JP2001517799A

JP2001517799A - 抗原を安定化するための緩衝液

Info

Publication number: JP2001517799A
Application number: JP2000513148A
Authority: JP
Inventors: デイビッドワイ．チェン，; フィリップアルカンジェル，; スティーブンティレル，; ワンダジーグラー，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2001-10-09
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: JP2009180750A; US6537745B2; EP1021723A1; JP4427182B2; US20010039009A1; CA2303165C; ES2316171T3; US6261764B1; DE69840334D1; WO1999015901A1; EP1021723B1; AU9498098A; CA2303165A1; ATE417275T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗原、特にＨＣＶ組換え抗原のための抗原希釈剤または緩衝液に関し、これは、ジチオスレイトール、チオグリセロールまたはメルカプトエタノールのような還元剤を含む。抗原希釈剤または緩衝剤は、抗原のための安定化緩衝液として作用する。本発明はまた、自動化イムノアッセイにおける使用のための抗原希釈剤または緩衝液に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、出願番号６０／０５９、７０３号に対して米国特許法１１９条に基づ
く優先権を主張し、これによって、その全体が参考として援用される。

【０００２】（発明の分野）本発明は、一般にイムノアッセイの分野に、具体的には、抗ＨＣＶイムノアッ
セイにおける使用のための、抗原、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原を安定
化する緩衝液に関する。

【０００３】（発明の背景）一般に、イムノアッセイは、ウイルスに特に関連するエピトープを最初に決定
し、次いで、どのエピトープが、開発されるアッセイに好ましいかを決定するこ
とによって行われる。特定のエピトープが単離された場合、これらの配列は、決
定され、そして、エピトープ調製のための遺伝的物質が生成される。化学的また
は生物学的手段のいずれかによりタンパク質を生成する方法は、既知であり、例
えば、特定のエピトープに対して抗体の存在を検出するために使用されるアッセ
イである。高度に選択性および感受性のイムノアッセイは、一般に患者に感染し
ている疑いのある病原体の主要な免疫優性エピトープを含む。

【０００４】ウイルス、ＨＣＶについて、主要な免疫優性の線状エピトープは、ウイルスポ
リタンパク質のコア、ＮＳ（非構造的）３、ＮＳ４およびＮＳ５領域から同定さ
れている。ＨＣＶコアタンパク質および推定のマトリックスタンパク質は、ＨＣ
Ｖに対する抗体を含むヒト血清サンプルに対してアッセイされ、そしてＨＣＶタ
ンパク質内のいくつかの免疫優性な領域が規定されている。Ｓａｌｌｂｅｒｇら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９２、３０：１９８９−１９９４
（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。ドメインＣ、Ｅ１
、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５を含むＨＣＶ−１ポリタ
ンパク質のタンパク質ドメインが同定され、そしてこれらのおおよその境界は、
ＷＯ９３／００３６５（本明細書中でその全体が参考として援用される）におい
て提供される。さらに、ＨＣＶの構造的領域由来の配列を有する個々のポリペプ
チドは、ＨＣＶ患者の血清の試験において有用な免疫優性エピトープを得るため
に設計されている。Ｋｏｔｗａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、１９９２、８９、４４８６−４４８９（これは、本明細書中でその全体
が参考として援用される）。

【０００５】ＨＣＶ抗体検出のための現在えり抜きのアッセイは、手動アッセイであるＯｒ
ｔｈｏ３．０ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡにおける使用のためにカイロン
（Ｃｈｉｒｏｎ）が製造した組換えＨＣＶ抗原は、ｃ２００（ｎｓ−３、ｃ１０
０）、ｃ２２およびＮＳ−５である。このｃ３３ｃおよびｃ２２抗原は、非常に
免疫原性である。ｃ３３ｃおよびｃ２２に対する抗体はまた、初期のセロコンバ
ージョンパネルにおいて見出される。ＨＣＶ抗体の有病率は、５８％〜９５％ま
で異なり、最も高い検出率はｃ３３ｃポリペプチドについて得られ、次いでｃ２
２ポリペプチドについてである。Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、１００１１−１００１５（これは、本明細
書中でその全体を参考として援用される）。しかし、液相においてＨＣＶ抗原を
安定化する問題に遭遇している。液相におけるＨＣＶ抗原の安定性の欠如は、現
在のＨＣＶ抗体検出アッセイの主要な欠点である。従って、抗ＨＣＶイムノアッ
セイのための抗原緩衝液を開発することは、Ｏｒｔｈｏ３．０ＥＬＩＳＡと
同じ抗原を利用して試みられており、ここでこの緩衝液は、ＨＣＶ抗原を安定化
する。さらに、既存の自動化された機械（例えば、ＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒ）に
試薬、緩衝液およびプロトコールを適応させることが試みられている。従って、
現在、抗ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のために液相でＨＣＶ抗原の安定性
を改良する必要がある。このような改良されたアッセイ試薬および方法は、血液
供給物および他の生物学的液体のスクリーニングにおいてＨＣＶ抗体のより良い
検出を提供する。この緩衝液が、液相で不安定であり得る他の抗原（例えば、ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原）のために使用され得ることを意図する。

【０００６】（発明の要旨）１つの局面において、本発明は、液相における抗原、特にＨＣＶ組換え抗原を
安定化し得る、還元剤を含む、抗原希釈剤または緩衝液に関する。

【０００７】別の局面において、本発明は、還元剤を含む抗原希釈剤または緩衝液を使用し
たイムノアッセイを関する。

【０００８】別の局面において、改良されたイムノアッセイキットが提供され、この改良は
、還元剤を含む、ＨＣＶ抗原のための抗原希釈剤または緩衝液の使用を含む。

【０００９】（発明の詳細な説明）本発明の実施は、他に示されなければ、当該技術分野の範囲内のウイルス学、
免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する
。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編
、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ
およびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏ
ｌｏｇｙ、第２版、ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉ
ｐｅ編）を参照のこと。

【００１０】時間に関する試薬安定性は、重要な問題である。緩衝液で希釈され、同じ日に
試験されたｃ３３ｃ抗原は、下記のＭａｇｉｃＬｉｔｅアッセイプロトコール
を使用すると機能的であった。しかし、３７℃でストレスをかけた場合、この試
薬は、初期のセロコンバージョンパネルに対して５０％を越える免疫反応性を失
う。液相におけるｃ３３ｃは、ゆっくりと「凝集」し得、または不溶と成り得る
。既知の成分（例えば、糖、ゼラチン、グリセロール、架橋試薬および抗酸化剤
）は、ｃ３３ｃ免疫反応性を安定化するために試用された。還元形態でｃ３３ｃ
抗原を保持することは、２４時間以上、さらに少なくとも７日までの期間、３７
℃で初期のｃ３３ｃセロコンバージョンパネルについて免疫活性を維持し得る（
Ｏｒｔｈｏ３．０ＥＬＩＳＡの性能に匹敵する）ことを発見した。この還元
剤は、ｃ３３ｃ分子内のシステイン基間のジスルフィド結合を還元し、おそらく
ｃ３３ｃ免疫反応性および溶解度を改良している。ｃ３３ｃのための抗原希釈剤
の出現の前には、液相において従来のライト（ｌｉｔｅ）試薬では３７℃でこの
ような長期抗原安定性を示すものはなかった。同様の実験は、以下に示すように
ｃ２００および多くのエピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ−６）について行われた。
従って、本発明は、抗ＨＣＶイムノアッセイにおける使用に関して、ＨＣＶ抗原
を安定化するための抗原希釈剤または緩衝液を提供する。本発明の抗原希釈剤ま
たは緩衝液は、例えば、ＥＬＩＳＡおよびＣＬＩＡのようなイムノアッセイにお
いて使用され得る。

【００１１】本発明は、液相においてＨＣＶ抗原の改良された安定性を提供する抗原希釈剤
または緩衝液に関する。本明細書に使用されているように、「抗原希釈剤または
緩衝液」とは、抗原が含まれる溶液をいう；それは、緩衝能力を有してもよいし
、有さなくてもよい。特に、本発明は、Ｏｒｔｈｏ３．０ＥＬＩＳＡなどに
おける、組換えＨＣＶ抗原に関して改良された安定性のための抗原希釈剤または
緩衝液に関する。本発明は、例えば、抗原希釈剤または緩衝液に対して、ジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤を添加することによって達成された。

【００１２】本発明の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、還元
剤を含む。本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤または緩
衝液は、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ
）、ＤＴＴ、ゼラチン、チオシアン酸アンモニウム、アジ化ナトリウムおよびＳ
ＤＳを含む。しかし、これらの個々の試薬は、本質的に同じ機能を果たす同様の
試薬によって置換され得る。例えば、ＤＴＴは、さらなる還元剤（例えば、チオ
グリセロール、メルカプトエタノールなど）と置換され得る。リン酸ナトリウム
は、ホウ酸ナトリウムおよび他の緩衝液によって置換され得る。ゼラチンは、Ｂ
ＳＡおよび他の非特異的結合のブロッキング剤で置換され得る。チオシアン酸ナ
トリウムは、チオシアン酸アンモニウムおよび他のカオトロピック剤と置換され
得る。ＳＤＳは、多くの界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０、および他の界
面活性剤など）によって置換され得る。アジ化ナトリウムは、他の抗細菌剤によ
って置換され得る。さらに、ＥＤＴＡは、エチレングリコール−ビス（β−アミ
ノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）および他のキレ
ート剤によって置換され得る。当業者は、本発明の試薬の代わりとなり得る試薬
に精通している。

【００１３】本発明の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１５ｍＭ〜約１
００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を含む。さらに好ましくは、この希
釈剤は、約２０ｍＭ〜約７５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ．６．５）を含む。
最も好ましくは、この希釈剤は、２４または２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ
６．５）を含む。

【００１４】本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１ｍＭ〜約
１０ｍＭのＥＤＴＡを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約３ｍＭ〜約７ｍ
ＭのＥＤＴＡを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、５ｍＭＥＤＴＡを含む
。

【００１５】本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１ｍＭ〜約
２００ｍＭのＤＴＴを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約５ｍＭ〜約１０
０ｍＭのＤＴＴを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、１０ｍＭのＤＴＴを含
む。

【００１６】本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約０．０５％
〜約１％のゼラチンを含む。さらに好ましくは、この希釈剤は、約０．１％〜約
０．５％のゼラチンを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、０．２％のゼラチ
ンを含む。

【００１７】本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約１０ｍＭか
ら約５００ｍＭのチオシアン酸アンモニウムを含む。さらに好ましくは、この希
釈剤は、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのチオシアン酸アンモニウムを含む。最も好
ましくは、この希釈剤は、１００ｍＭのチオシアン酸アンモニウムを含む。

【００１８】本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約０．０１％
〜約０．３％のアジ化ナトリウムを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約０
．０５％〜約０．２％のアジ化ナトリウムを含む。最も好ましくは、この希釈剤
は、０．０９％のアジ化ナトリウムを含む。

【００１９】本発明の別の好ましい実施態様において、ＨＣＶ抗原希釈剤は、約０．０１％
〜約０．５％のＳＤＳを含む。より好ましくは、この希釈剤は、約０．０５％〜
約０．２％のＳＤＳを含む。最も好ましくは、この希釈剤は、０．１％のＳＤＳ
を含む。

【００２０】本発明の別の好ましい実施態様において、手動アッセイのためのＨＣＶ抗原希
釈剤は、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭＤＴＴ、０．２％ゼラチン、１００ｍＭチオシアン酸アンモニウム、
０．０９％アジ化ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳを含む。

【００２１】自動化されたアッセイに関しては、ｃ３３ｃのための好ましい抗原緩衝液は、
５０ｍＭリン酸塩、５ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭチオシアン酸アンモニウ
ム、０．０６％ＳＤＳ、０．２５％魚ゼラチンおよび１０ｍＭＤＴＴを含
む。

【００２２】表１は、好ましいＨＣＶ緩衝液を示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】本発明のＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、周知の媒体調製技術によって調製
され得る。本発明のＨＣＶ抗原希釈剤の調製の好ましい実施態様は、表２に示さ
れる。

【００２５】

【表２】

【００２６】本発明のＨＣＶ抗原希釈剤または緩衝液は、手動および自動化されたアッセイ
において使用され得る。本発明の抗原希釈剤または緩衝液は、多くのＨＣＶ抗原
（ｃ３３ｃ、ＭＥＦＡ−６、ｃ２２ｐ、ｃ１００ｐ、ＮＳ−５およびｃ２００を
含むが、これらに限定されない）で使用され得る。これらのＨＣＶ抗原は、当該
分野で慣用的に使用される組換え手順によって調製され得る。

【００２７】ＨＣＶｃ３３ｃ（ＮＳ３）およびｃ１００（ＮＳ４）領域配列は、免疫優性コ
アからのエピトープを含み、そしてＣｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、１００１１−１００１５に記載されるよ
うに調製された。ｃ２００抗原は、ｃ３３ｃおよびｃ１００抗原からなる融合タ
ンパク質である。ｃ２２（１１９アミノ酸）およびＮＳ５（９４２アミノ酸）抗
原は、ｃ１００−３（３６３アミノ酸）抗原の生成について以前記載された方法
を使用して、ヒトスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）とのＣ末端融合物
として、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の内部抗原として発現された。Ｋｕｏ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４４、３６２−３６４（これは、本明細書中
でその全体が参考として援用される）；およびＣｏｕｓｅｎら、Ｇｅｎｅ、１９
８７、６１、２６５−２７５（これは、本明細書中で全体が参考として援用され
る）。ｃ３３ｃ抗原（３６３アミノ酸）は、５−１−１抗原の合成について記載
された方法によってＥ．ｃｏｌｉ中で内部ＳＯＤ融合ポリペプチドとして発現さ
れた。Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４４、３５９−３６２（これ
は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。組換えＨＣＶ抗原は、Ｃ
ｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８９
、１００１１−１００１５に記載されるように精製された。本発明において、全
ＨＣＶ抗原は、ＳＯＤ融合タンパク質として調製された。しかし、他の適切な融
合タンパク質は、融合パートナーを認識する適切な抗体の利用可能性に依存して
作製され得る。

【００２８】ＭＥＦＡ−６は、Ｃ型肝炎ポリタンパク質のコア、エンベロープ、ＮＳ３、Ｎ
Ｓ４およびＮＳ５領域からのエピトープを含み、これらは、ＨＣＶ株１、２、お
よび３からの等価な抗原決定基を含む。ＨＣＶエピトープについてコードする様
々なＤＮＡセグメントは、ＰＣＲ増幅によって、または合成オリゴヌクレオチド
によって構築された。以下の表３は、ＭＥＦＡ−６カセットにおける各エピトー
プのアミノ酸セグメント、様々なエピトープの線状配置およびコピー数を記載す
る。ＭＥＦＡ−６カセットは、本明細書中でその全体が参考として援用される１
９９７年５月２３日に出願された出願、ＰＣＴＵＳ９７／０８９５０に記載さ
れるように調製された。

【００２９】表３に示したように、ＭＥＦＡ−６抗原は、以下を含む：コアおよびＮＳ５領
域からの多コピーのＨＣＶエピトープ；ＮＳ４５−１−１領域からの異なった
血清型エピトープ；ｃ１００のＣ末端領域、Ｅ１およびＥ２領域、ならびにＨＣ
ＶＮＳ３（ｃ３３ｃ）領域からの単一コピーの主要な線状エピトープ。ＭＥＦ
Ａ−６についての一般的構造式は、ｈＳＯＤ−−Ｅ１−Ｅ２−ｃ３３ｃ−５−１
−１（タイプ１）−５−１−１（タイプ３）−５−１−１（タイプ２）−ｃ１０
０−ＮＳ５（２コピー）−コア（２コピー）である。この抗原は、酵母において
大変高い発現レベルを有し、高度に均一になるまで精製され、そして下記のイム
ノアッセイにおいて高い感度および高い選択性を示す。ＭＥＦＡ−６は、１９９
７年５月２０日に出願された出願第０８／８５９，５２４号（その全体が参考と
して本明細書中で援用される）に記載されるように調製された。

【００３０】

【表３】

【００３１】検出可能なマーカーとしては、発色団、抗体、抗原、酵素、切断産物が検出可
能な酵素反応性化合物、ローダミンまたはローダミン誘導体、ビオチン、ストレ
プトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物、これらのマーカーの誘導体および
／または組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。本実施例では、
化学発光化合物であるジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ、Ｃｉｂａ
ＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．）が使用された。任意の
マーカーでの標識化がＭＥＦＡ−６または他のエピトープの最適な検出および抗
原性を得るための条件下で行われる。ＤＭＡＥが、アッセイにおいて検出マーカ
ーである場合、生じるＨＣＶｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ結合物は、トレーサーであり
、ＤＭＡＥは、ＮａＯＨ／Ｈ₂Ｏ₂と反応させたときに、発光によって検出可能で
ある。

【００３２】ポリペプチド、抗体または合成ペプチド抗原は、ＤＭＡＥに共有結合した反応
性部分とアミノ酸側鎖（例えば、リジンε側鎖またはシステインチオール）との
反応によってＤＭＡＥで標識された（１９９５年１０月１９日に公開された、Ｃ
ｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｓＣｏｒｐのＷＯ９５／２７
７０２（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと
。例えば、本明細書中で記載されたＨＣＶ抗原は、ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇか
ら得られたＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−サ
クシンイミジルオキシカルボニル）フェニル−１０−（３’−スルホプロピル）
−アクリジニウム−９−カルボキシレート）とリジン側鎖のアミノ基との反応に
よって標識された。アミノ酸側鎖のチオールは、ＤＭＡＥ−ＥＤ−ＭＣＣまたは
ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−ＢｒＡｃ（ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇ）を使用して
標識され得る。標識手順は、一般にＷＯ９５／２７７０２に記載された通りで
あり、各抗原について最適な検出および抗原性を提供するために必要に応じて条
件は変化する。

【００３３】

【実施例】

（実施例１：手動アッセイ）マジックライトアナライザーシステムＩＩ（ＭａｇｉｃＬｉｔｅＡｎａｌ
ｙｚｅｒＳｙｓｔｅｍＩＩ；ＭＬＡＩＩ）を手動アッセイのために使用す
る。体積、濃度、時間および温度のようなパラメーターが手引きのために提供さ
れるが、しかるべく調整され得る。簡潔には、試験サンプルの１０μｌのアリコ
ートを、対応するチューブに添加した。試験サンプルは、好ましくは、おそらく
抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体（例えば、血漿または血清）ならびに適切なコ
ントロールである。各チューブに１００μｌの抗原希釈剤または緩衝液を加え、
３７℃で６分間インキュベートする。各チューブに約６０μｇ／アッセイの最終
濃度でラット抗ヒトＩｇＧ抗体（ＰＭＰ／抗ヒトＩｇＧ）と結合体化した常磁性
粒子（ＰＭＰ）を含む１００μｌの固相緩衝液を加える。しかし、他の抗ヒトＩ
ｇＧ抗体が適切である。好ましくは、常磁性粒子は、直径が約１０μｍより小さ
い。ＰＭＰ／抗ヒトＩｇＧ粒子をＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、２．７５％ＢＳＡ、０．１％カゼイン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−
２０、０．１％酵母抽出物、０．２５％Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物、０．００５％
ＳＯＤ、０．０９％ＮａＮ₃および１ｍＭＥＤＴＡを含む希釈剤で希釈し得る。続いて、ＤＭＡＥと結合体化した組換えＨＣＶ抗原（ＨＣＶ抗原／ＳＯＤ
融合タンパク質）（例えば、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ、ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥおよ
びｃ２００−ＤＭＡＥ）を約０．１μｇ／アッセイ〜約１μｇ／アッセイの濃度
で５０μｌの容量のリガンド試薬（ＬＲ）希釈剤中に加える。好ましくは、アッ
セイ当たりに約２５×１０⁶光ユニット当量（相対光ユニット、ＲＬＵ）が存在するようなリガンド試薬量を各サンプルに加える。このおおよその量の光ユニッ
ト当量は、単一のリガンドの添加、または多くのリガンドについて好ましい。Ｌ
Ｒ希釈剤は、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１．０％
ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％ＮａＮ₃および１ｍＭＥＤＴＡを含む。完全な混合を保証するために、このチューブを１回当たり５〜
１０秒間づつ６回ボルテックスミキサーで攪拌する。サンプルチューブを１８分
間、３７℃でインキュベートする。サンプルチューブを磁石上に３分間（ＰＭＰ
粒子を沈降させるのに十分な時間）置く。このサンプルをＰＭＰ粒子を保持する
ために磁石を使用してデカントする。ＰＭＰ粒子を１ｍｌのＰＢＳでボルテック
スして２回洗浄する。洗浄溶液は、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．
０９％ＮａＮ₃および１ｍＭＥＤＴＡである。混合、インキュベート、沈降およびデカントを行なう工程は、少なくとも１回繰り返され得る。各チューブに
１００μｌの水を加え、ＰＭＰ粒子を再懸濁する。次いで、チューブをＭＬＡ−
ＩＩ機器に配置し、そして発光を２秒間測定する。

【００３４】（実施例２：自動化アッセイ）上記の手動抗ＨＣＶアッセイをＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒ装置を使用して、自動
化使用に適応させた。以下の手順を使用する。簡潔には、ＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕ
ｒシステムは、以下の工程を自動的に行う：１）１０μｌのサンプルをキュベッ
トに分配する；２）１００μｌの補助希釈緩衝液、１００μｌのＬｉｔｅ試薬／
固相、５０μｌの抗原試薬２（例えば、ＭＥＦＡ−６）、５０μｌの抗原試薬１
（例えば、ｃ３３ｃ）を分配し、そして３７℃で１８分間混合物をインキュベー
トする；３）混合物から固相を分離し、非結合試薬を吸引する；４）洗浄試薬１
でキュベットを洗浄する；５）各３００μｌの酸性試薬および塩基性試薬を分配
し、化学発光反応を開始する；そして６）システム作動指示またはオンラインヘ
ルプシステムに記載されるように、選択されたオプションに従って結果を報告す
る。固相／Ｌｉｔｅ試薬希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＫＣｌ
、１ｍＭＥＤＴＡ、３．７５％ＢＳＡ、０．００３％酵母、０．０５ｇ／
ＬＥ．ｃｏｌｉ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌアンホテリシン
Ｂ、２４ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、３０μｇ／試験固相および４５×１
０⁶試験Ｌｉｔｅ試薬（抗ＳＯＤ^*ＤＭＡＥ抗体）を含む。補助の希釈緩衝液は、
５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、３．７５％ＢＳ
Ａ、０．００３％酵母、０．０５ｇ／ＬＥ．ｃｏｌｉ、０．５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０、２ｍｇ／ＬアンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシ
ン、０．０５ｇ／Ｌ腹水ＩｇＧ１および０．１ｇ／Ｌ腹水ＩｇＧ２Ａ（
ブロッキング抗体）を含む。洗浄試薬は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０を含む。酸
性試薬は、０．５％Ｈ₂Ｏ₂／０．１ＮＨＮＯ₃を含む。塩基性試薬は、界面活性剤とともに０．２５Ｎ未満のＮａＯＨを含む。

【００３５】（実施例３：ｃ３３ｃを用いた手動アッセイ）ｃ３３ｃＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、実施例１において上記した方
法論を使用してアッセイ当たり１００ｎｇのｃ３３ｃで行った。抗原希釈剤は、
２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１００ｍＭチオシアン酸ナトリ
ウム、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％魚ゼラチン、
０．０９％アジ化ナトリウムおよび１０ｍＭＤＴＴを含んでいた。このアッセ
イを３×１０⁶ＲＬＵ／１０μｌ、３０μｇ／アッセイのＰＭＰで行った。アッセイを種々の時間および種々の温度下で行った。例えば、アッセイを４℃で０日
目、４℃で３日目、３７℃で１日目、３７℃で２日目、３７℃で３日目および３
７℃で６日目に行った。

【００３６】１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サ
ンプルチューブに加えた。サンプルは以下のものを含んでいた：ランダムな陰性
コントロール（ｒ１、ｒ２およびｒ３）、陽性コントロール（Ｖｉｒｏｔｒｏｌ
）、セロコンバージョンパネル（ＰＨＶ９０５−５、ＰＨＶ９０７−４およびＰ
ＨＶ９０４−６）、ＨＣＶ患者サンプル（ＦＦ２５９３１）およびセロコンバー
ジョンサンプル（６２１４−０９および６２１２−０４）。結果を表４に示す。
感度を光学密度単位のアッセイ検出カットオフによって除したアッセイサンプル
の光学密度（ｓ／ｃｏ）として報告する。すべての既知の陰性サンプルは、カッ
トオフ値より下の相対光単位（ＲＬＵ）を示したが、既知の陽性サンプルは、カ
ットオフ値よりずっと上のＲＬＵを示した。

【００３７】比較の目的で、いくつかのサンプル（表４を参照のこと）からのＨＣＶ抗体の
検出をまた、Ｏｒｔｈｏ３．０および市販のストリップイムノブロットアッセ
イ（ＲＩＢＡ・３．０ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって、どちらのアッセイがＨＣＶ抗体検出のための確認試験として臨床的に使用される
かについて行った。ＲＩＢＡ法に従って、組換えＨＣＶ抗原をゲル電気泳動で分
離し、そして患者の血清と接触させた。分離した抗原との反応性を標識２次抗体
を使用してイムノブロットアッセイによって実施する。アッセイの結果をプラス
／マイナスのスケールで記録する。Ｅｈｅｌｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９１
、３３７、９１２−９１３（これは、本明細書中でその全体が参考として援用さ
れる）。Ｏｒｔｈｏ３．０アッセイを製造者の指示に従って行った。ｃ３３ｃ
、ｃ２２ｐ、ｃ１００ｐおよびＮＳ−５をこれらの試験のためのＨＣＶ抗原とし
て使用した。

【００３８】簡潔には、ＲＩＢＡ・３．０アッセイを以下のように行った。アッセイ開始の約３０分前に、キットを冷蔵（２〜８℃）から取りだし、そしてキットの成分を
室温（１５〜３０℃）に至らしめた。必要な数のストリップをシールしたホイル
ポーチから取り除き、そしてアッセイチューブ立て中でそれぞれのチューブの中
に置いた。１ｍｌの検体希釈剤をストリップ全体が液体で覆われるように各チュ
ーブに加えた。２０μｌの適切な検体またはコントロールを、対応するチューブ
に加えた。チューブにふたをし、反転して混合した。チューブを備えたラックを
ロッカーに置き、そしてゴムバンドまたはテープで固定した；ラックを室温（１
５〜３０℃）で４〜４．５時間揺り動かした（１６〜２０サイクル／分で）。チ
ューブは、ふたをはずし、そして液体を廃棄物容器へと完全に吸引した。１ｍｌ
の検体希釈剤を各チューブに加えた。チューブはふたをし、ロッカー上のラック
に置き、そして室温で３０〜３５分間揺り動かした。次いで、液体を吸引した。
１ｍｌの作業洗浄緩衝液を各チューブに加え、次いで、液体およびストリップを
３０ｍｌの作業洗浄緩衝液を含む洗浄容器に注いだ（洗浄容器当たり最高２０ス
トリップ）。洗浄容器を完全に作業洗浄緩衝液で満たし（総容量、６０ｍＬ）、
次いで、洗浄液をデカントした。ストリップを保持するため、洗浄容器をデカン
トしながらやさしく転がした。６０ｍｌの作業洗浄緩衝液を加え、旋回し、次い
でストリップを保持しながら洗浄液をデカントした。ストリップ当たり１ｍｌの
結合物を各洗浄容器に加えた（洗浄容器当たり最低１０ｍｌ）。洗浄容器をロー
タリシェイカー上で１１０±５ｒｐｍ、９〜１１分間、室温（１５〜３０℃）で
回転した。作業基質を使用前１時間までに調製した。結合物インキュベーション
の終了に際して、結合物をデカントし、ストリップを６０ｍｌの作業洗浄緩衝液
を加え、そして旋回することにより洗浄した。洗浄液をデカントし、この工程を
さらに２回繰り返した。最終洗浄液をデカントした。ストリップ当たり１ｍｌの
作業基質を各洗浄容器に対して加えた（洗浄容器あたり最低１０ｍｌ）。洗浄容
器をロータリシェイカー上で１１０±５ｒｐｍ、１５〜２０分間、室温（１５〜
３０℃）で回転した。作業基質をデカントし、そしてストリップを６０ｍｌの蒸
留水または脱イオン水を加え、旋回することによって洗浄した。洗浄液をデカン
トし、この工程をさらに１回繰り返した。ストラップを保持するため、洗浄容器
をデカントしながらやさしく回転した。ピンセットを使用して、ストリップを吸
収紙に移し、そして過剰な水をブロットした。ストリップを暗所、室温で少なく
とも３０分間風乾した。ストリップを３時間以内に判読した。検体における抗Ｈ
ＣＶ反応性を各ストリップのヒトＩｇＧ（レベルＩおよびレベルＩＩ）内部のコ
ントロールバンドの強度と各抗原バンドの強度を比較することによって決定した
。抗体の同定を抗原バンドの特定の位置によって規定した。抗原／ペプチドバン
ドの強度を以下のように内部ＩｇＧコントロールの強度に関して記録した：なし
（−）、レベルＩＩｇＧコントロールバンドの強度より小さい（−／＋）、レ
ベルＩＩｇＧコントロールバンドの強度と等しい（１＋）、レベルＩＩｇＧ
コントロールバンドの強度より大きく、そしてレベルＩＩＩｇＧコントロール
バンドの強度より小さい（２＋）、レベルＩＩＩｇＧコントロールバンドの強
度と同等（３＋）、およびレベルＩＩＩｇＧコントロールバンドの強度より大
きい（４＋）。

【００３９】（実施例４：ｃ２００を用いた手動アッセイ）ｃ２００ＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、様々な量の還元剤を用いて
実施例１に記載されたように行った。安定化緩衝液は、還元剤の量を除いて実施
例３と同じであった。このアッセイを３×１０⁶ＲＬＵ／１０μｌ、３０μｇ／アッセイＰＭＰで行った。アッセイを種々の時間で、そして種々の量の還元剤
下で行った。例えば、アッセイを２０ｍＭＤＴＴを使用して３７℃で１日後（
バイアル１）行い、ＤＴＴなしで３７℃で１日後（バイアルＩＩ）、そして２０
ｍＭＤＴＴを試験前に加えた場合、３７℃で１日後（バイアルＩＩＩ）行った
。バイアルＩＩおよびＩＩＩをまた、３日後に試験した。

【００４０】１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サ
ンプルチューブに加えた。サンプルは、以下を含んでいた：様々な希釈でのラン
ダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ２、ｒ３、ｒ４およびｒ５）、セロコンバー
ジョンパネル（ＰＨＶ９０４−６およびＰＨＶ９０６−１）およびＨＣＶ患者サ
ンプル（ＦＦ２５９３１）。結果を表５に示す。ｓ／ｎは、平均陰性値で除した
感度である。

【００４１】（実施例５：ＭＥＦＡ−６およびｃ３３ｃを使用した手動アッセイ）ＭＥＦＡ−６およびｃ３３ｃＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、実施例１
において上記された方法論を使用して、アッセイ当たり１００ｎｇのＭＥＦＡ−
６および８５ｎｇのｃ３３ｃで行った。ＭＥＦＡ−６のための安定化緩衝液は、
５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％ＢＳＡ、および１％チオグリセロールを含んで
いた。このｐＨ９．５でＭＥＦＡ−６は安定なので、還元剤は必要ない。ｃ３３
ｃのための緩衝液は、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％魚ゼラチン、１００ｍＭチオ
シアン酸ナトリウムおよび１０ｍＭＤＴＴを含んでいた。アッセイを４．５×
１０⁶ＲＬＵ／１０μｌの抗ＳＯＤ^*ＤＭＡＥ、３０μｇ／アッセイＰＭＰで行っ
た。アッセイを種々の時間で、そして種々の温度下で行った。例えば、アッセイ
を４℃で７日目に、そして３７℃で７日目に行った。

【００４２】１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サ
ンプルチューブに加えた。サンプルは、ランダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ
２、ｒ３およびｒ４）、陽性コントロール（Ｖｉｒｏｔｒｏｌ）、セロコンバー
ジョンパネル（ＰＨＶ９０５−５、ＰＨＶ９０９−１、ＰＨＶ９０９−２および
ＰＨＶ９０９−３）、セロコンバージョンサンプル（６２１２−０２および６２
１４−０９）およびセロコンバージョンコントロールパネル（ＳＣ−００３０Ａ
、ＳＣ−００３０Ｂ、ＳＣ−００３０Ｃ、ＳＣ−００３０Ｄ、ＳＣ−００４０Ａ
、ＳＣ−００４０Ｂ、ＳＣ−００４０Ｃ、ＳＣ−００４０ＤおよびＳＣ−００４
０Ｅ）を含んでいた。結果を表６に示す。感度を、光学密度単位のアッセイ検出
カットオフによって除したアッセイサンプルの光学密度（ｓ／ｃｏ）として報告
した。すべての既知の陰性サンプルは、カットオフ値より下の相対光単位（ＲＬ
Ｕ）を示したが、既知の陽性サンプルは、カットオフ値よりずっと上のＲＬＵを
示した。

【００４３】比較の目的で、いくつかのサンプルからのＨＣＶ抗体の検出（表６を参照のこ
と）をまた、実施例３で記載されているように、Ｏｒｔｈｏ３．０およびＲＩ
ＢＡ・３．０によって行った。

【００４４】（実施例６：ＭＥＦＡ−６を用いた手動アッセイ）ＭＥＦＡ−６ＨＣＶ抗原を使用した手動アッセイを、実施例１で上記された
方法論を使用してアッセイ当たり１００ｎｇのＭＥＦＡ−６を用いて行った。Ｍ
ＥＦＡ−６の緩衝液は、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．５）、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％ＢＳＡおよび１％チオ
グリセロールを含んでいた。アッセイを４．５×１０⁶ＲＬＵ／１０μｌの抗ＳＯＤ^*ＤＭＡＥ、３０μｇ／アッセイＰＭＰで行った。アッセイを４℃で７日目に行った。

【００４５】１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を各サ
ンプルチューブに加えた。サンプルは、ランダムな陰性コントロール（ｒ１、ｒ
２およびｒ３）、陽性コントロール（Ｖｉｒｏｔｒｏｌ）およびセロコンバージ
ョンコントロールパネル（ＳＣ−００３０Ａ、ＳＣ−００３０Ｂ、ＳＣ−００３
０ＣおよびＳＣ−００３０Ｄ）を含んでいた。結果を表７に示す。感度を光学密
度単位のアッセイ検出カットオフによって除したアッセイサンプルの光学密度（
ｓ／ｃｏ）として報告した。すべての既知の陰性サンプルは、カットオフ値より
下の相対光単位（ＲＬＵ）を示したが、既知の陽性サンプルは、カットオフ値よ
りずっと上のＲＬＵを示した。

【００４６】比較の目的で、いくつかのサンプルからのＨＣＶ抗体の検出（表７を参照のこ
と）をまた、上記のようにＯｒｔｈｏ３．０およびＲＩＢＡ・３．０によって行った。前述の実施例は、本発明を例示することを意味し、そしていかなる方法
でも本発明を制限するとは解釈されない。当業者は、本発明の精神および範囲内
である改変を認識する。本明細書中で引用されたすべての参考文献は、ここでそ
の全体が参考として援用される。

【００４７】

【表４】

【００４８】

【表５】

【００４９】

【表６】

【００５０】

【表７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ティレル，スティーブンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02038，フランクリン，プロスペクトストリート 287 (72)発明者ジーグラー，ワンダアメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，メドウェイ，ウィントープストリート５エイ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】還元剤を含む、抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２】還元剤を含む、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）抗原のための抗原希釈剤
または緩衝液。
【請求項３】前記還元剤がジチオスレイトール、チオグリセロールおよび
メルカプトエタノールからなる群から選択される、請求項１または２に記載の抗
原希釈剤または緩衝液。
【請求項４】前記還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項
１または２に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項５】ＤＴＴの濃度が約１ｍＭから約２００ｍＭである、請求項４
に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項６】ＤＴＴの濃度が約５ｍＭから約１００ｍＭである、請求項４
に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項７】ＤＴＴの濃度が約１０ｍＭである、請求項４に記載の抗原希
釈剤または緩衝液。
【請求項８】さらに緩衝剤を含む、請求項１または２に記載の抗原希釈剤
または緩衝液。
【請求項９】前記緩衝剤がリン酸ナトリウムまたはホウ酸ナトリウムから
なる群から選択される、請求項８に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１０】前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである、請求項９に記載の
抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１１】リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）の濃度が約１５ｍＭから
約１００ｍＭである、請求項１０に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１２】さらに界面活性剤を含む、請求項１または２に記載の抗原
希釈剤または緩衝液。
【請求項１３】前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およ
びＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）からなる群より選択される、請求項１２に記載
の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１４】前記界面活性剤がＳＤＳである、請求項１３に記載の抗原
希釈剤または緩衝液。
【請求項１５】ＳＤＳの濃度が約０．０１％から約０．５％である、請求
項１４に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１６】さらに抗細菌剤を含む、請求項１または２に記載の抗原希
釈剤または緩衝液。
【請求項１７】前記抗細菌剤がアジ化ナトリウムである、請求項１６に記
載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１８】前記アジ化ナトリウムの濃度が約０．０１％から約０．３
％である、請求項１７に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項１９】さらにキレ−ト剤を含む、請求項１または２に記載の抗原
希釈剤または緩衝液。
【請求項２０】前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で
ある、請求項１９に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２１】ＥＤＴＡの濃度が約１ｍＭから約１０ｍＭである、請求項
２０に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２２】さらに非特異的結合のブロッキング剤を含む、請求項１ま
たは２に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２３】前記非特異的結合のブロッキング剤がゼラチンおよびウシ
血清アルブミンからなる群から選択される、請求項２２に記載の抗原希釈剤また
は緩衝液。
【請求項２４】前記非特異的結合のブロッキング剤がゼラチンである、請
求項２３に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２５】ゼラチンの濃度が０．０５％から約１．０％である、請求
項２４に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２６】さらにカオトロピック剤を含む、請求項１または２に記載
の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２７】前記カオトロピック剤がチオシアン酸ナトリウムおよびチ
オシアン酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項２６に記載の抗原希
釈剤または緩衝液。
【請求項２８】前記カオトロピック剤がチオシアン酸アンモニウムである
、請求項２７に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項２９】前記チオシアン酸アンモニウムの濃度が約１０ｍＭから約
５００ｍＭである、請求項２８に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３０】さらに緩衝剤、キレート剤、非特異的結合のブロッキング
剤、カオトロピック剤、抗細菌剤および界面活性剤を含む、請求項１または２に
記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３１】前記緩衝剤がリン酸ナトリウムであり、前記キレート剤が
ＥＤＴＡであり、前記非特異的結合のブロッキング剤がゼラチンであり、前記カ
オトロピック剤がチオシアン酸ナトリウムであり、前記抗細菌剤がアジ化ナトリ
ウムであり、そして前記界面活性剤がＳＤＳである、請求項３０に記載の抗原希
釈剤または緩衝液。
【請求項３２】２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５ｍＭＥ
ＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、０．２％ゼラチン、１００ｍＭチオシアン酸ア
ンモニウム、０．０９％アジ化ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳを含む、請
求項３１に記載の抗原希釈剤または緩衝液。
【請求項３３】５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ、１００
ｍＭチオシアン酸アンモニウム、０．０６％ＳＤＳ、０．２５％魚ゼラチ
ンおよび１０ｍＭＤＴＴを含む、請求項３１に記載の抗原希釈剤または緩衝液
。
【請求項３４】ＨＣＶ抗体の検出のための改良されたイムノアッセイキッ
トであって、この改良は、還元剤を含むＨＣＶ抗原のための抗原希釈剤または緩
衝液を含む、改良されたイムノアッセイキット。
【請求項３５】前記還元剤がジチオスレイトール、チオグリセロールおよ
びメルカプトエタノールからなる群から選択される、請求項３４に記載の改良さ
れたイムノアッセイキット。
【請求項３６】前記還元剤がジチオスレイトールである、請求項３４に記
載の改良されたイムノアッセイキット。
【請求項３７】Ｃ型肝炎ウイルス抗原に対して指向された抗体の検出のた
めの改良されたアッセイであって、この改良は、請求項１に記載の抗原希釈剤ま
たは緩衝液を含む、改良されたアッセイ。
【請求項３８】少なくとも１個の抗原、および還元剤を含む抗原希釈剤ま
たは緩衝液を含む、組成物。
【請求項３９】少なくとも１個のＨＣＶ抗原、および還元剤を含む抗原希
釈剤または緩衝液を含む、組成物。