DE19502386A1

DE19502386A1 - Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Tests durch Zusatz von kleinen Hitzeschockproteinen

Info

Publication number: DE19502386A1
Application number: DE1995102386
Authority: DE
Inventors: Christoph Dr Hergersberg; Dorothee Dr Ambrosius; Alfons Dr Nichtl; Ursula-Henrike Wienhues-Thelen
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1995-01-26
Publication date: 1996-08-01
Also published as: EP0871882A1; WO1996023224A1; JPH10512676A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immuno logisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabili sators dafür sowie die Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung.

Der Einsatz von Antigenen und insbesondere von rekombinanten oder chemisch synthetisierten Peptid- oder Polypeptid-Antigenen in immunologischen Bestimmungsverfahren ist aus dem Stand der Technik bekannt. Beim Nachweis von Peptid- oder Polypeptid- Analyten werden Lösungen, die eine bekannte Konzentration des Analyten enthalten, beispielsweise zur Kalibrierung benötigt. In Testsystemen zur Bestimmung von spezifischen Antikörpern werden immunologisch mit dem zu bestimmenden Antikörper reaktive Peptide oder Polypeptide zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis des Antikörpers verwendet. Bei der artigen immunologischen Bestimmungssystemen ist die Stabilität der Peptide oder Polypeptide von wesentlicher Bedeutung, um einerseits die Linearität des Tests und ein gutes Signal- Rausch-Verhältnis sicherzustellen und andererseits eine zuverlässige Reproduzierbarkeit des Bestimmungsergebnisses über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten.

Aus dem Stand der Technik ist eine Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Testlösungen durch Zusatz von unspezifischen Proteinen (z. B. RSA) oder von Puffersystemen (Salz, pH-Wert etc.) bekannt. Diese Stabilisierungsmethoden führen jedoch im allgemeinen nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen und insbesondere rekombinante oder chemisch synthetisierte Peptide oder Polypeptide zeigen eine Neigung zur Aggregation und Adsorption, die durch die genannten Stabilisie rungsverfahren nicht ausreichend beseitigt werden kann.

Aus dem Stand der Technik ist auch bekannt, daß Hitzeschock proteine denaturierte Proteine binden können (Ang et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 24244-24236). Es ist weiterhin bekannt, daß Proteinlösungen durch Zugabe von Hitzeschockproteinen stabilisiert werden können, wobei diese stabilisierende Wirkung insbesondere auf einer Verhinderung der Bildung von unlöslichen Aggregaten beruht.

Es wird jedoch angenommen, daß Proteine, die an Hitzeschock proteine gebunden sind, im allgemeinen nicht in ihrer nativen Konformation vorliegen. Mayer-Hartl et al., EMBO J. 13 (1994), 3192-3202 berichten beispielsweise, daß an GroEL (hsp60 aus E.coli) gebundene Proteine in einer offenen Struktur, der sogenannten "molten globule" Struktur, vorliegen. Aufgrund dieser Konformationsänderung ist nicht gewährleistet, daß Peptide und Polypeptide, die durch Bindung von Hitzeschock proteinen stabilisiert werden, ihre für die Anwendung in immunologischen Testverfahren notwendigen strukturellen Merkmale aufweisen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß immunologisch reaktive Bereiche auf Peptiden und Polypeptiden durch die Anwesenheit von Hitzeschockproteinen maskiert werden.

In der DE-OS 42 39 969 ist ein Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen in wäßriger Lösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine (kleine hsp′s) offenbart. Über die immunologischen Eigen schaften von an kleine hsp′s gebundenen Proteinen gibt es jedoch keine Daten.

Es war somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Stabilisierung von Antigenen in wäßriger Lösung bereitzustellen, bei dem die obengenannten Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weitgehend beseitigt sind.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immuno logisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabili sators dafür, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Stabilisator ein oder mehrere Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine (kleine hsp) umfaßt.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die kleinen hsp fähig sind, Peptide und Polypeptide in Lösung zu stabilisieren, ohne deren immunologische Eigenschaften zu beeinträchtigen.

Bei der Familie der kleinen Hitzeschockproteine handelt es sich um eine heterogene Gruppe von Proteinen mit einem oder mehreren Vertretern in Hefen (hsp 26), Vertebraten (hsp 24, hsp 28), Drosophila (hsp 22, 23, 26, 28), Maus (hsp 25) und über 20 Proteinen in Pflanzen (Nover & Schaft, Eur. J. Biochem. 139 (1984), 303-313; Lindquist & Craig, Ann. Rev. Genet. 22 (1988) 631-677). Ihre Molekularmassen liegen je nach Organismus zwischen 15 und 40 kDa, wobei in den meisten Zellen und Geweben die kleinen hsp′s auch in Abwesenheit von Streß synthetisiert werden und als cytosolische Aggregate (Hitzeschock-Granula) mit einer Molekularmasse von über 700 kDa vorliegen (Arrigo et al., Mol. Cell Biol. 8 (1988), 5059-5071). Hitzeschock und chemi scher Streß induzieren die Synthese der kleinen hsp′s, die dann bis zu 1% des Gesamtzellproteins ausmachen können (Österreich et al., Biomed. Biochim. Acta 49 (1990), 219-226). Zudem bewirken die oben genannten Streßfaktoren eine Veränderung im Phosphorylierungsgrad der Proteine sowie in ihrer zellulären Lokalisation (Arrigo et al., supra; Zantema et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 12936-12941). Die kleinen hps′s der ver schiedenen Organismen zeigen trotz ihrer Heterogenität überein stimmende Hydrophobizitätsprofile und kleine Regionen identi scher Aminosäuresequenzen (Lindquist & Craig, supra). Daneben konnten eindeutige Sequenzhomologien mit dem ebenfalls hoch molekulare Assoziate bildenden α-Kristallin aus Wirbeltieren nachgewiesen werden (Ingolia & Craig, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 2360-2364). Auf DNA-Ebene sind Sequenzhomologien der kleinen hsp′s untereinander beschrieben.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind im Prinzip alle Peptide oder Polypeptide geeignet, die durch Hitzeschockproteine stabilisiert werden können, d. h. im wesentlichen Peptide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine und dgl. sowie andere Substanzen, die einen Peptidanteil aufweisen. In einer bevor zugten Ausführungsform verwendet man rekombinant oder syn thetisch hergestellte Peptide oder Polypeptide. Derartige Substanzen neigen besonders zur Aggregation und Adsorption und können durch das erfindungsgemäße Verfahren besonders vor teilhaft stabilisiert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man das hsp 25 aus Maus. hsp 25 bildet ein 32mer (Mr = 800 kD) (Behlke et al., FEBS Letters, Vol. 288 Nr. 1,2 (1992), 119-122). Das hsp 25-Gen in der Maus steht unter der Regulation eines Hitzeschock-Promotors, so daß durch Hitzestreß die Expression des Proteins induziert wird. Die Klonierung und Sequenzierung einer für hsp 25 kodierenden DNA-Sequenz sowie deren Expression in E.coli wird von Gaestel et al. in Eur. J. Biochem. 179 (1989), 209-213, J. Biol. Chem., Vol. 266., Nr. 22 (1991), S. 14721-14724 und in der DD 2 73 071 A1 beschrieben. Besonders vorteilhaft ist hsp 25 u. a. deshalb, da bezogen auf das 32mer der Protein-stabilisierende Effekt bereits bei einem deutlichen Unterschuß auf molarer Basis meßbar ist. Weiterhin ist hsp 25 extrem hitzeresistent, wobei nach Inkubation des hsp allein bei 100°C über 15 Minuten und nachfolgender Abkühlung dessen Ausgangsaktivität wiedergefunden wurde. hsp 25 erscheint daher als ein besonders vorteilhafter Kandidat für das erfin dungsgemäße Verfahren. Durch die Möglichkeit der rekombinanten Herstellung ist es auch in ausreichenden Mengen verfügbar.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung setzt man das kleine hsp in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 0,0001 : 1 bis 1000:1, besonders bevorzugt von 0,01 : 1 bis 1000:1 und am meisten bevorzugt von 0,1 : 1 bis 500 : 1 bezogen auf das zu stabilisierende Peptid- oder Polypeptid ein. Die Konzentration von hsp25 bezieht sich in diesem Zusammenhang auf eine monomere Einheit.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kleinen Hitzeschockproteinen zur Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung. Mit dem Begriff "Peptid", werden Proteine, umfassend von 6 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt von 6 bis 30 Aminosäuren, bezeichnet.

In einer besonderen Ausführungsform verwendet man die kleinen hsp′s zur Verbesserung der Lagerbeständigkeit einer wäßrigen Lösung, die Peptide enthält und insbesondere zur Langzeit stabilisierung eines Reagenzes für immunologische Bestimmungs verfahren, das als wäßrige Lösung vorliegt und immunologisch reaktive Peptide enthält. Üblicherweise führt die Instabilität von Peptiden in wäßriger Lösung insbesondere bei Aufbewahrung über einen längeren Zeitraum zu einer Verschlechterung der Meßresultate. Durch den Zusatz von kleinen hsp′s wird dagegen die Stabilität der Peptide erheblich verbessert, so daß auch nach einem längeren Zeitraum, z. B. nach mehreren Wochen, keine signifikante Verschlechterung von Meßergebnissen, z. B. in immunologischen Bestimmungsverfahren beobachtet wird.

Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kleinen hsp′s zur Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses bei einem Bestimmungsverfahren, das in Gegenwart mindestens eines Peptids oder/und Polypeptids in wäßriger Lösung durchgeführt wird. Bevorzugt ist das Bestim mungsverfahren ein immunologisches Bestimmungsverfahren, das unter Verwendung von immunologisch reaktiven Peptiden oder/und Polypeptiden durchgeführt wird. Es hat sich nämlich über raschenderweise herausgestellt, daß in Bestimmungsverfahren durch die Zugabe kleiner hsp′s die ermittelten Leerwerte erheblich reduziert werden können. Obwohl die Ursache hierfür nicht genau bekannt ist, wird davon ausgegangen, daß die Verminderung der Leerwerte auf der verbesserten Stabilisierung der in der Testlösung vorhandenen Peptide oder/und Polypeptide beruht. Durch die Reduzierung der Leerwerte wird die Signaldif ferenzierung verbessert und somit kann bei der erfindungs gemäßen Verwendung von kleinen hsp′s die Meßgenauigkeit erhöht werden.

Der erfindungsgemäße Zusatz von kleinen hsp kann grundsätzlich bei allen Formen von Bestimmungsverfahren eingesetzt werden, wie etwa zur Stabilisierung von Peptid- oder Polypeptidantige nen in direkten oder indirekten Nachweisverfahren für spezi fische Antikörper, zur Stabilisierung von Analytanaloga in kompetitiven Immunoassays und zur Stabilisierung von Eichlösun gen. Es ist für den Fachmann jedoch offensichtlich, daß die erfindungsgemäße Stabilisierung von Peptiden oder Polypeptiden auch auf andere hierin nicht explizit beschriebene Bestimmungs verfahren angewendet werden kann.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines spezifischen Antikörpers in einer Probeflüssigkeit, wobei man die Probeflüs sigkeit mit mindestens einem Peptid- oder Polypeptid-Antigen, das mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig ist, inku biert und den Antikörper über eine Bindung mit dem Antigen nachweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert. Besonders bevorzugt wird ein solches Verfahren als heterogenes Immunoassay in Gegenwart einer reaktiven Festphase durch geführt.

Ein Beispiel für einen solchen heterogenen Immunoassay ist ein indirektes Testformat. Dabei inkubiert man die Probeflüssig keit, die den zu bestimmenden Antikörper enthält, in Gegenwart einer reaktiven Festphase mit einem stabilisierten Antigen, das in einer an die Festphase bindefähigen Form vorliegt, und einem gegen das Antigen gerichteten Nachweisantikörper, der eine Markierungsgruppe trägt. Der qualitative oder/und quantitative Nachweis des zu bestimmenden Antikörpers kann anschließend durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase erfolgen. Das an die Festphase bindefähige Antigen kann biotinyliert und die Festphase z. B. mit Streptavi din oder Avidin beschichtet sein.

Ein weiteres bevorzugtes Testformat für die Bestimmung von Antikörpern ist der Doppelantigenbrückentest. Bei diesem Verfahren inkubiert man die Probeflüssigkeit, die den zu bestimmenden Antikörper enthält, in Gegenwart einer reaktiven Festphase mit mindestens zwei Antigenen AG₁ und AG₂, wobei das erste Antigen AG₁ in einer an die Festphase bindefähigen Form vorliegt und das zweite Antigen AG₂ eine Markierungsgruppe trägt. Der zu bestimmende Antikörper wird durch die Bestimmung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase, bevorzugt jedoch in der Festphase nachgewiesen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Stabilisierung von Analytanaloga in einem kompetitiven Immuno assay, insbesondere in einem Verfahren zur Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten in einer Probeflüssigkeit nach dem Prinzip des kompetitiven Immunoassay, wobei man die Probeflüs sigkeit mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper und einem mit dem Analyten um den Antikörper konkurrierenden Peptid oder Polypeptid, das eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert und den Analyten durch Messung der Markierung nachweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das markierte Peptid oder Polypeptid durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine stabilisiert.

Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Referenzwerten für die Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten, wobei man mindestens eine Testlösung, die eine bekannte Konzentration des zu bestimmenden Analyten enthält, mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper inkubiert und durch Quantifizierung der Immunreaktion zwischen Antikörper und dem in bekannter Konzen tration vorliegenden Analyten mindestens einen Referenzwert bildet, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen in der Testlösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert. Der wesentliche Vorteil ist darin begründet, daß mit erfindungs gemäß stabilisierten Testlösungen eine Verbesserung der Linearität des Tests erreicht wird und wie vorstehend be schrieben die Haltbarkeit bzw. Langzeitstabilität derartiger Testlösungen erheblich gesteigert werden kann. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, auch der Probeflüssigkeit Hitzeschock proteine zuzusetzen, insbesondere wenn das immunologische Bestimmungsverfahren nicht direkt im Anschluß an die Probenent nahme durchgeführt wird.

Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Verwendung in immunologischen Testver fahren, bei dem Peptide oder Polypeptide durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschock proteine stabilisiert sind. Ein derartiger Reagenzienkit umfaßt somit in räumlich getrennter Form (a) mindestens ein erstes Reagenz, das ein stabilisiertes Peptid oder Polypeptid enthält, (b) mindestens ein zweites Reagenz, das eine weitere immunolo gisch reaktive Komponente, z. B. einen Nachweisantikörper, enthält und (c) gegebenenfalls weitere Hilfs- und/oder Nach weisreagenzien.

Als Hilfsreagenzien werden Substanzen bezeichnet, die z. B. zum Ansetzen der Testlösungen oder zum Einstellen derer Konzen tration erforderlich sind, wie z. B. deionisisertes Wasser, Puffer etc. Unter Nachweisreagenzien werden Substanzen ver standen, mit denen ein gebildeter Immunkomplex nachgewiesen werden kann. Bevorzugt enthält ein Nachweisreagenz ein Substrat für eine korrespondierende Markierungsgruppe des Antigens oder Antikörpers. Geeignete Verfahren bzw. Substanzen sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit enthält die Reagenzien in einer Form, die vom beabsichtigten anzuwendenden Verfahren abhängig ist. Demgemäß können Reagenzien bereitgestellt werden, bei denen z. B. das stabilisierte Peptid oder Polypeptid in einer an eine reaktive Festphase bindefähigen Form vorliegt oder eine Markierungsgruppe trägt. Gegebenenfalls kann der Reagenzienkit auch mehrere Reagenzien mit verschiedenen stabilisierten Peptiden oder Polypeptiden enthalten, z. B. ein Reagenzienkit für einen Doppelantigenbrückentest. Weiterhin kann der Reagenzienkit auch ein oder mehrere Reagenzien enthalten, die Peptid- oder Polypeptid-Antigene zur Erstellung von Referenzwerten, z. B. einer Eichkurve, in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen enthalten. Die Form, in der die Antigene im erfindungsgemäßen Reagenzkit bereitgestellt werden, ist nicht entscheidend. Es können sowohl Lösungen als auch Lyophilisate verwendet werden, die dann vor dem ersten Gebrauch in eine flüssige Form überführt werden.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit eignet sich in einer Vielzahl von immunologischen Bestimmungsverfahren und die Auswahl des stabilisierten Peptids oder Polypeptids ist dabei nicht kritisch. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß der erfindungsgemäße Reagenzienkit besonders vorteilhaft bei Verwendung von synthetisch oder rekombinant hergestellten Peptiden oder Polypeptiden eingesetzt wird. In einer bevor zugten Ausführungsform wird der Reagenzienkit zur Bestimmung von viralen Antigenen bzw. von gegen virale Antigene gerichte ten Antikörpern eingesetzt und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Peptide oder Polypeptide aus dem Hepatitis C-Virus, z. B. aus den Bereichen NS-3 bzw. NS-4 oder aus HIV, z. B. aus dem Bereich p24, stabilisiert.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert in Verbindung mit den beigefügten Abbildungen. Es zeigen:

Abb. 1 die Stabilisierung von Testlösungen mit bekannten Konzentrationen an Troponin T durch Zusatz von hsp25,

Abb. 2 die Aminosäuresequenz eines HCV-NS3-Polypeptids (a), eines synthetischen HCV-NS4-Polypeptids (b) sowie eines rekombinanten HIV-p24 Polypeptids (c) und

Abb. 3 die Verbesserung der Signaldifferenzierung in Ab hängigkeit von der Konzentration an zugesetztem hsp 25.

Beispiel 1 Stabilisierung von Troponin T-Testlösungen 1.1 Herstellung der Lösungen a) Troponin T-Lösung mit 5 Mol hsp25 (32-mer; 160 Mol Monomer) pro 1 Mol Troponin T

Zu 546 µl Puffer (0,1 mol/l Tris, pH 8,0/100 mmol/l KCl/2 mmol/l Dithiothreitol (DTT)/0,05% NaN₃) werden 100 µl Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 0,43 mg/ml (in 5 mmol/l KPO₄, pH 7,3/2,0 mol/l Harnstoff/0,6 mol/l KCl/2 mmol/l DTT/0,05% NaN₃) und 354 k¹ hsp25-Lösung mit einer Konzentration von 14,7 mg/ml (in 0,1 mmol/l Tris, pH 8,0/100 mmol/l KCl/2 mmol/l DTT/0,05% NaN₃) gegeben.

Die Herstellung von rekombinantem hsp25 erfolgte wie in DE-A 42 39 969.6 beschrieben.

Bedingungen in der Lösung

Troponin T-Konz.: 0,043 µg/ml
hsp25-Konz.: 5,204 mg/ml

b) Kontroll- und Vergleichslösungen Troponin T-Lösung ohne hsp25

Die Herstellung erfolgte wie unter a) beschrieben. Anstelle der hsp25-Lösung wird aber nur Puffer zugegeben.

Troponin T-Lösungen mit 5 Mol bzw. 10 mol Rinderserumalbumin (RSA) pro 1 mol Troponin T Herstellung

Zu 800 bzw. 700 µl Puffer (0,1 mol/l Tris, pH 8,0/100 mmol/l KCl/2 mmol/l DTT/0,05% NaN₃) werden 100 µl Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 0,43 mg/ml (in 5 mmol/l KPO₄₁ pH 7,3/2,0 mol/l Harnstoff/0,6 mol/l KCl/2 mmol/l DTT/0,05% NaN₃) und 100 bzw. 200 µl RSA-Lösung mit einer Konzentration von 4,2 mg/ml (in 0,1 mol/l Tris, pH 8,0/100 mmol/l KCl/2 mmol/l DTT/0,05% NaN₃) gegeben.

Bedingungen in der Lösung

Troponin T-Konz.: 0,043 µg/ml
RSA-Konz.: 0,42 mg/ml bzw. 0,84 mg/ml.

Mit dieser Lösung sollte gezeigt werden, daß es sich bei dem stabilisierenden Effekt von hsp25 nicht um einen unspezifischen Proteineffekt handelt.

hsp25-Lösung

Die Herstellung erfolgte wie unter a) beschrieben. Anstelle der Troponin T-Lösung wurde aber nur Puffer eingesetzt.

Mit dieser hsp25-Lösung sollten Auswirkungen des hsp25 auf den Troponin T-ELISA-Test sichtbar gemacht werden.

Die Lösungen wurden alle am gleichen Tag hergestellt und dann unter identischen Bedingungen 5 Tage bei Raumtemperatur gelagert.

1.2 Überprüfung der Stabilität von Troponin T (TN-T) in den obengenannten Lösungen

Die Stabilität von Troponin T in den Lösungen wurde durch Messung der immunologischen Aktivität des Troponin T mit dem Troponin T-ELISA von Boehringer Mannheim bestimmt.

Dazu wurde nach 5 Tagen Lagerung der unter 1.1a) beschriebenen Troponin T-Lösung durch Verdünnen mit TN-T-freiem Humanserum eine Verdünnungsreihe von 0,65-12,5 ng/ml (0,65/1,8/4,8 und 12,5 ng/ml) hergestellt. Die Verdünnungen wurden an schließend, wie in der Packungsbeilage des Tests beschrieben, im ELISA-Test eingesetzt.

Die unter 1.1b) beschriebenen Kontroll- und Vergleichs-Lösungen wurden entsprechend verdünnt und ebenfalls im ELISA-Test eingesetzt.

Als Vergleichsmaßstab wurde die entsprechende Verdünnungsreihe einer bei -80°C gelagerten Troponin T-Probe im Test mitgeführt.

Testformat

Bei dem Troponin T-ELISA-Test handelt es sich um einen 1-Schritt-Sandwich-Assay. Die Troponin T enthaltende Probe wird in einem Streptavidin-beschichteten Tube mit einem biotinylierten anti-TN-T-Antikörper 1 und einem Peroxidase (POD)-markierten anti-TN-T-Antikörper 2 inkubiert. Es bildet sich ein immunologischer Komplex (Sandwich) aus den beiden Antikörpern und dem Troponin T, der über das Biotin an die SA- Tubewand gebunden wird. Der Nachweis des Komplexes erfolgt dann nach Zugabe von POD-Substrat (ABTS®) über die Bestimmung der POD-Aktivität.

1.3. Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt.

- In Abwesenheit von hsp25 ist eine deutliche Verminderung der immunologischen Aktivität im Vergleich zur frisch aufgetauten Troponin T-Lösung (TN-T bei -80°C) festzustellen.
- In der Lösung von TN-T mit hsp25 wird keine Abnahme der immunologischen Aktivität beobachtet.
- RSA hat keinen stabilisierenden Einfluß auf das Troponin T. Die stabilisierende Wirkung von hsp25 beruht also auf einen hsp25-spezifischen Effekt und nicht auf einem reinen Proteineffekt.
- Der Troponin T-ELISA-Test wird durch die eingesetzte hsp25-Konzentration nicht beeinflußt.

Beispiel 2 Stabilisierung von rekombinanten HCV- und HIV-Antigenen

Die Beispiele wurden mit dem Doppelantigen-Brückentestkonzept erstellt. Bei diesem Verfahren wird die Probenflüssigkeit mit einem biotinylierten Antigen, das an eine Streptavidin-be schichtete Festphase binden kann, und mit einem Antigen, das eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert. Der immobilisierte immunologische Komplex aus zu bestimmendem Antikörper und zwei Antigenen wird anschließend detektiert. Die Markierungsgruppe in den gezeigten Beispielen war hierbei ein Rutheniumkomplex, und der Nachweis erfolgte über eine Elektrochemilumines zenz-Reaktion (ECL-counts).

Es wurden folgende Antigene verwendet:

a) HCV-NS3

Das Antigen entspricht der Helikase-Sequenz des Hepatitis C Virus (HCV)-Nichtstrukturprotein 3 (NS3) und wurde gemäß DE-A 44 28 705.4 rekombinant in E.coli hergestellt.

Die Aminosäuresequenz des HCV-NS3-Polypeptids ist in Abb. 2a gezeigt.

b) HCV-NS4

Das Antigen entspricht einer Partialsequenz des HCV-NS4- Proteins und wurde synthetisch hergestellt. Die Aminosäuresequenz des synthetischen HCV-NS4-Peptids ist in Abb. 2b gezeigt (Nle = Norleucin).

c) HIV-p24

Das Antigen entspricht einem Fusionsantigen aus der Sequenz des core-Antigens p24 (Ghrayeb und Chang, DNA 5 (1986), 93-99) sowie weiterer core-Antigensequenzen p17 und p15 von HIV und wurde rekombinant in E.coli herge stellt. Die Aminosäuresequenz dieses rekombinanten Polypeptids ist in Abb. 2c dargestellt.

Das synthetische HCV-NS4-Antigen wurde sowohl in biotinylierter als auch in ruthenilierter Form jeweils mit der Konzentration 30 ng/ml im Reaktionsansatz eingesetzt.

Die rekombinanten Antigene HCV-NS3 sowie auch HIV-p24 wurden sowohl in biotinylierter als auch in ruthenilierter Form jeweils mit der Konzentration 400 ng/ml im Reaktionsansatz eingesetzt.

Die Pufferzusammensetzung in allen Experimenten war wie folgt:
Hepes 50 mmol/l, pH 7,4
Thesit 0,1%
MIT (N-Methylisothiazolon-Hcl) 0,01%
CAA (2-Chlor-Acetamid) 0,1%
Mischung von Proteaseinhibitoren.

Die hsp25-Konzentration bezogen auf hsp25-Monomer variierte im Bereich von 0/0, 1/1, 1/5, 1/10 Mol Antigen/Mol hsp25.

Die Antigene wurden unmittelbar vor Durchführung der immunolo gischen Reaktion mit dem hsp25-haltigen Puffer versetzt. Die Inkubationszeit von Probenantikörper und Antigenen betrug 20 Minuten bei 37°C.

Die Ergebnisse waren wie folgt:

a) Synthetisches HCV/NS4-Antigen

Durch Zusatz von hsp25 wird die Signalwiederfindung gegenüber der Kontrolle (Puffer alleine) und Vergleichsansätzen (RSA und groEl) deutlich verbessert. Besonders bemerkenswert ist die überlegene Wirkung von hsp25 gegenüber dem großen Hitzeschock protein groEl.

b) Rekombinantes HCV/NS3-Antigen

Durch Zusatz von hsp25 wird eine signifikante Leerwertreduktion sowohl bei Puffer als auch bei einem negativen Serum gefunden. Dies bewirkt eine überraschend hohe Verbesserung der Signal- Rausch-Verhältnisses bzw. der Signaldifferenzierung.

c) Rekombinantes HIV/p24-Antigen

Auch hier findet man eine deutliche Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses bzw. der Signaldifferenzierung, wenn man das Antigen mit hsp25 stabilisiert.

Beispiel 3 Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von hsp25

Die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von hsp25 bei der Stabilisierung des HCV-NS3 Antigens in einem Doppelantigen brückentest (Durchführung gemäß Beispiel 2) ist in Abb. 3 gezeigt.

Daraus ist ersichtlich, daß die Signalreduktion bei einer negativen Probe bereits deutlich bei einem molaren Verhältnis des Antigens zu hsp25 von 1 : 1 zu erkennen ist. Selbst bei Zusatz hoher Mengen an hsp25 wird keine signifikante Signalre duktion bei positiven Proben gefunden.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immunologisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabilisators dafür, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator ein oder mehrere Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine (kleine hsp) umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das hsp in einem molaren Verhältnis von 0,0001 : 1 bis 1000:1 und bevorzugt von 0,01 : 1 bis 1000:1 bezogen auf hsp-Monomer:Peptid- oder Polypeptid verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man immunologisch reaktive Polypeptide oder Peptide verwendet, die rekombinant oder synthetisch hergestellt sind.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das hsp 25 aus der Maus oder/und rekombinantes hsp 25 verwendet.

5. Verwendung eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine zur Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung.

6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Verbesserung der Lagerbe ständigkeit einer wäßrigen Lösung, die Peptide enthält.

7. Verwendung eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses bei einem Bestimmungsver fahren, das in Gegenwart mindestens eines Peptids oder/und Polypeptids in wäßriger Lösung durchgeführt wird.

8. Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines spezifi schen Antikörpers in einer Probeflüssigkeit, wobei man die Probeflüssigkeit mit mindestens einem Peptid- oder Polypeptid-Antigen, das mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig ist, inkubiert und den Antikörper über eine Bindung mit dem Antigen nachweist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation oder/und den Nachweis in Gegenwart einer reaktiven Festphase durchführt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probeflüssigkeit in Gegenwart einer Festphase mit einem Antigen, das in einer an die Festphase bindefä higen Form vorliegt, und mit einem gegen das Antigen gerichteten Nachweisantikörper, der eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert und den zu bestimmenden Antikörper durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase nachweist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probeflüssigkeit mit mindestens zwei Antigenen AG₁ und AG₂ in Gegenwart einer Festphase inkubiert, wobei das erste Antigen AG₁ in einer an die Festphase bindefähi gen Form vorliegt und das zweite Antigen AG₂ eine Markie rungsgruppe trägt, und man den zu bestimmenden Antikörper durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase nachweist.

12. Verfahren zur Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid- Analyten in einer Probeflüssigkeit nach dem Prinzip des kompetitiven Immunoassay, wobei man die Probeflüssigkeit mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper und einem mit dem Analyten um den Antikörper konkurrierenden Peptid oder Polypeptid, das eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert und den Analyten durch Messung der Markierung nachweist, dadurch gekennzeichnet, daß man das markierte Peptid oder Polypeptid durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine stabilisiert.

13. Verfahren zur Ermittlung von Referenzwerten für die Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten, wobei man mindestens eine Testlösung, die eine bekannte Konzen tration des zu bestimmenden Analyten enthält, mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper inkubiert und durch Quantifizierung der Immunreaktion zwischen Antikör per und dem in bekannter Konzentration vorliegenden Analyten mindestens einen Referenzwert bildet, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen in der Testlösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert.

14. Reagenzienkit zur Verwendung in immunologischen Testver fahren, umfassend in räumlich getrennter Form

(a) mindestens ein erstes Reagenz, das ein immunologisch reaktives Peptid oder Polypeptid enthält,
(b) mindestens ein zweites Reagenz, das eine weitere immunologisch reaktive Komponente enthält und
(c) gegebenenfalls weitere Hilfs- und/oder Nachweisrea genzien,

dadurch gekennzeichnet,
daß mindestens ein erstes Reagenz, das ein immunologisch reaktives Peptid oder Polypeptid enthält, durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert ist.

15. Reagenzienkit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Polypeptid in einer an eine reaktive Festphase bindefähigen Form vorliegt.

16. Reagenzienkit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Polypeptid eine Markierungsgruppe trägt.

17. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Polypeptid rekombinant oder syn thetisch hergestellt ist.

18. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien als Lösung oder Lyophilisat vorliegen.

19. Verwendung eines Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 14 bis 18 zur Bestimmung von viralen Antigenen oder von gegen virale Antigene gerichteten Antikörpern.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid oder Polypeptid aus HCV oder HIV verwendet.