融合タンパク質、および検出マーカーに結合した抗第1リガンド抗体を備える、キット。
- 前記リガンドがSODである、請求項21に記載の試験キット。
- 前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項21に記載の試験キット。
- 前記検出マーカーがアクリジニウムエステルである、請求項23に記載の試験キット。
- 前記固相抗被験体免疫グロブリン抗体および検出マーカーが同じコンパートメント中に格納される、請求項23に記載の試験キット。
- 前記第1リガンドに結合した第2標的抗原をさらに含む、請求項24に記載の試験キット。
- 単回インキュベーション工程における試験サンプル中の2つ以上の標的抗原に関する抗体の検出用の試験キットであって、ここで該標的抗原は異なる供給源由来であり、該試験キットは、コンパートメント、固相抗被験体免疫グロブリン抗体、第1リガンドに結合した第1標的抗原を含む融合タンパク質、第2リガンドに結合した少なくとも第2標的抗原、第1光試薬に結合した抗第1リガンド抗体、および第2光試薬に結合した少なくとも抗第2リガンド抗体を備え、該第1および少なくとも該第2光試薬は検出可能に異なる波長の発光シグナルを発する、キット。
- 前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項27に記載の試験キット。
- 前記検出マーカーがアクリジニウムエステルである、請求項27に記載の試験キット。
- 前記第1リガンドがSODである、請求項27に記載の試験キット。
- 前記第2リガンドがユビキチンである、請求項27に記載の試験キット。
- 前記固相抗被験体免疫グロブリン抗体および検出マーカーが同じコンパートメント中に格納される、請求項27に記載の試験キット。
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