campo de los inmunoensayos, especialmente en la arena de la farmacogenómica para el descubrimiento de fármacos y propósitos de diagnóstico clínico. Los ensayos múltiplex permiten la detección simultánea o cuantificación de múltiplex de analitos a partir de una sola muestra. Uno de los procedimientos para realizar ensayos múltiplex' es el microarreglo, que se desarrolló originalmente como un sistema de arreglo basado en DNA/RNA pero desde entonces ha evolucionado para incluir otros sistemas de arreglo tales como microarreglos de proteína. Los microarreglos de proteína son compatibles con el hardware y software utilizados por los microarreglos de DNA. Puesto que los microarreglos de proteína facilitan el análisis de las interacciones de proteína-proteína, proteína-ligando o proteína-fármaco, así como ensayos enzimáticos, ellos se han utilizado en la investigación y desarrollo básicos, la identificación y validación objetivo de fármacos, selección de fármacos, selección de toxicidad, optimización de guías y la estratificación de pacientes para experimentos clínicos y el manejo de enfermedad (Ver, por ejemplo, Bussow, y colaboradores, Nucleic Acids Res, 26:5007-5008, 1998; Eisen y colaboradores, Methods Enzymol 303:179-2000, 1999; nezevic, y colaboradores, Proteomics, 1:1271-1278, 2001; Adam y colaboradores, Proteomics, 1:1264-1270, 2001; Zhu, y colaboradores, Current Opinión in Chemical Biology, 5:40-45,
2001; y Ronald y colaboradores, Proteome Research, 1:233-237, 2002) . Además de los diversos microarreglos de proteina, otros procedimientos de análisis múltiplex de proteínas incluyen la tecnología basada en cuentas, que realiza bioensayos discretos de múltiples proteínas sobre la superficie de cuentas fluorescentes codificadas en color o de diferente tamaño conocidas como microesferas . Durante los bioensayos, esas cuentas se leen en un analizador compacto/citómetro de flujo, que simultáneamente identifica los bioensayos y mide los resultados, todo en tiempo real cuando la muestra se marca directamente con fluoróforos. Mientras que las tecnologías de ensayo múltiplex, tales como los microarreglos y la tecnología de cuentas, se han empleado en muchas aplicaciones de investigación y clínicas, ellas no se han utilizado para el monitoreo de infecciones virales en animales. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un aspecto de la presente invención se relaciona a un método barato para la detección de alto rendimiento de infección viral utilizando procedimientos de multiplexión, tales como microarreglos y la tecnología de cuentas. El método se puede utilizar para la diagnosis clínica, la observación de animales y aplicaciones de investigación. En una modalidad, el método comprende las etapas de
poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un sistema de microarreglo que comprende una pluralidad de subarreglos capaces de capturar una pluralidad de ligandos objetivo, y detectar un ligando objetivo capturado al poner en contacto el sistema de microarreglo de proteina con un anti-ligando marcado que enlaza específicamente al ligando objetivo capturado. La presencia de un ligando objetivo en la muestra biológica es indicativa de una infección viral en el sujeto, en donde los ligandos objetivos son ya sea antígenos virales o anticuerpos anti-virus y en donde el sistema de microarreglo es capaz de. la detección simultánea de ligandos objetivo en una pluralidad de muestras biológicas. En una modalidad relacionada, el sistema de microarreglo de proteína esta basado en microplaquita o chip o un microarreglo basado en placa de microtítulo. En otra modalidad relacionada, el enlace del anti-ligando marcado al ligando objetivo capturado es detectado mediante la detección de fluorescencia, detección de quimioluminiscencia o detección colorimétrica . En otra modalidad, el método comprende las etapas de incubar una muestra biológica del sujeto con un anti-ligando marcado capaz dé formar un complejo de ligando/anti-ligado con un ligando objetivo; poner en contacto la muestra biológica incubada con ¦ un sistema de microarreglo de proteína que comprende una pluralidad de
subarreglos capaces de capturar un complejo de ligando/anti- ligando, y detectar el complejo de ligando/anti-ligando champurrado. La presencia de un ligando objetivo en la muestra biológica es indicativa de una infección viral en el sujeto, en donde el ligando objetivo es ya sea un antigeno viral o un anticuerpo anti-virus, y en donde el sistema de microarreglo es capaz de la detección simultánea de una pluralidad de ligandos objetivo en una pluralidad de muestras biológicas . En otra modalidad, el método comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un subarreglo de proteina en un sistema de microarreglo en la presencia de un estándar de ligando objetivo marcado, el estándar del ligando objetivo marcado compite con un ligando objetivo en la muestra biológica para el enlace del subarreglo de proteina, y determinar la presencia del ligando objetivo en la muestra biológica basado en un nivel de enlace del estándar de ligando objetivo marcado al subarreglo de proteina, en donde el sistema de microarreglo comprende una pluralidad de subarreglo de proteina y es capaz de capturar simultáneamente una pluralidad de ligandos objetivo en una pluralidad de muestras, y en donde los ligandos objetivo comprenden antigenos virales y anticuerpos anti-virus. En otra modalidad, el método comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un
microarreglo basado en membrana que comprende una pluralidad de anti-ligandos capaces de capturar una pluralidad de ligandos objetivo, y detectar un ligando objetivo capturado al poner en contacto el microarreglo basado en membrana con un anti-ligando marcado que enlaza específicamente al ligando objetivo capturado. La presencia de un ligando objetivo en la muestra biológica es indicativa de una infección viral en el sujeto, en donde los ligandos objetivo son ya sea antígenos virales o anticuerpos anti-virus . En otra modalidad, el método comprende las etapas de poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una pluralidad de especies de microcuentas, cada especie de microcuenta está recubierta con un anti-ligando capaz de capturar un ligando objetivo en la muestra biológica; marcar un ligando objetivo, el ligando objetivo es ya sea un antígeno viral o un anticuerpo anti-virus; y determinar un enlace de ligando objetivo y las microcuentas. El ligando objetivo puede ser marcado ya sea antes o después del contacto con la pluralidad de especies de microcuentas, y el enlace de ligando objetivo a las microcuentas es indicativo de una infección viral. Otro aspecto de la presente invención se relaciona al microarreglo y sistema de cuentas para la detección de infección viral en un sujeto. En una modalidad, la presente invención proporciona
un sistema de microarreglo que comprende una pluralidad de subarreglos fabricados sobre un soporte sólido. Cada subarreglo comprende una pluralidad de anti-ligandos inmovilizados al soporte de sólido, y cada anti-ligando es capaz del enlace especifico a un ligado objetivo que es ya sea un antigeno viral o un anticuerpo anti-virus. En una modalidad relacionada, el soporte sólido está en la, forma de una platina o una placa de microtitulo. En otra modalidad, la presente invención proporciona un sistema de cuentas que comprende una pluralidad de especies de microcuentas, cada especie de microcuenta está recubierta con un anti-ligando capaz de capturar un ligando objetivo en la muestra biológica, en donde el ligando objetivo ya sea un antigeno viral o un anticuerpo anti-virus. Es todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo para la detección de infección viral en un sujeto. El equipo comprende el microarreglo y/o el sistema de microcuentas descrito en lo anterior, y un reactivo de marcación capaz de enlazar al ligando objetivo. Aspectos adicionales de la ¦ descripción serán expuestos en parte en la descripción, en parte serán obvios a partir de la descripción, y/o pueden ser aprendidos a partir de la práctica de la invención. La invención se expone y particularmente se indica en las reivindicaciones, y la
descripción no debe ser considerada como limitativa del alcance de las reivindicaciones. La siguiente descripción detallada incluye representaciones ejemplares de varias modalidades de la invención que no son restrictivas de la invención como es reclamada. Las figuras acompañantes constituyen una parte de esa especificación y, junto con la descripción, sirven para ilustrar modalidades y no para limitar la invención. BREVE DESCRIOPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diseño esquemático de una platina de observación de animales con 8 subarreglos por platina y un código de barras. Los puntos llenos y vacíos denotan 15 antigenos virales (P1-P15, puntos llenos) y sus controles negativos respectivos (N1-N15, puntos vacíos) por duplicado. Los puntos sombreados denotan un control positivo (Cl) por duplicado y en diferentes concentraciones. En su arreglo actual, cada platina puede ser utilizada para detectar hasta 8 muestras de suero y hasta 15 virus en cada muestra. El código de barras puede ser utilizado para distinguir las platinas del arreglo. La Tabla 1 proporciona una lista representativa de posibles antígenos virales para una platina de observación de ratón. La Figura 2 es un diseño esquemático de la microplaquita de observación de animal con 16 subarreglos por platina. Similar a la Figura 1, los puntos llenos y vacíos
denotan 15 antígenos virales (P1-P15, puntos llenos) y sus controles negativos respectivos (N1-N15, puntos vacios) por duplicado. Los puntos sombreados denotan un control positivo (Cl) por duplicado y a diferentes concentraciones. En este arreglo, cada platina puede ser utilizada para detectar hasta 16 muestras de suero y hasta 15 virus en cada muestra. La Figura 3 es una representación esquemática de un inmunoensayo de un "antigeno-aba o" utilizando un microarreglo de proteina o microcuentas . La Figura 4 es una representación esquemática de un inmunoensayo de una "intercalación" utilizando un microarreglo de proteina o microcuentas. La Figura 5 es una representación esquemática de un inmunoensayo competitivo utilizando , un microarreglo de proteina o microcuentas. ¦ Las Figuras 6A y 6B demuestran la especificidad de la platina de microarreglo de observación de ratón de la Figura 1. La Figura 6A es una imagen de un subarreglo con una señal positiva para el virus K murino. El subarreglo tiene una disposición de antigeno viral como se muestra en la Figura 1 y Tabla 1, con un antigeno viral para el virus K murino en la posición P15 y el control negativo correspondiente a la posición N15. El subarreglo se incubó con una muestra de suero de ratón que contiene anticuerpo al virus murino. La Figura 6B muestra el análisis de imagen
del microarreglo de virus K murino de la Figura 6A. Pl y NI denotan el antigeno viral 1 y su control negativo en la Tabla 1, y asi sucesivamente para otros antigenos. Las Figuras 7A y 7B demuestran la detección múltiplex de una platina de microarreglo de observación de ratón mediante un escáner colorimétrico . La Figura 7A muestra imágenes de microarreglos de observación de ratón expuestos a diferentes muestras de suero y de control. Las imágenes se capturaron utilizando un escáner SpotWare (TeleChem Internacional, Sunnyvale, CA) . La Figura 7B es el análisis de cuantificación de las imágenes en la Figura 7A con un software comercialmente disponible - GenePix Pro 4.0 (Axon Instruments, Union City, CA) . Las señales colorimétricas de cada infección viral se promedian en puntos por duplicado. Las Figuras 8A y 8B muestran la detección múltiple del microarreglo de observación de ratón mediante un escáner de láser fluorescente (ScanArray 3000, general Scanning, Watertown, MA) . La Figura 8A muestra imágenes de microarreglos de observación de ratón expuestos a diferentes muestras de suero y de control de ratón. El microarreglo se diseño como se muestra en la Figura 1 excepto para los controles positivos. La Figura 8B es un análisis cuantitativo del microarreglo de la Figura 8A con GenePix Pro 4.0 (Axon Instruments, Union City, CA) . Las Figuras 9A y 9B muestran la comparación entre
la detección colorimétrica y fluorescente de la infección viral utilizando microarreglos de observación de ratón. Dos platinas de microarreglo idénticas se utilizaron para la detección colorimétrica y fluorescente de anticuerpos anti-virus en el mismo suero de ratón, respectivamente. Las señales se promedian en puntos por duplicado de cada antigeno viral y sus controles negativos. La Figura 9? muestra las señales positivas normalizadas en los puntos del antigeno viral PVM (P3) . La Figura 9B muestra señales que son normalizadas en los puntos de control negativo del antigeno viral PVM (N3) . La Figura 10 muestra la detección múltiple de antisueros de ratón con ensayos basados en cuentas. Un lector de cuentas Luminex 100 se utilizó para la adquisición de datos y el análisis. Los antigenos virales de ratón y los controles negativos se inmovilizaron en diferentes cuentas recubiertas con color (Luminex, Austin, TX) . Los antisueros de ratón se incubaron con las cuentas, seguido por la incubación del anti-ratón de cabra biotinilado, y el conjugado estreptavidina-PE . Las Figuras 11A-11C muestran la detección múltiplex de antisueros de ratón con microarreglos basados en placa microtitulo de 96 cavidades. La Figura 11A muestra un diseño de subarreglo 4x4 en una cavidad. Pl, P2, P5, NI, N2, N5 se describe en la Tabla 1. PBS y PC son controles negativos y
positivos, respectivamente. La Figura 11B muestra la imagen de arreglo en placa en 4 cavidades bajo diferentes condiciones de ensayo: 1- incubación con un antisuero seguido con anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado (1.0 ug/ml) y estreptavidina-Cy5 (1.0 ug/ml) / 2- incubación con un antisuero seguido con anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado (0.1 ug/ml) y estreptavidina-Cy5 (1.0 ug/ml) ; 3- incubación con un antisuero seguido con anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado (10.0 ug/ml) y estreptavidina-Cy5 (10.0 ug/ml); 4- incubación con un antisuero seguido con anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado (1.0 ug/ml) y estreptavidina-Cy5 (1.0 ug/ml) ; La Figura 11C muestra los resultados del ensayo en términos de la intensidad fluorescente. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "virus de animal" se refiere a cualquier virus que es capaz de la reproducción o propagación en una célula hospedera de animal. Los virus de animales incluyen, pero no están limitados a/ virus de humano, orangután, gorila, chimpancé, mono, ratón, rata, perro, asno, gato, ganado vacuno, caballo, pollo, pato,
cerdo y vaca. Como se utiliza en la presente, el término "muestra biológica" se refiere a muestras biológicas en cualquier forma tal como la sangre entera, suero, plasma, orina, saliva, heces, fluido espinal, células y tejidos, etc. Como se utiliza en la presente, el término "ligando" se refiere a un miembro de un par de enlace de ligando/anti-ligando . El ligando puede ser, por ejemplo, una de las hebras de ácido nucleico en un par de enlace dúplex de ácido nucleico hibridado, complementario; una molécula efectora o receptora en un par de enlace efector/receptor; o un antigeno o anticuerpo en un par de enlace de antigeno/anticuerpo . Como se utiliza en la presente, el término "anti-ligando" se refiere al miembro opuesto de un par de enlace de ligando/anti-ligando. El anti-ligando puede ser la otra de las hebras de ácido nucleico en un par de enlace dúplex de ácido nucleico hibridado, complementario, la molécula receptora o efectora en un par de enlace efector/receptor; o un antigeno o anticuerpo en un par de enlace antigeno/anticuerpo. Un "anticuerpo", como se utiliza en la presente, significa un anticuerpo policlonal o monoclonal. Además, el término "anticuerpo" significa moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina quiméricas o
fragmentos Fab o F(ab')2. Tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpos se pueden producir por técnicas bien conocidas en el arte que incluyen aquellas descritas en Harlow y Lañe (Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) y Kohler y colaboradores, (Nature 256: 495-97 (1975)) y las patentes norteamericanas Nos. 5,545,806, 5,569,825 y 5,625,126, incorporadas en la presente por referencia. De manera correspondiente, los anticuerpos, como se definen en la presente, también incluyen anticuerpos de cadena individual (ScFv) , que 'comprenden dominios VH y VL enlazados y que retienen la conformación y la actividad de enlace especifica del idiotipo nativo del anticuerpo. Tales anticuerpos de cadena individual son bien conocidos en la técnica y se pueden producir por métodos estándares (ver, por ejemplo, Alvarez y colaboradores, Hum. Gene Ther. 8: 229-242 (1997)). Los anticuerpos de la presente invención pueden ser de cualquier isotipo IgG, IgA, IgD, IgE e IgM. Un "anticuerpo anti-virus", como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos que enlazan específicamente a un antígeno no viral . Un "antigeno", ' como se utiliza en la presente, incluye sustancias que la administración a un vertebrado son capaces de inducir una respuesta inmune, para estimular de esta manera la producción y liberación de anticuerpos que
enlazan específicamente al antígeno. Antígeno, como se define en la presente, incluye moléculas y/o porciones que son enlazadas específicamente por un anticuerpo para formar, un complejo de antígeno/anticuerpo . De acuerdo con la invención, los antígenos pueden ser, pero no limitados a, péptidos, polipéptidos , proteínas, ácidos nucleicos, DNA, RNA, sacáridos, combinación de los mismos, fracciones de los mismos, o miméticos de los mismos. Un "antígeno viral", como se utiliza en la presente, incluye un antígeno derivado de un virus, y cualquier' sustancia antigénica que es capaz de inducir una respuesta inmune a un antígeno derivado de un virus, para de esta manera estimular . la producción y liberación de anticuerpos que enlazan específicamente al antígeno derivado de un virus . "Mimético", como se utiliza en la presente, incluye un compuesto químico, una molécula orgánica, o cualquier otro mimético, la estructura del cual está basada en o derivado de una región de enlace de un anticuerpo o antígeno. Por ejemplo, se puede predecir el modelo de las estructuras químicas para imitar las estructuras de una región de enlace, tal como un espiral de enlace de un péptido. Tal modelación puede ser realizado utilizando métodos estándares. En particular, la estructura de cristal de los péptidos y una proteína puede ser determinada mediante cristalografía de
rayos-X de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Los péptidos también pueden ser conjugados a secuencias más largas para facilitar la cristalización, cuando sea necesario. Luego la información de conformación derivada de la estructura de cristal puede ser utilizada para buscar bases de datos de molécula pequeña, que están disponibles en la técnica, para identificar miméticos de péptidos que serian esperados que tengan la misma función de enlace como la proteina (Zhao y colaboradores, Nat . Struct . Biol. 2: 1131-1137 (1995)). Los miméticos identificados por este método pueden ser además caracterizados por tener la misma función de enlace como la molécula originalmente identificada de .interés de acuerdo con los ensayos de enlace descritos en la presente. Alternativamente, los miméticos también pueden ser seleccionados de librerías químicas combinatorias de la misma manera que son los péptidos (ver, por ejemplo, Eichler y colaboradores, Med. Res. Rev. 15: 481-96 (1995); Blondelle y colaboradores, Biochem. J 313: 141-147 (1996); Perez-Paya y colaboradores, J. Biol. Chem. 271: 4120-6 (1996)). Un "arreglo" se refiere ampliamente a un arreglo de agente (por ejemplo, proteínas, anticuerpos) en localizaciones posicionalmente distintas sobre un sustrato. En algunos casos los agentes sobre el arreglo son espacialmente codificados tal que la identidad de un agente
puede ser determinada a partir de su localización en el arreglo . Un "microarreglo" generalmente se refiere a un arreglo en el cual la detección requiere el uso de la detección microscópica para detectar complejos formados con gentes sobre el sustrato. Una "localización" o "punto" sobre un arreglo se refiere a un área localizada en la superficie del arreglo que incluye agentes, cada uno definido de modo que se puede distinguir de localizaciones adyacentes (por ejemplo, que son posicionadas en el arreglo total o que tienen alguna .característica detectable, que permite la localización que sea distinguida de otras localizaciones) . Típicamente, cada localización incluye un solo tipo de agente pero esto no es requerido. La localización puede tener cualquier forma conveniente (por ejemplo, circular, rectangular, elíptica o en forma de cuña) . El tamaño o área de .localización puede variar significativamente. En algunos casos, el área de una localización es mayor que 1 cm2, tal como 2-20 cm2, incluyendo cualquier área dentro de este intervalo. Más típicamente el área de la localización es de menos de 1 cm2, en otros casos menos de 1 rom2, en todavía otros casos menos de 0.5 rara2, en aún todavía otros casos menos de 10, 000 um2, o menos de 100 um2. Un "microarreglo basado en microplaquita/platina", como se utiliza en la presente, se refiere a un microarreglo fabricado sobre un
soporte sólido en la forma de una microplaquita o platina. Un "microarreglo basado en placa de microtitulo", como se utiliza en la presente, se refiere a un microarreglo fabricado sobre el fondo de una cavidad ;de una placa microtitulo, tal como una microplaca de 96 cavidades. Un "microarreglo basado en membrana", como se utiliza en la presente, se refiere a un microarreglo fabricado sobre una membrana de soporte, tal como una membrana de nitrocelulosa . Un "soporte sólido", como se utiliza en la presente, significa cualquier soporte capaz de enlazar un antigeno un anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales o modificadas, poliacrilamidas , gabros y magnetita. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible mientras que la molécula acoplada sea capaz de enlazar un antigeno o ' anticuerpo. Asi, la configuración de soporte puede ser esférica, como en una cuenta, o cilindrica, como en la superficie interior de un tubo de prueba o una cavidad de placa de microtitulo. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una lámina, membrana, tira de prueba, microplaquita, platina, etc. Los soportes preferidos incluyen membrana de nitrocelulosa, platinas recubiertas de nitrocelulosa, placas
de microtítulo de 96 cavidades, y cuentas de poliestireno o carboxilo. Aquellos expertos en la técnica entenderían que muchos otros portadores son adecuados para el enlace de anticuerpo o antígeno, o serán capaces de averiguar lo mismo mediante el uso de la experimentación de rutina. La frase "una pluralidad de...", como se utiliza en la presente, se refiere a dos o más especies en un género. Por ejemplo, una pluralidad de antigenos se refiere a dos o más antígenos . Las frases "específicamente enlaza", "afinidad de enlace específico" (o simplemente "afinidad específica") , "específicamente reconoce", y otros términos relacionados con se. utilizan para referirse al enlace entre una proteína y un anticuerpo, se refiere a una reacción de enlace que es determinativa de la presencia de la proteína en la presencia de una población heterogenia de proteínas y otros materiales biológicos. Así, bajo las condiciones designadas, un anticuerpo específico enlaza preferencialmente a una proteína particular y no enlaza en una cantidad significante a otras proteínas presentes en la muestra. Un anticuerpo que específicamente enlaza a una proteína tiene una constante de asociación de por lo menos 103 M_1 o 104 M_1, algunas veces 105 M"1 o 106 M"1, en otros casos 106 M"1 o 107 M"1, de preferencia 108 M"1 a 109 M"1, y de preferencia, aproximadamente 1010 M"1 a 1011 -1 o más alta. Una variedad de formatos de inmunoensayo
se puede utilizar para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA de fase sólida rutinariamente se utilizan para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína (Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications , New York, para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden ser utilizadas para determinar la inmunorreactividad específica) . Una "marca" se refiere a un agente que puede ser detectado al utilizar métodos físicos, químicos, ópticos, electromagnéticos, electroquímicos y/u otros métodos. Ejemplos de marcas detectables que pueden ser utilizadas incluyen, pero no están limitadas a, radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, marcas de masa, partículas densas de electrones, partículas magnéticas, marcas de spin, moléculas que emiten quimioluminicencia, moléculas electroquímicamente activas, enzimas, cofactores, y sustratos de enzima. Microarreglo y Sistema de Cuentas para Detección Viral La presente invención proporciona procedimientos múltiplex para la detección de infección por virus utilizando microarreglos y la tecnología basada en cuentas. Un aspecto de la presente invención se relaciona a un aparato barato para la detección de alto rendimiento de la infección viral
utilizando procedimientos de multiplexión, tales como microarreglos basados en microplaquita, microarreglos basados en placa de microtitulo, microarreglos basados en membrana y la tecnología de cuentas. El aparato puede ser utilizado para la observación de animales, investigación y aplicación de diagnostico . En una modalidad, la presente invención proporciona un sistema de microarreglo capaz de la detección simultánea de una pluralidad de ligandos objetivo en una pluralidad de muestras de prueba. El sistema de microarreglo comprende anti-ligandos inmovilizados sobre un soporte sólido en la forma de microarreglos basados en microplaquita, microarreglos basados en placa de microtitulo, y microarreglos basados en membrana. Los anti-ligandos son capaces del enlace a ligandos objetivo, tales como antígenos virales y anticuerpos antivirales. El microarreglo de la presente invención se puede fabricar con cualquier formato sobre un soporte sólido adecuado (es decir, un sustrato) . Ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen, pero no están limitaos a, vidrio químicamente recubierto o no recubíerto, y platinas de polímero, varios tipos de membranas hechas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) , nitrocelulosa, nylon y/u otros materiales adecuados, tales como Biotrans (ICN) , Zeta-probe (Bio-Rad) , Colony/Plaque Screen (NEN) , Hybond-N+ (Amersham) ,
Magnacharge (MSI), Magnagraph (MSI) y Hybond ECL (Amersham) , pastillas de silicio químicamente modificadas o no modificadas, varios tipos de placas de microtítulo hechas de poliestireno con o sin recubrimiento, superficies de polímero, filtros porosos hechos de óxido de metal u otros, e hidrogel . Otros ejemplos de materiales de soporte sólidos incluyen silicio, sílice, cuarzo, vidrio, vidrio de poro controlado, carbón, alúmina, titania, óxido de tantalio, germanio, nitruro de silicio, zeolitas y arseníuro de galio. Muchos metales tales como oro, platino, aluminio, cobre, titanio, y sus aleaciones también son opciones para el material de soporte sólido del arreglo. Además, muchas cerámicas y polímeros también se pueden utilizar como material de soporte sólido. Los polímeros que pueden ser utilizados como material de soporte sólido incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: poliestireno; poli (tetra) fluoroetileno (PTFE); polivinildenodifloruro; policarbonato ; polimetilmetacrilato; poliviniletileno; polietilenimina; poli (etereter) cetona; polioximetileno (POM) ; polivinilfenol; polilacturos ; polimetacrilimida (PMI) ; polialquenosulfona (PAS) ; polipropiletileno, polietileno; polihidroxietilmetacrilato (HEMA) ; polidimetilsiloxano; poliacrilamida; polimida; y copolímeros de bloque. El material de soporte sólido preferido para el arreglo incluye
silicio, sílice, vidrio y polímeros. El material de soporte sólido sobre el cual las moléculas de enlace residen también, pueden ser una combinación de cualquiera de los materiales de sustrato mencionados en lo anterior. La geometría del soporte sólido incluye materiales de superficie plana o lisa de 2 dimensiones, pastillas de silicio y vidrio a través de flujo de 3- dimensiones, así como filtros porosos o hidrogeles. Todos esos soportes sólidos pueden ser utilizados con o sin materiales de soporte adicionales para la detección múltiplex de la infección viral. El soporte sólido puede ser fabricado dentro de un cartucho para aplicaciones y operaciones en modos manuales, semi-automáticos o automáticos. Los anti-ligandos incluyen, pero no están limitados a, antígenos virales, anticuerpos antivirus, o cualquiera de otras moléculas capaces de la captura/enlace específico a un anticuerpo antiviral o anticuerpo antivirus, tal como los aptámeros de SomaLogic, Inc. (Boulder, CO) . El aptámero es un oligonucleótido de una sola hebra (generalmente DNA para aplicaciones de diagnóstico) que asume una forma dependiente de la secuencia, específica y enlaza una proteína objetivo basado en un ajuste de cerradura y llave entre las dos moléculas. Los aptámeros son identificados utilizando el proceso RLINK"http : //www . somalogic . com/glossary/glossary .html"\l"selp
rocess"SELEX. Los anti-ligandos pueden ser inmovilizados sobre un soporte sólido a través de interacciones covalentes o no covalentes entre varios grupos funcionales. Una discusión detalladas de tecnologías de inmovilización se pueden encontrar en, por ejemplo, las patentes norteamericanas No. 6,329,209 y 6,305,418, que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Un arreglo de la presente invención opcionalmente puede comprender además un recubrimiento entre materiales de soporte sólido y las moléculas de enlace (es decir, los anti-ligandos) . Este recubrimiento puede ser ya sea formado sobre el material de soporte sólido o aplicado al material de soporte sólido. El material de soporte sólido puede ser modificado con un recubrimiento al utilizar la tecnología de película delgada basado, por ejemplo, en la deposición de vapor física (PVD), deposición de vapor química mejorada con plasma (PECVD) , o procesamiento térmico. Alternativamente, la exposición del plasma se puede utilizar para activar o alterar directamente el material de soporte sólido y crear y recubrimiento. Por ejemplo, los procedimientos de grabado en plasma se puede utilizar para oxidar una superficie polimérica (por ejemplo, poliestireno ó polietileno para exponer las funcionalidades polares tales como hidroxilos, ácidos carboxílicos , aldehidos y los similares) que luego
actúa como un recubrimiento. Los anti-ligandos pueden ser depositados sobre el soporte sólido mediante el micromanchado . El micromanchado comprende tecnologías de deposición que permiten la producción de microarreglo automatizada al imprimir cantidades pequeñas de sustancias bioquímicas pre-hechas sobre superficies sólidas. La impresión se realiza mediante el contacto de superficie directo entre la superficie de un soporte sólido y un mecanismo de suministro, tal como un perno o un capilar. Los sistemas de control robóticos y cabezas de impresión múltiplex permiten la fabricación de microarreglo automatizada. Los anti-ligandos también pueden ser depositados sobre el soporte sólido al suministrar contacto con válvulas de cerámica o de microsolenoide piezo-eléctricas . Otras tecnologías para la producción de microarreglo incluyen la fotolitografía y las tecnologías de chorro de tinta. Los métodos para fabricar microarreglos son descritos en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,807,522 de Brown y colaboradores, patente norteamericana No. 6,110,426 de Shalan y colaboradores y la patente norteamericana No. 6,139,831 de Shivashankar y colaboradores, que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Dependiendo de la aplicación, un solo microarreglo puede ser inmovilizado con anticuerpos a, o antígeno de,
docenas o aún cientos de virus, y múltiples anticuerpos específicos virales/antígenos pueden ser utilizados para cada virus. Los puntos en el microarreglo cada uno puede representar una especie diferente de proteína o los múltiples puntos en el microarreglo pueden representar la misma especie de proteína. Diferentes anticuerpos a, o antígenos de, el mismo virus pueden ser manchados individualmente o en una mezcla. Como es bien conocido para un experto en la técnica, controles positivos y negativos también son incluidos en cada microarreglo. Las concentraciones de anticuerpos/antígenos depositados sobre microarreglos serán optimizadas en términos de intervalos dinámicos, sensibilidad y especificidad del ensayo. La eficiencia de inmovilización de proteínas sobre un soporte sólido depende de varios factores incluyendo la concentración de las proteínas, el tiempo de inmovilización y los medios ambientes después del manchado (temperatura y humedad, etc.), y las condiciones de almacenamiento (temperatura y humedad, etc. ) . En una modalidad de la invención, el microarreglo de la presente invención tiene una densidad de por lo menos 5 puntos/cm2, de preferencia por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o
,000 puntos/cm2. En otra modalidad, múltiples microarreglos se fabrican en una sola platina o microplaquita para la detección simultánea de la infección viral en múltiples muestras . La Figura 1 muestra una platina de detección de virus de animal representativa que puede ser utilizado para detectar hasta 8 muestras de sueros y hasta 15 infecciones por virus en cada muestra. La Figura 2 muestra una platina con un formato más compacto que permite la detección de hasta 16 muestras de suero y hasta 15 infecciones por virus en cada muestra. La tabla 1 muestra una lista representativa de antigenos virales para una microplaquita de microarreglo de observación de ratón. Típicamente, cada antígeno viral y su control negativo están presentes por duplicado. El arreglo también incluiría controles positivos que reaccionan con el sistema de marcación en la ausencia de un ligando objetivo. La platina de detección opcionalmente contiene un código de barras que es utiliza para identificar la platina. Tabla 1. Disposición del antígeno viral sobre un microarreglo de observación de ratón Antigeno Antigeno Descripción del Antigeno Viral Positivo Negativo Pl NI MHV (Virus de hepatitis de ratón) P2 N2 MVM (Virus diminuto de ratón) P3 N3 PVM (Virus de neumonía de ratón)
P4 N4 Sendai (Parainfluenza 1) P5 N5 Polioma P6 N6 Ectromelia (pox de ratón) P7 N7 Reovirus 3 P8 N8 TMEV (Virus de Theiler, GD, VII) . P9 N9 EDIM (Rotavirus de ratón) PIO NIO MSGV (Citomegalovirus de ratón) Pll Nll Herpesvirus 68 P12 N12 Adenovirus de ratón (FL) P13 N13 Adenovirus de ratón (K87) P14 N14 LCM (coriomeningitis Limfocitica) En otra modalidad, los microarreglos de la presente invención se fabrican en el fondo de una cavidad de la placa de microtitulo de 96 cavidades, tal como la Microplaca High Bind de poliestireno de 96 cavidades Corning® (negra con el fondo plano claro) . Características deseadas de la placa de microtitulo para la fabricación de microarreglo de proteína incluyen la superficie de enlace de alta afinidad para las biomoléculas medianas y grandes (>10kD) que poseen grupos iónicos y/o regiones hidrofóbicas ; y la capacidad de enlace grande en el intervalo de 100 a 2000 ng IgG/cm2, de preferencia en el intervalo de 300 a 600 ng IgG/cm2, y más de preferencia en el intervalo de 400 a 500 ng IgG/cm2. Las placas de microtitulo adecuadas para la fabricación del microarreglo deben tener fondos de la cavidad delgada que
proporcionan fluorescentes de fondo inferiores . y permiten longitudes de onda de lectura por debajo d 340 ron. Las placas también deben ser diseñadas para reducir el cruzamiento de cavidad a cavidad durante los erisayos fluorescentes, conformar a las impresiones y dimensiones de microplacas estándares, y adecuadas para el uso en instrumentos de lectura tanto de la parte' superior como del fondo. Las cavidades de la placa de microtitulo pueden tener un volumen del trabajo de 25 a 400 µ?, de preferencia 75 a 200 µ? . La fabricación del microarreglo en una placa de microtitulo se describe en por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,803,238, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Los microarreglos basados en placa de microtitulos se pueden utilizar para detectar la infección viral en un modo de. alto rendimiento y son fácilmente adaptables a los procesos automáticos de ELISA basados en placas estándares, tal como el suministro de muestra o reactivo, incubación y las etapas de lavado. En otra modalidad, el microarreglo de la presente invención se fabrica sobre un soporte de membrana, tal como una membrana de microcelulosa . Métodos para la Detección Viral Utilizando el Microarreglo Otro aspecto de la presente invención se relaciona a métodos para detectar la infección viral utilizando el microarreglo de la presente invención. Típicamente, el
microarreglo se incuba con una muestra de prueba para capturar cualquier ligando objetivo en la muestra de prueba. En la presencia de uno o más ligandos objetivo es indicativa de una o más infecciones por virus en el sujeto del cual se obtiene la muestra de prueba. En una modalidad, los ligandos objetivo son anticuerpos anti-virus y los ligandos son capturados a través de un llamado inmunoensayo "antigeno-aba o". Como se muestra en la Figura 3, los anti-ligandos sobre el microarreglo comprenden antigenos virales inmovilizados. Cada punto del arreglo puede comprender un antigeno viral inmovilizado o mezcla de antigenos virales sobre cada punto del arreglo. Una primera incubación permite que un anticuerpo especifico de virus en una muestra de prueba (por ejemplo, un suero de animal) se ha capturado por el antigeno viral inmovilizado sobre la superficie del arreglo. La segunda incubación permite que el anticuerpo secundario marcado enlace al anticuerpo especifico de virus capturado y produzca una señal sobre el punto del arreglo correspondiente. Dependiendo de la naturaleza de la técnica de detección utilizada, la proteina objetivo marcada o varios reactivos de detección marcado (por ejemplo, anticuerpos marcados o paquetes marcados) se pueden utilizar para detectar la formación de un complejo entre una proteina objetivo y el reactivo de paquete/anticuerpo. Una variedad de
diferentes marcas pueden ser utilizados en estos esquemas de detección. Las proteínas, anticuerpos o paquetes pueden ser marcados con cualquiera de una variedad de diferentes tipos de marcas, siempre y cuando la marca no interfiera con la formación de un complejo entre un reactivo de paquete/anticuerpo y una proteína objetivo y pueda generar una señal detectable una vez que se forma tal complejo. Las marcas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, radiomarcas, marcas de quimioluminiscencia, cromóforos, agentes densos de electrones, marcas de spin NMR, una etiqueta química adecuada para la detección en un espectrómetro de masas, agentes detectables por espectroscopia infrarroja o espectroscopia NMR y sustratos de enzima o cofactores por ejemplo. Las radiomarcas, particularmente para proteínas espacialmente resueltas, pueden ser utilizada utilizando formadores de imagen de fósforo y técnicas fotoquímicas. Ciertos métodos utilizan fluoróforos puesto que varios detectores comerciales para detectar la fluorescencia de proteínas marcadas están disponibles. Una variedad de moléculas fluorescentes pueden ser utilizadas como marcas incluyendo, por ejemplo, fluoresceína y derivados de fluoresceína, rodamina y derivados de rodamina, naftitilamina y derivados de naftilamina, benzamidizoles, etiidios, propidios, antraciclinas, nitramicinas , acridinas,
actinomicinas , merocianinas , coumarinas, pirenos, crisenos, estilbenos, antracenos, naftalenos, ácidos salicilicos, benz-2-oxa-l-diazoles (también llamados benzofurazanos) , fuorescaminas y tintes Bodipy. Mientras que la marcación de fluorescencia se ha utilizado ampliamente en tecnologías de _ microarreglo debido a los beneficios de los fluoróforos estables y baratos, la alta sensibilidad y la seguridad ambiental, la detección de fluorescencia requiere instrumentación costosa. Además, la autofluorescencia en la superficie de la microplaquita, que causa más alto fondo y menor relación de señal a ruido, también limita la aplicación de la fluorescencia en las tecnologías de microarreglo. Las estrategias de detección novedosas · tales como la formación de imagen colorimétrica proporcionan un método de detección alternativo en los sistemas basados en microarreglo múltiples. Una de las características atractivas de la detección colorimétrica es el bajo fondo. La formación de imagen de fluorescencia, se necesita una fuente de excitación en ciertas cantidades de señal son generadas en áreas de microarreglo cuando el fluoróforo no está presente. En la formación de imagen colorimétrica, sin embargo, los fotones se generan solamente donde los reactivos tal como las enzimas de marcaciones están presentes. Consecuentemente, la radiación no específica es significativamente reducida. Además, la formación de imagen
colorimétrica no tiene los problemas relacionados con la fuente de excitación, tal como el calentamiento y el desplazamiento de la fuente de luz, y la interferencia de la dispersión de luz. Otra característica atractiva de la detección colorimétrica es su bajo costo (un escáner colorimétrico basado en CCD con software asociado para la captura de imagen y los costos de análisis en una fracción de un equipo de exploración fluorescente comparable) . La tecnología de exploración fluorescente de complementación, el sistema colorimétrico permite a los investigadores utilizar el espectro amplio de las marcas pigmentadas incluyendo los productos de peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina (AP) , reveladores de oro-plata, y cualquier otro sistema de marcación que produce un precipitado de reacción pigmentado . En una modalidad preferida, el anticuerpo antivirus capturado en un microarreglo de "antígeno-abaj o" se detecta al utilizar .un anticuerpo secundario biotinilado marcado con enzima seguido por la incubación con un conjugado de estreptavidina-fluoróforo (para la detección de fluorescencia) o un sustrato de enzima (para la detección colorimétrica) . En otra modalidad, la presente invención proporciona un microarreglo de anticuerpo que contiene
anticuerpos específicos de antígeno viral inmovilizado sobre su superficie. Como se muestra en la Figura 4, el microarreglo puede ser utilizado en un ensayo de "intercalación" en el cual el anticuerpo en el microarreglo captura un antígeno específico (por ejemplo, un antígeno de superficie viral) en la muestra de prueba y el antígeno capturado es detectado por , un anticuerpo secundario marcado específicamente enlaza el antígeno viral capturado. En una modalidad preferida, el anticuerpo secundario es biotinilado marcado con enzima. La detección se logra mediante la incubación subsecuente con un conjugado de estreptavidina-floróforo (para la detección de fluorescencia) o un sustrato de enzima (para la detección colorimétrica) . Típicamente, un ensayo múltiplex contiene múltiples etapas de incubación, incluyendo la incubación con las muestras y la incubación con varios reactivos (por ejemplo, anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, reactivos de reporte, etc.) . También se necesitan lavados repetidos entre las etapas de incubación. Los ensayos múltiples de la presente invención se pueden realizar en un modo de ensayo rápido que requiere solamente una o dos incubaciones. Por ejemplo, un microarreglo de antígeno puede ser primero incubado con las muestras, y luego con una mezcla de los anticuerpos primarios y secundarios, o con una mezcla de los anticuerpos primarios, los anticuerpos secundarios y los
reactivos de manchado. También es concebible que la detección de un complejo inmune detectable (por ejemplo, un complejo de anticuerpo antivirus/anti-Ig/marca capturada) puede ser logrado en una sola etapa de incubación al exponer el microarreglo de proteina a una mezcla d la muestra y todos los reactivos necesarios. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un inmunoensayo competitivo utilizando un microarreglo de anticuerpo. Brevemente, un microarreglo que comprende anticuerpos antivirus inmovilizados se incuba con una muestra de prueba en la presencia de un estándar de antígeno viral marcado (Figura 5). El antígeno viral marcado compite con el antígeno viral no marcado en la muestra de prueba para el enlace al anticuerpo específico de antígeno inmovilizado. En tal arreglo competitivo, una concentración incrementada del antígeno viral específico en la muestra de prueba conduciría a un enlace disminuido del estándar de antígeno viral marcado al anticuerpo inmovilizado y por consiguiente una intensidad de señal reducida a partir de la marca . Los microarreglos de la presente invención pueden ser procesados en modos manuales, semiautomáticos o automáticos . El modo manual se refiere a las operaciones manuales para todas las etapas del ensayo e incluyendo el suministro reactivo y la muestra sobre los microarreglos, la
incubación de la muestra y el lavado del microarreglo. Los modos semiautomáticos se refieren a la operación manual para el suministro de la muestra y el reactivo sobre el microarreglo, mientras que la incubación y las etapas de lavado operan automáticamente. En un modo automático, tres etapas (suministro de muestra/reactivo, incubación y lavados) se puede controlar mediante una computadora o una unidad de tablero integrado con un teclado. Por ejemplo, un microarreglo de antigeno puede ser procesado con un ProteinArray Workstation (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) o Assay 1200™ Workstation (Zyomyx, Hayward, CA) . Varios dispositivos ópticos, incluyendo cámaras de CCD o PMT o escáneres de linea de CCD por fluorescencia, colorimétrico y de quimioluminiscencia, se pueden utilizar para detectar la señal de microarreglo y capturar imágenes de microarreglo. La cuantificación de los ensayos basados en microarreglo también se puede lograr por otros medios, tal como la espectrometría de masas y la resonancia del plasma de superficie. Las imágenes de microarreglo capturadas pueden ser analizadas mediante el software de análisis de imagen establecido o con adquisición de imagen y el paquete de software de análisis. Por ejemplo, la cuantificación de un microarreglo de antígeno se puede lograr con el escáner basado en PMT fluorescente - ScanArray 3000 (General Scanning, Watrtown, MA) o el escáner basado en CCD
colorimétrico - VisionSpot (Allied Biotech, Ijamsville, MD) . Típicamente, el análisis de la imagen incluiría la adquisición de datos y la preparación de reporte de ensayo con paquetes de software separados. Para agilizar el proceso de ensayo completo desde la captura de una imagen para generar un reporte de ensayo, todas las etapas analíticas incluyendo la captura de imagen, análisis de imagen y generación de reporte se pueden confinar en y/o controlar por un paquete de software. Tal sistema de control unificado proporcionaría el análisis de imagen y la generación de reporte de ensayo de una manera favorable para el usuario. Sistema de Cuentas y Método de Ensayo Otro aspecto de la presente invención se relaciona a la utilización de inmunoensayos basados en cuentas para la detección de infecciones virales. En un ensayo basado en cuentas las reacciones moleculares toman lugar en la superficie de las cuentas microscópicas. Las cuentas se pueden hacer de una variedad de materiales tales como poliestireno, hidrofísicamente o químicamente modificado, silicio, óxidos de metal, y otros materiales que tienen superficies que contienen grupos carboxilo. Los ligandos objetivo (por ejemplo, antígenos virales o anticuerpos antivirus) se pueden movilizar covalentemente sobre la superficie de la cuenta carboxilada (COOH) mediante el acoplamiento de amina con reactivos, tales
como l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisulfosuccinimida (S-NHS) . Otros procedimientos incluyen inmovilización de antigenos o anticuerpos sobre superficies de cuentas que contienen grupos aldehido o epoxi. Los antigenos o anticuerpos también pueden ser no covalentemente inmovilizados sobre la superficie de la cuenta de enlace de alta proteina, tales como superficies recubiertas con varios polímeros. Las cuentas son internamente codificadas en color con tintas fluorescentes y la superficie de la cuenta es marcada con un antiligando (por ejemplo, un antigeno viral o un anticuerpo anti virus) que puede enlazar un ligando objetivo en una muestra de prueba. El ligando objetivo, a su vez, · es ya sea directamente marcado con una marca fluorescente o indirectamente marcado con un antiligando conjugado a una marca fluorescente. Por consiguiente, hay dos fuentes de color, una de la cuenta y la otra de la marca fluorescente. Alternativamente, las cuentas pueden ser internamente codificadas por diferentes tamaños. Al utilizar una mezcla de diferentes intensidades fluorescentes a partir de los dos tintes, asi como las cuentas de diferentes tamaños, el ensayo puede medir hasta cientos de diferentes ligandos objetivo. Durante el ensayo, una mezcla que contiene las cuentas de color/codificadas en tamaño, los antiligandos marcados con fluorescencia, y la
muestra se combinan y se inyectan un instrumento que utiliza material fluidico de precisión para alinear las cuentas. Las cuentas luego pasan a través de un láser y, en la base de su color o tamaño, ya sea que se clasifican o se miden para la intensidad de color, que es procesado en datos cuantitativos para cada reacción. Cuando las muestras se marcan directamente con fluoróforos, el sistema puede leer y cuantificar solamente la fluorescencia sobre las cuentas sin remover los fluoróforos no enlazados en solución. Los ensayos pueden ser multiplexados al diferenciar varias cuentas de color o de tamaño. La medición en tiempo real es lograble cuando una muestra se marca directamente con fluoróforos. Típicamente, un anticuerpo secundario marcado con fluoróforo es requerido para las muestras no marcadas. Las etapas de ensayo estándares incluyen la incubación de una muestra con cuentas recubiertas con antiligando, la incubación con el anticuerpo secundario marcado con fluoróforo o biotin, en la detección de las señales de flourescencia . Las señales fluorescentes pueden ser desarrolladas sobre la cuenta (al adicionar conjugados de estreptabidina-fluoróforo para el anticuerpo secundario biotinilado) y leídas .mediante un analizador de cuentas. Dependiendo del antiligando inmovilizado sobre la superficie de la cuenta, un inmunoensayo basado en cuentas puede ser un inmunoensayo de tipo antígeno-abaj o (Figura 3) ,
un tipo de intercalación (Figura 4), o un inmunoensayo de tipo competitivo (Figura 5) . Equipos La presente invención también se relaciona a un equipo de detección viral que contiene (1) un sistema de detección de infección viral basado en microarreglo y/o un sistema de detección de infección viral basado en cuentas como es descrito en lo anterior y (2) uno o más reactivos requeridos para realizar el ensayo de detección. Los reactivos pueden incluir, pero no están limitados a, anticuerpos secundarios marcados, antigenos marcados, sustratos de enzima, reactivos de bloqueo y soluciones reguladoras de lavado. Como es descrito en la presente, el microarreglo y el sistema de cuentas de la presente invención se puede utilizar para la detección de la infección por virus en humanos y animales. La Tabla 1 proporciona una lista representativa de virus de murino que pueden ser detectados por el microarreglo y el sistema de cuentas de la presente invención. Un experto en la técnica entendería que el microarreglo y sistema de cuentas de la presente invención puede ser utilizado para la detección de infecciones virales en humanos causadas por, por ejemplo, el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , virus de herpes simple (HSV, virus de chickenpox (virus de varicela-zoster o VZV) , virus
sincitial respiratorio (RSV) , virus de Epstein-Barr, citomegalovirus (CMV) , rotavirus, virus de hepatitis, papilomavirus humano (HPV) y virus de influenza. También es concebible utilizar el microarreglo y el sistema de puentes de la presente invención para la detección de infección " viral en otros animales de laboratorio, tales como ratas, conejos, hurones, y conejillos de indias, en animales de granja tales como caballos, ganado vacuno, ovejas, cabras, cerdos, pavos, pollos, patos, gansos, alces y llamas, y en mascotas tales como gatos y perros. Por ejemplo, un microarreglo de observación de rata puede ser manufacturado para detectar infecciones causadas por el virus de rata Kilham. (KRV) , virus reo tipo 3 (REO 3) , virus de pneumonía de rata (PVM) , virus sendai, virus de sialodacroadenitis (SDAV) , adenovirus de ratón (MADFL) , virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV) , virus de encefalomielitis (GD VIII) y virus Toolan Hl (Hl) . De manera similar, un microarreglo de observación de ganado vacuno puede ser manufacturado para detectar enfermedades virales tal como la fiebre aftosa, leucosis bovina enzootica, lengua azul, epizoótica, enfermedad hemorrágica de venado, rinderpest, enfermedad de Arkabane, enfermedad de diarrea mucosal viral bovina, rinotraqueitis bovina infecciosa, paratuberculosis, brucelosis, tuberculosis, canfilobacteriosis bovina y ántrax. Ejemplos
Ejemplo 1: Microarreglo de observación de ratón Se produjo un microarreglo de antigeno para la detección simultánea de hasta 14 infecciones por virus en el suero de ratón. El microarreglo se fabricó al depositar 14 antigenos virales y sus controles negativos, ambos de los cuales son productos comerciales (Churchill Applied Biotechnology Ltd, UK) en una disposición como se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1. Los antigenos virales se derivaron del cultivo de células o huevecillos junto con extractos de ese cultivo y medio. Los controles negativos se prepararon de una manera idéntica con la excepción de que el cultivo no se sembró con el virus. Las tinas recubiertas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell Bioscience, Inc., Keene, NH) se utilizaron como sustratos de microplaquita . Una inmunoglobina G (IgG) de ratón se utilizó como los controles positivos. Las microplaquitas manchadas se secaron con aire durante 2 horas y estuvieron listas para el uso. Ejemplo 2: Especificidad del microarreglo de observación de ratón . Antes de cargar los antisueros de ratón infectados
(Churchill Applied Biotechnology Ltd, UK) , el microarreglo de observación de ratón se incubó con Tris-solución reguladora (pH 7.2) durante 15 minutos para deslavar los antigenos no enlazados. El microarreglo de observación de ratón luego se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con 30 ul de un
suero de ratón de virus K anti-murino en una dilución de 1:1600 con solución salina regulada con Tris, pH 7.2. El microarreglo se lavó después de la primera incubación, se incubó con un anticuerpo anti-ratón de cabra biotinilado durante 1 hora, se lavó nuevamente, y luego se incubó con el conjugado estreptavidina-Cy5 durante 30 minutos. La imagen ' de fluorescencia se capturó mediante un escáner fluorescente y se analizó con el software de análisis de imagen. Como se muestra en la Figura 6A, solamente el virus K de murino y los puntos de control positivos se levantaron después de las incubaciones. Las señales de fluorescencia se cuantificaron en la Figura 6B. En el siguiente conjunto de experimentos, dos cócteles de antisuero de ratón, designados Suero 1 y 2 de Ratón Infectado, se prepararon al mezclar 4 y 6 diferentes antisueros de ratón, respectivamente. Específicamente, el Suero 1 de Ratón Infectado contiene antisueros al virus Sendai, EDIM, adenovirus FL de ratón (MAD FL) y RE03; y el Suero 2 de Ratón Infectado contiene antisuero a PVM, Sendai, EDIM, MAD FL, RE03 y adenovirus de ratón K87 (MAD K87) . Después de una incubación de 15 minutos con una solución reguladora de tris (pH 7.2) para deslavar los antígenos no enlazados, el microarreglo de observación de ratón se incubó con ya sea el Suero 1 de Ratón Infectado o el Suero 2 de Ratón Infectado durante 2 horas a la temperatura ambiente
para evaluar la especificidad de los ensayos. Los microarreglos luego se lavan son solución salina regulada con Tris, pH 7.2, se incuba durante 1 hora a la temperatura ambiente con una peroxidasa biotinilada o de rábano picante (HRP) anticuerpos secundarios marcados específicos para IgG de ratón se incubó con los arreglos durante 1 hora. Seguido por una incubación con el sustrato de color de Estreptavidina-Cy5 o HRP para la generación de señal de enlace. La imagen de fluorescencia de color se capturó mediante un escáner fluorescente o colorimétrico y se analizó con el software de análisis de imagen. El volumen de la • muestra o reactivo requerido en cada etapa fue de 35 µ? por microarreglo . La Figura 7A muestra los resultados de microarreglo de observación de ratón detectado por un escáner colorimétrico. Las señales se desarrollaron solamente sobre los puntos virales interaccionados con los anticuerpos específicos existentes en el suero infectado. Hubo pocas señales en el arreglo incubado con el suero de ratón sano diferente a los controles positivos . Los resultados se cuantifican en la Figura 7B. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que el microarreglo de observación de ratón proporciona la detección específica de antisuero a una variedad de antígenos virales. Los microarreglos pueden ser utilizados para detectar simultáneamente múltiples infecciones virales en
sueros de ratones. Además, el ensayo multiplex y barato puede ser completado en aproximadamente tres horas con pequeñas cantidades de muestras o reactivos y en modos potencialmente automáticos y de alto rendimiento. Ejemplo 3: Detección múltiplex de la infección viral de animal utilizando ensayos de microarreglo fluorescentes y colorimétricos . En este experimento, dos platinas de microarreglo de antigeno idénticas se utilizaron para la detección colorimétrica y fluorescente, respectivamente. Los microarreglos de antigeno se incubaron con el Suero 2 de Ratón infectado por 1 hora a temperatura ambiente (seguido por la incubación con el anticuerpo antiratón de cabra marcado con HRP (Platina colorimétrica) o anticuerpo antiratón de cabra biotinilado (platina fluorescente) durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego con el sustrato de color HRP (platina colorimétrica) o Estreptavidina-Cy5 (platina fluorescente) durante 30 minutos). Las imágenes del ensayo se capturaron mediante un escáner de láser fluorescente - ScanArray 3000 (General Scanning, Watrtown, MA) o el escáner de CCD colorimétrico - VisionSpot (Allied Biotech, Ijamsville, MD) . El análisis de cuantificación de imágenes capturado se realizó utilizando el software disponible comercial - GenePix Pro 4.0 (Axon Instruments, Union City, CA) . Las señales se promediaron en puntos
duplicados de cada antigeno viral y sus controles negativos. Las Figuras 8A y 8B muestran la imagen fluorescente de microarreglo y la intensidad de señal relativa, respectivamente. Como se muestra en las Figuras 9A y 9B, el método colorimétrico barato logró la sensibilidad de ensayo similar y la especificidad para la formación de imagen de microarreglo como la detección fluorescente demostrado en las Figuras 8A y 8B. Ejemplo 4: Detección Múltiplex de la infección viral de animal utilizando inmunoensayos basados en cuentas Los inmunoensayos de múltiplex para la medición simultánea de múltiples infecciones virales de animales en un solo ensayo se logró utilizando los arreglos basados en cuentas, donde los antigenos virales fueron inmovilizados en las diferentes cuentas marcadas fluorescentes y el ensayo se detectó mediante un lector de cuentas. Se utilizó un Equipo de Acoplamiento de Amina Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA) para inmovilizar los antigenos virales (Charles river, ilmington, MA) en cuentas de COOH (Carboxilado) Bio-Plex (Luminex, Austin, TX) y el procedimiento en el equipo fue seguido para la activación de la cuenta y el acoplamiento del antigeno viral. Los ensayos de cuentas se corrieron en el lector de cuentas Luminex 100 (Luminex, Austin, TX) con la adquisición de datos y el software de análisis de Applied Cytometry System, Sacramento,
CA. Brevemente, la placa de filtro de 96 cavidades Pre húmeda con solución reguladora de ensayo en el Equipo de Ensayo de Citoquina Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA) . La solución reguladora se removió mediante el múltiple de vacio de placa de filtro (Millipore, Billerica, MA) . La solución de trabajo de las cuentas múltiples se giró en vórtice y se pipeteó en cada cavidad. Los antigenos no conjugados y la solución reguladora luego se removió. Los anticuerpos anti virus en los antisueros se detectaron a través de un procedimiento que contiene tres incubaciones con las cuentas a temperatura ambiente, y tres ' etapas de lavado, una después de cada incubación. Las tres incubaciones son: (1) incubar las cuentas con antisuero de ratón (Charles River, Wilmington, MA) durante 1 hora; (2) incubar el antiratón de cabra biotinilado con las cuentas .durante 30 min; y (3) incubar la estreptavidina-PE con las cuentas durante 10 min. Las cuentas se lavaron después de cada incubación y se leyeron mediante un lector de microplaca Luminex 100 en una placa de filtro de 96 cavidades. La tabla 2 resumió los resultados del ensayo de cuentas para la detección múltiple de tres infecciones virales de ratón, donde P2, P3 y P6 denotan los antigenos positivos y N2, N2 y N6 denotan antigenos negativos como es descrito en la Tabla 1; la mezcla de antisuero de ratón (2, 3, 6) se refiere a la mezcla de antisuero de ratón especifico para los antigenos P2, P3 y P6. Los resultados del ensayo
mostrados en la Tabla 2 y la Figura 10 indican la detección exitosa de las tres infecciones virales de ratón en una mezcla de tres antisueros de ratón utilizando ensayos múltiplex basados en cuentas. Tabla 2. Ensayos múltiplex basados en cuentas para la observación de ratones
Ejemplo 5: Detección múltiplex de la infección viral de ratón utilizando microarreglos basados en microplaca de 96 cavidades La detección múltiplex de múltiples infecciones virales de ratón se logró utilizando microarreglos basados en microplacas de 96. cavidades, de los antigenos virales de ratón se inmovilizaron en el fondo de una cavidad. Los antigenos virales de ratón positivos, Pl (16 ug/ml en PBS) , P2 16 ug/ml en PBS) y P5 (19 ug/ml en PBS) y los controles negativos relevantes, NI (16 ug/ml en PBS) , N2 (16 ug/ml en PBS) y N5 (19 ug/ml en PBS) como se describe en la Tabla 1 se depositaron en cavidades de una placa negra con fondo claro, de poliestireno Corning Costar 3712 (Corning, Acton, MA) utilizando · el manchador Radius 3XVP (Radius Biosciences,
Gaithersburg, MD) . El diseño del arreglo se mostró en la Figura 11 (A) . Los arreglos de placa manchados se conservaron en 4°C durante la noche. Antes de cargar los antisueros de ratón infectados (Churchill Applied Biotechnology Ltd, UK) , los arreglos de placas se incubaron con solución reguladora de lavado de PBS (pH 7.2, Tween-20 0.2%) por 3 veces. Los antisueros de ratón (P2 & P5) en dilución de 1:100 en PBS (pH 7.2) se incubaron con los arreglos (40 mi por cavidad) durante 2 horas. El anticuerpo secundario biotinilado especifico para IgG de ratón se incubó con los arreglos durante 1 hora. La estraptividina-Cy5 se adicionó en los ' arreglos " para el desarrollo de fluorescencia de los puntos de enlace. Las imágenes de fluorescencia de los arreglos de placa se capturaron por AlphaArray 7000 (Alpha Innotech, San Leandro, CA) y GenePix 4.0 (Axon Instruments, Union City, CA) se utilizó para el análisis de imagen del arreglo. La Figura 11 muestra los resultados del ensayo de los arreglos en placa indicando la detección exitosa de las infecciones virales de ratón 2 (P2 y P5) simultáneamente. Hay pocas señales fluorescentes desarrolladas para los controles negativos y los puntos de antigeno Pl, que confirma la especificidad del ensayo de los microarreglos basados en placa para la detección múltiplex de antisueros de ratón. Las descripciones anteriores detallan las
modalidades actualmente preferidas de la presente invención. Numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de las mismas se esperan que se les ocurran a aquellos expertos en la técnica en consideraciones de estas descripciones. Esas modificaciones y variaciones se creen que están comprendidas dentro de las reivindicaciones adjuntas a la presente. Todos los documentos citados en esta solicitud son incorporados por referencia en su totalidad. Adicionalmente, todas las secuencias citadas en bases de datos y todas las referencias divulgadas son incorporadas por referencia en su totalidad.