EP0871882A1 - Stabilisierung von peptiden und polypeptiden in immunologischen tests durch zusatz von kleinen hitzeschockproteinen - Google Patents

Stabilisierung von peptiden und polypeptiden in immunologischen tests durch zusatz von kleinen hitzeschockproteinen

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EP0871882A1
EP0871882A1 EP96900976A EP96900976A EP0871882A1 EP 0871882 A1 EP0871882 A1 EP 0871882A1 EP 96900976 A EP96900976 A EP 96900976A EP 96900976 A EP96900976 A EP 96900976A EP 0871882 A1 EP0871882 A1 EP 0871882A1
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EP
European Patent Office
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peptide
polypeptide
proteins
antigen
analyte
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96900976A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Hergersberg
Dorothee Ambrosius
Alfons Nichtl
Ursula-Henrike Wienhues-Thelen
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Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0871882A1 publication Critical patent/EP0871882A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining an analyte in aqueous solution using immunologically reactive peptides or polypeptides and a stabilizer therefor, and the stabilization of peptides in aqueous solution.
  • antigens and in particular of recombinant or chemically synthesized peptide or polypeptide antigens in immunological determination methods is known from the prior art.
  • solutions which contain a known concentration of the analyte are required, for example, for calibration.
  • immunologically reactive peptides or polypeptides with the antibody to be determined are used for the qualitative and / or quantitative detection of the antibody.
  • the stability of the peptides or polypeptides is of essential importance, on the one hand to ensure the linearity of the test and a good signal-to-noise ratio and on the other hand to ensure reliable reproducibility of the determination results over a longer period of time.
  • heat shock proteins can bind denatured proteins (Ang et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 24244-24236). It is also known that protein solutions can be stabilized by adding heat shock proteins, this stabilizing effect being based in particular on preventing the formation of insoluble aggregates.
  • DE-OS 42 39 969 discloses a method for stabilizing proteins in aqueous solution by adding one or more proteins from the family of small heat shock proteins (small hsp's). However, there is no data on the immunological properties of proteins bound to small hsp's.
  • This object is achieved by a method for determining an analyte in aqueous solution using immunologically reactive peptides or polypeptides and a stabilizer therefor, which is characterized in that the stabilizer comprises one or more proteins from the "small" family Heat shock proteins (small hsp) included.
  • the small hsp are capable of stabilizing peptides and polypeptides in solution without impairing their immunological properties.
  • the family of small heat shock proteins is a heterogeneous group of proteins with one or more representatives in yeast (hsp 26), vertebrates (hsp 24, hsp 28), Drosophila (hsp 22, 23, 26, 28), mouse ( hsp 25) and over 20 proteins in plants (Nover & Schaft, Eur. J. Biochem. 139 (1984), 303-313; Lindquist & Craig, Ann. Rev. Genet. 22 (1988), 631-677).
  • peptides or polypeptides that can be stabilized by heat shock proteins, i.e. essentially peptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins and the like, and other substances which have a peptide content.
  • heat shock proteins i.e. essentially peptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins and the like, and other substances which have a peptide content.
  • recombinant or synthetically produced peptides or polypeptides are used.
  • Such substances have a particular tendency to aggregate and adsorb and can be stabilized particularly advantageously by the process according to the invention.
  • the hsp 25 gene in the mouse is regulated by a heat shock promoter, so that the expression of the protein is induced by heat stress.
  • the cloning and sequencing of a DNA sequence coding for hsp 25 and its expression in E. coli is described by Gaestel et al. in Eur. J. Bioche. 179 (1989), 209-213, J. Biol. Chem., Vol. 266., No. 22 (1991), pp.
  • hsp 25 is particularly advantageous because, based on the 32mer, the protein-stabilizing effect can be measured on a molar basis even with a clear deficit. Furthermore, hsp 25 is extremely heat-resistant, and after incubation of the hsp alone at 100 ° C. for 15 minutes and subsequent cooling, its starting activity was found again, hsp 25 therefore appears to be a particularly advantageous candidate for the process according to the invention. Due to the possibility of recombinant production, it is also available in sufficient quantities.
  • the small hsp is set in a molar ratio of preferably 0.0001: 1 to 1000: 1, particularly preferably from 0.01: 1 to 1000: 1 and most preferably from 0.1: 1 to 500: 1 based on the peptide or polypeptide to be stabilized.
  • concentration of hsp25 refers to a monomeric unit.
  • Another object of the present invention is the use of small heat shock proteins to stabilize peptides in aqueous solution.
  • peptide denotes proteins comprising from 6 to 50 amino acids, preferably from 6 to 30 amino acids.
  • the small hsp's are used to improve the storage stability of an aqueous solution which contains peptides and in particular for the long-term stabilization of a reagent for immunological determination methods which is in the form of an aqueous solution and contains immunologically reactive peptides.
  • a reagent for immunological determination methods which is in the form of an aqueous solution and contains immunologically reactive peptides.
  • the instability of peptides in aqueous solution leads to a deterioration in the measurement results, especially when stored over a longer period of time.
  • the stability of the peptides is considerably improved, so that even after a longer period, e.g. after several weeks, no significant deterioration of measurement results, e.g. is observed in immunological determination methods.
  • Yet another object of the present invention is the use of small hsp's to improve the signal-to-noise ratio in a determination method which is carried out in the presence of at least one peptide and / or polypeptide in aqueous solution.
  • the determination method is preferably an immunological determination method which is carried out using immunologically reactive peptides and / or polypeptides.
  • small hsp according to the invention can in principle be used in all forms of determination methods, such as for stabilizing peptide or polypeptide antigens in direct or indirect detection methods for specific antibodies, for stabilizing analyte analogs in competitive immunoassays and for stabilizing calibration solutions ⁇ gen.
  • determination methods such as for stabilizing peptide or polypeptide antigens in direct or indirect detection methods for specific antibodies, for stabilizing analyte analogs in competitive immunoassays and for stabilizing calibration solutions ⁇ gen.
  • the stabilization according to the invention of peptides or polypeptides can also be applied to other determination methods not explicitly described here.
  • a preferred embodiment of the invention comprises a method for the immunological determination of a specific antibody in a sample liquid, the sample liquid being incubated with at least one peptide or polypeptide antigen which is capable of binding with the antibody to be determined and detects the antibody by binding to the antigen, which is characterized in that the antigen is stabilized by adding one or more proteins from the family of the "small" heat shock proteins.
  • Such a method is particularly preferably carried out as a heterogeneous immunoassay in the presence of a reactive solid phase.
  • heterogeneous immunoassay is an indirect test format.
  • the sample liquid containing the antibody to be determined is incubated with a stabilized antigen in the presence of a reactive solid phase is present in a form capable of binding to the solid phase, and a detection antibody directed against the antigen which bears a marking group.
  • the qualitative and / or quantitative detection of the antibody to be determined can then be carried out by measuring the marking in the solid phase and / or in the liquid phase.
  • the antigen capable of binding to the solid phase can be biotinylated and the solid phase can be coated, for example, with streptavidin or avidin.
  • Another preferred test format for the determination of antibodies is the double antigen bridge test.
  • the sample liquid containing the antibody to be determined is incubated in the presence of a reactive solid phase with at least two antigens AGj and AG 2 , the first antigen AGi being in a form capable of binding to the solid phase and the second antigen AG 2 being a labeling group wearing.
  • the antibody to be determined is detected by determining the label in the solid phase and / or in the liquid phase, but preferably in the solid phase.
  • a further preferred embodiment of the invention is the stabilization of analyte analogs in a competitive immunoassay, in particular in a method for determining a peptide or polypeptide analyte in a sample liquid according to the principle of the competitive immunoassay, the sample liquid being counteracted with a the analyte-directed antibody and a peptide or polypeptide which competes with the analyte for the antibody and carries a labeling group, and detects the analyte by measuring the label, which is characterized in that the labeled peptide or polypeptide is added by adding a or several proteins from the family of small heat shock proteins stabilized.
  • Yet another embodiment of the invention relates to a method for determining reference values for the determination of a peptide or polypeptide analyte, with at least one a test solution which contains a known concentration of the analyte to be determined, incubated with an antibody directed against the analyte and, by quantifying the immune reaction between the antibody and the analyte in known concentration, forms at least one reference value, which is characterized in that the Antigen stabilized in the test solution by adding one or more proteins from the "small" heat shock protein family.
  • the main advantage is that test solutions stabilized according to the invention improve the linearity of the test and, as described above, the durability or long-term stability of such test solutions can be increased considerably.
  • Yet another object of the present invention is a reagent kit for use in immunological test procedures, in which peptides or polypeptides are stabilized by adding one or more proteins from the family of small heat shock proteins.
  • a reagent kit thus comprises in spatially separated form (a) at least one first reagent which contains a stabilized peptide or polypeptide, (b) at least one second reagent which contains a further immunologically reactive component, e.g. a detection antibody, and (c) optionally further auxiliary and / or detection reagents.
  • Auxiliary reagents are substances which are required, for example, to prepare the test solutions or to adjust their concentration, such as deionized water, buffers, etc.
  • Detection reagents are substances with which an immune complex formed can be detected.
  • a detection reagent preferably contains a substrate for a corresponding labeling group of the antigen or antibody. pers. Suitable methods or substances are known from the prior art.
  • a reagent kit according to the invention contains the reagents in a form which is dependent on the intended method to be used. Accordingly, reagents can be provided in which e.g. the stabilized peptide or polypeptide is in a form capable of binding to a reactive solid phase or carries a labeling group.
  • the reagent kit can also contain multiple reagents with different stabilized peptides or polypeptides, e.g. a reagent kit for a double antigen bridge test.
  • the reagent kit can also contain one or more reagents which contain peptide or polypeptide antigens for establishing reference values, e.g. a calibration curve, in different known concentrations.
  • the form in which the antigens are provided in the reagent kit according to the invention is not critical. Both solutions and lyophilisates can be used, which are then converted into a liquid form before first use.
  • the reagent kit according to the invention is suitable in a variety of immunological determination methods and the selection of the stabilized peptide or polypeptide is not critical. However, it has been found that the reagent kit according to the invention is used particularly advantageously when using synthetically or recombinantly produced peptides or polypeptides.
  • the reagent kit is used to determine viral antigens or antibodies directed against viral antigens, and in a particularly preferred embodiment, peptides or polypeptides from the hepatitis C virus, for example from the areas NS 3 or NS-4 or from HIV, eg from the p24 range, stabilized.
  • the present invention is illustrated by the following examples in conjunction with the accompanying figures. Show it:
  • Fig. 1 the stabilization of test solutions with known concentrations of troponin T by adding hsp25
  • Fig. 2 shows the amino acid sequence of an HCV-NS3 polypeptide (a), a synthetic HCV-NS4 polypeptide (b) and a recombinant HIV-p24 polypeptide (c) and
  • Fig. 3 the improvement of the signal differentiation depending on the concentration of added hsp 25.
  • Recombinant hsp25 was produced as described in DE-A-42 39 969.6.
  • the preparation was carried out as described under a). Instead of the hsp25 solution, only buffer is added.
  • 100 ⁇ l of troponin T solution with a concentration are added to 800 or 700 ⁇ l of buffer (0.1 mol / 1 Tris, pH 8.0, 100 mmol / 1 KCl / 2 mmol / 1 DTT / 0.05% NaN 3 ) of 0.43 mg / ml (in 5 mmol / 1 KP ⁇ « , pH 7.3 / 2.0 mol / 1 urea / 0.6 mol / 1 KCl / 2 mmol / 1 DTT / 0.05% NaN 3 ) and 100 or 200 ⁇ l RSA solution with a concentration of 4.2 mg / ml (in 0.1 mol / 1 Tris, pH 8.0 / 100 mmol / 1 KCl / 2 mmol / 1 DTT / 0.05% NaN 3 ).
  • RSA conc . 0.42 mg / ml or 0.84 mg / ml
  • the aim of this solution was to show that the stabilizing effect of hsp25 is not an unspecific protein effect.
  • Troponin T solution was only used as a buffer.
  • This hsp25 solution was designed to visualize the effects of hsp25 on the Troponin T-ELISA test.
  • the stability of troponin T in the solutions was determined by measuring the immunological activity of troponin T using the Troponin T ELISA from Boehringer Mannheim.
  • control and comparison solutions described under 1.1b) were diluted accordingly and also used in the ELISA test.
  • the Troponin T-ELISA test is a 1-step sandwich assay.
  • the sample containing troponin T is incubated in a streptavidin-coated tube with a biotinylated anti-TN-T antibody 1 and a peroxidase (POD) -labelled anti-TN-T antibody 2.
  • An immunological complex (sandwich) is formed from the two antibodies and the troponin T, which is bound to the SA tube wall via the biotin.
  • the complex is then detected after adding POD substrate (ABTS ® ) by determining the POD activity.
  • POD substrate ABTS ®
  • RSA has no stabilizing effect on troponin T.
  • the stabilizing effect of hsp25 is based on an hsp25-specific effect and not on a pure protein effect.
  • the examples were created using the double antigen bridge test concept.
  • the sample liquid is incubated with a biotinylated antigen that can bind to a streptavidin-coated solid phase and with an antigen that carries a labeling group.
  • the immobilized immunological complex consisting of the antibody to be determined and two antigens is then detected.
  • the labeling group in the examples shown was a ruthenium complex, and the detection was carried out via an electrochemiluminescence reaction (ECL counts).
  • the antigen corresponds to the helicase sequence of the hepatitis C virus (HCV) - non-structural protein 3 (NS3) and was produced recombinantly in E. coli according to DE-A-44 28 705.4.
  • the amino acid sequence of the HCV-NS3 polypeptide is shown in Fig. 2a. b) HCV-NS4
  • the antigen corresponds to a partial sequence of the HCV-NS4 protein and was produced synthetically.
  • the antigen corresponds to a fusion antigen from the sequence of the core antigen p24 (Ghrayeb and Chang, DNA 5 (1986), 93-99) and further core antigen sequences pl7 and pl5 from HIV and was produced recombinantly in E. coli.
  • the amino acid sequence of this recombinant polypeptide is shown in Fig. 2c.
  • the synthetic HCV-NS4 antigen was used both in biotinylated and in ruthenilated form with a concentration of 30 ng / ml in the reaction mixture.
  • the recombinant antigens HCV-NS3 and HIV-p24 were used both in biotinylated and in ruthenilated form with a concentration of 400 ng / ml in the reaction mixture.
  • the hsp25 concentration based on hsp25 monomer varied in the range of 0/0, 1/1, 1/5, 1/10 mole antigen / mole hsp25.
  • the antigens were mixed with the hsp25-containing buffer immediately before carrying out the immunological reaction.
  • the incubation time of sample antibodies and antigens was 20 minutes at 37 ° C. The results were as follows
  • hsp25 significantly improves signal recovery compared to the control (buffer alone) and comparison approaches (RSA and groEl). The superior effect of hsp25 over the large heat shock protein groEl is particularly remarkable.
  • ORGANISM Human immunodeficiency virus type 1

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Abstract

In immunologischen Bestimmungsverfahren zur Bestimmung eines Analyten in wässriger Lösung kann eine gute Testlinearität und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht werden durch Stabilisierung von immunologisch-reaktiven Peptiden oder Polypeptiden (Antigenen) durch Zusatz eines Stabilisators, der ein oder mehrere Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine (kleine hsp) umfasst. Das Stabilisierungsverfahren eignet sich zur Verbesserung der Lagerbeständigkeit wässriger Lösungen, die Peptide enthalten, und ist in herkömmlichen immunologischen Testsystemen verwendbar.

Description

Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Tests durch Zusatz von kleinen Hitzeschockproteinen
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immuno¬ logisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabili¬ sators dafür sowie die Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung.
Der Einsatz von Antigenen und insbesondere von rekombinanten oder chemisch synthetisierten Peptid- oder Polypeptid-Antigenen in immunologischen Bestimmungsverfahren ist aus dem Stand der Technik bekannt. Beim Nachweis von Peptid- oder Polypeptid- Analyten werden Lösungen, die eine bekannte Konzentration des Analyten enthalten, beispielsweise zur Kalibrierung benötigt. In Testsystemen zur Bestimmung von spezifischen Antikörpern werden immunologisch mit dem zu bestimmenden Antikörper reak¬ tive Peptide oder Polypeptide zum qualitativen oder/und quanti¬ tativen Nachweis des Antikörpers verwendet. Bei derartigen immunologischen Bestimmungssystemen ist die Stabilität der Peptide oder Polypeptide von wesentlicher Bedeutung, um einer¬ seits die Linearität des Tests und ein gutes Signal-Rausch- Verhältnis sicherzustellen und andererseits eine zuverlässige Reproduzierbarkeit des Bestimmungsergebnisseε über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten.
Aus dem Stand der Technik ist eine Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Testlösungen durch Zusatz von unspezifischen Proteinen (z.B. RSA) oder von Puffersystemen (Salz, pH-Wert ■ etc. ) bekannt. Diese Stabilisierungsmethoden führen jedoch im allgemeinen nicht zu zufriedenstellenden Er¬ gebnissen und insbesondere rekombinante oder chemisch synthe- tisierte Peptide oder Polypeptide zeigen eine Neigung zur Aggregation und Adsorption, die durch die genannten Stabilisie¬ rungsverfahren nicht ausreichend beseitigt werden kann.
Aus dem Stand der Technik ist auch bekannt, daß Hitzeschock¬ proteine denaturierte Proteine binden können (Ang et al. , J. Biol. Chem. 266 (1991), 24244-24236). Es ist weiterhin bekannt, daß Proteinlösungen durch Zugabe von Hitzeschockproteinen stabilisiert werden können, wobei diese stabilisierende Wirkung insbesondere auf einer Verhinderung der Bildung von unlöslichen Aggregaten beruht.
Es wird jedoch angenommen, daß Proteine, die an Hitzeschock¬ proteine gebunden sind, im allgemeinen nicht in ihrer nativen Konformation vorliegen. Hayer-Hartl et al., EMBO J. 13 (1994), 3192-3202 berichten beispielsweise, daß an GroEL (hsp60 aus E.coli) gebundene Proteine in einer offenen Struktur, der sogenannten "molten globule" Struktur, vorliegen. Aufgrund dieser Konformationsänderung ist nicht gewährleistet, daß Peptide und Polypeptide, die durch Bindung von Hitzeschock¬ proteinen stabilisiert werden, ihre für die Anwendung in immunologischen Testverfahren notwendigen strukturellen Merk¬ male aufweisen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß immuno¬ logisch reaktive Bereiche auf Peptiden und Polypeptiden durch die Anwesenheit von Hitzeschockproteinen maskiert werden.
In der DE-OS 42 39 969 ist ein Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen in wäßriger Lösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine (kleine hsp's) offenbart. Über die immunologischen Eigen¬ schaften von an kleine hsp's gebundenen Proteinen gibt es jedoch keine Daten.
Es war somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Stabilisierung von Antigenen in wäßriger Lösung bereitzustellen, bei dem die obengenannten Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weitgehend beseitigt sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immuno¬ logisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabili¬ sators dafür, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Stabilisator ein oder mehrere Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine (kleine hsp) umfaßt.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die kleinen hsp fähig sind, Peptide und Polypeptide in Lösung zu stabilisieren, ohne deren immunologische Eigenschaften zu beeinträchtigen.
Bei der Familie der kleinen Hitzeschockproteine handelt es sich um eine heterogene Gruppe von Proteinen mit einem oder mehreren Vertretern in Hefen (hsp 26), Vertebraten (hsp 24, hsp 28), Drosophila (hsp 22, 23, 26, 28), Maus (hsp 25) und über 20 Proteinen in Pflanzen (Nover & Schaft, Eur. J. Biochem. 139 (1984), 303-313; Lindquist & Craig, Ann. Rev. Genet. 22 (1988), 631-677) . Ihre Molekularmassen liegen je nach Organismus zwi¬ schen 15 und 40 kDa, wobei in den meisten Zellen und Geweben die kleinen hsp's auch in Abwesenheit von Streß synthetisiert werden und als cytosolische Aggregate (Hitzeschock-Granula) mit einer Molekularmasse von über 700 kDa vorliegen (Arrigo et al., Mol. Cell Biol. 8 (1988), 5059-5071). Hitzeschock und chemi¬ scher Streß induzieren die Synthese der kleinen hsp's, die dann bis zu 1 % des Gesamtzellproteins ausmachen können (Österreich et al., Biomed. Biochim. Acta 49 (1990), 219-226) . Zudem bewir¬ ken die oben genannten Streßfaktoren eine Veränderung im Phos- phorylierungsgrad der Proteine sowie in ihrer zellulären Loka¬ lisation (Arrigo et al. , supra Zantema et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 12936-12941) . Die kleinen hps's der verschiedenen Organismen zeigen trotz ihrer Heterogenität übereinstimmende Hydrophobizitätsprofile und kleine Regionen identischer Amino- säuresequenzen (Lindquist & Craig, supra) . Daneben konnten eindeutige Sequenzhomologien mit dem ebenfalls hochmolekulare Assoziate bildenden α-Kristallin aus Wirbeltieren nachgewiesen werden (Ingolia & Craig, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982), 2360-2364) . Auf DNA-Ebene sind Sequenzhomologien der kleinen hsp's untereinander beschrieben.
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind im Prinzip alle Peptide oder Polypeptide geeignet, die durch Hitzeschockproteine stabi¬ lisiert werden können, d.h. im wesentlichen Peptide, Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine und dgl. sowie andere Substanzen, die einen Peptidanteil aufweisen. In einer bevorzugten Ausfüh¬ rungsform verwendet man rekombinant oder synthetisch herge¬ stellte Peptide oder Polypeptide. Derartige Substanzen neigen besonders zur Aggregation und Adsorption und können durch das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft stabilisiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man das hsp 25 aus Maus, hsp 25 bildet ein 32mer (Mr = 800 kD) (Behlke et al. , FEBS Letters, Vol. 288 Nr. 1,2 (1992) , 119-122) . Das hsp 25-Gen in der Maus steht unter der Regulation eines Hitzeschock-Promotors, so daß durch Hitzestreß die Expression des Proteins induziert wird. Die Klonierung und Sequenzierung einer für hsp 25 kodierenden DNA-Sequenz sowie deren Expression in E.coli wird von Gaestel et al. in Eur. J. Bioche . 179 (1989), 209-213, J. Biol. Chem. , Vol. 266., Nr. 22 (1991), S. 14721-14724 und in der DD-Al 273 071 beschrieben. Besonders vorteilhaft ist hsp 25 u.a. deshalb, da bezogen auf das 32mer der Protein-stabilisierende Effekt bereits bei einem deutlichen Unterschuß auf molarer Basis meßbar ist. Weiterhin ist hsp 25 extrem hitzeresistent, wobei nach Inkubation des hsp allein bei 100°C über 15 Minuten und nachfolgender Abkühlung dessen Ausgangsaktivität wiedergefunden wurde, hsp 25 erscheint daher als ein besonders vorteilhafter Kandidat für das erfin¬ dungsgemäße Verfahren. Durch die Möglichkeit der rekombinanten Herstellung ist es auch in ausreichenden Mengen verfügbar. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung setzt man das kleine hsp in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 0,0001:1 bis 1000:1, besonders bevorzugt von 0,01:1 bis 1000:1 und am meisten bevorzugt von 0,1:1 bis 500:1 bezogen auf das zu stabilisierende Peptid- oder Polypeptid ein. Die Konzentration von hsp25 bezieht sich in diesem Zusammenhang auf eine monomere Einheit.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kleinen Hitzeschockproteinen zur Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung. Mit dem Begriff "Peptid" werden Proteine, umfassend von 6 bis 50 Aminosäuren, bevorzugt von 6 bis 30 Aminosäuren, bezeichnet.
In einer besonderen Ausführungsform verwendet man die kleinen hsp's zur Verbesserung der Lagerbeständigkeit einer wäßrigen Lösung, die Peptide enthält und insbesondere zur Langzeit- Stabilisierung eines Reagenzes für immunologische Bestimmungs¬ verfahren, das als wäßrige Lösung vorliegt und immunologisch reaktive Peptide enthält. Üblicherweise führt die Instabilität von Peptiden in wäßriger Lösung insbesondere bei Aufbewahrung über einen längeren Zeitraum zu einer Verschlechterung der Meßresultate. Durch den Zusatz von kleinen hsp's wird dagegen die Stabilität der Peptide erheblich verbessert, so daß auch nach einem längeren Zeitraum, z.B. nach mehreren Wochen, keine signifikante Verschlechterung von Meßergebnissen, z.B. in immunologischen Bestimmungsverfahren beobachtet wird.
Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von kleinen hsp's zur Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses bei einem Bestimmungsverfahren, das in Gegenwart mindestens eines Peptids oder/und Polypeptids in wäßriger Lösung durchgeführt wird. Bevorzugt ist das Bestim¬ mungsverfahren ein immunologisches Bestimmungsverfahren, das unter Verwendung von immunologisch reaktiven Peptiden oder/und Polypeptiden durchgeführt wird. Es hat sich nämlich über¬ raschenderweise herausgestellt, daß in Bestimmungsverfahren durch die Zugabe kleiner hsp's die ermittelten Leerwerte erheb¬ lich reduziert werden können. Obwohl die Ursache hierfür nicht genau bekannt ist, wird davon ausgegangen, daß die Verminderung der Leerwerte auf der verbesserten Stabilisierung der in der Testlösung vorhandenen Peptide oder/und Polypeptide beruht. Durch die Reduzierung der Leerwerte wird die Signaldifferenzie¬ rung verbessert und somit kann bei der erfindungsgemäßen Ver¬ wendung von kleinen hsp's die Meßgenauigkeit erhöht werden.
Der erfindungsgemäße Zusatz von kleinen hsp kann grundsätzlich bei allen Formen von Bestimmungsverfahren eingesetzt werden, wie etwa zur Stabilisierung von Peptid- oder Polypeptidantige- nen in direkten oder indirekten Nachweisverfahren für spezi¬ fische Antikörper, zur Stabilisierung von Analytanaloga in kompetitiven Immunoassays und zur Stabilisierung von Eichlösun¬ gen. Es ist für den Fachmann jedoch offensichtlich, daß die erfindungsgemäße Stabilisierung von Peptiden oder Polypeptiden auch auf andere hierin nicht explizit beschriebene Bestimmungs¬ verfahren angewendet werden kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Ver¬ fahren zur immunologischen Bestimmung eines spezifischen Anti¬ körpers in einer Probeflüssigkeit, wobei man die Probeflüs¬ sigkeit mit mindestens einem Peptid- oder Polypeptid-Antigen, das mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig ist, inku¬ biert und den Antikörper über eine Bindung mit dem Antigen nachweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert. Besonders bevorzugt wird ein solches Verfahren als heterogenes Im unoassay in Gegenwart einer reaktiven Festphase durch¬ geführt.
Ein Beispiel für einen solchen heterogenen Immunoassay ist ein indirektes Testformat. Dabei inkubiert man die Probeflüssig¬ keit, die den zu bestimmenden Antikörper enthält, in Gegenwart einer reaktiven Festphase mit einem stabilisierten Antigen, das in einer an die Festphase bindefähigen Form vorliegt, und einem gegen das Antigen gerichteten Nachweisantikörper, der eine Mar¬ kierungsgruppe trägt. Der qualitative oder/und quantitative Nachweis des zu bestimmenden Antikörpers kann anschließend durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase erfolgen. Das an die Festphase bindefähige Antigen kann biotinyliert und die Festphase z.B. mit Streptavi- din oder Avidin beschichtet sein.
Ein weiteres bevorzugtes Testformat für die Bestimmung von Antikörpern ist der Doppelantigenbrückentest. Bei diesem Verfahren inkubiert man die Probeflüssigkeit, die den zu bestimmenden Antikörper enthält, in Gegenwart einer reaktiven Festphase mit mindestens zwei Antigenen AGj und AG2, wobei das erste Antigen AGi in einer an die Festphase bindefähigen Form vorliegt und das zweite Antigen AG2 eine Markierungsgruppe trägt. Der zu bestimmende Antikörper wird durch die Bestimmung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase, bevorzugt jedoch in der Festphase nachgewiesen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Stabilisierung von Analytanaloga in einem kompetitiven Immuno¬ assay, insbesondere in einem Verfahren zur Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten in einer Probeflüssigkeit nach dem Prinzip des kompetitiven Immunoassay, wobei man die Probe- flüsεigkeit mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper und einem mit dem Analyten um den Antikörper konkurrierenden Peptid oder Polypeptid, das eine Markierungsgruppe trägt, inku¬ biert und den Analyten durch Messung der Markierung nachweist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das markierte Peptid oder Polypeptid durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine stabilisiert.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Referenzwerten für die Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten, wobei man mindestens eine Testlösung, die eine bekannte Konzentration des zu bestimmenden Analyten enthält, mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper inkubiert und durch Quantifizierung der Immunreaktion zwischen Antikörper und dem in bekannter Konzen¬ tration vorliegenden Analyten mindestens einen Referenzwert bildet, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen in der Testlösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert. Der wesentliche Vorteil ist darin begründet, daß mit erfindungs¬ gemäß stabilisierten Testlösungen eine Verbesserung der Linea- rität des Tests erreicht wird und wie vorstehend beschrieben die Haltbarkeit bzw. Langzeitstabilität derartiger Testlösungen erheblich gesteigert werden kann. Zusätzlich kann es wünschens¬ wert sein, auch der Probeflüssigkeit Hitzeschockproteine zuzu¬ setzen, insbesondere wenn das immunologische Bestimmungsver¬ fahren nicht direkt im Anschluß an die Probenentnahme durch¬ geführt wird.
Ein nochmals weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Verwendung in immunologischen Testver¬ fahren, bei dem Peptide oder Polypeptide durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschock¬ proteine stabilisiert sind. Ein derartiger Reagenzienkit umfaßt somit in räumlich getrennter Form (a) mindestens ein erstes Reagenz, das ein stabilisiertes Peptid oder Polypeptid enthält, (b) mindestens ein zweites Reagenz, das eine weitere immunolo¬ gisch reaktive Komponente, z.B. einen Nachweisantikörper, ent¬ hält und (c) gegebenenfalls weitere Hilfs- und/oder Nachweis¬ reagenzien.
Als Hilfsreagenzien werden Substanzen bezeichnet, die z.B. zum Ansetzen der Testlösungen oder zum Einstellen derer Konzentra¬ tion erforderlich sind, wie z.B. deionisisertes Wasser, Puffer etc. Unter Nachweisreagenzien werden Substanzen verstanden, mit denen ein gebildeter Immunkomplex nachgewiesen werden kann. Bevorzugt enthält ein Nachweisreagenz ein Substrat für eine korrespondierende Markierungsgruppe des Antigens oder Antikör- pers. Geeignete Verfahren bzw. Substanzen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Ein erfindungsgemäßer Reagenzienkit enthält die Reagenzien in einer Form, die vom beabsichtigten anzuwendenden Verfahren abhängig ist. Demgemäß können Reagenzien bereitgestellt werden, bei denen z.B. das stabilisierte Peptid oder Polypeptid in einer an eine reaktive Festphase bindefähigen Form vorliegt oder eine Markierungsgruppe trägt. Gegebenenfalls kann der Reagenzienkit auch mehrere Reagenzien mit verschiedenen stabilisierten Peptiden oder Polypeptiden enthalten, z.B. ein Reagenzienkit für einen Doppelantigenbrückentest. Weiterhin kann der Reagenzienkit auch ein oder mehrere Reagenzien ent¬ halten, die Peptid- oder Polypeptid-Antigene zur Erstellung von Referenzwerten, z.B. einer Eichkurve, in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen enthalten. Die Form, in der die Antigene im erfindungsgemäßen Reagenzkit bereitgestellt werden, ist nicht entscheidend. Es können sowohl Lösungen als auch Lyophilisate verwendet werden, die dann vor dem ersten Gebrauch in eine flüssige Form überführt werden.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit eignet sich in einer Viel¬ zahl von immunologischen Bestimmungsverfahren und die Auswahl des stabilisierten Peptids oder Polypeptids ist dabei nicht kritisch. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß der erfin¬ dungsgemäße Reagenzienkit besonders vorteilhaft bei Verwendung von synthetisch oder rekombinant hergestellten Peptiden oder Polypeptiden eingesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungs¬ form wird der Reagenzienkit zur Bestimmung von viralen Antige¬ nen bzw. von gegen virale Antigene gerichteten Antikörpern ein¬ gesetzt und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Peptide oder Polypeptide aus dem Hepatitis C-Virus, z.B. aus den Bereichen NS-3 bzw. NS-4 oder aus HIV, z.B. aus dem Bereich p24, stabilisiert. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert in Verbindung mit den beigefügten Abbildungen. Es zeigen:
Abb. 1 die Stabilisierung von Testlösungen mit bekannten Konzentrationen an Troponin T durch Zusatz von hsp25,
Abb. 2 die Aminosäuresequenz eines HCV-NS3-Polypeptids (a) , eines synthetischen HCV-NS4-Polypeptids (b) sowie eines rekombinanten HIV-p24 Polypeptids (c) und
Abb. 3 die Verbesserung der Signaldifferenzierung in Ab¬ hängigkeit von der Konzentration an zugesetztem hsp 25.
Beispiel 1
Stabilisierung von Troponin T-Testlösungen
1.1 Herstellung der Lösungen a) Troponin T-Lösung mit 5 Mol hsp25 (32-mer; 160 Mol
Monomer) pro 1 Mol Troponin T: Zu 546 μl Puffer (0,1 mol/1 Tris, pH 8,0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 Dithiothreitol (DTT) / 0,05 % NaN3) werden 100 μl Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 0,43 mg/ml (in 5 mmol/1 KP0<, pH 7,3 / 2,0 mol/1 Harnstoff / 0,6 mol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN3) und 354 μl hsp25-Lösung mit einer Konzentration von 14,7 mg/ml (in 0,1 mmol/1 Tris, pH 8,0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN3) gegeben.
Die Herstellung von rekombinantem hsp25 erfolgte wie in DE-A-42 39 969.6 beschrieben.
Bedingungen in der Lösung: Troponin T-Konz.: 0,043 μg/ l hsp25-Konz.: 5,204 mg/ml b) Kontroll- und Vergleichslösungen:
Troponin T-Lösung ohne hsp25 :
Die Herstellung erfolgte wie unter a) beschrieben. Anstelle der hsp25-Lösung wird aber nur Puffer zugegeben.
Troponin T-Lösungen mit 5 Mol bzw. 10 ol Rinderserumalbumin (RSA) pro 1 mol Troponin T: Herstellung:
Zu 800 bzw. 700 μl Puffer (0,1 mol/1 Tris, pH 8, 0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN3) werden 100 μl Troponin T-Lösung mit einer Konzentration von 0,43 mg/ml (in 5 mmol/1 KPÖ«, pH 7,3 / 2,0 mol/1 Harnstoff / 0,6 mol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN3) und 100 bzw. 200 μl RSA-Lösung mit einer Konzentration von 4,2 mg/ml (in 0,1 mol/1 Tris, pH 8,0 / 100 mmol/1 KCl / 2 mmol/1 DTT / 0,05 % NaN3) gegeben.
Bedingungen in der Lösung:
Troponin T-Konz.: 0,043 μg/ml
RSA-Konz.: 0,42 mg/ml bzw. 0,84 mg/ml
Mit dieser Lösung sollte gezeigt werden, daß es sich bei dem stabilisierenden Effekt von hsp25 nicht um einen unspezifischen Proteineffekt handelt.
hsp25-Lösung:
Die Herstellung erfolgte wie unter a) beschrieben. Anstelle der
Troponin T-Lösung wurde aber nur Puffer eingesetzt.
Mit dieser hsp25-Lösung sollten Auswirkungen des hsp25 auf den Troponin T-ELISA-Test sichtbar gemacht werden.
Die Lösungen wurden alle am gleichen Tag hergestellt und dann unter identischen Bedingungen 5 Tage bei Raumtemperatur gelagert. 1.2 Überprüfung der Stabilität von Troponin T (TN-T) in den obengenannten Lösungen
Die Stabilität von Troponin T in den Lösungen wurde durch Messung der immunologischen Aktivität des Troponin T mit dem Troponin T-ELISA von Boehringer Mannheim bestimmt.
Dazu wurde nach 5 Tagen Lagerung der unter 1.1a) beschriebenen Troponin T-Lösung durch Verdünnen mit TN-T-freiem Humanserum eine Verdünnungsreihe von 0,65 - 12,5 ng/ml (0,65 / 1,8 / 4,8 und 12,5 ng/ml) hergestellt. Die Verdünnungen wurden anschlie߬ end, wie in der Packungsbeilage des Tests beschrieben, im ELISA-Test eingesetzt.
Die unter 1.1b) beschriebenen Kontroll- und Vergleichs-Lösungen wurden entsprechend verdünnt und ebenfalls im ELISA-Test eingesetzt.
Als Vergleichsmaßstab wurde die entsprechende Verdünnungsreihe einer bei -80°C gelagerten Troponin T-Probe im Test mitgeführt.
Testformat
Bei dem Troponin T-ELISA-Test handelt es sich um einen 1-Schritt-Sandwich-Assay. Die Troponin T enthaltende Probe wird in einem Streptavidin-beschichteten Tube mit einem biotinylier- ten anti-TN-T-Antikörper 1 und einem Peroxidase (POD) -markier¬ ten anti-TN-T-Antikörper 2 inkubiert. Es bildet sich ein immu¬ nologischer Komplex (Sandwich) aus den beiden Antikörpern und dem Troponin T, der über das Biotin an die SA- Tubewand gebun¬ den wird. Der Nachweis des Komplexes erfolgt dann nach Zugabe von POD-Substrat (ABTS®) über die Bestimmung der POD-Aktivitä .
1.3. Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt.
==> In Abwesenheit von hsp25 ist eine deutliche Verminderung der immunologischen Aktivität im Vergleich zur frisch aufgetauten Troponin T-Lösung (TN-T bei -80°C) festzustel¬ len.
==> In der Lösung von TN-T mit hsp25 wird keine Abnahme der immunologischen Aktivität beobachtet.
==> RSA hat keinen stabilisierenden Einfluß auf das Troponin T. Die stabilisierende Wirkung von hsp25 beruht also auf einen hsp25-spezifischen Effekt und nicht auf einem reinen Proteineffekt.
==> Der Troponin T-ELISA-Test wird durch die eingesetzte hsp25-Konzentration nicht beeinflußt.
Beispiel 2
Stabilisierung von rekombinanten HCV- und KIV-Antigenen
Die Beispiele wurden mit dem Doppelantigen-Brückentestkonzept erstellt. Bei diesem Verfahren wird die Probenflüssigkeit mit einem biotinylierten Antigen, das an eine Streptavidin-be- schichtete Festphase binden kann, und mit einem Antigen, das eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert. Der immobilisierte immunologische Komplex aus zu bestimmendem Antikörper und zwei Antigenen wird anschließend detektiert. Die Markierungsgruppe in den gezeigten Beispielen war hierbei ein Rutheniumkomplex, und der Nachweis erfolgte über eine Elektrochemilumineszenz- Reaktion (ECL-counts) .
Es wurden folgende Antigene verwendet: a) HCV-NS3
Das Antigen entspricht der Helikase-Sequenz des Hepatitis C Virus (HCV) - Nichtstrukturprotein 3 (NS3) und wurde gemäß DE-A-44 28 705.4 rekombinant in E.coli hergestellt. Die Aminosäuresequenz des HCV-NS3-Polypeptids ist in Abb. 2a gezeigt. b) HCV-NS4
Das Antigen entspricht einer Partialsequenz des HCV-NS4 Proteins und wurde synthetisch hergestellt. Die Aminosäuresequenz des syntetischen HCV-NS4-Peptids ist in Abb. 2b gezeigt (Nie = Norleucin) . c) HIV-p24
Das Antigen entspricht einem Fusionsantigen aus der Sequenz des core-Antigens p24 (Ghrayeb und Chang, DNA 5 (1986) , 93-99) sowie weiterer core-Antigensequenzen pl7 und pl5 von HIV und wurde rekombinant in E.coli herge¬ stellt. Die Aminosäuresequenz dieses rekombinanten Polypeptids ist in Abb. 2c dargestellt.
Das synthetische HCV-NS4-Antigen wurde sowohl in biotinylierter als auch in ruthenilierter Form jeweils mit der Konzentration 30 ng/ml im Reaktionsansatz eingesetzt.
Die rekombinanten Antigene HCV-NS3 sowie auch HIV-p24 wurden sowohl in biotinylierter als auch in ruthenilierter Form jeweils mit der Konzentration 400 ng/ml im Reaktionsansatz eingesetz .
Die Pufferzusammensetzung in allen Experimenten war wie folgt:
Hepes 50 mmol/1, pH 7, 4
Thesit 0,1 %
MIT (N-Methylisothiazolon-HCl) 0,01 %
CAA (2-Chlor-Acetamid) 0,1 %
Mischung von Proteaseinhibitoren
Die hsp25-Konzentration bezogen auf hsp25-Monomer variierte im Bereich von 0/0, 1/1, 1/5, 1/10 Mol Antigen / Mol hsp25.
Die Antigene wurden unmittelbar vor Durchführung der immunolo¬ gischen Reaktion mit dem hsp25-haltigen Puffer versetzt. Die Inkubationszeit von Probenantikörper und Antigenen betrug 20 Minuten bei 37°C. Die Ergebnisse waren wie folgt
Synthetisches HCV/NS4-Antigen
Probe Puffer Puf fer mi t Puf fer mi t Puffer mi t Puffer mi t Puffer mi t RSA 0, 5 X sp25 1/1 hsp25 1/5 groE l 1 /1 groE l 1/5
Si gnalwieder indung nach einer Lagerung für 3 Wochen bei 35°C in X
1 19 59 106 110 56 54 2 15 23 81 101 48 29
Durch Zusatz von hsp25 wird die Signalwiederfindung gegenüber der Kontrolle (Puffer alleine) und Vergleichsansätzen (RSA und groEl) deutlich verbessert. Besonders bemerkenswert ist die überlegene Wirkung von hsp25 gegenüber dem großen Hitzeschock¬ protein groEl.
b) Rekombinantes HCV/NS3-Antigen
Kontrolle (ohne Zusatz von hsp25!
Signal Signaldifferenzierung
(ECL counts ) (Signal pos. Serum/ Signal neg. Serum)
Puf fer 396000 neg . Serum 88000 pos . Serum 381000
Erfindungsgemäßes Verfahren (mit Zusatz von hsp25)
Signal Signaldifferenzierung
(ECL counts (Signal pos. Serum/ Signal neg. Serum)
Puf fer 36000 neg . Serum 29000 pos . Serum 345000 12
Durch Zusatz von hsp25 wird eine signifikante Leerwertreduktion sowohl bei Puffer als auch bei einem negativen Serum gefunden. Dies bewirkt eine überraschend hohe Verbesserung der Signal- Rausch-Verhältnisses bzw. der Signaldifferenzierung.
c) Rekombinantes HIV/p24-Antigen
Probe Puffer mit Puffer mit Puffer mit Puffer mit (positiv) RSA 0,5 X hsp25 1/5 hsp25 1/10 hsp25 1/10 ohne Antigen
Signatdifferenzierung pos. Signal/neg. Signal
1 13 15 16 1 2 17 19 23 1 3 18 21 22 1
Auch hier findet man eine deutliche Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses bzw. der Signaldifferenzierung, wenn man das Antigen mit hsp25 stabilisiert.
Beispiel 3
Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von hsp25
Die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von hsp25 bei der Stabilisierung des HCV-NS3 Antigens in einem Doppelantigen¬ brückentest (Durchführung gemäß Beispiel 2) ist in Abb. 3 gezeigt.
Daraus ist ersichtlich, daß die Signalreduktion bei einer negativen Probe bereits deutlich bei einem molaren Verhältnis des Antigens zu hsp25 von 1:1 zu erkennen ist. Selbst bei Zusatz hoher Mengen an hsp25 wird keine signifikante Signalre¬ duktion bei positiven Proben gefunden. SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABE : (i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim
(B) STRASSE: Sandhofer Strasse 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: Ger any
(F) POSTLEITZAHL: D-68298
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Stabilisierung von Peptiden und Polypeptiden in immunologischen Tests durch Zusatz von kleinen Hitzeschockproteinen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0 , Version #1.30 (EPA) (vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 195 02 386.2
(B) ANMELDETAG: 26-JAN-1995
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 282 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Hepatitis C virus
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Val Val Pro Gin Ser 1 5 10 15
Phe Gin Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr
20 25 30
Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu 35 40 45 Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys
50 55 60
Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr 65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp
85 90 95
Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp Glu Cys
100 105 110
His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp
115 120 125
Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr
130 135 140
Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala 145 150 155 160
Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu
165 170 175
Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys
180 185 190
Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala
195 200 205
Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly
210 215 220
Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly 225 230 235 240
Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gin Thr Val
245 250 255
Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro
260 265 270
Gin Asp Ala Val Ser Arg Thr Gin Arg Arg 275 280
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Hepatitis C virus (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 2:
Ser Gin His Leu Pro Tyr Ile Glu Gin Gly Nie Nie Leu Ala Glu Gin 1 5 10 15
Phe Lys Gin Gin Ala Leu Gly Leu Leu Gin Thr 20 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 328 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM:
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Human immunodeficiencyvirus type 1
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Leu Ala Ala Gly Pro Asp Lys Gly Asn 1 5 10 15
Ser Ser Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile Val Gin Asn Leu Gin Gly
20 25 30
Gin Met Val His Gin Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val
35 40 45
Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe
50 55 60
Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu 65 70 75 80
Asn Thr Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr
85 90 95
Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala
100 105 110
Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile
115 120 125
Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn
130 135 140
Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu 145 150 155 160 Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp
165 170 175
Ile Arg Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe
180 185 190
Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp
195 200 205
Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr 225 230 235 240
Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala
245 250 255
Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Ser Ala Thr Ile Met Met Gin Arg
260 265 270
Gly Asn Phe Arg Asn Gin Lys Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly
275 280 285
Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
290 295 300
Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu 305 310 315 320
Arg Gin Ala Asn Phe Leu Gly Asn
325

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in wäßriger Lösung unter Verwendung von immunologisch reaktiven Peptiden oder Polypeptiden und eines Stabilisators dafür, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator ein oder mehrere Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine (kleine hsp) umfaßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das hsp in einem molaren Verhältnis von 0,0001:1 bis 1000:1 und bevorzugt von 0,01:1 bis 1000:1 bezogen auf hsp-Monomer:Peptid- oder Polypeptid verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man immunologisch reaktive Polypeptide oder Peptide verwendet, die rekombinant oder synthetisch hergestellt sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das hsp 25 aus der Maus oder/und rekombinantes hsp 25 verwendet.
5. Verwendung eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine zur Stabilisierung von Peptiden in wäßriger Lösung.
6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Verbesserung der Lagerbe¬ ständigkeit einer wäßrigen Lösung, die Peptide enthält.
7. Verwendung eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses bei einem Bestimmungsver- fahren, das in Gegenwart mindestens eines Peptids oder/und Polypeptids in wäßriger Lösung durchgeführt wird.
8. Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines spezifi¬ schen Antikörpers in einer Probeflüssigkeit, wobei man die Probeflüssigkeit mit mindestens einem Peptid- oder Polypeptid-Antigen, das mit dem zu bestimmenden Antikörper bindefähig ist, inkubiert und den Antikörper über eine Bindung mit dem Antigen nachweist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen durch Zusatz eines oder mehrerer
Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation oder/und den Nachweis in Gegenwart einer reaktiven Festphase durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probeflüssigkeit in Gegenwart einer Festphase mit einem Antigen, das in einer an die Festphase bindefä¬ higen Form vorliegt, und mit einem gegen das Antigen gerichteten Nachweisantikörper, der eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert und den zu bestimmenden Antikörper durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase nachweist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probeflüssigkeit mit mindestens zwei Antigenen AGj und AG2 in Gegenwart einer Festphase inkubiert, wobei das erste Antigen AGX in einer an die Festphase bindefähi¬ gen Form vorliegt und das zweite Antigen AG- eine Markie¬ rungsgruppe trägt, und man den zu bestimmenden Antikörper durch Messung der Markierung in der Festphase oder/und in der flüssigen Phase nachweist.
12. Verfahren zur Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid- Analyten in einer Probeflüssigkeit nach dem Prinzip des kompetitiven Immunoassay, wobei man die Probeflüssigkeit mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper und einem mit dem Analyten um den Antikörper konkurrierenden Peptid oder Polypeptid, das eine Markierungsgruppe trägt, inkubiert und den Analyten durch Messung der Markierung nachweist, dadurch gekennzeichnet, daß man das markierte Peptid oder Polypeptid durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der kleinen Hitzeschockproteine stabilisiert.
13. Verfahren zur Ermittlung von Referenzwerten für die Bestimmung eines Peptid- oder Polypeptid-Analyten, wobei man mindestens eine Testlösung, die eine bekannte Konzen¬ tration des zu bestimmenden Analyten enthält, mit einem gegen den Analyten gerichteten Antikörper inkubiert und durch Quantifizierung der Immunreaktion zwischen Antikör¬ per und dem in bekannter Konzentration vorliegenden Analyten mindestens einen Referenzwert bildet, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen in der Testlösung durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert.
14. Reagenzienkit zur Verwendung in immunologischen Testver¬ fahren, umfassend in räumlich getrennter Form
(a) mindestens ein erstes Reagenz, das ein immunologisch reaktives Peptid oder Polypeptid enthält,
(b) mindestens ein zweites Reagenz, das eine weitere immunologisch reaktive Komponente enthält und
(c) gegebenenfalls weitere Hilfs- und/oder Nachweisrea¬ genzien, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein erstes Reagenz, das ein immunologisch reaktives Peptid oder Polypeptid enthält, durch Zusatz eines oder mehrerer Proteine aus der Familie der "kleinen" Hitzeschockproteine stabilisiert ist.
15. Reagenzienkit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Polypeptid in einer an eine reaktive Festphase bindefähigen Form vorliegt.
16. Reagenzienkit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Polypeptid eine Markierungsgruppe trägt .
17. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid oder Polypeptid rekombinant oder syn¬ thetisch hergestellt ist.
18. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien als Lösung oder Lyophilisat vorliegen.
19. Verwendung eines Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 14 bis 18 zur Bestimmung von viralen Antigenen oder von gegen virale Antigene gerichteten Antikörpern.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid oder Polypeptid aus HCV oder HIV verwendet .
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