KR100312534B1

KR100312534B1 - 씨(c)형간염및비(b)형간염동시측정면역블롯검정키트및면역블롯검정법

Info

Publication number: KR100312534B1
Application number: KR1019930026612A
Authority: KR
Inventors: 조중명; 최덕영
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지씨아이
Priority date: 1993-04-28
Filing date: 1993-12-06
Publication date: 2002-05-13
Also published as: CN1130566C; JP3136327B2; WO1994025874A1; JPH08504954A; CN1122162A

Abstract

본 발명은 C형 및 B형 간염 바이러스의 재조합 특이항원을 사용하여 C형 및/또는 B형 간염의 감염 여부를 동시에 확인할 수 있는 진단용 검정키트 및 검정법에 관한 것이며, 좀 더 구체적으로는 C형 및 B형 감염 바이러스의 서로 다른 항원 결정기를 갖는 재조합 특이항원을 복합적으로 사용함으로써 C형 및/또는 B형 간염의 감염 여부를 동시에 확인할 수 있는 진단용 면역블롯 검정법 및 면역블롯 검정법(immunoblot assay)에 관한 것이다.

Description

씨(C)형 간염 및 비(B)형 간염 동시측정 면역블롯 검정키트 및 면역블롯 검정법

본 발명은 C형 및 B형 간염 바이러스의 재조합 특이항원을 사용하여 C형 및/또는 B형 간염의 감염 여부틀 동시에 확인할 수 있는 진단용 검정키트 및 검정법에 관한 것이며, 좀 더 구체적으로는 C형 및 B형 간염 바이러스의 서로 다른 항원 결정기를 갖는 재조합 특이항원을 복합적으로 사용함으로써 C형 및/또는 B형 간염의 감염 여부를 동시에 확인할 수 있는 진단용 면역블롯 검정법 및 면역블롯 검정법 (immunoblot assay)에 관한 것이다.

바이러스성 간염은 간염 바이러스의 감염에 의하여 발생되는 간질환으로서지금까지 그 주된 발병체로서 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), 델타 간염 바이러스(HDV), 사이토메갈로 바이러스(CMV) 및 엡스틴 바 바이러스 (EBV)등이 단리 및 확인되었다.

그러나 상기의 간염과는 달리 수혈 후 발병되는 간염의 90% 를 차지하는 비A비B형 간염(NANBH) 바이러스가 확인되었다(Alter, H.J., et al., Lancet 2, 838-841(1975)). 더 나아가, 헌혈자의 1 내지 6% 가 NANB 바이러스 보균자로 간주되며, 간염 환자의 약 40-50% 가 만성 간염으로 진전되고 약 20% 정도가 간경변 및 간암으로 진전된다는 사실이 밝혀졌다(Dienstag, J.L., et al., Seminar Liver Dis. 6, 67-81(1986)).

그 후, 미국의 카이론사에서는 NANBH 환자의 혈장을 침팬지에 감염시켜 비A비B형 바이러스의 분리 및 회수가 가능함을 보고하였고(Bradley, D.W. et al., Gastroenterology 88, 773-779(1985)), 상기한 침팬지 혈청을 대량으로 이용하여 NANBH 바이러스를 확보한 뒤 바이러스의 전 핵산을 추출하여 부분적인 cDNA를 클로닝하여 이 바이러스가 양성 가닥 리보핵산(positive-stranded RNA)바이러스로서 약 10,000개의 염기로 이루어져 있음을 보고하였다

(Kuo, G., et al., Science 244, 359-362(1989)).

C형 간염 바이러스의 간염에 대한 진단은 초기에 미국 카이론사의 츄 등이 부분적인 2개의 비구조 유전자 절편(NS3/NS4)을 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 유전자와 융합시켜 효모에서 융합 단백질 SOD-C100-3 를 발현시키고 이를 사용하여 효소면역측정법에 의해 수혈성 간염환자의 70% 이상이 이 항원에 대한 항체를 가지고 있음을 증명하였다(Kuo, G., et al., Science 244, 362-464(1989)).

이를 이용하여 오르토사(Ortho Diagnostic Systems. Inc.)는 HCV 항체 감정용 면역효소 진단시약을 1990년에 개발하여 C형 간염 진단에 널리 이용되게 되었다 (PCT 출원 제 PCT/US88/04125 호). 그러나 SOD-C100-3 를 이용한 이 진단방법은 C100-3 에 대한 항체가 바이러스 감염 후 4-6개월이 지난뒤에 측정되므로 초기의 급성 C형 간염 환자를 제대로 진단하지 못하며 더우기 C형 간염 이외의 자가면역성 간염 환자의 경우에서도 높은 빈도의 양성 반응이 나타나는 단점이 있음이 보고되었다(McFarlane, I. G., et. al., Lancet 335, 754-757(1990); Gray, J.J., et. al., Lancet 335, 609-610(1990)).

최근에는 5' 말단에 위치한 핵(core) 구조 유전자로부터 발현시킨 핵 단백질을 이용함으로써, C100-3 을 이용한 항체 진단 방법보다 더 개선되고 조기 진단이 가능한 방법이 개발되었다(Muraiso, K. et. al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 172, 511-516(1990),; Hosein, B. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3647-3651(1991)). 특히 이 핵 항원을 사용한 진단방법의 경우 C100-3 경우보다 약 6 내지 8주 일찍 항체를 진단할 수있다고 보고된 바 있으며(Harada, S., et. al., J. Virol. 65, 3015(1991)) 이에 따라 많은 회사들이 핵 항원을 포함한 제 2 세대 진단시약을 개발하게 되었고 미국의 애보트사(Abbott Lab.)는 상기의 핵 항원을 첨가하여 기존의 C100-3 항원을 사용한 제 1 세대 진단방법 보다 더 민감하고 더 특이도가 높은 개선된 진단방법을 개발하고 보고한 바 있다(Lesniewski, R.R., et. al., EP725354(1990)).

또한 미국의 UBI(United Biomed. Inc.)사는 서로 다른 10종의 HCV 항원 결정기(epitope)를 가진 15 내지 65개 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 인공으로 합성하고 이를 이용하여 특이도가 더 높은 개선된 진단방법을 개발하였음을 보고하였다(Wang, C.Y., EP 442394(1991)). 기존의 C100-3 항원에 핵 구조 유전자 유래 C22 및 비구조 3 유전자 유래의 C33C 를 첨가한 제 2 세대 진단방법을 개발하여 HCV 항체에 대한 민감도와 특이도를 더욱 증가시킬 수 있음이 보고되었다(Van der Poel, C. L., et al. Lancet 337, 317-319(1991)). 또한 미국의 오르토사에서는 기존의 제 1 세대 진단시약에 핵 항원인 C22-3 와 비구조 3 및 4 부분 단백질인 C33C 와 C200 를 첨가한 제 2 세대 진단방법을 개발으로써 HCV 항체에 대한 민감도를 더욱 개선했다고 보고한 바 있으며(McHutchison, J. G., et al., Hepatology 15, 19-25(1992)), 감염된지 15 내지 20주 정도 경과한 환자의 혈청에서도 HCV 항체를 검출할 수 있다는 보고도 있었다(Alter, H. J., Annals of Internal Hedicine 115, 644-649(1991)). 즉, 단일항원을 사용하는 경우보다는 서로 다른 항원 결정기를 갖는 항원들을 복합 사용함으로써 더욱 민감하고 특이한 C형 간염 진단방법을 개발할 수 있다는 것을 보여주었다.

본 발명자들은 한국인 C형 간염 환자의 혈청으로부터 HCV 입자를 분리하고 그 유전자 구조를 규명하여 기존의 미국형 및 일본형 HCV 와는 상이한 고유한 한국형 HCV 가 존재함을 규명한 바 있으며 또한 핵 유전자로부터 KHCV UB Core 14, 비구조 3 유전자로부터 KHCV UB897 단백질, 비구조 5 유전자로부터 KHCV 403 단백질 및 외피 유전자로부터 KHCV 외피 1, KHCV 외피 2N, KHCV 외피 2C 단백질들을 재조합 효모 및 대장균으로부터 발현시키고(선행 한국 특허출원 제 91-10942 호, 제 91-10943 호, 제 91-25505 호, 제 92-10039 호 참조), 이들 단백질들의 면역특이성을 확인한 다음 고순도로 대량 분리 정제하는 방법을 개발하였다(선행 한국 특허출원 제 91-13594 호, 제 91-13595 호, 제 91-13597 호, 제 91-25506 호, 제 92-10039 호 참조).

또한 이들 HCV 특이항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소면역 측정법(ELISA immunoassay, EIA) 원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 개선된 진단방법을 개발하여 보고한 바 있다(선행 한국 특허출원 제 91-13601 호 참조).

더욱이, HCV 의 외피 단백질들의 항원 결정기(epitope)를 밝히고 이들 항원결정기만을 융합시킨 단백질인 UB E1E2 단백질을 재조합 대장균에서 발현시키고(선행 한국 특허출원 제 93-6493 호 참조) 이 UB E1E2 단백질을 UB NS4 단백질과 융합시킨 UB NS4 E1E2 단백질을 재조합 대장균에서 발현시켰다(선행 한국 특허출원 제 93-7230 호 참조). 또한 상기의 403 단백질을 포함하는 비구조 5 유전자의 아미노 말단 1,200 염기쌍(NS5 1.2)의 단백질 산물이 HCV 의 항체와 높은 특이도의 면역반응을 보인다는 사실을 발견하고 이를 유비퀴틴(UB)과 융합시킨 재조합 단백질(UB NS5 1.2)을 대장균에서 발현시켜(동일자로 출원하는 한국 특허출원 제 93-26611 호 참조) 이를 이용하여 더욱 민감하고 정확한 C형 간염 환자의 진단을 가능케 하였다.

그러나 상기한 ELISA 방법을 이용한 진단에 있어서, C형 간염 외의 다른 많은 간질환(예컨대, 쓸개즙 간 경변증, 자가면역성 간염, 잠원성 간 경변증 등)에 걸린 환자의 혈청들이 양성으로 나타나는 경우가 있고(Contreras M., et. al., Lancet 2, 505(1989); Cash J. D., et. al., Lancet 2, 505(1989)) 또 류마티스 관절염에 걸린 환자의 경우는 약 60% 이상이 오르토사의 제 1 세대 C형 간염 진단방법에서 양성으로 나타났다는 보고도 있었다(Theilmann L. et al., Lancet 335, 1346,(1990)). 이와 같은 사실은 기존의 ELISA 진단방법의 경우 가양성(false posi-tive)이 나타날 가능성이 높으며 이들 혈청들에 대해서는 확인검정 (confirmation test)이 필요하다는 것을 시사해 준다.

미국의 카이론 및 오르토사는 2가지의 HCV 특이항원(SOD 5-1-1, SOD C100-3)을 니트로셀룰로스 막에 흡착시키고 혈청시료와 반응시킨 다음 과산화 효소로 표지된 항 사람 면역 글로블린 G 항체를 사용하여 각 특이항원 밴드들의 발색정도를 기준으로 C형 간염을 진단하는 방법인 재조합 면역블롯 검정법(Recombinant Immunoblot Assay, RIBA)을 개발하여 기존의 ELISA 진단방법에서 양성으로 나타난 시료 혈청들에 대한 확인검정으로서 사용하였는데, ELISA 진단방법에서 184명의 이상단백혈증 환자의 혈청중 28명(15.2%)이 양성으로 나타났는데 상기의 RIBA 진단방법을 사용한 확인검정시 단 1명만이 양성이고 3명이 판정유보로 나타났다는 보고 (D. Baudart, et. al., Lancet 336, 63(1990))를 통해서 그 유용성이 입증된 바 있다. 더 나아가 오르토사는 상기의 2가지 특이항원 외에 C22-3 와 C33C 를 첨가하여 더욱 개선된 제 2 세대 RIBA 를 개발한 바 있다. 그리고 이 C22-3, C33-C 그리고 상기의 C100-3 를 이용한 도트 면역블롯 검정(dot immunoblot assay)시에는 C100-3만을 사용했을 때 보다 더 민감하고 또 조기진단이 가능하다는 보고도 있었다(D. Vallari, et. al., J. Clin. Microbiol. 30(3), 552, (1992)).

이와 같은 사실에 의거하여, 본 발명자들은 기존의 ELISA 진단방법 및 기존의 RIBA 진단방법보다 더욱 특이도가 높은 C형 간염 검정방법을 개발하고자 연구노력한 결과, HCV 의 5개 구조 및 비구조 유전자들(핵, 외피, NS3, NS4, NS5)로부터 발현된 특이항원들과 B형 간염 바이러스(이하 HBV)의 2가지 특이항원(Core, Pre S2 S Ag(Pre S2 S 표면항원))들을 사용하는 면역블롯 진단법을 개발하게 되었다.

즉, 본 발명은 기존의 다른 회사의 C형 간염 진단방법에서는 측정하지 못하는 HCV 의 외피 항원 및 NS5 항원에 대한 특이항체의 측정을 가능케 함으로써 보다 정확한 C형 간염의 진단이 가능하고 또 B형 간염의 급성 상태와 초기 회복여부를 나타내는 지표인 HBV 핵(core)에 대한 항체와 B형 간염의 회복기에 대한 지표인 HBV Pre S2 S Ag 에 대한 항체(본 출원인의 선행 한국 특허출원 1986년 제 679 호 참조)를 동시에 측정할 수 있어서 C형 간염의 진단 및 확인검정 뿐 아니라 B형 간염의 동시진단도 가능한 면역블롯 검정법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 HCV 의 재조합 특이항원, UB Core 14, UB NS4, UB NS4 E1E2, UB 897 및 UB NS5 1.2, HBV 의 특이항원 HBV Core 및 HBV Pre S2 S Ag, 유비퀴틴 유전자에 글리신을 포함한 16개의 아미노산 폴리펩티드를 융합시킨 재조합 단백질 UB Gly 16 및 사람 면역 글로불린을 포함하는, C형 및 B형 간염 바이러스의 서로 다른 항원 결정기를 갖는 재조합 특이항원을 복합적으로 사용함으로써 C형 및/또는 B형 간염의 감염 여부를 동시에 확인할 수 있는 검정 키트를 제공하는것이다.

본 발명의 또다른 목적은

가) 정제된 사람 면역 글로불린, HCV 의 5가지 재조합 특이항원 UB Core 14, UB NS4, UB NS4 E1E2, UB 897, UB NS5 1.2, HBV 의 2가지 특이항원 HBV Core, HBV Pre S2 S Ag 및 UB Gly 16 단백질(유비퀴틴 유전자에 글리신을 포함한 16개 아미노산 폴리펩티드를 융합시킨 재조합 단백질)을 각각 서로 분리된 밴드로서 흡착시킨 흡착막을 폐쇄용액으로 처리하고,

나) 상기 흡착막을 지지막에 부착시켜 각 특이항원, 사람 면역 글로불린 및 UB Gly 16 단백질의 밴드가 1개씩 포함되도록 절단한 스트립을 시료 혈청액과 반응시키고,

다) 상기 스트립에 양고추냉이 과산화효소, 알칼라인 포스파타제 또는 방사선 등위원소가 표지된 항 사람 면역글로불린과 반응시킨 후, 발색반응시키거나 방사능 측정함을 포함하는, C형 및/또는 B형 간염의 진단방법을 제공하는 것이다.

상기와 같이 본 발명에 따른 C형 간염 및 B형 간염 동시진단 방법은 특히 기존의 진단방법에 의해 양성으로 판정된 혈청들에 대한 확인 검정으로서 크게 유용할 뿐만 아니라, 차후 HCV 의 각 특이항원들에 대한 특이항체들의 생성시기들이 밝혀지면 C형 간염의 진행 경과를 병리학적으로 측정하는데에도 크게 기여할 것이다.

이하 실시예에 의거하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 주어진 것으로 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 면역블롯 검정(immunoblot assay) 키트의 제조

5가지의 HCV 재조합 특이항원 UB Core(선행 한국 특허출원 제 91-13596 호, 제 91-10581 호 및 제 91-10582 호), UB NS4(선행 한국 특허출원 제 93-4164 호); UB NS4 E1E2(선행 한국 특허출원 제 93-7230 호), UB 897(선행 한국 특허출원 제 93-6356 호) 및 UB NS5-1.2(동일자로 출원하는 한국 특허출원 제 93-26611 호 2가지의 HBV 제조합 특이항원 HBV Core 및 HBV Pre S2 S Ag(선행 한국 특허출원 제 86-679 호), UB Gly 16 및 사람 면역 글로불린 G(이하 hIgG)을 불롯팅 완충액(100mM 탄산나트륨, pH 9.5)으로 다음과 같은 적정 농도로 희석시켜서 사용하였다. hIgG: 5㎍/㎖ 및 0.1㎍/㎖; UB Core 14: 10㎍/㎖; UB NS4, 20㎍/㎖; UN NS4 E1E2: 10㎍/㎖; UB 897: 10㎍/㎖; UB NS5 1.2: 20㎍/㎖; HBV Core: 10㎍/㎖; HBV Pre S2 S Ag: 10㎍/㎖ ; UB Gly 16: 5㎍/㎖.

각기 희석된 상기의 바이러스 특이항원들을 슬롯 블롯팅(slot blotting) 기구(Bio-Rad Lab., Dot SF blotting apparatus, cat. No 170-6542, U.S.A.)를 사용하여 미리 블롯팅 완충액에 적셔놓고 동일 완충액으로 1회 세척한 니트로셀룰로스 여과막(Schliescher & Schuell, BA 83, 구멍 크기 0.22㎛, U.S.A.)에 다음과 같은 순서와 양으로 각 슬롯(0.7 ×7.0㎜)에 첨가하였다: 슬롯 1: hIgG 5㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 2: UB Core 14, 10㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 3: US NS4 20㎍/㎖, 125㎕ 및 UB NS4 E1E2 10㎍/㎖, 125㎕; 슬롯 4: UB 897 10㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 5: UB NS5 1.2 20㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 6: UB HBV Core 10㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 7: HBV Pre S2 S Ag 10㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 8: UB-Gly 16 5㎍/㎖, 250㎕; 슬롯 9: hIgG 0.1㎍/㎖, 250㎕.

8 내지 10 in.Hg 의 진공압력을 가하여 10 내지 20분에 걸쳐 특이항원이 포함된 용액을 여과함으로써 니트로셀룰로스 여과막에 블롯팅시킨 다음 각 슬롯당 25㎕ 씩의 블롯팅 완충액을 가하고 다시 여과시키는 방법으로 1회 세척하였다. 핀셋을 사용하여 상기의 여과막을 회수하고 이를 60℃ 에서 약 10분정도 건조시킨 뒤 0.1% 젤라틴(w/v)이 함유된 인산염 완충액(phosphate buffered saline(PBS); 10mM 인산, pH 7.0, 150mM 염화나트륨)을 가하고 상온에서 30분동안 약하게 흔들어 줌으로써 특이항원이 블롯팅되어 있지 않은 여과막 부위에 시료혈청내의 단백질이 비특이적으로 결합되지 못하게 폐쇄(blocking)시켰다. 상기의 여과막을 다시 상기와 동일한 조건에서 건조시키고 이 여과막에 적절한 방법으로 일련번호를 표기하거나 또는 미리 일련번호가 인쇄된 지지대에 상기의 여과막을 부착시킨 다음 특이항원들이 블롯팅된 슬롯을 1개씩 모든 종류를 포함하는 개개의 스트립으로 절단하였다.

실시예 2 면역블롯 검정 키트를 이용한 진단

상기의 실시예 1 에서 만들어진 면역블롯 검정 키트의 각 스트립들을 미리 표기된 개개의 유리관(13 ×100㎜)에 넣은 다음 5㎍/㎖ 의 UB Gly 16 을 함유한 시료 희석 완충액(0.25% 젤라틴, 1% 트리톤 X-100, imM EDTA, 0.02% 티메로살을 포함한 PBS)으로 50배 희석시킨 시료혈청 희석액을 첨가하고 파라 필름으로 밀봉한 다음 여과막이 시료혈청 희석액에 충분히 잠기게 한 다음 상온에서 2시간동안 약하게 흔들어 줌으로써 시료혈청내의 항체들과 여과막의 바이러스 특이항원들 사이에 면역반응이 이루어지게 하였다. 상기의 각 유리관으로부터 흡입장치를 사용하여 시료혈청을 제거하고 다시 세척액(0.05% 트윈 20 을 함유한 PBS)4㎖ 씩을 각 유리관에첨가하고 약 5분동안 흔들어 주고 다시 제거하는 방법으로 1회 세척해주고 20㎖ 의 상기 세척액을 담은 반응접시에 10개씩의 스트립을 모은 뒤 3회 이상 세척하였다. 상기의 각 스트립에 10㎍/㎖ 의 UB-Gly 16 을 함유한 효소 표지항체 희석액 (10%(v/v) 소 혈청(FBS), 1% 피콜, 0.05% 트윈 20, 0.02% 티메로살을 함유한 인산염 완충액) 5 내지 7㎍/㎖ 로 희석시킨 20㎖ 의 양고추냉이 과산화효소로 표지된 염소 항 사람 면역 글로불린 G 감마사슬 특이항체(goat anti-hIgG(r)-HRP)를 첨가하고 상온에서 약 40분동안 약하게 흔들면서 반응시키고 이어서 20㎖ 씩의 상기 세척액으로 4회 세척한 다음 다시 20㎖ 씩의 반응 완충액(50mM 트리스, pH 7.5)으로 2회 세척하였다. 400㎍/㎖ 의 4-클로로-1-나프톨과 0.03% 과산화수소수를 함유한 반응완충액 20㎖ 을 가하고 상온에서 20분동안 약하게 혼들면서 반응시킨 다음 반응완충액을 제거하고 증류수로 2회 세척한 뒤 여과막을 거름종이 위로 옮기고 상온에서 약 20분동안 정도 건조시켰다.

그 결과는 제 1 도에서 보는 바와 같이 각 바이러스 특이항원의 밴드에서 가시적인 발색 반응이 나타남을 알 수 있다. 제 1 도에서 시료번호 1 에서 18 까지는 오르토사의 제 1 세대 C형 간염 진단 키트에서 양성으로 나타난 혈청시료(대한 적십자사 대전 혈액원으로부터 구입)를 사용한 결과이며 19 부터 21번까지는 B형 간염 양성 환자의 혈청을 사용한 결과를 나타낸다.

실시예 3 검정 결과의 판정

실시예 2 의 검정 과정을 실시한 뒤 스트립에 나타나는 각 특이항원의 발색 정도를 2개의 대조 밴드의 발색 정도와 비교하여 하기와 같은 방법으로 검정 결과를 판정하였다.

가) 밴드 1 과 밴드 9 의 사람 면역글로불린 밴드는 발색이 되고 밴드 8의 UB-Gly 16 밴드에는 아무런 발색이 나타나지 않는 것을 확인하고,

나) 각 특이항원의 발색정도가,

아무런 발생이 없으면 - 로

밴드 9 의 사람 면역 글로불린의 발색정도 보다 낮으면 +/- 로

밴드 9 의 사람 면역블로불린의 발색정도와 유사하면 1+ 로

밴드 9 와 밴드 1 의 사람 면역글로불린 발색정도의 중간에 해당되면 2+ 로

밴드 1 의 사람 면역글로불린과 유사하거나 높으면 3+ 로

표기한 다음,

다) 상기의 표기를 통해서 1+ 또는 그 이상의 반응성이 있으면 양성으로, 1+ 또는 그 이상의 반응성이 없으면 음성으로, 1+ 또는 그 이상의 반응성이 있으나 밴드 8의 UB-Gly 16 밴드의 발색 정도가 1+ 또는 그 이상의 반응성으로 나타나면 판정유보로 결정한다. 또한 B형 간염의 경우 HBV Core 와 HBV Pre S2 S Ag 모두 + 이거나 HBV Pre S2 S Ag 하나만이라도 + 인 경우는 B형 간염의 회복기로 간주하고 HBV Core 만 + 인 경우는 급성(acute)으로 판정한다.

상기의 방법으로 검정결과를 판정했을 때 제 2 도와 같은 판정 결과를 얻었다. 오르토사의 제 1 세대 간염 진단 키트에서 양성으로 나타난 18개의 혈청시료액중 주식회사 럭키의 C형 간염 효소면역측정 진단방법(본 출원인의 선행특허출원 제 92-10039 호 참조)으로는 5개만이 양성으로 나타났고 1개 혈청시료액이 중성(=intermediate, +/-)으로 나타났으며, 본 발명에 따른 면역블롯 검정법에서는 5개(28%)만 양성으로 나타났으며 효소면역 측정법에서는 중성으로 나타난 4번 시료는 본 발명에 따른 면역블롯 검정법에서는 음성으로 나타났는데, 이는 본 발명의 면역블롯 검정법이 가양성을 현저하게 줄일 수 있다는 것을 시사해 주며 효소면역측정법에서 양성으로 나타난 혈청시료액에 대하여 본 발명에 따른 면역블롯 검정을 사용하여 확인함으로써 오진으로 인한 위험성 및 경제적 손실을 크게 줄일 수 있음을 보여준다.

상기의 실시예와 그 결과에서 보는 바 대로 본 발명의 산물인 C형 간염 및 B형 간염 동시측정 면역블롯 검정법은 바이러스의 특기항원들이 여과막에 블롯팅된 다음 혈청시료액의 각 특이항체와 반응하여 가시적인 밴드로서 나타남으로써 기존의 효소결합면역측정법(ELISA)에 의한 진단방법에서 나타날 수 있는 오진율을 크게 낮출 수가 있다. 또한 기존의 타 회사의진단방법에는 포함되어 있지 않은 HCV 의 외피1, 외피2 단백질의 항원결정기 융합단백질(E1E2)과 NS5 1.2 단백질들이 포함되어 있으므로 이들 특이항원들에 대한 특이항체를 검정함으로써 더욱 정확한 C형 간염 진단이 가능하게 되었으며, 핵 항원을 비롯한 총 5개의 HCV 유전자(Core, Envelope, NS3, NS4, NS5)의 특이항원을 사용함으로써 차후 HCV 에 대한 특이항체들의 혈청변환이 정확하게 밝혀지면 이 면역블롯 검정법을 사용하여 C형 간염의 진행 결과를 정확하게 진단할 수 있는 가능성도 제공하고 있다. 더 나아가 HBV 에 대한 2개의 특이항원을 동시에 사용함으로써 1회의 검정으로 2가지 바이러스성 간염을 동시 진단할 수 있는데, 이는 제 1 도에서 보는 바와 같이 C형 간염 환자들중상당수에서 HBV 의 특이항체(항 HBV Core, 항 HBV Pre S2 S Ag)가 동시에 검정된 결과를 통해서도 확실시 된다.

본 발명을 통해서, 기존의 효소 결합 면역측정법에서 나타난 결과에 대해 본 발명의 산물인 면역블롯 검정법을 그 확인검정(confirmatory test)에 사용할 수 있게 되었고, 또 C형 및 B형 간염에 대한 진단을 동시에 시행함으로써 보다 경제적이고 효율적인 간염 진단이 가능하게 되었으며, 특히 기존의 진단방법에서 사용하지 않은 새로운 HCV 특이항체를 사용함으로써 더욱 정확한 진단이 가능하게 되었고 차후의 연구결과에 따라 C형 간염의 병리학적 진행 경과에 대한 진단에도 크게 기여할 수 있게 되었다.

제 1 도는 기존의 효소면역측정법(ELISA)으로 C형 간염 및 B형 간염 진단시 양성으로 판정되었던 혈청들을 본 발명의 면역 블롯 검정법으로 확인검정 (confirmation test)한 결과이며,

제 2 도는 제 1 도의 검정 결과를 기존의 C형 간염 진단방법에서 나타난 결과들과 비교한 도표이다.

Claims

HCV UB Core 14, UB, NS4, UB NS4 E1E2, UB 897 및 UB NS5 1.2로 이루어진 그룹에서 선택된 하나이상의 HCV의 특이항원; 및 HBV Core 및 HBV Pre S2 S Ag로 이루어진 그룹에서 선택된 하나이상의 HBV의 특이항원을 동시에 포함하는, 혈청시료 중 C형 및 B형 간염 바이러스에 대한 항체를 동시애 검출할 수 있는 면역블롯 검정 키트.
제 1 항에 있어서,

유비퀴틴 유전자에 글리신을 포함한 16개의 아미노산 폴리펩티드를 융합시킨 재조합 단백질 UB Gly 16 및 사람 면역 글로불린을 추가로 포함하는 면역블롯 검정 키트.
제 1 항에 있어서,

가) 정제된 사람 면역 글로불린, HCV의 재조합 특이항원 UB Core 14, UB NS4, UB NS4 E1E2, UB 897, UB NS5 1.2, HBV의 특이항원 HBV Core, HBV Pre S2 S Ag 및 UB Gly 16 단백질(유비퀴틴 유전자에 글리신을 포함한 16개 아미노산 폴리펩티드를 융합시킨 재조합 단백질)을 각각 서로 분리된 밴드로서 흡착시킨 흡착막을 지지막에 부착시킨 후 각 특이항원, 사람 면역글로불린 및 UB Gly 16 단백질의 밴드가 1개씩 포함되도록 절단한 스트립, 및

나) 양고추냉이 과산화효소, 알칼라인 포스파타제 또는 방사선 동위원소가 표지된 항 사람 면역글로불린으로 구성되는 면역블롯 검정 키트.
제 3 항에 있어서,

상기 흡착막이 니트로셀룰로스 여과막, 아미노벤질옥시메틸 페이퍼, 활성화된 나일론막, 폴리스티렌 또는 폴리비닐인 면역블롯 검정 키트.