KR100189700B1

KR100189700B1 - 합성 펩타이드의 혼합항원을 포함하는 c형 간염바이러스에 대한 항체의 진단시약

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Publication number: KR100189700B1
Application number: KR1019960007938A
Authority: KR
Inventors: 하영주; 박해준; 안종성; 도현주; 이승찬; 김성열; 오재택; 정홍석; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 1996-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1999-06-01
Also published as: KR970065728A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자 구조 중 핵(core), 비구조4(NS4) 및 비구조5(NS5) 부위에서 항원성이 확인된 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드, 그의 유사체(analogue), 조합체(complex), 본체(fragment), 중합체(polymer), 결합체(conjugate) 또는 이들의 혼합체(mixture)들을 주요성분으로 포함하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약 및 그를 이용한 HCV 감염의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명의 합성 펩타이드 혼합항원을 이용한 HCV항체의 진단시약은 HCV 항체 검출의 민감도 및 특이도를 향상시키고, HCV에 대한 항체의 조기 검출을 가능케한다. 또한, 본 발명의 진단시약 및 그를 이용한 HCV 감염의 진단방법은 다음과 같은 장점을 가지고 있다: ① 합성 펩타이드는 화학적으로 용이하게 합성할 수 있으므로, 일정한 질과 양으로 펩타이드를 제공하여 HCV 감염의 진단에 대한 재현성을 보장할 수 있다. ② 펩타이드의 화학합성시 아미노산의 변형이나 치환을 통하여 HCV 항체 검출에 유용한 펩타이드를 제조할 수 있다. ③ 혼합항원은 생바이러스 유래가 아니므로, 진단시약의 제조과정중 HCV의 감염 위험성이 없다. ④ 혼합항원은 화학합성되므로 숙주세포로 부터의 항원정제시 오염물질(숙주 자체의 단백질)에 의한 위양성의 진단결과를 방지할 수 있다. ⑤ 혼합항원은 소량 필요하므로 펩타이드 제조비용이 절감되며, 그 결과 HCV에 대한 항체검출 또는 HCV 감염의 진단시약 제조비용이 절감된다.

Description

합성 펩타이드의 혼합항원을 포함하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약

본 발명은 합성 펩타이드의 혼합항원을 포함하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스의 유전자 구조 중 핵(core), 비구조4(NS4) 및 비구조5(NS5) 부위에서 항원성이 확인된 특정 아미노산 배열에 대한 합성 펩타이드, 그의 유사체(analogue), 조합체(complex), 분체(fragment), 중합체(polymer), 결합체(conjugate) 또는 이들의 혼합체(mixture)들을 주요성분으로 포함하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약 및 그를 이용한 HCV 감염의 진단방법에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, 이하, 'HCV'라 함)는 간경화증 및 간암 등과 관련된 바이러스성 간염의 주원인이며, 수혈 후 간염의 70내지 80% 정도가 HCV에 의해 발병되는 것으로 알려져 있다(참조: Alter H.J. et al., Lancet, 2:838(1975)). HCV의 유전자 구조는 1989년 츄(Choo) 등에 의하여 처음 밝혀졌는데, 이 바이러스는 하나의 양성가닥으로 이루어진 약 1 x 10⁴개의 염기로 구성된 RNA 바이러스로서, 몇 개의 구조 및 비구조 단백질로 이루어진 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고 있다(참조: Houghton M. et al., EP 0318216A1(1989); Okamoto H. et al., J. Exp. Med., 60:167(1990); Choo et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 88:2451(1991); Kato N. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 87:9524(1990)).

HVC의 유전자 구조는 플라비바이러스(Flavivirus)나 페스티바이러스(Pestivirus)와 유사성을 가지며, 이들 유연관계로 부터 HCV의 폴리펩타이드는 아미노 말단으로부터 핵(core) - 외피1(E1) - 외피2/비구조1(E2/NS1) - 비구조2(NS2) - 비구조3(NS3) - 비구조4(NS4) - 비구조5(NS5) 순으로 구성되어 있는 것으로 추정하고 있다(참조: Choo et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 88:2451(1991); Kato. N. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 87:9524(1990)).

한편, HCV의 진단을 위하여, 초기에는 인체 과산화물 디스무타제(superoxide dismutase: SOD)와 HCV의 C100 영역(비구조3(NS3)와 비구조4((NS4)의 유전자 일부)에 해당하는 363개 아미노산을 융합시킨 재조합 항원('SOD-HCV C100-3'로 명명)을 이용하여, 혈액에 존재하는 HCV의 항체를 검정하였다. 즉, 츄(Choo) 등은 재조합 효모의 클론을 배양하고, 그로부터 SOD-HCV C100-3를 정제한 다음, 이를 이용하여 혈액내의 HCV 항체를 검출하는 효소 면역 측정법을 개발하였다. 이 방법을 사용하여 수혈성 간염환자의 70% 이상이 HCV에 대한 항체를 가지고 있음을 확인하였다(참조: Choo Q-L. et al., Science, 244:359(1989)).

그러나, 많은 환자의 경우 HCV C100-3에 대한 항체는 HCV 감염 후 4내지 6개월 경과 후에 생성되기 때문에, 감염 초기에는 HCV에 감염되었음에도 불구하고 C100-3 항체음성, 즉 위음성(false negative)으로 나타나, SOD-HCV C100-3 재조합 항원은 감염 초기의 급성 간염 환자에 대한 정확한 진단에는 부적절한 것으로 보고되었다(참조: Alter H.J. et al., New England J. of Medicine, 321:1494-1500 (1989); Miyamura T. et al., Proc. Nat1. Acad. Sci., USA, 87:983-987 (1990)). 또한 SOD-HCV C100-3 재조합 항원은 자가 면역성 질환 등에 기인한 간염 환자에 대해서도 상당한 비율로 위양성(false positive)을 나타낸다는 단점을 가지고 있었다(참조: McFarlane I.G. et al., Lancet, 1335:754-757(1990)).

따라서, SOD-HCV C100-3 재조합 항원만을 사용한 1세대 c형 간염 진단시약을 개선하기 위하여, HCV의 다른 구조 및 비구조 유전자로부터 유래한 항원을 개발하려는 노력이 시도되었다.

예를 들면, 오카모토(Okamoto) 등은 일본인 환자 혈청으로부터 HCV 유전자를 클로닝하여, 츄(Choo) 등이 클로닝한 HCV와는 다른 아종의 HCV를 발견하였고(참조: Okamoto H. et al., J. Exp. Med., 60:167(1990)), 또한, 이 HCV의 5-말단 핵 구조 유전자로부터 발현된 핵 항원을 이용한 HCV에 대한 항체의 진단방법이 SOD-HCV C100-3 재조합 항원을 이용한 진단방법보다 6 내지 8주 더 빨리 항체를 검출할 수 있다고 보고하였다(참조: Harada S. et al., J. Virol., 65:3015(1991)).

또한, 츄(Choo) 등은 핵 구조 유전자로부터 발현되는 핵 단백질 C22-3과 비구조3(NS3) 부분인 C33C, 비구조4(NS4) 부분인 C200을 혼합한 제2세대 진단시약을 개발하여, HCV 항체에 대한 민감도 및 특이도를 향상시켰다고 보고하였다(참조: Choo Q.L. et al., Br. Med. Bull., 46: 423-441(1990)). 이상의 결과는 HCV에 대한 단일항원만을 사용하는 것보다는 구조 및 비구조 각 부위에 대한 혼합항원을 사용하는 것이 HCV 항체 검출의 민감도 및 특이도를 향상시키고, HCV에 대한 항체의 조기 검출에도 유리하다는 사실을 제시하고 있다.

그러나, 전기와 같이 재조합 항원을 이용한 진단시약의 개발은 다음과 같은 몇가지 문제점과 한계를 지니고 있었다: ① 대부분의 재조합 항원은 발현 및 정제의 편의성 때문에 SOD와 같은 외래 단백질과 융합된 형태로 제조되는데, 이들 외래 단백질을 항원으로 인식하여 혈청내의 항체와 반응하여 위양성의 결과를 나타내기도 한다. ② 재조합 항원은 대장균이나 효모로부터 배양, 정제되기 때문에, 정제과정에서 대장균이나 효모 유래의 단백질을 완전히 제거할 수 없어, 이들 대장균이나 효모 유래의 단백질에 의해 위양성의 결과가 유발되기도 한다. 이상과 같은 문제점은 1세대 및 2세대 진단시약 모두에서 문제점으로 지적되어 왔다.

상기와 같은 재조합 항원의 문제점을 개선하는 방법으로, 미국의 UBI(United Biomedical Institute)사에서는 HCV의 핵 및 비구조4(NS4) 부위에서 10종의 HCV 항원 결정기를 확인하고, 이들 항원 결정기를 포함하는 15내지 65개 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 화학합성법으로 합성하여, 이를 항원으로 사용하는 면역분석법을 개발하였다. 이러한 합성 펩타이드를 이용한 면역분석법은 우수한 감도와 특이성 때문에 밀접하게 관련된 바이러스간의 감염을 구분하는데도 유용하며, 바이러스 용해물이나 재조합 단백질을 사용한 면역분석법에서 유발되는 여러 가지 문제점을 해결할 수 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 발명자들은 HCV 유전자의 핵, 비구조4(NS4), 비구조5(NS5) 부위의 특정 아미노산 배열이 항원성을 가지고 있음을 확인하고, 그 부위에 대한 합성 펩타이드와 그의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 및 혼합체가 HCV 감염의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 예측하였으며(참조: 대한민국 특허출원 제 95-34372호), 나아가, 상기 합성 펩타이드 및 그의 유도체들을 혼합한 항원이 혈액중에 있는 HCV에 대한 항체를 조기에 진단할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 상기 HCV의 합성 펩타이드, 그의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 또는 이들의 혼합체들을 주요성분으로 포함하고, HCV 감염을 조기에 판별할 수 있는 HCV 항체의 진단시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 진단시약을 이용하여 혈액 중의 HCV 항체를 검출항으로써, HCV 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.

제1도는 본 발명의 혼합항원 A, B, C, D형을 각각 사용하여 측정한 음성혈청 시료에 대한 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 결과를 신호 대 판정치비의 빈도 분포로 나타낸 그래프이다.

제2(a) 내지 2(d)도는 혼합항원 A, B, C 또는 D형을 사용하여 측정한 양성혈청 시료에 대한 ELISA 결과를 신호 대 판정치비의 빈도 분포로 각각 나타낸 그래프이다.

제3(a) 및 3(b)도는 혼합항원 A형과 B 또는 C형의 음성 및 양성혈청 시료에 대한 ELISA 결과를 신호대 판정치비의 빈도 분포로 비교하여 각각 나타낸 그래프이다.

제3(c)도는 혼합항원 B형과 C형의 음성 및 양성혈청 시료에 대한 ELISA 결과를 신호대 판정치비의 빈도 분포로 비교하여 나타낸 그래프이다.

제4(a) 내지 4(c)도는 혼합항원 A, B 또는 C형과 D형의 음성 및 양성혈청 시료에 대한 ELISA 결과를 신호대 판정치비의 빈도 분포로 비교하여 각각 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 HCV 유전자의 핵, 비구조4(NS4), 비구조5(NS5) 부위의 특정 아미노산 배열이 항원성을 가지고 있음을 확인하고, 그 부위에 대한 합성 펩타이드를 제조하여 그의 항원성을 측정한 결과, HCV의 항원성을 보유하고 있음을 확인하였다. 아울러, 전기 합성 펩타이드의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 및 혼합체를 제조하고, 그의 항원성을 측정한 결과, 역시 HCV의 항원성을 지니고 있음을 확인하였다. 따라서, 상기 합성펩타이드와 그의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 및 혼합체는 HCV 감염 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예측되었다(참조: 대한민국 특허출원 제 95-34372호).

상기에서 언급하였듯이, 혼합항원은 HCV 항체 검출의 민감도 및 특이도를 향상시키고, HCV에 대한 항체의 조기 검출에도 유용할 것이라는 실험결과를 근거로, 본 발명에서는 상기 합성 펩타이드, 그의 유사체, 조합체, 분체, 중합체, 결합체 또는 이들의 혼합체들을 이용하여 HCV 감염의 진단에 이용될 혼합항원을 제조하였다.

바람직하게는, 우선 상기의 펩타이드들 중에서 항원성이 높은 것으로 확인된 하기의 합성 펩타이드와 그의 중합체, 소혈청알부민 결합체, 바이오틴 결합체를 선별하고, 각 항원을 적합한 조건으로 유효량 혼합하였다:

(1) 하기의 아미노산 서열을 가지는 C2, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, NS5-2282의 합성 펩타이드:

Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-PRo-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-X (C2)

Val-Ile-Pro-Asp-Arg-Glu-Val-Leu-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-X (NS4-1694)

Glu-Gln-Cly-Met-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-X (NS4-1719)

Ser-Arg-Gly-Asn-His-Val-Ser-Pro-Thr-His-Tyr-Val-Pro-Glu-Ser-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-x (NS4-1924)

Pro-Pro-Ala-Leu-Pro-Ile-Trp-Ala-Arg-Pro-Asp-Tyr-Asn-Pro-Pro-Leu-Leu-Glu-Ser-Trp-Lys-Asp-Pro-Asp-X (NS5-2282)

(2) C2, C22, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, NS5-2282의 합성 펩타이드 팔량체(C22의 아미노산 서열: Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-X)

(3) C22A, NS4-1694A, NS4-1719A, NS4-1924A, NS5-2282A의 소혈청알부민 결합체

(4) C2B, C22B, NS4-1694B, NS4-1719, NS4-1924B, NS5-2282B의 바이오틴 결합체.

이렇게 제조한 혼합항원을 이용하여, HCV 항체 양성 및 음성 대조 혈청에 대해 효소 면역흡착 분석법(ELISA)을 수행한 결과, HCV 항체 검출에 최적인 다음과 같은 조성을 같는 A형, B형, C형, D형의 4가지 혼합항원이 선정되었다:

(1) C22A의 소혈청알부민 결합체와 C2, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, NS5-2282 합성 펩타이드를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물('혼합항원 A형'이라 함)

(2) C2, C22, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, NS5-2282의 각 팔량체를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물('혼합항원 B형'이라 함)

(3) C2 합성 펩타이드와 C22A, NS4-1694A, NS4-1719A, NS4-1924A, NS5-2282A의 소혈청알부민 결합체를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물('혼합항원 C형'이라 함)

(4) C2B, C22B, NS4-1694B, NS4-1719B, NS4-1924B, NS5-2282B의 바이오틴 결합체를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물('혼합항원 D형'이라 함).

아울러, 이들 혼합항원은 혈청 및 체액내에 존재하는 HCV에 대한 항체의 조기검출과 HCV 진단을 위한 민감도와 특이도가 높은 면역분석법에 유용하게 사용할 수 있다. 이때, 본 발명에서 제조한 혼합항원은 효소 면역 흡착 분석법(ELISA), 효소 면역 우(immunodot) 시험, 응집(agglutination) 시험, RIA(Radioimmunoassay), EIA(Enzyme immunoassay), IRMA(Immunoradiometric assay) 또는 당해 기술분야에서 공지된 다른 면역 분석법에 사용함으로써, HCV 감염을 진단할 수 있다.

또한, 최근의 ELISA 방법을 위한 고체상 플레이트의 제조방법으로, 항원의 보다 안정되고 균일한 흡착을 위하여, 바이오틴이 결합된 항원과 스트렙토아비딘과의 복합체를 제조하여 항원을 흡착시키는 방법이 사용되고 있으므로, 본 발명에서도 D형의 바이오틴 결합 혼합항원의 스트렙토아비딘 복합체를 사용하여 ELISA법을 수행한 결과, 우수한 민감도와 특이도를 나타냄을 확인하였다.

한편, HCV 감염의 진단에 본 발명의 혼합항원을 사용하면 다음과 같은 장점이 있다: ① 합성 펩타이드는 화학적으로 용이하게 합성할 수 있으므로, 일정한 질과 양으로 펩타이드를 제공하여 HCV 감염의 진단에 대한 재현성을 보장할 수 있다. ② 펩타이드의 화학합성시 아미노산의 변형이나 치환을 통하여 HCV 항체 검출에 유용한 펩타이드를 제조할 수 있다. ③ 혼합항원은 생바이러스 유래가 아니므로, 진단시약의 제조과정중 HCV의 감염 위험성이 없다. ④ 혼합항원은 화학합성되므로 숙주세포로 부터의 항원정제시 오염물질(숙주 자체의 단백질)에 의한 위양성의 진단결과를 방지할 수 있다. ⑤ 혼합항원은 소량 필요하므로 펩타이드 제조비용이 절감되며, 그 결과 HCV에 대한 항체검출 또는 HCV 감염의 진단시약 제조비용이 절감된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

(실시예 1) : 합성펩타이드 혼합항원을 이용한 ELISA

상기에서 언급한 A, B C, D형 혼합항원을 이용하여 HCV 항체 양성 및 음성 혈청에 대한 ELISA를 수행함으로써, 전기 혼합항원은 HCV 항체검출에 적합함을 확인하였다.

(실시예 1-1) : A형 합성 펩타이드 혼합항원을 이용한 ELISA

카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 3.0μg/ml의 농도로 용해된 A형 혼합항원 함유용액 200μl를 96공(well) 플레이트의 각 공에 주입하고, 37℃에서 2시간 동안 흡착시켰다. 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위하여, 혼합항원이 흡착된 공을 소혈청알부민이 1.0중량% 함유된 인산염 완충생리 식염수 봉쇄액 300μl로 채우고, 25℃에서 2시간 배양하였다. 이어, 봉쇄액을 흡입해 내고, 90분 동안 진공 건조시켰다.

그런 다음 ALT검사, PCR 검사 및 현재 시판되고 있는 2종의 HCV 항체 검출 EIA 검사를 통하여, HCV항체 양성으로 확인된 189개 검체와 음성으로 확인된 150개 검체를 사용하여 다음과 같이 ELISA를 수행하였다: 0.5 중량% 카제인, 10 부피% 소 태아 혈청, 0.1 부피% 트윈 20이 함유된 인산염 완충 생리 식염수 검체희석액을 200μl씩 플레이트의 각 공에 주입하고, 검체, 양성대조액 및 음성대조액 각각을 10μl씩 공에 넣어, 1 : 21(부피비)로 희석하였다. 96-공 플레이트를 잘 혼합하고, 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, 결합하지 않은 항체를 제거하기 위하여 0.1 부피% 트윈 20을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수로 각 공을 5회 세척하였다. 이어, HCV 양성인 각공에서 형성된 HCV 항체-펩타이드 혼합항원 복합체의 2차 추적자로, 염소의 항-사람 IgG와 결합된 양고추냉이 과산화 효소를 사용하기 위하여, 염소의 항-사람 IgG로 표지된 과산화 효소를 20 부피% 정상 염소혈청 및 0.1 부피% 트윈 20을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수로 1:20,000으로 희석한 액 200μl씩을 각 공에 주입하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합되지 않는 접합체액을 제거하기 위하여, 0.1 부피% 트윈 20을 함유한 인산염 완충 생리 식염수로 각 공을 5회 세척한 다음, 3,3', 5,5'-테트라메칠벤지딘(TMB) 및 과산화수소수를 함유하는 기질 완충용액 200μl를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 이어, 4N 황산 50μl를 가하여 반응을 중지시키고, 참조파장 620mm, 측정파장 450mm에서 흡광도를 측정하였다.

전기 A형 혼합항원을 이용한 ELISA의 결과는 제1도, 제2도, 제3도 및 제 4도에 나타내었으며, 각 도면에 대한 설명은 후술하는 바와 같다.

(실시예 1-2) : B형 합성 펩타이드 혼합항원을 이용한 ELISA

A형 혼합항원 대신에 B형 혼합항원을 사용하는 점을 제외하고는 전기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 혼합항원을 흡착시키고, HCV 양성 혈청 및 음성 혈청에 대한 ELISA를 수행하였다. 전기 B형 혼합항원을 이용한 ELISA의 결과는 제1도, 제2도, 제3도 및 제 4도에 나타내었으며, 각 도면에 대한 설명은 후술하는 바와 같다.

(실시예 1-3) : C형 합성 펩타이드 혼합항원을 이용한 ELISA

A형 혼합항원 대신에 C형 혼합항원을 사용하는 점을 제외하고는 전기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 혼합항원을 흡착시키고, HCV 양성 혈청 및 음성 혈청에 대한 ELISA를 수행하였다. 전기 C형 혼합항원을 이용한 ELISA의 결과는 제1도, 제2도, 제3도 및 제 4도에 나타내었으며, 각 도면에 대한 설명은 후술하는 바와 같다.

(실시예 1-4) : D형 합성 펩타이드 혼합항원을 이용한 ELISA

카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 2.5μg/ml의 농도로 용해된 스트렙토아비딘(Pierce, USA) 함유용액 200μl를 96-공 플레이트의 각 공에 주입하고, 4℃에서 하룻밤 동안 흡착시켰다. 스트렙토아비딘 흡착이 종결된 다음, 용액을 흡입해 내고, 합성 펩타이드 혼합항원 D형이 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 3.0μg/ml의 농도로 용해된 용액을 200μL씩 다시 각 공에 넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 2차 흡착시켰다.

비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위하여, 혼합항원이 흡착된 공을 소혈청알부민이 1.0 중량% 함유된 인산염 완충 생리 식염수 봉쇄액 300μl로 채우고, 25℃에서 2시간 배양하였다. 이어, 봉쇄액을 흡입해 내고, 90분 동안 진공 건조시켰다.

HCV 양성 혈청 및 음성 혈청에 대한 ELISA는 실시예 1-1에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, 전기 D형 혼합항원을 사용한 ELISA의 결과는 제1도, 제2도, 제3도 및 제4도에 나타내었다.

제1도는 혼합항원 A, B, C, D형을 각각 사용하여 측정한 음성 혈청 150개에 대한 ELISA 결과를 신호 대 판정치비의 빈도 분포로 나타낸 그래프이다. 제1도에서, A형과 D형의 특이도는 100%였으며, A형이 D형에 비해 낮은 신호에서 높은 빈도 분포를 나타내었다. 또한, B형과 C형의 특이도는 각각 99.3%, 98.7%이었으며, A, D형과 비교하여 높은 신호에서 빈도가 높은 것으로 나타났다.

제2(a) 내지 2(d)도는 혼합항원 A, B, C, D형을 각각 사용하여 측정한 양성 혈청 189개에 대한 ELISA 결과를 신호 대 판정치비의 빈도 분포로 나타낸 그래프이다. 제2(a) 내지 2(d)도에서, A, B, C, D형 모두 특이도는 100%였으며, A, B, C형은 비슷한 신호대에서 유사한 빈도 분포를 나타내었으나, D형은 A, B, C형과 비교하여 보다 높은 신호대에서 빈도가 높은 것으로 나타나 상대적으로 민감도가 우수할 것으로 예상된다.

이상의 결과를 종합하여 혼합항원 A, B, C, D형의 양성 및 음성 혈청에 대한 ELISA 결과를 신호 대 판정치비로 비교하여 제3(a) 내지 3(c)도 및 제 4(a) 내지 4(c)도에 나타내었다. 제3(a) 및 3(b)도에서, A형과 B 및 C형을 비교한 결과, 신호 대 판정치비 1을 중심으로 일직선상에 빈도 분포를 나타내었다. 제3(c)도에서, B형과 C형을 비교한 결과, 역시 신호 대 판정치비 1을 중심으로 일직선상에 빈도 분포를 나타내었다. 따라서, A, B, C형은 서로 비슷한 신호대 분포를 나타내며, 민감도와 특이도도 서로 유사하였다. 반면, 제 4(a) 내지 4(c)도에서, D형과 A, B, C형을 비교한 결과, 신호대 판정치비 1을 중심으로 불연속적인 직선상에 빈도 분포를 나타내었다. 따라서, D형은 A, B, C형보다 더 높은 양성 신호를 나타내며, 우수한 특이도와 민감도를 나타냄을 알 수 있었다.

(실시예 2) : 단일항원 및 혼합항원을 이용한 ELISA 결과의 비교

혼합항원 D형을 구성하는 항원 6종 각각을 단일항원으로 사용하였는데, 전기 단일항원이 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 1.0μg/ml의 농도로 용해된 용액을 항원 함유용액으로 사용하는 점을 제외하고는 전기 실시예 1-4와 동일한 방법으로 항원을 흡착시키고, 실시예 1-1의 방법으로 HCV 양성 혈청 189개에 대한 ELISA를 수행하였다.

아울러, 혼합항원 A, B, C, D형의 흡착은 실시예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4와 동일한 방법으로 각각 수행하고, 실시예 1-1의 방법으로 HCV 양성 혈청 189개에 대한 ELISA를 수행하였다(참조: 표 1)

[표 1]

상기 표 1에서 보듯이, 189개 HCV 양성 혈청 중에서 핵 부위 향원 C2B, C22B에만 양성인 혈청이 24개 있었으며, 비구조4 부위 항원 NS4-1694B, NS4-1719B, NS4-1924B에만 양성인 혈청이 8개 있었고, 비구조 5부위 항원 NS5-2282B에만 양성인 혈청은 없었다. 또한, 전기 양성인 혈청 32개는 단일항원보다 혼합항원을 사용한 ELISA에서 모두 향상된 신호를 나타내었다. 따라서, 단일항원보다 혼합항원을 사용하는 경우, 양성검체에 대한 신호 상승효과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

(실시예 3) : 흡착방법을 달리한 D형 혼합항원의 ELISA

카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 1mg/ml의 농도로 용해된 스트렙토아 비딘(Pierce, USA) 함유용액 50μl와, 합성 펩타이드 혼합항원 D형이 카보네이트 완충용액(pH 9.6)에 1mg/ml의 농도로 용해된 용액 50μl를 혼합하여 37℃에서 1시간 배양시켰다. 이어, 전기 혼합물을 카보네이트 완충요액(pH 9.6) 20ml로 희석하여, 96-공 플레이트의 각 공에 200μl씩 주입하고, 4℃에서 하룻밤 동안 흡착시켰다. 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위하여, 혼합항원이 흡착된 공을 소혈청알부민이 1.0 중량% 함유된 인산염 환충 생리 식염수 봉쇄액 300μl로 채우고, 25℃에서 2시간 배양하였다. 이어, 봉쇄액을 흡입해 내고, 90분 동안 진공 건조시켰다.

HCV 양성 혈청 및 음성 혈청에 대한 ELISA는 실시예 1-1에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, 실시예 1-4의 D형 혼합항원을 사용한 ELISA 결과와 비교하였다.

전기 방법으로 D형 혼합항원을 흡착시킨 플레이트를 사용한 ELISA 결과는 실시예 1-4와 유사하게 나타났다. 따라서, 전기 방법을 사용하는 경우 흡착과정에 필요한 시간을 단축할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 합성 펩타이드 혼합항원을 이용한 HCV 항체의 진단시약은 HCV 항체 검출의 민감도 및 특이도를 향상시키고, HCV에 대한 항체의 조기 검출을 가능케한다. 또한, 본 발명의 진단시약 및 그를 이용한 HCV 감염의 진단방법은 다음과 같은 장점을 가지고 있다: ① 합성 펩타이드는 화학적으로 용이하게 합성할 수 있으므로, 일정한 질과 양으로 펩타이드를 제공하여 HCV 감염의 진단에 대한 재현성을 보장할 수 있다. ② 펩타이드의 화학합성시 아미노산의 변형이나 치환을 통하여 HCV 항체 검출에 유용한 펩타이드를 제조할 수 있다. ③ 혼합항원은 생바이러스 유래가 아니므로, 진단시약의 제조과정중 HCV의 감염 위험성이 없다. ④ 혼합항원은 화학합성되므로 숙주세포로 부터의 항원정제시 오염물질(숙주 자체의 단백질)에 의한 위양성의 진단결과를 방지할 수 있다. ⑤ 혼합항원은 소량 필요하므로 펩타이드 제조비용이 절감되며, 그 결과 HCV에 대한 항체검출 또는 HCV 감염의 진단시약 제조비용이 절감된다.

Claims

(정정) HCV 유전자의 핵, 비구조4(NS4), 비구조5(NS5) 부위에서 항원성이 확인된 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드, 그의 중합체(polymer), 결합체(conjugate) 또는 이들의 혼합체(mixture)들을 주요성분으로 포함하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약:

(1) Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-X (C2) (2) Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-X (CC2)

(3) Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-X (C42)

(4) Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-X (C50)

(5) Thr-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly-Tyr-Pro-Trp-Pro-Leu-Tyr-Gly-Asn-Glu-Gly-Met-Gly-Trp-Ala-Gly-Trp-Leu-Leu-Ser-X (C75)

(6) Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Pro-Ser-Trp-Gly-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Arg-Arg-X (C100)

(7) Ser-Arg-Asn-Leu-Gly-Lys-Val-Ile-Asp-Thr-Leu-Thr-Cys-Gly-Phe-Ala-X (C116)

(8) Pro-Leu-Gly-Gly-Ala-Ala-Arg-Ala-Leu-Ala-His-Gly-Val-Arg-Val-Leu-Glu-Asp-Gly-Val-Asn-Tyr-Ala-Thr-Gly-Asn-X (C143)

(9) Val-Ile-Pro-Asp-Arg-Glu-Val-Leu-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-X (NS4-1694)

(10)Glu-Gln-Cly-Met-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Gln-Lys-Ala-Leu-Gly-Leu-X (NS4-1719)

(11) Thr-Ala-Thr-Lys-Gln-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Pro-Val-Val-Glu-Ser-Lys-Trp-Arg-Ala-X (NS4-1738)

(12) Ser-Arg-Gly-Asn-His-Val-Ser-Pro-Thr-His-Tyr-Val-Pro-Glu-Ser-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-X (NS4-1924)

(13) Pro-Pro-Ala-Leu-Pro-Ile-Trp-Ala-Arg-Pro-Asp-Tyr-Asn-Pro-Pro-Leu-Leu-Glu-Ser-Trp-Lys-Asp-Pro-Asp-X (NS5-2282)

(14) Gly-Thr-Ala-Thr-Gly-Pro-Pro-Asp-Gln-Ala-Ser-Asp-Asp-Gly-Asp-Lys-Asp-Ser-Asp-Val-Glu-X (NS5-2363)

(15) Lys-Lys -Val-Thr-Phe-Asp-Arg-Leu-Gln-Val-Leu-Asp-Asp-His-Tyr-Arg-Asp-Val-Leu-Lys-Glu-Met-Lys-X (NS5-2469)

상기에서 X는 -OH 또는 -NH₂이다.
제1항에 있어서, 혼합항원은 C22A의 소혈청알부민 결합체와 C2, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, NS5-2282 합성 펩타이드를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물인 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약.
제1항에 있어서, 혼합항원은 C2, C22, NS4-1694, NS4-1719, NS4-1924, NS5-2282의 각 팔량체를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물인 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약.
제1항에 있어서, 혼합항원은 C2 합성 펩타이드와 C22A, NS4-1694A, NS4-1719A, NS4-1924A, NS5-2282A의 소혈청알부민 결합체를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물인 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약.
제1항에 있어서, 혼합항원은 C2B, C22B, NS4-1694B, NS4-1719B, NS4-1924B, NS5-2282B의 바이오틴 결합체를 1:1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 조성물인 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스에 대한 항체의 진단시약.
(정정) 혈액을 제1항의 진단시약에 가하여 HCV 항체를 검출하는 단계를 포함하는 HCV 감염의 측정방법.
(정정) 제6항에 있어서, HCV 항체는 효소 면역 흡착 분석법(ELISA), 효소 면역 우성(immunodot) 시험법, 응집(agglutination) 시험법, RIA(Radioimmunoassay), EIA(Enzyme immunoassay) 및 IRMA(Immunoradiometric assay)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 방법에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 HCV 감염의 측정방법.
(정정) 제6항에 있어서, 제1항의 진단시약이 바이오틴 결합체의 혼합항원을 포함하는 경우, 혼합항원을 스트렙토아비딘이 흡착된 플레이트에 2차로 흡착시킨 후 또는 혼합항원과 스트렙토아비딘과의 복합체를 미리 형성시키고 그를 플레이트에 흡착시킨 후, 혈액을 가하는 것을 특징으로 하는 HCV 감염의 측정방법.