ES2316171T3

ES2316171T3 - Tampones para estabilizar antigenos hcv.

Info

Publication number: ES2316171T3
Application number: ES98948399T
Authority: ES
Inventors: David Y. Chien; Phillip Arcangel; Stephen Tirell; Wanda Ziegler
Original assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: EP1021723B1; WO1999015901A1; ATE417275T1; JP2001517799A; EP1021723A1; US6537745B2; JP4427182B2; DE69840334D1; CA2303165C; US6261764B1; CA2303165A1; AU9498098A; JP2009180750A; US20010039009A1

Abstract

Un diluyente para antígenos que comprende un antígeno del Virus de la Hepatitis C (HCV), un agente reductor y un agente caotrópico.

Description

Tampones para estabilizar antígenos HCV.

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad conforme a 35 U.S.C. 119 frente a la solicitud Núm. de serie 60/059.703.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de los inmunoensayos y específicamente a tampones para estabilizar antígenos, en particular, antígenos del virus de la hepatitis C (HCV), para usar en inmunoensayos de anticuerpos anti-HCV.

Antecedentes de la invención

En general, los inmunoensayos se fabrican determinando primero los epítopos que están asociados específicamente con un virus, y determinando luego cuál de esos epítopos es el preferido para el ensayo que se está desarrollando. Cuando se aíslan los epítopos concretos, se determinan sus secuencias y se produce el material genético encargado de producir esos epítopos. Se conocen métodos para producir proteínas tanto mediante medios químicos como biológicos, así como también ensayos usados para detectar la presencia de anticuerpos dirigidos contra epítopos concretos. Los inmunoensayos de alta selectividad y sensibilidad generalmente contienen los epítopos inmunodominantes principales del patógeno sospechoso de infectar a un paciente.

En el caso del virus HCV, los epítopos inmunodominantes principales se han identificado en la nucleocápsida (del inglés, "core"), en las regiones NS3, NS4 y NS5 (no estructurales) (del inglés, " nonstructural") de la poliproteína vírica. La proteína de la nucleocápsida de HCV y las proteínas putativas de la matriz se han ensayado frente a muestras de suero humano que contenían anticuerpos dirigidos contra HCV y se han definido varias regiones inmunodominantes incluidas en las proteínas de HCV. Sallberg y col., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 1989-1994. Se han identificado los dominios proteicos de las poliproteínas de HCV-1, que incluyen los dominios C, El, E2/NS1, NS2, NS3, NS4 y NS5, y sus límites aproximados se han proporcionado en el documento WO 93/00365. Además, se han diseñado polipéptidos individuales que poseen secuencias derivadas de la región estructural de HCV, con el fin de obtener un epítopo inmunodominante, útil en los ensayos de sueros de pacientes con HCV. Kotwal y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 4486-4489.

El presente ensayo elegido para la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV es el ensayo ELISA Ortho 3.0, que es un ensayo manual. Los antígenos recombinantes de HCV, producidos por Chiron, para usar en este ensayo ELISA, son c200 (ns-3, c100), c22 y NS-5. Los antígenos c33c y c22 son muy inmunogénicos. Los anticuerpos dirigidos contra c33c y c22 se encuentran también en paneles de seroconversión obtenidos durante la fase de infección temprana. La prevalencia de los anticuerpos dirigidos contra HCV varía desde el 58% hasta el 95%, obteniéndose el índice de detección más alto para el polipéptido c33c seguido por el del polipéptido c22. Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10011-10015. Sin embargo, se han encontrado problemas para estabilizar los antígenos de HCV en la fase líquida. La falta de estabilidad de los antígenos de HCV en la fase líquida es uno de los principales inconvenientes del presente ensayo de detección de anticuerpos dirigidos contra HCV. Por lo tanto, se ha intentado desarrollar un tampón para antígenos destinado al inmunoensayo de anticuerpos anti-HCV, utilizando los mismos antígenos que en el ensayo ELISA Ortho 3.0, en el que el tampón estabiliza los antígenos de HCV. Además, se ha probado a adaptar los reactivos, el tampón y los protocolos a las máquinas automáticas ya existentes, tales como la ACS:Centaur. Se conocen algunas composiciones acuosas que comprenden un tampón biológico y un agente reductor (documento WO 96/41164; documento WO 96/32004; documento US 5.616.460; documento DE 195 02386; documento WO 94/25874; documento JP 06 074956; documento EP O 341439).

Por consiguiente, existe actualmente la necesidad de mejorar la estabilidad de los antígenos de HCV en la fase líquida, para usarlos en inmunoensayos de anticuerpos anti-HCV. Esos reactivos y métodos analíticos mejorados proporcionan una mejor detección de anticuerpos dirigidos contra HCV en ensayos de escrutinio de materiales de aporte de sangre y de otros fluidos biológicos. Se contempla que esos tampones se pueden usar para otros antígenos que pueden ser inestables en fase líquida, p. ej., antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV).

Sumario de la invención

En uno de los aspectos, la presente invención está dirigida a un diluyente para antígenos capaz de estabilizar antígenos de HCV en la fase líquida, en particular antígenos recombinantes de HCV, que comprende un agente reductor y un agente caotrópico.

En otro de los aspectos, la presente invención está dirigida al uso de un diluyente para antígenos que contiene un agente reductor, un agente caotrópico y un antígeno de HCV, en un inmunoensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra el virus de la Hepatitis C.

En otro de los aspectos, se proporciona un kit de inmunoensayo, kit que comprende un antígeno de HCV y un diluyente para antígenos que contiene un agente reductor y un agente caotrópico.

La invención por lo tanto proporciona:

- un diluyente para antígenos que comprende un antígeno del Virus de la Hepatitis C (HCV), un agente reductor y un agente caotrópico;

- un kit de inmunoensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV, en el que el kit comprende un antígeno de HCV y un diluyente para antígenos que comprende un agente reductor y un agente caotrópico; y

- Uso del diluyente para antígenos de la invención, en un ensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra antígenos del virus de la hepatitis C.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención utilizará, salvo que se indique lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de DNA recombinante, incluidos en la experiencia en la técnica. Esas técnicas, se encuentran explicadas con todo detalle en la literatura. Véanse, p. ej., Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I y II (D. Glover, compilador); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, compiladores, Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, compiladores, Blackwell Scientific Publications); y Fundamental Virology, 2ª Edición, Vols. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, compiladores).

La estabilidad de los reactivos a lo largo del tiempo es una cuestión crítica. El antígeno c33c diluido en un tampón y ensayado en el mismo día, fue funcional usando los protocolos del ensayo Magic Lite Assay que se describen más adelante. Independientemente del reactivo, cuando dicho antígeno se sometió a un estrés de 37ºC, perdió más del 50% de inmunorreactividad frente a paneles de seroconversión obtenidos durante la fase de infección temprana. El c33c en la fase líquida puede "formar agregados" lentamente o puede volverse insoluble. Se probaron componentes conocidos con el fin de estabilizar la inmunorreactividad de c33c, tales como azúcares, gelatina, glicerol, reactivos formadores de enlaces cruzados y antioxidantes. Se descubrió que el hecho de conservar el antígeno c33c en forma reducida, puede mantener la inmunorreactividad durante períodos de más de 24 horas, incluso hasta al menos 7 días, a 37ºC, en paneles de seroconversión de c33c obtenidos durante la fase de infección temprana (que corresponden a la ejecución del ensayo ELISA Ortho 3.0). El agente reductor reduce los enlaces disulfuro entre los grupos de cisteína del interior de la molécula de c33c, mejorando quizás la inmunorreactividad y solubilidad de c33c. No se dio indicación de la estabilidad del antígeno a 37ºC durante esos períodos de tiempo, de reactivos Lite convencionales en la fase líquida, antes del advenimiento del diluyente de antígenos en el caso de C33c. Se realizaron experimentos similares en el caso de c200 y de un antígeno de fusión multiepitópico (MEFA-6), como se muestra más adelante. Por lo tanto, la presente invención proporciona diluyentes o tampones para antígenos, para estabilizar antígenos del HCV, para usarlos en inmunoensayos de anticuerpos anti-HCV. Los diluyentes o tampones para antígenos de la presente invención se pueden usar en inmunoensayos tales como, por ejemplo, ELISA y CLIA.

La presente invención está dirigida a diluyentes o tampones para antígenos que proporcionan una estabilidad mejorada de antígenos de HCV en la fase líquida. Según aquí se usa, "diluyentes para antígenos o tampones" se refiere a la disolución en la que el antígeno está contenido; esa disolución puede poseer o no capacidad de tamponamiento. En particular, la invención está dirigida a diluyentes o tampones para antígenos, destinados a mejorar la estabilidad de los antígenos recombinantes de HCV en el ensayo ELISA Ortho 3.0 y en ensayos similares. La presente invención se realizó añadiendo un agente reductor tal como, por ejemplo, ditiotreitol (DDT), al diluyente o tampón para antígenos.

En una realización preferida de la invención, el diluyente o tampón para antígenos de HCV comprende un agente reductor. En otra realización preferida de la invención, el diluyente o tampón para antígenos de HCV comprende fosfato sódico (pH 6,5), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), DTT, gelatina, tiocianato amónico, azida sódica y SDS. Sin embargo, cada uno de estos reactivos se puede reemplazar por reactivos similares que desempeñan esencialmente la misma función. Por ejemplo, el DTT se puede reemplazar por agentes reductores adicionales tales como, por ejemplo, tioglicerol, mercaptoetenol y agentes similares. El fosfato sódico se puede reemplazar por borato sódico y otros tampones. La gelatina se puede reemplazar por BSA u otros agentes bloqueantes de uniones inespecíficas. El tiocianato sódico se puede reemplazar por tiocianato amónico y otros agentes caotrópicos. El SDS se puede reemplazar por varios detergentes tales como, por ejemplo, Tween-20 y otros detergentes. La azida sódica se puede reemplazar por otros agentes antibacterianos. Además, el EDTA se puede reemplazar por el ácido etileneglicol-bis(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) y por otros agentes quelantes. El experto en la técnica está familiarizado con reactivos que pueden sustituir a los de la presente invención.

En una realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende fosfato sódico en concentración desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 100 mM, pH 6,5. Más preferiblemente, el diluyente comprende fosfato sódico en concentración desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 75 mM, pH 6,5. Muy preferiblemente, el diluyente comprende fosfato sódico 24 mM o 25 mM, pH 6,5.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende EDTA en concentración desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 10 mM. Más preferiblemente, el diluyente comprende EDTA en concentración desde aproximadamente 3 mM hasta aproximadamente 7 mM. Muy preferiblemente, el diluyente comprende EDTA 5 mM.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende DTT en concentración desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 200 mM. Más preferiblemente, el diluyente comprende DTT en concentración desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 100 mM. Muy preferiblemente, el diluyente comprende DTT 10 mM.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende gelatina en concentración desde aproximadamente al 0,05% hasta aproximadamente al 1%. Más preferiblemente, el diluyente comprende gelatina en concentración desde aproximadamente al 0,1% hasta aproximadamente al 0,5%. Muy preferiblemente, el diluyente comprende gelatina al 0,2%.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende tiocianato amónico en concentración desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 500 mM. Más preferiblemente, el diluyente comprende tiocianato amónico en concentración desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM. Muy preferiblemente, el diluyente comprende tiocianato amónico 100 mM.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende azida sódica en concentración desde aproximadamente al 0,01% hasta aproximadamente al 0,3%. Más preferiblemente, el diluyente comprende azida sódica en concentración desde aproximadamente al 0,05% hasta aproximadamente al 0,2%. Muy preferiblemente, el diluyente comprende azida sódica al 0,09%.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV comprende SDS en concentración desde aproximadamente al 0,01% hasta aproximadamente al 0,5%. Más preferiblemente, el diluyente comprende SDS en concentración desde aproximadamente al 0,05% hasta aproximadamente al 0,2%. Muy preferiblemente, el diluyente comprende SDS al 0,1%.

En otra realización preferida de la presente invención, el diluyente para antígenos de HCV del ensayo manual comprende fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, EDTA 5 mM, DTT 10 mM, gelatina al 0,2%, tiocianato amónico 100 mM, azida sódica al 0,09% y SDS al 0,1%.

En los ensayos automatizados, un tampón para antígenos preferido para c33c comprende fosfato 50 mM, EDTA 5 mM, tiocianato amónico 100 mM, SDS al 0,06%, gelatina de pescado al 0,25% y DTT 10 mM.

La Tabla 1 muestra un tampón preferido para HCV.

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TABLA 1 Tampón para antígenos de HCV aplicado a antígenos de HCV

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Los diluyentes o tampones para antígenos de HCV de la presente invención se pueden preparar mediante técnicas de preparación de medios muy conocidas. Una realización preferida para preparar diluyentes para antígenos de HCV de la presente invención se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2 Procedimiento para la preparación de diluyentes

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Los diluyentes o tampones para antígenos de HCV de la presente invención se pueden usar en ensayos manuales o automáticos. Los diluyentes o tampones para antígenos de la presente invención se pueden usar con numerosos antígenos de HCV que incluyen, pero que no se limitan a, c33c, MEFA-6, c22p, c100p, NS-5 y c200. Estos antígenos para HCV se pueden preparar mediante procedimientos recombinantes usados habitualmente en la técnica.

Secuencias de regiones de c33c (NS3) y c100 (NS4) de HCV contienen epítopos de la nucleocápsida inmunodominante y se prepararon según se describe en Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10011-10015. El antígeno c200 es una proteína de fusión que consiste en los antígenos c33c y c100. Los antígenos c22 (119 aminoácidos) y NS5 (942 aminoácidos) se expresaron como antígenos internos en la levadura S. cerevisiae en forma de fusiones C-terminales con la superóxido dismutasa (SOD) humana, usando métodos previamente descritos para la generación del antígeno c100-3 (363 aminoácidos). Kuo y col., Science, 1989, 244, 362-364; y Cousens y col., Gene, 1987, 61, 265-275. El antígeno c33c (363 aminoácidos) se expresó como un polipéptido interno de fusión con SOD en E. coli, mediante métodos descritos para la síntesis del antígeno 5-1-1. Choo y col., Science, 1989, 244, 359-362. Los antígenos recombinantes de HCV se purificaron según se describe en Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 89, 10011-10015. En la presente invención, todos los antígenos de HCV se prepararon en forma de proteínas de fusión con SOD. No obstante, se pueden preparar otras proteínas de fusión adecuadas dependiendo de la disponibilidad de los anticuerpos convenientes que reconozcan a la pareja de la fusión.

MEFA-6 contiene epítopos procedentes de la nucleocápsida, de la envoltura, de las regiones NS3, NS4 y NS5 de la poliproteína del virus de la hepatitis C, que incluyen determinantes antigénicos equivalentes procedentes de las cepas 1, 2 y 3 de HCV. Los diferentes segmentos de DNA que codifican los epítopos de HCV se construyeron mediante amplificación por PCR o por medio de oligonucleótidos sintéticos. La Tabla 3, más adelante, describe los segmentos de aminoácidos de cada uno de los epítopos, el ordenamiento lineal de los diferentes epítopos y el número de copias de la casete de MEFA-6. La casete de MEFA-6 se preparó según se describe en la solicitud de PCT, documento US 97/08950, presentada el 23 de mayo de 1997.

Como se muestra en la Tabla 3, el antígeno MEFA-6 incluye múltiples copias de epítopos de HCV procedentes de la nucleocápsida y de la región NS5; diferentes epítopos serotípicos procedentes de la región NS4 5-1-1; una copia única de los principales epítopos lineales procedentes de las regiones C-terminales de c100, las regiones E1 y E2, así como la región NS3 (c33c) de HCV. La fórmula estructural general de MEFA-6 es hSOD-E1-E2-c33c-5-1-1(tipo 1)-5-1-1(tipo 3)-5-1-1(tipo 2)-c100-NS5(2 copias)-nucleocápsida (2 copias). Este antígeno tiene un nivel de expresión muy alto en levaduras, se purifica con un alto grado de homogeneidad, y exhibe una elevada sensibilidad y elevada selectividad en los inmunoensayos que se describen más adelante. El MEFA-6 se preparó según se describe en la solicitud Núm. de serie 08/859.524, presentada el 20 de mayo de 1997.

TABLA 3 Epítopos del antígeno MEFA-6 y su situación dentro del genoma de HCV

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El marcador detectable puede incluir, pero no se limita a, un cromóforo, un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un compuesto reactivo con enzimas cuyo producto de escisión es detectable, rodamina o un derivado de rodamina, biotina, estreptavidina, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, derivados y/o combinaciones de estos marcadores. En los presentes ejemplos, se usó el compuesto quimioluminiscente éster de dimetil-acridinio (DMAE, Ciba Corning Diagnostics Corp.). El marcaje con cualquiera de los marcadores se lleva a cabo en las condiciones adecuadas para obtener la detección y antigenicidad óptimas del MEFA-6 o de otros epítopos. Cuando DMAE es el marcador detectable en un ensayo, el conjugado DMAE-rAg de HCV es el trazador, siendo el DMAE detectable por su emisión de luz cuando reacciona con NaOH/H_{2}O_{2}.

Un polipéptido, anticuerpo o antígeno peptídico sintético se marcó con DMAE mediante reacción de las cadenas laterales de los aminoácidos (p. ej., cadena lateral de lisina en \varepsilon o tiol de cisteína) con un resto reactivo unido covalentemente a DMAE (véase el documento WO 95/27702, publicado el 19 de octubre de 1995, Ciba Corning Diagnostics Corp.). Por ejemplo, los antígenos de HCV aquí descritos, se marcaron mediante reacción de los grupos amino de las cadenas laterales de lisina con NSP-DMAE-NHS (9-carboxilato de 2',6'-Dimetil-4'-(N-succinimidiloxi-carbonil)fenil-10-(3'-sulfopropil)-acridinio), obtenido procedente de Ciba Corning. Los tioles de las cadenas laterales de aminoácidos se pueden marcar usando DMAE-ED-MCC o NSP-DMAE-PEG-BrAc (Ciba Corning). Los procedimientos de marcaje fueron en general como los descritos en el documento WO 95/27702, con variaciones en las condiciones según se necesiten para proporcionar a cada antígeno la detección y antigenicidad óptimas.

Ejemplos Ejemplo 1 Ensayo manual

Para el ensayo manual se usó un Magic Lite Analyzer System II (MLA II). Parámetros tales como volumen, concentración, tiempo y temperatura se proporcionan como orientación, pero se pueden ajustar de la manera que corresponda. Brevemente expuesto, una parte alícuota de 10 \mul de una muestra a ensayar se añadió a los correspondientes tubos. La muestra a ensayar es preferiblemente un fluido biológico (plasma o suero, por ejemplo) que contiene anticuerpos anti-HCV, así como controles adecuados. A cada uno de los tubos se añaden 100 \mul de diluyente o tampón para antígenos y se incuban durante 6 minutos a 37ºC. A cada uno de los tubos se añaden 100 \mul de un tampón para la fase sólida que contiene partículas paramagnéticas (PMP) conjugadas con anticuerpos anti-IgG humana, procedentes de rata, (PMP/anticuerpos anti-IgG humana) para alcanzar una concentración final de aproximadamente 60 \mug/ensayo). No obstante, son adecuados otros anticuerpos anti-IgG humana son adecuados. Preferiblemente, las partículas paramagnéticas tienen un diámetro menor que aproximadamente 10 \mum. Las partículas de PMP/anticuerpo anti-IgG humana se pueden diluir en un diluyente que contiene tampón de Tris, pH 8,0, NaCl 150 mM, BSA al 2,75%, caseína al 0,1%, Tween-20 al 0,1%, extracto de levadura al 0,1%, extracto de E. coli al 0,25%, SOD al 0,005%, NaN_{3} al 0,09% y EDTA 1 mM. Posteriormente, antígenos recombinantes de HCV (proteínas de fusión de antígeno de HCV/SOD), conjugados con DMAE (MEFA-6-DMAE, c33c-DMAE y c200-DMAE, por ejemplo), se añaden en un volumen de 50 \mul de diluyente del reactivo ligando (LR), en una concentración de aproximadamente desde 0,1 \mug/ensayo hasta 1 \mug/ensayo. Preferiblemente, una cantidad de reactivo ligando se añade a cada una de las muestras de manera que aproximadamente 25 x 10^{6} equivalentes de unidades de luz (unidades relativas de luz, RLU) están presentes en cada ensayo. Esta cantidad aproximada de equivalentes de unidades de luz se prefiere en el caso de la adición de un solo ligando o en el caso de la adición de múltiples ligandos. El diluyente de LR contiene tampón de Tris, pH 8,0, NaCl 150 mM, BSA al 1,0%, Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} al 0,09% y EDTA 1 mM. Para garantizar una mezcla completa, los tubos se agitan en un mezclador Vortex 6 veces, 5 - 10 segundos cada vez. Los tubos de las muestras se incuban a 37ºC durante 18 minutos. Los tubos de las muestras se colocan sobre un imán durante 3 minutos, tiempo suficiente para sedimentar las partículas PMP. Las muestras se decantan usando un imán para retener las partículas PMP. Las partículas PMP se lavan dos veces, con agitación en el Vortex en 1 ml de PBS. La disolución de lavado es PBS, Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} 0,09% y EDTA 1 mM. Las etapas de mezclar, incubar, sedimentar y decantar se pueden repetir al menos una vez. A cada tubo se añaden 100 \mul de agua para resuspender las partículas PMP. Los tubos se colocan luego en un instrumento MLA-II y la emisión de luz se mide durante 2 segundos.

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Ejemplo 2 Ensayo automatizado

El ensayo manual anti-HCV anteriormente descrito se adaptó para uso automatizado usando un aparato ACS:
Centaur. Se usa el siguiente procedimiento. Brevemente expuesto, el sistema ACS:Centaur ejecuta automáticamente las siguientes etapas: 1) dispensa 10 \mul de muestra en una cubeta; 2) dispensa 100 \mul un tampón diluyente adicional, 100 \mul de Reactivo Lite/Fase sólida, 50 \mul de reactivo antigénico 2 (p. ej., MEFA-6), 50 \mul de reactivo antigénico 1 (p. ej., c33c) e incuba la mezcla durante 18 minutos a 37ºC; 3) separa la fase sólida de la muestra y aspira el reactivo no unido; 4) lava la cubeta con un reactivo de lavado 1; 5) dispensa 300 \mul del reactivo ácido y 300 \mul del reactivo básico para iniciar la reacción quimioluminescente; y 6) expresa los resultados conforme a la opción seleccionada, según se describe en las instrucciones operativas del sistema o en el sistema de ayuda en línea. El tampón diluyente de Reactivo Lite/Fase sólida comprende Tris 50 mM, KCl 0,5 M, EDTA 1 mM, BSA al 3,75%, levadura al 0,003%, E. coli 0,05 g/L, Tween-20 al 0,5%, anfotericina B 2 mg/L, sulfato de gentamicina 24 mg/L, Fase sólida 30 \mug/ensayo, Reactivo Lite (anticuerpos anti-SOD*DMAE) 45 x 10^{6} ensayo. El tampón diluyente adicional comprende Tris 50 mM, KCl 0,5 M, EDTA 1 mM, BSA al 3,75%, levadura al 0,003%, E. coli 0,05 g/L, Tween-20 al 0,5%, anfotericina B 2 mg/L, sulfato de gentamicina 24 mg/L, IgG1 procedente de ascitis 0,05 g/L e IgG2A (anticuerpos bloqueantes) procedente de ascitis 0,1 g/L. El reactivo de lavado comprende PBS/Tween-20. El reactivo ácido comprende H_{2}O_{2} al 0,5%/HNO_{3} 0,1 N. El reactivo básico comprende NaOH <0,25 N con un tensioactivo.

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Ejemplo 3 Ensayo manual con c33c

Un ensayo manual usando el antígeno c33c de HCV se realizó con 100 ng de c33c por ensayo, usando la metodología anteriormente descrita en el Ejemplo 1. El diluyente del antígeno comprendió fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, tiocianato sódico 100 mM, EDTA 5 mM, Tween-20 al 0,1%, gelatina de pescado al 0,2%, azida sódica al 0,09% y DTT 10 mM. El ensayo se realizó con 3 x 10^{6} RLU/10 \mul, PMP 30 \mug/ensayo. El ensayo se realizó en distintos momentos y a distintas temperaturas. Por ejemplo, el ensayo se realizó en el Día 0 a 4ºC, en el Día 3 a 4ºC, en el Día 1 a 37ºC, en el Día 2 a 37ºC, en el Día 3 a 37ºC y el el Día 6 a 37ºC.

Una muestra (tal como un fluido biológico que contiene anticuerpos anti-HCV humanos) de 10 \mul se añadió a cada uno de los tubos para las muestras. Las muestras incluían: controles negativos al azar (r1, r2 y r3), un control positivo (Virotrol), paneles de seroconversión (PHV905-5, PHV907-4 y PHV904-6), muestras de pacientes infectados por HCV (FF25931) y muestras de seroconversión (6214-09 y 6212-04). Los resultados se muestran en la Tabla 4. La sensibilidad se expresó como la densidad óptica de la muestra analizada dividida entre el valor de corte de la detección del ensayo en unidades de densidad óptica (s/co) (del inglés, " sample/cut off"). Todas las muestras que se sabía que eran negativas exhibieron unidades relativas de luz (RLU) por debajo del valor de corte, mientras que las muestras que se sabía que eran positivas exhibieron RLU muy por encima del valor de corte.

Con fines comparativos, la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV en algunas de las muestras (véase la Tabla 4) se realizó también mediante el ensayo Ortho 3.0 y mediante un ensayo comercial de inmunotransferencia en tiras (RIBA® 3.0, Chiron Corporation), ensayo que se usa en clínica como ensayo confirmatorio de la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV. Conforme al método de RIBA®, antígenos recombinantes de HCV se separan mediante electroforesis en gel y se ponen en contacto con el suero de un paciente. La reactividad con los antígenos separados se realiza mediante un ensayo de inmunotransferencia usando segundos anticuerpos marcados. Los resultados del ensayo se evalúan sobre una escala de más/menos. Eheling y col., Lancet, 1991, 337, 912-913. El ensayo Ortho 3.0 se llevó a cabo conforme a las instrucciones del fabricante. Los antígenos c33c, c22p, c100p y NS-5 se usaron como los antígenos de HCV en estos ensayos.

Brevemente expuesto, el ensayo RIBA® 3.0 se realizó de la siguiente manera. Aproximadamente 30 minutos antes de comenzar el ensayo, el kit se sacó del refrigerador (de 2ºC a 8ºC) y se dejó que los componentes del kit alcanzaran la temperatura ambiente (de 15ºC a 30ºC). El número requerido de tiras se extrajo de las bolsas de papel de aluminio precintadas y las tiras se colocaron en la gradilla de tubos de ensayo en sus respectivos tubos. En cada uno de los tubos se añadió 1 ml de Diluyente para el Espécimen de manera que toda la tira quedó cubierta por líquido. Se añadieron 20 \mul del espécimen o del control adecuado al tubo correspondiente. Los tubos se taparon y se invirtieron para su mezcla. La gradilla con los tubos se colocó luego sobre una plataforma oscilante y se sujetó con gomas elásticas de caucho o con una cinta adhesiva; la gradilla se hizo oscilar (a 16-20 ciclos/minuto) durante de 4 horas a 4½ horas a temperatura ambiente (de 15ºC a 30ºC). Los tubos se destaparon y el líquido se aspiró totalmente y se vertió en un recipiente para residuos. A cada uno de los tubos se añadió un ml de Diluyente para el Espécimen. Los tubos se taparon y se colocaron en la gradilla sobre la plataforma oscilante y se hicieron oscilar durante de 30 a 35 minutos a temperatura ambiente. El líquido después se aspiró. A cada uno de los tubos se añadió un ml del Tampón de Lavado de Trabajo, a continuación el líquido y las tiras se echaron en el interior de recipientes de lavado que contenían 30 ml de Tampón de Lavado de Trabajo (un máximo de 20 tiras por recipiente de lavado). Los recipientes de lavado se llenaron por completo de Tampón de Lavado de Trabajo (volumen total de 60 mL), y seguidamente el líquido de lavado se decantó. Para retener las tiras, el recipiente de lavado se hizo rodar con cuidado mientras se hacía la decantación. Se añadieron 60 ml del Tampón de Lavado de Trabajo, se agitaron en vórtice, y a continuación el líquido de lavado se decantó al mismo tiempo que se retenían las tiras. A cada uno de los recipientes de lavado se añadió un ml de Conjugado por cada tira (mínimo 10 ml por recipiente de lavado). Los recipientes de lavado se hicieron girar sobre un agitador giratorio a 110 rpm \pm 5 rpm, durante de 9 a 11 minutos, a temperatura ambiente (de 15ºC a 30ºC). Se preparó el Sustrato de Trabajo como máximo 1 hora antes de su uso. Una vez completada la incubación con el Conjugado, el Conjugado se decantó y las tiras se lavaron añadiendo 60 ml del Tampón de Lavado de Trabajo y agitando en vórtice. El líquido resultante del lavado se decantó y esta etapa se repitió dos veces más. El líquido del lavado final se decantó. A cada uno de los recipientes de lavado se añadió un ml del Sustrato de Trabajo por cada tira (mínimo 10 ml por recipiente de lavado). Los recipientes de lavado se hicieron girar sobre un agitador giratorio a 110 rpm \pm 5 rpm, durante de 15 a 20 minutos, a temperatura ambiente (de 15ºC a 30ºC). El sustrato de trabajo se decantó y las tiras se lavaron añadiendo 60 ml de agua destilada o desionizada y agitando en vórtice. El líquido resultante del lavado se decantó y esta etapa se repitió una vez más. Para retener las tiras, el recipiente de lavado se hizo rodar con cuidado mientras se hacía la decantación. Usando unas pinzas, las tiras se transfirieron a papel absorbente y el agua en exceso se secó sobre el papel. Las tiras se secaron al aire y en oscuridad durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. La interpretación de las tiras se realizó en el plazo de 3 horas. La reactividad anti-HCV de un espécimen se determinó comparando la intensidad de cada una de las bandas de los antígenos con la intensidad de las bandas de control interno de IgG humana (Nivel I y Nivel II) en cada una de las tiras. La identidad de los anticuerpos se definió por la situación concreta de la banda del antígeno. La intensidad de las bandas antígeno/péptido se evaluó en relación con las intensidades de los controles internos de IgG de la siguiente manera: ausente (-), intensidad menor que la de la banda de control de IgG de Nivel I (-/+), intensidad igual a la de la banda de control de IgG de Nivel I (1+), intensidad mayor que la de la banda de control de IgG de Nivel I y menor que la de la banda de control de IgG de Nivel II (2+), intensidad igual a la de la banda de control de IgG de Nivel II (3+), e intensidad mayor que la de la banda de control de IgG de Nivel II (4+).

Ejemplo 4 Ensayo manual con c200

Un ensayo manual usando el antígeno c200 de HCV se realizó según se describe en el Ejemplo 1, con diferentes cantidades de agente reductor. El tampón de estabilización fue el mismo que el utilizado en el Ejemplo 3, excepto por la cantidad de agente reductor. El ensayo se realizó con 3 x 10^{6} RLU/10 \mul, PMP 30 \mug/ensayo. El ensayo se realizó en distintos momentos y con distintas cantidades de agente reductor. Por ejemplo, el ensayo se realizó después de 1 día a 37ºC, con DTT 20 mM (Vial I), después de 1 día a 37ºC, sin DTT (Vial II), y después de 1 día a 37ºC, cuando el DTT 20 mM se añadió antes de realizar el ensayo (Vial III). Los viales II and III se ensayaron también pasados 3 días.

Una muestra de 10 \mul (tal como un fluido biológico que contiene anticuerpos anti-HCV humanos) se añadió a cada uno de los tubos de las muestras. Las muestras incluían: controles negativos al azar (r1, r2, r3, r4 y r5), paneles de seroconversión (PHV904-6 y PHV906-1), muestras de pacientes infectados por HCV (FF25931) en diluciones diferentes. Los resultados se muestran en la Tabla 5. El cociente s/n es la sensibilidad dividida entre el valor ave.neg.

Ejemplo 5 Ensayo manual con MEFA-6 y c33c

Un ensayo manual usando MEFA-6 y el antígeno c33c de HCV se llevó a cabo con 100 ng de MEFA-6 y 85 ng de c33c por ensayo, usando la metodología anteriormente descrita en el Ejemplo 1.

El tampón de estabilización para MEFA-6 comprendía borato sódico 50 mM, pH 9,5, EDTA 5 mM, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% y tioglicerol al 1%. A este pH 9,5, MEFA-6 es estable por lo que no se necesita agente reductor. El tampón para c33c comprendía fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, EDTA 5 mM, Tween-20 al 0,1%, gelatina de pescado al 0,2%, tiocianato sódico 100 mM y DTT 10 mM. El ensayo se llevó a cabo con una cantidad de anti-SOD*DMAE de 4,5 x 10^{6} RLU/10 \mul y con PMP 30 \mug/ensayo. El ensayo se realizó en distintos momentos y a distintas temperaturas. Por ejemplo, el ensayo se realizó en el Día 7 a 4ºC y en el Día 7 a 37ºC.

Una muestra de 10 \mul (tal como un fluido biológico que contiene anticuerpos anti-HCV humanos) se añadió a cada uno de los tubos de las muestras. Las muestras incluían: controles negativos al azar (r1, r2, r3 y r4), un control positivo (Virotrol), paneles de seroconversión (PHV905-5, PHV909-1, PHV909-2 and PHV909-3), muestras de seroconversión (6212-02 y 6214-09) y paneles de seroconversión de control (SC-0030A, SC-0030B, SC-0030C, SC-0030D, SC-0040A, SC-0040B, SC-0040C, SC-0040D y SC-0040E). Los resultados se muestran en la Tabla 6. La sensibilidad se expresó como la densidad óptica de la muestra analizada dividida entre el valor de corte de detección del ensayo en unidades de densidad óptica (s/co). Todas las muestras que se sabía que eran negativas exhibieron unidades relativas de luz (RLU) por debajo del valor de corte, mientras que las muestras que se sabía que eran positivas exhibieron RLU muy por encima del valor de corte.

Con fines comparativos, la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV, procedentes de algunas de las muestras (véase la Tabla 6), se realizó también mediante el ensayo Ortho 3.0 y el ensayo RIBA® 3.0, según se describe en el Ejemplo 3.

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Ejemplo 6 Ensayo manual con MEFA-6

Un manual de ensayo usando el antígeno MEFA-6 de HCV se llevó a cabo con 100 ng de MEFA-6 por ensayo, usando la metodología anteriormente descrita en el Ejemplo 1. El tampón para MEFA-6 comprendía borato sódico 50 mM sodium borate, pH 9,5, EDTA 5 mM, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% y tioglicerol al 1%. El ensayo se llevó a cabo con una cantidad de anti-SOD*DMAE de 4,5 x 10^{6} RLU/10 \mul y con PMP 30 \mug/ensayo. El ensayo se realizó en el Día 7 a 4ºC.

Una muestra (tal como un fluido biológico que contiene anticuerpos anti-HCV humanos) de 10 \mul se añadió a cada uno de los tubos de las muestras. Las muestras incluían: controles negativos al azar (r1, r2 y r3), un control positivo (Virotrol) y paneles de seroconversión de control (SC-0030A, SC-0030B, SC-0030C y SC-0030D). Los resultados se muestran en la Tabla 7. La sensibilidad se expresó como la densidad óptica de la muestra analizada dividida entre el valor de corte de la detección del ensayo en unidades de densidad óptica (s/co). Todas las muestras que se sabía que eran negativas exhibieron unidades relativas de luz (RLU) por debajo del valor de corte, mientras que las muestras que se sabía que eran positivas exhibieron RLU muy por encima del valor de corte.

Con fines comparativos, la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV, procedentes de algunas de las muestras (véase la Tabla 7), se realizó también mediante el ensayo Ortho 3.0 y el ensayo RIBA® 3.0, según se ha descrito en lo que antecede.

Los anteriores ejemplos tienen la intención de ilustrar la invención y no se ha de interpretar que limiten la invención en modo alguno.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Claims

1. Un diluyente para antígenos que comprende un antígeno del Virus de la Hepatitis C (HCV), un agente reductor y un agente caotrópico.

2. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, en el que el agente reductor se selecciona entre ditiotreitol (DTT), tioglicerol y mercaptoetanol.

3. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, en el que el agente reductor es ditiotreitol (DTT).

4. El diluyente para antígenos de la reivindicación 3, en el que la concentración de DTT es desde 1 mM hasta
200 mM.

5. El diluyente para antígenos de la reivindicación 3, en el que la concentración de DTT es desde 5 mM hasta
100 mM.

6. El diluyente para antígenos de la reivindicación 3, en el que la concentración de DTT es aproximadamente
10 mM.

7. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, que comprende además un agente de tamponamiento.

8. El diluyente para antígenos de la reivindicación 7, en el que el agente de tamponamiento se selecciona entre fosfato sódico o borato sódico.

9. El diluyente para antígenos de la reivindicación 8, en el que el agente de tamponamiento es fosfato sódico.

10. El diluyente para antígenos de la reivindicación 9, en el que la concentración de fosfato sódico, pH 6,5, es desde 15 mM hasta 100 mM.

11. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, que comprende además un detergente.

12. El diluyente para antígenos de la reivindicación 11, en el que el detergente se selecciona entre dodecilsulfato sódico (SDS) y Tween-20®.

13. El diluyente para antígenos de la reivindicación 12, en el que el detergente es SDS.

14. El diluyente para antígenos de la reivindicación 13, en el que la concentración de SDS es del 0,01% al 0,5%.

15. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, que comprende además un agente antibacteriano.

16. El diluyente para antígenos de la reivindicación 15, en el que dicho agente antibacteriano es azida sódica.

17. El diluyente para antígenos de la reivindicación 16, en el que la concentración de azida sódica es del 0,01% al 0,3%.

18. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, que comprende además un agente quelante.

19. El diluyente para antígenos de la reivindicación 18, en el que el agente quelante es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

20. El diluyente para antígenos de la reivindicación 19, en el que la concentración de EDTA es desde 1 mM hasta 10 mM.

21. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, que comprende además un agente bloqueante de uniones inespecíficas.

22. El diluyente para antígenos de la reivindicación 21, en el que el agente bloqueante de uniones inespecíficas se selecciona entre gelatina y albúmina de suero bovino.

23. El diluyente para antígenos de la reivindicación 22, en el que el agente bloqueante de uniones inespecíficas es gelatina.

24. El diluyente para antígenos de la reivindicación 23, en el que la concentración de gelatina es del 0,05% al 1,0%.

25. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, en el que el agente caotrópico se selecciona entre tiocianato sódico y tiocianato amónico.

26. El diluyente para antígenos de la reivindicación 25, en el que el agente caotrópico es tiocianato amónico.

27. El diluyente para antígenos de la reivindicación 26, en el que la concentración de tiocianato amónico es desde 10 mM hasta 500 mM.

28. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, que comprende además un agente de tamponamiento, un agente quelante, un agente bloqueante de uniones inespecíficas, un agente antibacteriano y un detergente.

29. El diluyente para antígenos de la reivindicación 28, en el que dicho agente de tamponamiento es fosfato sódico, dicho agente quelante es EDTA, dicho agente bloqueante de uniones inespecíficas es gelatina, dicho agente caotrópico es tiocianato sódico, dicho agente antibacteriano es azida sódica y dicho detergente es SDS.

30. El diluyente para antígenos de la reivindicación 29, que comprende fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, EDTA 5 mM, DTT 10 mM, gelatina al 0,2%, tiocianato amónico 100 mM, azida sódica al 0,09% y SDS al 0,1%.

31. El diluyente para antígenos de la reivindicación 29, que comprende fosfato sódico 50 mM, EDTA 5 mM, tiocianato amónico 100 mM, SDS al 0,06%, gelatina de pescado al 0,25% y DTT 10 mM.

32. El diluyente para antígenos de la reivindicación 1, en el que dicho antígeno del Virus de la Hepatitis C (HCV) es c33c, MEFA-6, c22p, c100p, NS-5 o c200.

33. Un kit de inmunoensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra HCV, en el que el kit comprende un antígeno de HCV y un diluyente para antígenos que comprende un agente reductor y un agente caotrópico.

34. El kit de inmunoensayo de la reivindicación 33, en el que el agente reductor se selecciona entre ditiotreitol, tioglicerol y mercaptoetanol.

35. El kit de inmunoensayo de la reivindicación 34, en el que el agente reductor es ditiotreitol.

36. Uso del diluyente para antígenos de la reivindicación 1, en un ensayo para la detección de anticuerpos dirigidos contra antígenos del virus de la Hepatitis C.