ES2251028T3 - Proteina de fusion de epitopos multiples. - Google Patents
Proteina de fusion de epitopos multiples.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LA PRODUCCION DE INMUNOENSAYOS DE EPITOPOS DE MULTIPLES COPIAS, CONSISTENTES EN: (1) IDENTIFICAR SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS QUE CODIFICAN PARA UNA PLURALIDAD DE EPITOPOS DISTINTOS; (2) INTRODUCIR LAS SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS EN UNA CASETE DE EXPRESION, INTRODUCIENDOSE AL MENOS DOS COPIAS DE UNA SECUENCIA QUE CODIFICA PARA EL MISMO EPITOPO, PREFERIBLEMENTE DE DIFERENTES CEPAS DE UN PATOGENO; (3) TRANFORMAR UN HUESPED ADECUADO CON LA CASETE, A FIN DE EXPRESAR LAS SECUENCIAS QUE CODIFICAN PARA LOS EPITOPOS; (4) PURIFICAR LOS EPITOPOS EXPRESADOS; Y (5) REVESTIR UNA SUPERFICIE DE UN SUSTRATO CON DICHOS EPITOPOS. LOS EPITOPOS PURIFICADOS ESTAN INCLUIDOS EN LA FORMULA ESTRUCTURAL (A) X - (B) Y (C) Z , QUE REPRESENTA UNA SECUENCIA AMINOACIDA LINEAL; B ES UNA SECUENCIA AMINOACIDA DE UN EPITOPO O AGRUPACION DE EPITOPOS Y CADA B CONTIENE AL MENOS CINCO Y NO MAS DE 1000 AMINOACIDOS, Y ES UN ENTERO DE VALOR 2 O SUPERIOR; A Y C SON CADA UNO INDEPENDIENTEMENTE UNA SECUENCIA AMINOACIDA DE UN EPITOPO O AGRUPACION DE EPITOPOS NO ADYACENTE A B EN LA NATURALEZA; Y X Y Z SON CADA UNO INDEPENDIENTEMENTE UN ENTERO DE VALOR 0 O SUPERIOR, DONDE AL MENOS UNO DE X Y Z ES 1 O SUPERIOR. LOS EPITOPOS DE LA INVENCION SON MAS SOLUBLES QUE LOS EPITOPOS CONVENCIONALES Y SE PURIFICAN, POR TANTO, MAS FACILMENTE. ADEMAS, LA PRESENCIA DE SECUENCIAS DE EPITOPOS REPETITIVAS (QUE REPITEN AL MENOS B EN LA MISMA SECUENCIA AMINOACIDA LINEAL, DE DIFERENTES CEPAS DE UN PATOGENO) INCREMENTA LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DEL ENSAYO. LA EXISTENCIA DE SECUENCIAS DE EPITOPOS REPETITIVAS EN UN ANTIGENO LINEAL UNICO, REDUCE ASIMISMO LOS PROBLEMAS DE ENMASCARAMIENTO Y HACE POSIBLE LA INCLUSION DE UN MAYOR NUMERO DE EPITOPOS EN UN AREA UNITARIA DE SUSTRATO, MEJORANDO POR TANTO LA SENSIBILIDAD EN LA DETECCION DE ANTICUERPOS.
Description
Proteína de fusión de epítopos múltiples.
La presente invención se refiere en general a los
campos de síntesis de proteínas e inmunoensayos y se refiere
específicamente a procedimientos de síntesis de cadenas largas de
aminoácidos que contienen copias múltiples de epítopos para virus
como VHC, y a dispositivos de ensayo que utilizan epítopos múltiples
para detectar la presencia de anticuerpos.
En general, los inmunoensayos se producen
determinando primero los epítopos que están asociados
específicamente con un virus y determinando después cuál de los
epítopos se prefiere para el ensayo que se está desarrollando.
Cuando se aíslan los epítopos inmunodominantes, se determinan sus
secuencias y se produce material genético para producir los epítopos
inmunodominantes. Se conocen procedimientos para producir proteínas
por medios químicos o biológicos, así como ensayos usados para
detectar la presencia de anticuerpos a epítopos particulares.
En la producción de inmunoensayos, el objeto
global es obtener un inmunoensayo que sea altamente sensible y
altamente selectivo. Más específicamente, el inmunoensayo debe
diseñarse de manera que pueda detectar incluso niveles muy bajos del
material para el que está diseñada la detección, es decir, para el
que es altamente sensible. Un ensayo que tiene un alto grado de
sensibilidad asegura que una muestra, que ha sido probada, no está
contaminada con el material para el que está diseñada la detección
por el ensayo. Por ejemplo, es deseable un ensayo altamente sensible
que detecte incluso la más ligera presencia de anticuerpos para un
virus dado, ya que hace posible detectar y, así, descartar muestras
que contienen cualquier cantidad del anticuerpo que indica que las
muestras contienen el virus.
Aunque en un ensayo es deseable un alto grado de
sensibilidad, no es deseable si el ensayo indica falsamente la
presencia del material, es decir, si el ensayo está proporcionando
un resultado de falso positivo. Dichos resultados de falso positivo
pueden producirse cuando el analito tiene un alto grado de semejanza
con otro material presente en la muestra. La capacidad de un ensayo
para diferenciar entre dos materiales similares pero diferentes se
relaciona con su selectividad.
Un inmunoensayo con un alto grado de selectividad
detectará la presencia de un material sometido a ensayo incluso
cuando que ese material está presente en la muestra en combinación
con otros materiales que tienen una estructura similar. Así, un
inmunoensayo altamente selectivo eliminará la mayoría de los
resultados de falso positivo. En general, cuando aumenta la
selectividad disminuye la sensibilidad. Esto sucede, en parte,
debido al alto grado de variabilidad en virus. Así, los ensayos que
se diseñan para ser altamente sensibles deben tener en cuenta la
variabilidad entre virus diferentes. Cuando se acomoda la
variabilidad de virus para mejorar la sensibilidad, la selectividad
disminuye. Alternativamente, cuando se produce un inmunoensayo que
es cada vez más selectivo con respecto a un virus particular,
aumenta la probabilidad de que el ensayo se haga tan selectivo como
para que se reduzca la sensibilidad.
En gran medida, el problema de proporcionar
selectividad mejorada (menos falsos positivos) se trata buscando y
encontrando los epítopos más inmunodominantes. El problema de
sensibilidad (baja detección de concentración) se trata
proporcionando epítopos inmunodominantes de una diversidad de
regiones diferentes del virus.
Las propiedades inmunológicas de un polipéptido
recombinante constituido por determinantes seleccionados de
proteínas de envoltura de virus de hepatitis B fueron examinadas por
Kumar A. y col. (Vaccine 1994 Vol. 12 nº
3:259-266). En Chien D.Y. y col. (J.
Gastroenterology and Hepatology 1993 Vol. 8: S33.39) se
describen un epítopo múltiple de antígeno de virus de hepatitis C y
su uso para el serodiagnóstico de infección por VHC. En van
Binsbergen J. y col. (J. Virol. Methods 1996 Vol.
60:131-137) se describe un inmunoensayo para
una detección mejorada de muestras positivas de
VIH-1 grupo O que incluyen antígenos derivados de
diferentes aislados de VIH.
Se diseñan ensayos actuales para utilizar
relativamente pocos péptidos seleccionados como "epítopos
mayores" o epítopos altamente inmunodominantes. La sensibilidad
del ensayo depende del número de epítopos mayores disponibles en el
soporte sólido. Si la disponibilidad de epítopos está limitada por
el número de péptidos que pueden recubrirse en la fase sólida, ese
ensayo tendrá sensibilidad reducida. Estos resultados pueden
demostrarse como de baja sensibilidad de dilución del ensayo, bajas
sensibilidades de seroconversión y/o determinaciones de falsos
negativos (Chien, D.Y. y col., (1993) J. Gastroent. Hepatol.
8:S33-39).
En consecuencia, existe actualmente la necesidad
de mejorar la sensibilidad y selectividad de los ensayos de
anticuerpos a patógenos en líquidos biológicos y, con ello, mejorar
el diagnóstico de la infección por patógenos que produce una
detección selectiva mejorada de suministros de sangre.
Se producen inmunoensayos de antígenos de fusión
de copias múltiples (MEFA) capaces de detectar anticuerpos de cepas
múltiples de un patógeno en un solo ensayo mediante (1)
identificación de secuencias de nucleótidos que codifican una
pluralidad de epítopos diferentes, incluyendo componentes
inmunodominantes; (2) colocación de las secuencias de nucleótidos en
una casete de expresión en la que al menos dos copias de una
secuencia que codifica la misma región de epítopo de un organismo
como un virus o regiones correspondientes de diferentes cepas del
virus se colocan en una sola casete; (3) transformación de un
huésped adecuado con una o más copias de la casete para expresar
secuencias que codifican epítopos, secuencias que incluirán dos o
más copias de al menos un epítopo en un solo antígeno de cadena; (4)
purificación del antígeno de epítopo múltiple expresado; y (5)
adaptación del antígeno de epítopos múltiples purificados para un
inmunoensayo, en la que la adaptación puede incluir, pero no se
limita a, lo siguiente: recubrimiento del antígeno de epítopos
múltiples sobre una superficie de un sustrato; uniendo de forma
covalente un marcador detectable al antígeno de epítopos múltiples;
y similares.
Los epítopos purificados están comprendidos por
la fórmula estructural general
(A)_{X}-(B)_{y}-(C)_{Z} que representa
una secuencia lineal de aminoácidos. B es una secuencia de
aminoácidos deal menos cinco y no más de 1.000 aminoácidos de un
determinante antigénico o conglomerado de determinantes antigénicos,
e y es un número entero de 2 o más. Cada copia de B es un
determinante antigénico equivalente (por ejemplo, cada copia es un
epítopo de una cepa viral diferente). A y C son cada uno
independientemente una secuencia de aminoácidos de un epítopo o
conglomerado de epítopos no inmediatamente adyacentes a B por
naturaleza; y x y z son cada uno independientemente un número entero
de 0 o más, en los que menos uno de x y z es 1 o más.
Preferentemente, los epítopos y de B son determinantes antigénicos
equivalentes de diferentes cepas virales, con lo que aumenta la
diversidad de patógenos detectables por un solo antígeno de epítopos
múltiples.
La selectividad se mejora además incluyendo
epítopos inmunodominantes de la misma región de dos o más cepas
diferentes del mismo virus. Más preferentemente, los determinantes
antigénicos equivalentes de B tienen diferente especificidad de
serotipo. Los epítopos de la invención son más solubles y son, por
tanto, más fáciles de purificar que los epítopos convencionales.
Además, la presencia de secuencias de epítopos repetidos disminuye
problemas de enmascaramiento y mejora la sensibilidad en la
detección de anticuerpos al permitir un mayor número de epítopos en
un área unidad de sustrato. La sensibilidad se mejora además
colocando los epítopos de copias múltiples de la invención en
pequeñas perlas o micropartículas esféricas o de forma irregular,
aumentando con ello la zona de superficie expuesta por área dada de
un dispositivo de ensayo.
Un objeto de la descripción es proporcionar una
secuencia de aminoácidos compuesta por una pluralidad de epítopos en
los que al menos la parte determinante antigénica de al menos uno de
los epítopos se repite dos o más
veces.
veces.
Otro objeto de la descripción es proporcionar un
procedimiento para producir un inmunoensayo que usa antígenos de
fusión de epítopos múltiples.
Una característica descrita es que las secuencias
de aminoácidos que comprenden copias múltiples de una secuencia de
epítopos dada tiene más alta solubilidad en comparación con las
secuencias de aminoácidos que comprenden una sola copia de cualquier
epítopo dado.
Otra característica de la invención es que las
secuencias de nucleótidos que codifican los epítopos están en un
orden lineal que puede ser diferente de su orden lineal en el genoma
del patógeno. Así, los determinantes antigénicos de A, B y C pueden
estar en un orden lineal diferente al de los determinantes
antigénicos de ocurrencia natural de A, B y C. El orden lineal de
las secuencias de la invención se dispone preferentemente para una
antigenicidad óptima de las secuencias expresadas de aminoácidos que
comprenden el antígeno de fusión de epítopos múltiples.
Una ventaja de la invención es que los antígenos
de epítopos múltiples de fórmula (I) pueden purificarse más
fácilmente en comparación con los epítopos convencionales.
Otra ventaja de la invención es que el
enmascaramiento de un determinante antigénico puede reducirse.
Otra ventaja de la invención es que los
inmunoensayos que utilizan los antígenos de fusión de epítopos
múltiples han mejorado la sensibilidad y la selectividad.
Otra ventaja más de la invención es que los
epítopos múltiples, particularmente los epítopos repetidos de B,
proporcionan un ensayo capaz de detectar más de una cepa de un virus
único basado en la especificidad tipo de los epítopos.
Otra característica de la invención es que las
secuencias de epítopos múltiples de fórmula (I) pueden diseñarse
para incluir un número mayor y/o secuencias más largas que las que
están presentes generalmente en secuencias de epítopos que contienen
una sola copia de cualquier epítopo dado.
Otra ventaja de la invención es que el diseño de
los antígenos de epítopos múltiples por fórmula (I) hace posible
incluir un número mayor de determinantes antigénicos en un área
unidad de superficie de un inmunoensayo en comparación con antígenos
que contienen una sola copia de cualquier epítopo dado.
La invención proporciona también la ventaja de
mejorar la especificidad y sensibilidad general de pruebas
serológicas cuando se requieren epítopos múltiples y el área
superficial de la fase sólida es limitativa. Adicionalmente, las
pruebas de inmunoensayo basadas en un solo antígeno quimérico
simplificarán enormemente el proceso de fabricación, particularmente
en pruebas que requieren antígenos marcados con marcadores
detectables.
Una forma de realización de la invención
proporciona además un inmunoensayo de ligando de captura rápida que
usa antígenos de fusión de epítopos múltiples que es sencillo y
cómodo de realizar, ya que es un ensayo simultáneo de una sola
etapa. La detección se realiza mediante la unión de un marcador
detectable a un miembro del complejo antígeno/anticuerpo,
preferentemente al antígeno. La unión puede hacerse por medios
covalentes o por la unión posterior de anticuerpos marcados de forma
detectable como, por ejemplo, un ensayo en sándwich estándar, o por
reacción enzimática, cuyo producto de reacción es detectable. El
marcador detectable puede incluir, pero no se limita a, un
cromóforo, un anticuerpo, un antígeno, una enzima, un compuesto
reactivo con enzimas cuyo producto de escisión es detectable,
rodamina o derivado de rodamina, biotina, estrepavidina, un
compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, como éster
de dimetilacridinio (DMAE, Ciba Corning Diagnostics Corp.),
derivados y/o combinaciones de estos marcadores.
En otra forma de realización de la invención, el
ensayo de formato de ligando de captura contiene un MEFA como
antígeno, así como un epítopo detectable adicional añadido a la
mezcla de ensayo. El epítopo detectable adicional puede incluir un
solo epítopo o epítopos múltiples y puede incluir, pero no se limita
a, los epítopos incluidos en el MEFA, preferentemente epítopos de
regiones como E1, E2 y c33c. Según esta forma de realización de la
invención, el epítopo adicional está unido o puede unirse a un
marcador detectable según se describe anteriormente. Cuando el
epítopo adicional tiene características preferidas como
conformación, glicosilación y similares, el epítopo adicional se
expresa como un polipéptido recombinante de una célula, expresión
que proporciona el epítopo en una forma deseada. Preferentemente, el
epítopo puede obtenerse de la célula usando condiciones de
aislamiento suaves que conservan las características deseadas del
epítopo. La célula puede ser cualquier célula apropiada como, por
ejemplo, célula de mamífero, preferentemente una célula de ovario de
hámster chino (CHO), o una célula bacteriana, de levadura o de
insecto de la cual puede aislarse el epítopo adicional en la forma
deseada.
Estos y otros objetos, ventajas y características
de la presente invención serán más comprensibles para los expertos
en la técnica leyendo los detalles de los epítopos de copias
múltiples, inmunoensayos y procedimientos para producirlos según se
establece más ampliamente a continuación, con referencia a la
fórmula general anexa que forma una parte de los mismos en la que
símbolos semejantes se refieren a fracciones moleculares
semejantes.
La Fig. 1 es un dibujo esquemático que muestra
la identificación, los aminoácidos y las configuraciones de
epítopos, en los antígenos MEFA-3,
MEFA-5 y MEFA-6.
La Fig. 2 es un dibujo esquemático que muestra
los epítopos de antígeno MEFA-5 y su posición dentro
del genoma de VHC. También se proporciona un diagrama de
pmefa-5, un vector de expresión de
MEFA-5.
La Fig. 3 es un dibujo esquemático que muestra
los epítopos de antígeno MEFA-6 y su posición dentro
del genoma de VHC. También se proporciona un diagrama de
pmefa-6, un vector de expresión de
MEFA-6.
La Fig. 4 es un dibujo esquemático de un ensayo
de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA) en el que se adsorbe
un MEFA en la superficie de un soporte sólido.
La Fig. 5 es un diagrama esquemático de un
formato de captura de anticuerpos para detección de anticuerpos
anti-VCH en el que se une un MEFA a una molécula de
marcador detectable, DMAE. También se indica en un formato en el que
un MEFA (MEFA-6) y un epítopo adicional (c33c) son
los antígenos del ensayo.
La Fig. 6 es un diagrama esquemático de un
formato de captura de anticuerpos para detección por
quimioluminiscencia de anticuerpos anti-patógeno
humanos en los que un antígeno (MEFA) se enlaza con biotina (B) que
une estrepavidina marcada con DMAE.
La Fig. 7 es un gráfico que compara la
sensibilidad de dilución de
MEFA-6-DMAE y
MEFA-6-DMAE +
c33c-DMAE con la sensibilidad de dilución de ELISA
comercial, ELISA de VHC 2.0G (segunda generación).
La Fig. 8 es un gráfico que compara la
sensibilidad de seroconversión de ELISA comercial (Abbott
Laboratories), MEFA-6, MEFA-6 + c33c
y RIBA© 3.0. Se tomaron muestras de un paciente infectado
crónicamente con respecto al tiempo (fechas de sangrado).
La Fig. 9 es un diagrama que correlaciona
detección de anticuerpos de VHC (positivos o negativos) en muestras
por ELISA de VHC de Segunda Generación para detección por un
inmunoensayo de quimioluminiscencia de MEFA (CLIA).
La Fig. 10 es una gráfica que ilustra la
precisión del CLIA de MEFA-6-DMAE de
la invención. Todas las muestras negativas exhibieron unidades
luminosas relativas (ULR) inferiores al valor de corte, mientras que
las muestras positivas conocidas exhibieron valores de ULR por
encima del valor de corte.
La práctica de la presente invención empleará,
salvo que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de
virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas
de ADN recombinante dentro de los conocimientos de la técnica.
Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase,
por ejemplo, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2ª edición, 1989); DNA Cloning: A Practical
Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Methods in
Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan ed., Academic Press, Inc.);
y Handbook of Experimental Immunology, Vol.
I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell ed., Blackwell
Scientific Publications); Fundamental Virology, 2ª edición,
vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, ed.).
Antes de producir y usar según se describe las
presentes proteínas de fusión de epítopos múltiples, inmunoensayos y
procedimientos, debe entenderse que esta invención no se limita a
las secuencias de aminoácidos, inmunoensayos o procedimientos de
producción particulares, ya que pueden, por supuesto, variar.
También debe entenderse que la terminología usada en la presente
memoria descriptiva tiene el propósito de describir sólo formas de
realización particulares, y no se pretende limitarse, ya que el
ámbito de la presente invención estará limitado únicamente por las
reivindicaciones adjuntas.
Salvo que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente memoria
descriptiva tienen el mismo significado que entiende normalmente un
experto corriente en la materia del campo al que pertenece esta
invención. Aunque en la práctica o en las pruebas de la presente
invención puede usarse cualquier procedimiento y materiales
similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria
descriptiva, a continuación se describen los procedimientos y
materiales preferidos.
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "copia múltiple" especifica una secuencia de
aminoácidos que contiene al menos cinco aproximadamente y no más de
1.000 aminoácidos aproximadamente en una forma lineal, repetidos dos
o más veces dentro de una molécula lineal. La secuencia repetida no
debe estar directamente conectada a sí misma, no estar repetida en
la naturaleza de la misma forma y, además, puede estar presente en
una secuencia mayor que incluya otros aminoácidos no repetidos o
"copiados". La secuencia de al menos cinco y no más de 1.000
aminoácidos comprende un epítopo según se define a continuación.
Para los fines de esta invención, una "copia" de una secuencia
de aminoácidos puede ser una copia de secuencia exacta o una
secuencia que corresponda al mismo epítopo de una cepa viral
diferente, es decir, las copias son copias exactas o secuencias que
son " determinantes antigénicos equivalentes" según se define a
continuación.
El término "epítopo" según se usa en la
presente memoria descriptiva se refiere a una secuencia de al menos
cinco aproximadamente y no más de 1.000 aminoácidos aproximadamente
conectados en una forma lineal, con dichos aminoácidos, en sí mismos
o como parte de una secuencia mayor, unidos a un anticuerpo generado
como respuesta a dicha secuencia. Un epítopo para su uso en la
invención objeto no se limita a un polipéptido que tiene la
secuencia exacta de la porción de la proteína madre de la cual
procede. De hecho, los genomas virales están en un estado de flujo
constante y contienen varios dominios variables que exhiben grados
relativamente altos de variabilidad entre aislados. Así, el término
"epítopo" comprende secuencias idénticas a la secuencia nativa,
así como modificaciones a la secuencia nativa, como deleciones,
adiciones y sustituciones (en general, conservadoras por
naturaleza).
Según se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo
recombinante que tiene características estructurales nativas de la
secuencia de aminoácidos que codifica el epítopo dentro de la
proteína natural de longitud completa. Las características nativas
estructurales incluyen, pero no se limitan a, glicosilación y
estructura tridimensional. Generalmente, se añade un epítopo
conformacional a la mezcla de inmunoensayo que contiene MEFA para
potenciar la sensibilidad y la selectividad del ensayo.
Preferentemente, un epítopo conformacional recombinante se expresa
en una célula a partir de la cual es extraíble en condiciones que
conservan sus características estructurales deseadas, por ejemplo,
sin desnaturalización del epítopo. Dichas células incluyen células
de bacterias, levadura, insectos y mamíferos. Preferentemente, la
célula en la que se expresa un epítopo conformacional es una célula
de mamífero, como una célula de ovario de hámster chino (CHO). La
expresión y el aislamiento de los epítopos conformacionales
recombinantes de las regiones E1 y E2 de VHC se describen en los
documentos WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053 y WO 92/08734.
El término "casete de expresión" según se
usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una secuencia de
ADN que contiene una región de codificación ligada operativamente a
una o más secuencias de control adecuadas capaces de efectuar la
expresión de la región de codificación en un huésped compatible. Los
sistemas de expresión comprenden invariablemente un promotor, pero,
dependiendo del huésped pretendido, pueden contener secuencias
críticas adicionales de nucleótidos como un sitio de unión a
ribosoma o sitio CAP, secuencia de terminación y secuencias de
potenciador óptimas en sentido ascendente desde el promotor o en
otras posiciones operativas. Las casetes de expresión recombinantes
de la invención en la presente memoria descriptiva comprenden un ADN
de la invención que codifica un MEFA ligado operativamente a
secuencias de ADN adicionales que son capaces de efectuar su
expresión. La casete de expresión puede residir en un vector de
transferencia como, por ejemplo, un plásmido u otro vector que es
autorreplicante independientemente del cromosoma de la célula
huésped, o puede construirse de manera que cuando se inserta en una
célula huésped es capaz de integrarse en el cromosoma.
Por "determinante antigénico equivalente" se
entiende un determinante antigénico de subespecies o cepas
diferentes de un organismo dado como, por ejemplo, una cepa
diferente de un virus como, por ejemplo, las cepas 1, 2 ó 3 de virus
de hepatitis C. Más específicamente, para un virus como el de
hepatitis C, se conocen epítopos, como
5-1-1, y dichos epítopos varían
entre las cepas conocidas 1, 2, y 3. Así, el epítopo
5-1-1 de las tres cepas diferentes
son determinantes antigénicos equivalentes y, así, son "copias"
aun cuando sus secuencias no sean idénticas. En general, las
secuencias de aminoácidos de determinantes antigénicos equivalentes
tendrán un alto grado de homología de secuencia.
El término "trazador" significará cualquier
molécula de marcador detectable enlazable a un epítopo o un MEFA. La
unión se realiza preferentemente por medios covalentes. Las
moléculas de marcadores detectables útiles como trazadores en la
invención incluyen, pero no se limitan a, éster de dimetilacridinio
(DMAE), cromóforo, biotina, estrepavidina, un anticuerpo, un
antígeno, compuestos fluorogénicos de enzimas, compuestos de
rodamina, fluoresceína, FITC y similares.
Pueden producirse inmunoensayos altamente
sensibles y selectivos usando los antígenos de fusión de epítopos
múltiples de la presente invención. Para producir dichos
inmunoensayos, es necesario primero identificar un objeto para el
que se vaya a someter la muestra a ensayo, por ejemplo, un virus
particular en una muestra fluida del cuerpo. Después de identificar
el virus de interés, se aíslan los epítopos inmunodominantes
preferidos del virus, se secuencian y se determinan y producen
secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de
aminoácidos de los epítopos. Las secuencias de nucleótidos que
codifican las secuencias de aminoácidos pueden fundirse
conjuntamente usando procedimientología recombinante estándar. Las
secuencias pueden fusionarse también a polipéptidos adicionales para
facilitar la expresión y purificación de los mismos.
La secuencia fusionada debe incluir al menos dos
copias de secuencias de nucleótidos que codifican un epítopo dado.
Entonces se coloca la secuencia de nucleótidos en una casete de
expresión y se transforma un huésped adecuado con la casete. Se deja
que el huésped exprese las secuencias para proporcionar los epítopos
de copias múltiples (antígeno de fusión de epítopos múltiples,
MEFA). A continuación se purifican los epítopos de copias múltiples
producidos, por ejemplo, por cromatografía de afinidad, un
procedimiento que se facilita hasta cierto grado debido a la
presencia de las copias múltiples de un epítopo dado. Los MEFA
purificados se recubren a continuación en la superficie del sustrato
para ensayos de tipo ELISA. Alternativamente, se unen los MEFA
purificados a una molécula trazadora de marcador
detectable para detección de unión a anticuerpo, como, por ejemplo, en un ensayo de quimioluminiscencia (CLIA).
detectable para detección de unión a anticuerpo, como, por ejemplo, en un ensayo de quimioluminiscencia (CLIA).
La esencia de la invención es los epítopos de
copias múltiples purificados, es decir, proteínas de fusión
purificadas que incluyen copias múltiples de un epítopo dado
fundido, en una forma lineal por naturaleza, a otros epítopos que
normalmente no están conectados a otros de esta forma (MEFA). Los
epítopos purificados están comprendidos por la fórmula estructural
general (I) siguiente:
(A)_{x}-(B)_{y}-(C)_{z}, que representa
una secuencia de aminoácidos lineal. B es una secuencia de
aminoácidos de un epítopo o conglomerado de epítopos y cada B
contiene al menos cinco y no más de 1.000 aminoácidos, y es un
número entero de 2 o más, A y C son cada uno independientemente una
secuencia de aminoácidos de un epítopo o conglomerado de epítopos no
inmediatamente adyacente a B por naturaleza, y x y z son cada
independientemente un número entero de 0 o más en los que al menos
uno de x y z es 1 o más. Cuando x, y o z es mayor que 1, o cuando x,
y y z son mayores que 1, las copias múltiples de A, B y C pueden ser
idénticas, es decir, cada copia de A (diferente de B y C) es la
misma secuencia exacta de aminoácidos, cada copia de B (diferente de
A y C) es la misma secuencia exacta de aminoácidos y cada copia de C
(diferente de A y B) es la misma secuencia exacta de aminoácidos.
Alternativamente, cada copia A, B o C puede ser un determinante
antigénico equivalente de cepas diferentes del mismo virus. Así, por
ejemplo, si y es 3, cada B puede ser una secuencia de aminoácidos
idéntica o tres secuencias diferentes de determinantes antigénicos
equivalentes de la cepa de VHC 1, 2 y 3. La invención puede utilizar
material genético que codifica epítopos o grupos de epítopos
conocidos conectando el material en un constructo de ácidos
nucleicos que produce un epítopo de copias múltiples de la fórmula
(I).
Los ensayos de captura de anticuerpo de VHC en
los que los epítopos únicos individuales se recubren en un soporte
sólido son menos sensibles que los ensayos de captura en los que se
recubre una poliproteína de epítopos quimérica, como (C25) que
contiene epítopos del secuencias de regiones centrales
inmunodominantes, c33c (NS3) y c100 (NS4) (Chien, D.Y., y col.
(1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA
89:10.011-10.015), en un soporte sólido. A su
vez, un ensayo de captura que usa la poliproteína quimérica C25 es
menos sensible que un ensayo de captura de anticuerpo de VHC que usa
un MEFA de la invención, en el que el MEFA contiene copias múltiples
de al menos un epítopo y al menos una copia es de una cepa de VHC
diferente. Así, un MEFA preferido de la invención que tiene la
fórmula general
A_{x}-B_{y}-C_{z} contiene más
de una copia de un epítopo (es decir, y es un número entero de 2 o
más), y al menos uno de los epítopos de B es un determinante
antigénico equivalente diferente (por ejemplo, un epítopo de una
cepa de patógeno diferente).
La invención desvelada en la presente memoria
descriptiva utiliza tecnología de ADN recombinante e ingeniería de
proteínas para diseñar una poliproteína recombinante que fusionar
una diversidad de epítopos inmunodominantes diferentes a partir de
una diversidad de patógenos o cepas de patógenos como antígeno
quimérico para el desarrollo del inmunoensayo. Además, la invención
utiliza copias múltiples de epítopos seleccionados de regiones de
codificación estructurales y no estructurales de un gen combinado y
expresado como una poliproteína recombinante para mejorar
significativamente la sensibilidad y selectividad de un
inmunoensayo.
Los epítopos usados para formar un epítopo de
copias múltiples de la invención pueden ser de una diversidad de
organismos diferentes. Por ejemplo, el epítopo puede ser una
secuencia de aminoácidos de bacterias, protozoos, virus,
rickettsias, parásitos u hongos. Una forma de realización preferida
de la invención usa epítopos que se obtienen de una bacteria o
virus, siendo los epítopos preferidos particularmente los obtenidos
de un virus, como virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y, con la
máxima preferencia, virus de hepatitis C (VHC). Por ejemplo, los
epítopos VIH pueden obtenerse de cualquiera de las diversas regiones
virales que muestran inmunorreactividad como, sin limitarse a ellas,
cualquiera de las diversas proteínas de envoltura como gp120, gp160
y gp41, antígenos gag como p24gag y p55gag, así como proteínas
obtenidas de la región pol. Análogamente, los epítopos de VHC pueden
obtenerse de cualquiera de las diversas regiones virales, como, sin
limitarse a ellas, las regiones C, E1, E2/NS1, NS2, NS3, NS4 y
NS5.
La Figura 1 muestra antígenos MEFA
representativos para su uso en la presente invención que se obtienen
de VHC. Sin embargo, debe entenderse que otros epítopos obtenidos
del genoma de VHC también encontrarán uso en los presentes ensayos.
Por ejemplo, epítopos adicionales, obtenidos, por ejemplo, de la
región hipervariable de E2, como aminoácidos extendidos a la región
384-410 ó 390-410, pueden incluirse
en el antígeno MEFA. Un epítopo E2 particularmente eficaz es el que
incluye una secuencia de consenso obtenida de esta región, como la
secuencia de consenso
Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn,
que representa una secuencia de consenso para aminoácidos
390-410 de genoma de VHC tipo 1. Un epítopo E2
representativo presente en un antígeno MEFA de la invención puede
comprender aminoácidos extendidos a epítopos híbridos
390-444. Dicho epítopo E2 híbrido puede incluir una
secuencia de consenso que representa aminoácidos
390-410 fusionados con la secuencia nativa de
aminoácidos para los aminoácidos 411-444 de VHC
E2.
Es bien conocido que cualquier organismo dado
varía de un organismo individual a otro, y además que un organismo
dado, como un virus, puede tener una serie de cepas diferentes. Por
ejemplo, existen numerosos aislados de VIH y el virus de hepatitis C
incluye al menos las cepas 1, 2 y 3. Cada una de estas cepas
incluirá determinantes antigénicos equivalentes. Más
específicamente, cada cepa incluirá una serie de determinantes
antigénicos que estarán presentes en todas las cepas del virus pero
será ligeramente diferente de una cepa viral a otra. Por ejemplo, la
hepatitis C incluye el determinante antigénico conocido como
5-1-1 (en la región NS3 región del
genoma viral). Este determinante antigénico en particular aparece en
tres formas diferentes en las tres cepas virales diferentes de
hepatitis C. En consecuencia, en una forma de realización preferida
de la invención aparecen las tres formas de
5-1-1 en el antígeno de fusión de
epítopos múltiples de la invención. Un MEFA de la invención tiene la
fórmula estructural anterior I, en la que y es 3 y así las tres
"B" son determinantes antigénicos equivalentes de
5-1-1 tomados de las tres cepas
virales diferentes de hepatitis C.
El equipo de copias múltiples de la presente
invención puede incluir también copias múltiples que son copias
exactas del mismo epítopo. Por ejemplo, es deseable incluir dos
copias de un epítopo de la región central de hepatitis C. Una forma
de realización preferida particularmente de la presente invención es
el epítopo de copias múltiples según se muestra en la Fig. 3. Este
epítopo de copias múltiples incluye dos copias exactas de un epítopo
de la región central y tres copias de un epítopo de la región
5-1-1, copias que son determinantes
antigénicos equivalentes, con el significado de que son
determinantes antigénicos tomados de las tres cepas virales
diferentes de hepatitis C. En general, los determinantes antigénicos
equivalentes tienen un alto grado de homología en términos de
secuencia de aminoácidos,
Los inmunoensayos altamente selectivos y
sensibles contienen generalmente epítopos mayores inmunodominantes
del patógeno sospechoso de infectar a un paciente. Previamente, los
inmunoensayos hicieron uso de epítopos individuales que unen
anticuerpos anti-VHC en muestras biológicas.
Para el virus VHC, se identificaron epítopos
inmunodominantes mayores a partir de las regiones central, NS3
(no estructural), NS4 y NS5 de la poliproteína viral.
Sallberg y col. ensayaron proteína central de VHC y posibles
proteínas de matrices frente a muestras serológicas humanas que
contenían anticuerpos a VHC y definieron varias regiones
inmunodominantes en las proteínas de VHC (Sallberg, M. y col. (1992)
J. Clin. Microbiol. 30:1984-1994). Se
identificaron dominios de proteínas de poliproteínas de
VHC-1 que incluían dominios C, E1, E2/NS1, NS2, NS3,
NS4 y NS5 y sus límites aproximados fueron proporcionados por Chien
y Rutter (Chien, D.Y. y Rutter, W., WO 93/00365, publicación
internacional de fecha 7 de enero de 1993). Kotwal y col. diseñaron
polipéptidos individuales que tienen secuencias obtenidas de la
región estructural de VHC para obtener un epítopo inmunodominante
útil en las pruebas de sueros de pacientes de VHC (Kotwal, G.J., y
col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:4486-
4489).
4489).
Chien y col. identificaron subtipos
serológicamente definibles como subtipos virales que exhiben
antigenicidad variada (presentado en la Tercera Reunión
Internacional sobre Hepatitis, Tokio, mayo de 1993 y en Chien, D.Y.
y col. (1994) Viral Hepatitis and Liver Disease, pág.
320-324). Se encontraron regiones de
VHC-1 central, NS4 y NS5 que contienen epítopos
específicos del serotipo. Se usaron proteínas centrales posibles
individuales de VHC-1 y VHC-2 como
antígenos individuales para producir anticuerpos para ensayos de
inmunoabsorción ligados a una enzima para detectar infección por VHC
usando subtipos de antígenos centrales distinguibles serológicamente
(Machida, A. y col. (1992) Hepatology
16:886-891). Simmonds y col. investigaron el
efecto de la variabilidad de secuencia entre tipos diferentes de VHC
con respecto a la antigenicidad de la proteína NS4 por cartografía
de epítopos y por ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima
(ELISA). Estos autores cartografiaron dos regiones antigénicas
mayores en la poliproteína NS4 de VHC que fueron reconocidos por
anticuerpo producido por infección natural por VHC. Se detectó
también un anticuerpo específico del tipo para tipos de VHC
particulares (Simmonds, P. y col. (1993) J. Clin. Microbiol.
31:1493-1503). Ching y col. prepararon una
serie de péptidos sintéticos basados en la secuencia de una región
altamente conservada de la proteína de nucleocápside (central)
posible de VHC y se encontró una región inmunodominante que se
reconoció para suero humano y de chimpancé (Ching, W.-M. y col.
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
89:3190-3194).
Los ensayos que implican epítopos únicos como
antígenos de prueba tienen el inconveniente de que es difícil
controlar el recubrimiento de fase sólida de control de la
superficie de soporte por grandes números de epítopos individuales
que contienen péptidos cortos. En dichos casos, en los que el ensayo
implica la deposición de un antígeno inmunogénico sobre un soporte
sólido, la sensibilidad del ensayo está limitada a la cantidad de
antígeno que puede recubrirse en la superficie del soporte
sólido.
Se desvela un ejemplo de un inmunoensayo que
incluye epítopos inmunodominantes de diferentes regiones de un único
subtipo de virus en Chien y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
59:10.011-10.015 (1992)). El ensayo descrito
por Chien utiliza polipéptidos de VHC recombinantes obtenidos de
muchas regiones diferentes de la poliproteína de VHC de tipo 1,
incluyendo los de poliproteína recombinante quimérica, C25, y
comprende componentes inmunodominantes evidentes en las regiones
estructurales y no estructurales. Las poliproteínas producidas se
obtienen por recombinación de polipéptidos virales y se incluyen en
la superficie de un inmunoensayo para capturar anticuerpos, es
decir, detectar la presencia de anticuerpos generados como respuesta
a infección con VHC. Sin embargo, estas poliproteínas contienen
epítopos de una única cepa viral, limitando así la capacidad de
detectar anticuerpos anti-VHC de cepas diferentes
del virus.
Los ejemplos siguientes se presentan para
proporcionar a los expertos corrientes en la materia una
presentación y descripción completa de cómo formar los epítopos de
copias múltiples y los reactivos para su uso en inmunoensayos de la
invención, así como el uso de los mismos, y no pretenden limitar el
ámbito de lo que los autores de la invención consideran su
invención. Se han hecho esfuerzos para garantizar la precisión en lo
relativo a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura,
etc.), pero en la descripción puede haber algún error experimental o
desviación inherente. A no ser que se indique lo contrario, las
partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio
en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es
atmosférica o casi atmosférica.
El ejemplo siguiente ilustra el concepto de
preparación de una casete de epítopos mayores de poliproteína,
particularmente una casete de epítopos múltiples. El ejemplo ilustra
además el acierto de usar epítopos de diferentes cepas de un
patógeno. También se muestra que un antígeno hidrófilo de epítopos
múltiples aumenta la solubilidad de la poliproteína. Se demuestra
que los epítopos mantienen su conformación local nativa para unirse
a anticuerpos, según evidencia la antigenicidad de la
poliproteína.
La poliproteína expresada a partir de la casete
de epítopo múltiples se refiere en la presente memoria descriptiva
como antígeno de fusión de epítopos múltiples (MEFA).
Preferentemente, cuando se repite un epítopo, la
copia o copias adicionales se disponen en tándem en la misma
orientación. Se entiende que la región de una secuencia de
codificación viral usada como epítopo puede variar ligeramente y
sigue manteniendo actividad antigénica, y que la designación de la
numeración de aminoácidos puede variar de una cepa a otra. Así, los
epítopos repetidos pueden variar de una secuencia de aminoácidos a
otra debido a las variaciones y/o a la designación de numeración de
las secuencias de cepas.
Se introdujeron sitios de enzimas de restricción
únicos para conectar los epítopos en el orden prescrito y potenciar
la utilidad de la invención para facilitar modificaciones en el
diseño de un antígeno quimérico. La elección de sitios de enzimas de
restricción y procedimientos de clonación son fáciles de determinar
por un experto corriente en la materia de la tecnología de ADN
recombinante. Preferentemente, las uniones de epítopos (secuencias
de aminoácidos creadas entre epítopos debido a la clonación) no
generan epítopos no específicos. Los epítopos no específicos son,
por ejemplo, secuencias no VHC que no existen en contigüidad con los
epítopos de VHC por naturaleza. Los epítopos no específicos pueden
unirse a anticuerpos en una muestra de prueba causando resultados de
ensayo de falso positivo. Preferentemente, se prueba la proteína de
fusión de epítopos múltiples para encontrar resultados de falsos
positivos debido a dichas secuencias generadas en las uniones de
epítopos.
Para evitar interacciones no específicas con el
MEFA debido a secuencias de unión, la secuencia de ADN que codifica
la unión puede, por ejemplo, sufrir mutación de manera que se
reduzcan las interacciones no específicas con la secuencia de
aminoácidos mutantes, y es posible la clonación de los fragmentos de
epítopos.
La casete de expresión de MEFA-3
de VHC se construyó por clonación de las secuencias de nucleótidos
de codificación que contienen epítopos mayores en una disposición en
tándem según se muestra en la Fig. 1. Se escogió un epítopo mayor
basándose en la frecuencia de reacción de anticuerpos y en la
intensidad de reacción (titulación) con el epítopo (Chein, D.Y. y
col. (1994) Viral Hepatitis and Liver Disease, pág.
320-324). Los diversos segmentos de ADN que
codifican los epítopos de VHC se construyeron por amplificación de
PCR o por oligonucleótidos sintéticos. En cada segmento a
continuación se muestran los codones codificados en cada segmento.
La secuencia de aminoácidos completa de VHC-1 (3.011
aminoácidos) fue determinada por Choo, y col. (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:2451-2455. Los
oligonucleótidos capaces de unirse a VHC se describen en la patente
de EE.UU. nº 5.350.671. La numeración de los aminoácidos en epítopos
de la invención sigue la designación de numeración proporcionada en
Choo y col., más arriba, en la que el aminoácido #1 es la primera
metionina codificada por la secuencia de codificación de la región
central. Por ejemplo, un segmento de epítopo de la región central se
codifica por codones de aminoácidos 10 a 53 de la proteína central
de VHC. Un epítopo de la región c33c se codifica mediante codones de
aminoácidos 1.192 a 1.457.
El constructo de MEFA-3 contiene
en la casete de expresión dos copias de los aminoácidos de epítopos
de segmentos centrales 10-35; una copia del segmento
de epítopo c33c de los aminoácidos 1.192-1.457; tres
copias de determinantes antigénicos equivalentes de la región NS4 de
VHC, específicamente la región
5-1-1, en la que dos de los epítopos
son un segmento (aminoácidos 1.694 a 1.735) de la región
5-1-1 de NS4 de VHC tipo 1, mientras
que una copia es un segmento de la región
5-1-1 de NS4 de VHC tipo 2 (Nomoto)
de los aminoácidos 1.694 a 1.735; dos copias de epítopos mayores de
la región C-terminal (C100) de NS4 de aminoácidos
1.901-1.940; y dos copias de epítopos mayores de
aminoácidos 2.278-2.310 de la región NS5. La casete
de expresión de MEFA-3 tiene la fórmula estructural
general
2-1-2-1-2-2
para A_{x}-B_{y}-C_{z}, en la
que A = central-central-c33c, x = 1
; B = (5-1-1), y = 3; y C =
(c100)-(c100)-(NS5)-(NS5), z = 1.
Otros MEFA de VHC incluyen MEFA-5
y MEFA-6 para los que se construyeron casetes de
expresión por clonación de las secuencias de codificación de
nucleótidos que contienen epítopos mayores en una disposición en
tándem según se muestra en la Fig. 2 y Tabla 1, y en la Fig. 3 y
Tabla 2, respectivamente. Se observa que todos los epítopos en
MEFA-5 y MEFA-6 son de VHC tipo 1
excepto dos de los tres determinantes antigénicos equivalentes del
epítopo 5-1-1. Se ha encontrado que
los epítopos de la región 5-1-1
varían entre serotipos de VHC. Una copia de cada uno de los epítopos
5-1-1 específicos de tipo VHC
presentes en los MEFA descritos en la presente memoria descriptiva
permite la unión de cualquiera de los tipos de VHC que pueden estar
presentes en la muestra biológica de prueba. Es una característica
de la invención que un epítopo útil para distinguir serotipos de un
virus como VHC se proporcione como determinantes antigénicos
equivalentes repetidos para detectar múltiples tipos de un virus o
patógeno en un único ensayo. Los procedimientos para determinación
del serotipo de VHC se encuentran en el documento WO 96/27153.
| mefa aa# | Sitio terminal 5' | Epítopo | VHC aa# | Cepa |
| 1-154 | NcoI | hSOD | ||
| 159-202 | EcoRI | central | 10-53 | 1 |
| 205-246 | SacI | central | 10-53 | 1 |
| 251-268 | PstI | E1 | 303-320 | 1 |
| 271-309 | HindIII | E2 | 405-444 | 1 |
| 310-576 | DraIII | c33c | 1.192-1.457 | 1 |
| 579-625 | SphI | 5-1-1 | 1.689-1.735 | 1 |
| 628-674 | NruI | 5-1-1 | 1.689-1.735 | 3 |
| 677-723 | ClaI | 5-1-1 | 1.689-1.735 | 2 |
| 726-765 | AvaI | c100 | 1.901-1.940 | 1 |
| 768-803 | XbaI | NS5 | 2.278-2.313 | 1 |
| 806-841 | BglII | NS5 | 2.278-2.313 | 1 |
| mefa aa# | Sitio terminal 5' | Epítopo | VHC aa# | Cepa |
| 1-154 | NcoI | hSOD | ||
| 159-176 | EcoRI | E1 | 303-320 | 1 |
| 179-217 | HindIII | E2 | 405-444 | 1 |
| 218-484 | DraIII | c33c | 1.192-1.457 | 1 |
| 487-533 | SphI | 5-1-1 | 1.689-1.735 | 1 |
| 536-582 | NruI | 5-1-1 | 1.689-1.735 | 3 |
| 585-631 | ClaI | 5-1-1 | 1.689-1.735 | 2 |
| 634-673 | AvaI | c100 | 1.901-1.940 | 1 |
| 676-711 | XbaI | NS5 | 2.278-2.313 | 1 |
| 714-749 | BglII | NS5 | 2.278-2.313 | 1 |
| 750-793 | NcoI | central | 10-53 | 1 |
| 796-839 | SacI | central | 10-53 | 1 |
Los procedimientos de clonación para preparación
de MEFA-5 y MEFA-6 fueron similares
a los usados para preparar MEFA-3, más arriba.
MEFA-5 y MEFA-6 contenían epítopos
de las regiones central, de envoltura, NS3, NS4 y NS5 de la
poliproteína de hepatitis C, incluyendo determinantes antigénicos
equivalentes de cepas de VHC 1, 2 y 3. Los diversos segmentos de ADN
que codifican los epítopos de VHC se construyeron por amplificación
PCR o por oligonucleótidos sintéticos. Las Fig. 2 y 3 son
representaciones diagramáticas que muestran la posición de los
epítopos dentro del genoma de VHC usado en MEFA-5 y
-6, así como la construcción del vector de MEFA. Las tablas 1 y 2
describen los segmentos de aminoácidos de cada epítopo, la
configuración lineal de los diversos epítopos y el número de copias
en las casetes de MEFA-5 y MEFA-6,
respectivamente. Los aminoácidos entre cada epítopo (aminoácidos de
unión) se obtienen de los sitios de restricción usados para
clonación. Preferentemente, se prueba un MEFA en un inmunoensayo
para estudiar un resultado de falso positivo debido a los
aminoácidos de unión no patógenos (VHC, por ejemplo).
MEFA-5 difiere de MEFA-6 en la
configuración lineal en que los segmentos centrales están cerca del
N-término en MEFA-5, pero están en
el C-término en MEFA-6. Como el
epítopo central de aminoácidos 10-53 es altamente
antigénico, su colocación en el C-término mejora la
antigenicidad del MEFA, posiblemente por interacción mejorada de
epítopos de proteínas centrales y antígenos de regiones E1 y E2 con
los anticuerpos anti-VHC de la muestra.
Los epítopos se subclonaron en un vector de
expresión de levadura y se verificaron las secuencias antes de
ensamblar todo el antígeno de fusión como un fragmento
EcoRI-SalI de 2.060 pb (para MEFA-5 y
MEFA-6) y como un fragmento EcoRI-SalI
de 1.927 pb aproximadamente (para MEFA-3).
MEFA-5 y MEFA-6 se clonaron como
proteínas de fusión de superóxido-dismutasa humana
(hSOD) (157 aminoácidos de hSOD) bajo la regulación del promotor
ADH_{2}-GAPDH híbrido. Se ligaron las casetes de
expresión de MEFA-5 y MEFA-6 al
vector lanzadera de levadura pAB24 (Chiron Corporation) para
producir pMEFA-5 y pMEFA-6, según se
muestra en las Fig. 2 y Fig, 3, respectivamente.
Según se muestra en la Fig. 3, el antígeno de
MEFA-6 incluye copias múltiples de epítopos de VHC
de las regiones central y NS5; epítopos de serotipos diferentes de
la región NS4 5-1-1; una copia única
de epítopos lineales mayores de las regiones
C-terminales de c100, regiones E1 y E2, así como la
región NS3 (c33c) de VHC. La fórmula estructural general de
MEFA-6 es
hSOD-E1-E2-c33c-5-1-1(tipo
1)-5-1-1(tipo
3)-5-1-1(tipo
2)-c100-NS5(2
copias)-central(2 copias). Este antígeno
tiene un nivel de expresión muy alto en levadura, se purifica en un
alto grado de homogeneidad y exhibe alta sensibilidad y alta
selectividad en los inmunoensayos descritos a continuación.
El ejemplo siguiente de la expresión de un MEFA
en levadura puede aplicarse a la expresión de cualquier MEFA de la
invención. Está dentro del ámbito de la presente invención variar
las condiciones, si fuera necesario, para expresar un constructo de
MEFA en particular. Las células preferidas para la expresión de un
MEFA de la invención incluyen células de bacterias, levadura y e
insecto. Como ejemplo no limitativo de la presente invención se
proporciona la expresión de MEFA-6 en levadura.
Se transformaron cepas de levadura AB122, JSC310
y AD2 (Chiron Corporation) con el plásmido de expresión de MEFA
apropiado (como pMEFA-6) usando un protocolo de
acetato de litio. Se rayaron transformantes Ura^{-} para colonias
únicas y se pinzó en placas de Leu^{-}/glucosa al 8% para aumentar
el número de copias de plásmido. Se prepararon cultivos iniciadores
de Leu^{-} durante 24 horas a 30ºC y después se diluyó a 1:20 en
medio de YEPD (glucosa bactopeptona con extracto de levadura). Se
cultivaron las células durante 48 horas a 30ºC y se recogió. Para
probar la expresión del antígeno recombinante de
MEFA-6, se puso en ebullición una parte alícuota de
las células (0,5 OD equivalente unidad) en tampón de muestra de
electroforesis de gel de SDS (dodecilsulfato de sodio) (por ejemplo,
tampón de Lammli) que contenía DTT 50 mM y se separaron los
componentes de proteínas de la mezcla celular por electroforesis de
gel en un gel de poliacrilamida de Tris-glicina.
MEFA-6 se enriqueció altamente en la fracción de
sedimentos insolubles.
El siguiente procedimiento describe la
purificación de un MEFA específico, MEFA-6. Las
técnicas y condiciones no pretenden limitar la invención, ya que un
experto corriente en la materia puede encontrar necesario ajustar
las condiciones para la purificación de otro MEFA de la invención.
Salvo que se indique lo contrario, la purificación de un MEFA se
realiza a 0ºC aproximadamente.
MEFA-6 se expresó en S.
cerevisiae y se recogieron las células según se describe
anteriormente. Se suspendieron las células en tampón de lisis (Tris
50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pH 8,0) y se lisó en una
Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basilea, Suiza) o
un aparato equivalente usando perlas de vidrio. Se centrifugó el
lisado en condiciones de baja velocidad (3.000 a 5.000 rpm, 15 min)
y se lavó el sedimento que contenía la fracción de proteína
insoluble con concentraciones crecientes de urea (1 M, 2 M, 3 M) en
tampón de lisis. Se solubilizó la proteína del sedimento de
centrifugación con NaOH 0,1 N, urea 4 M en tampón de lisis. Se
eliminaron los desechos celulares por centrifugación de baja
velocidad a entre 3.000 y 5.000 rpm, 15 min. Se ajustó el
sobrenadante a pH 8,0 con HCl 6 N para precipitar proteínas
insolubles en estas condiciones.
Se eliminó el precipitado por centrifugación y se
ajustó el sobrenadante a SDS al 2,3%, DTT 50 mM, pH 8,0 y se mantuvo
en ebullición durante 3 min. Se fraccionaron las proteínas de la
mezcla por filtración de gel en un Pharmacia Sephacryl
S-400 en solución salina con tampón de fosfato que
contenía SDS al 0,1%, EDTA 1 mM y se ajustó a pH 7,4. Se recogieron
las fracciones de eluato en columna que contenían
MEFA-6, se pusieron en reserva y se concentraron en
membrana Amicon YM-30. Se repitió la filtración de
gel en las fracciones en reserva usando la misma columna y las
mismas condiciones.
Para evaluar la antigenicidad de un antígeno
quimérico de la invención, se expusieron los epítopos de
MEFA-3 a anticuerpos monoclonales o policlonales
mantenidos en epítopos individuales específicos. Se diluyeron los
antígenos recombinantes purificados de fusión de epítopos múltiples
(MEFA) a una concentración de recubrimiento óptima en solución
salina con tampón de fosfato (pH 7,4) y se recubrió en placas
Immulon I (Dynatech). Se prepararon anticuerpos monoclonales para
antisueros central, NS3 (c33c), NS4 (c100 y
5-1-1), NS5 y policlonales
anti-E1 y E2 de conejos mediante técnicas estándar
(BIOS-Chile, Maratón 1943, Santiago, Chile) y se
diluyeron 200 veces en diluyente de muestra en la placa y se incubó
durante 1 hora a 37ºC, y se lavó con tampón de lavado de placa (PBS,
Tween-20 al 0,075%, pH 7,2). Se añadió a cada
pocillo de ensayo anticuerpo antirratón de cabra F(ab')_{2}
o anticuerpo específico de cadena pesada y ligera de IgG de
anticonejo de cabra purificado con peroxidasa de rábano picante
(diluido a 1:5.000 para conjugado antirratón; diluido a 1:10.000
para conjugado anticonejo). Se incubaron las placas durante 1 hora a
37ºC y se lavó. Se añadieron dihidrocloruro de
o-fenilendiamina (OPD) y peróxido de hidrógeno para
desarrollo de color de reacción de peroxidasa de rábano picante
(HRPO). Se determinaron las lecturas de densidad óptica usando un
lector de placa a 492/620 nm.
Los resultados indicaron que todos los epítopos
de antígeno del MEFA diseñado fueron detectados fácilmente por los
anticuerpos de VHC específicos para todos los MEFA de la invención.
Por ejemplo, la Tabla 3 proporciona datos sobre la
inmunorreactividad de los epítopos individuales, así como del
antígeno quimérico, MEFA-3, para anticuerpos
monoclonales de epítopos específicos de VHC. Según se muestra en la
Tabla 3, los epítopos central, c33c, c100,
5-1-1 y NS5 de
MEFA-3 fueron inmunorreactivos con anticuerpos
específicos de VHC. La Tabla 4 muestra que los epítopos c33c, c22,
5-1-1, c100, NS5, E1 y E2 de
MEFA-5 y MEFA-6 fueron
inmunorreactivos con anticuerpos específicos de VHC.
| ID# HGV Mab | 3G1-1 | 4D1-1 | 22AFG3 | 20AGF3 | 5A1/F5 | Observaciones |
| Resultados | ||||||
| Especificidad Mab | anti-central | anti-c33c | anti-5-1-1 | anti-c100 | anti-ns-5 | |
| Antígenos de prueba | OD | OD | OD | OD | OD | |
| recombinantes | ||||||
| SOD | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,002 | 0,003 | Sin reacción con SOD |
| (no Recombinantes) | ||||||
| C25 | 2,755(+) | 2,813(+) | 2,726(+) | 0,028(-) | 0,023(-) | Reacciona con epítopos |
| central, c33c y 5-1-1 | ||||||
| c22 (central) | 2,700(+) | 0,043(-) | 0,035(-) | 0,036(-) | 0,038(-) | Reacciona con epítopos |
| centrales | ||||||
| c33c (NS3) | 0,029(-) | 2,646(+) | 0,018(-) | 0,020(-) | 0,014(-) | Reacciona con epítopos |
| de c33c | ||||||
| c100 (NS4) | 0,020(-) | 0,022(-) | 2,907(+) | 3,021(+) | 0,016(-) | Reacciona con epítopos de |
| 5-1-1 y epítopo C-terminal | ||||||
| de c100 | ||||||
| NS5 | 0,012(-) | 0,029(-) | 0,009(-) | 0,009(-) | 2,513(+) | Reacciona con epítopo |
| de NS5 | ||||||
| Antígeno de prueba | 3,236(+) | 3,236(+) | 3,467(+) | 0,713(+) | 0,024(-) | Reacciona con epítopos |
| central, | ||||||
| MEFA-3 | c33c, 5-1-1 y c100 |
| ID de | Especificidad | Antigénico a región de | Exposición a epítopo | Exposición a epítopo |
| anticuerpo | de anticuerpo | secuencia de VHC | de MEFA-6, OD | de MEFA-5, OD |
| Mab 3G1-1 | anti-central (c22c) | (aa# 10-50) | 3,018 (R) | 2,702 (R) |
| Mab 4D1-1 | anti-NS3 (c33c) | epítopo lineal de c33c | 3,119 (R) | 2,952 (R) |
| Mab 6C10/D1 | anti-NS4 (c100) | (aa# 1.901-1.940) | 3,853 (R) | 2,998 (R) |
| Mab 22A5/C12 | anti-NS4 (5-1-1) | (aa# 1.689-1.735) | 3,006 (R) | 3,192 (R) |
| Mab 3E1/F1 | anti-NS5 | (aa# 2.297-2.313) | 2,808 (R) | 2,863 (R) |
| Mab 1E5/F70 | anti-NS5 | (aa# 2.297-2.313) | 2,892 (R) | 2,784 (R) |
| Policlonal R667 | anti-E1 | (aa# 192-380) | 4,375 (R) | 1,908 (R) |
| Policlonal R669 | anti-E2 | (aa# 404-662) | 1,76 (R) | 0,963 (R) |
| Valor de corte | 0,45 OD | 0,45 OD | ||
| R = Reacción | ||||
| NR = No Reacción |
Ensayos de inhibición: Se realizaron
ensayos de inhibición de péptidos para probar si los epítopos
específicos de serotipo en un antígeno de MEFA detectan anticuerpos
específicos de tipo VHC en suero. El ensayo evaluó el grado en el
que un MEFA en solución se uniría a anticuerpos específicos de VHC
en suero, inhibiendo con ello la reacción ELISA posterior en la que
los péptidos específicos de serotipo son las especies antigénicas en
un soporte sólido. La Fig. 4 es un dibujo esquemático de un
procedimiento ELISA estándar en el que la unión al antígeno unido al
soporte sólido se detecta mediante hidrólisis catalizada por
enzima.
Se realizaron los ensayos de inhibición mediante
ELISA de antígenos múltiples. Se prepararon antígenos de VHC
recombinantes según se describe en Chien y col. (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. 89:10.011-10.015. Se
expresaron los antígenos de c22 (119 aminoácidos), E1 (130 aa), NS5
(942 aa) y C25 quimérico (858 aa) como antígenos internos en la
levadura S. cerevisiae como fusiones
C-terminales con
superóxido-dismutasa humana (SOD) usando
procedimientos descritos previamente para la generación del antígeno
c100-3 (363 aa) (Kuo, G. y col. (1989)
Science 244:362-364; y Cousens, L.S. y
col. (1987) Gene 61:265-275). El
antígeno c33c (363 aminoácidos) se expresó como un polipéptido de
fusión SOD interno en E. coli por procedimientos descritos
para la síntesis del antígeno 5-1-1
(Choo, O.-L. y col. (1989) Science
244:359-362). Se purificaron los antígenos de
VHC recombinantes según se ha descrito en Chien, D.Y. y col. ((1989)
Proc. Natl. Acad. Sci.
89:10.011-10.015, más arriba)).
Antes de realizar los ensayos de inhibición, se
determinaron los puntos de ruptura de dilución de la muestra de
pacientes (Tabla 5). Se diluyeron en serie las muestras de pacientes
para reacción con antígenos recombinantes c22, c33c, c100 y
NS-5 inmovilizados por separado en un soporte sólido
(véase, por ejemplo, Van der Poel, C.L. y col., (1991) Lancet
337:317-319). El punto de ruptura de dilución
fue la máxima dilución a la que seguía siendo detectable la unión.
Para detección óptima en ensayos de inhibición posteriores, las
muestras de pacientes se diluyeron por debajo del punto de ruptura
de dilución, según se indica en la Tabla 6.
| ID de muestra de paciente | Antígenos recombinantes de puntos de ruptura de | |||
| de VHC | dilución de muestras | |||
| PAA LL57366 | c22 1:8 | c33c 1:128 | c100 neto | N55 neto |
| PAA LL57454 | 1:32 | 1:128 | 1:8 | neto |
| PAA FF25946 | 1:32 | 1:256 | 1:32 | NR |
| PAA FF25912 | NH | NH | NH | neto |
| NR = no reacción; NH = no hecho |
En general, los ensayos de inhibición se
realizaron por el procedimiento siguiente. Se diluyeron antígenos de
VHC recombinantes y SOD desnaturalizado (control) a una
concentración óptima en solución salina con tampón de fosfato (pH
7,4) y se recubrió en placas Immulon I (Dynatech). Se mezclaron 200
\mul de parte alícuota de suero de ternera fetal (FCS) al 30% o
péptido de MEFA-3 (5 ó 10 \mug por ensayo según se
indique) disueltos en FCS al 30% en la placa con 5 \mul de
especimen de plasma o suero diluido. Se incubaron las muestras
durante 1 hora a 37ºC y se lavó con tampón de lavado de placas. Se
añadió a cada pocillo anticuerpo policlonal de IgG (específico de
cadena ligera y pesada) antihumano de cabra conjugado con ^{125}I
o peroxidasa de rábano picante (HRP). Se incubaron las placas
durante 1 hora a 37ºC y después se lavó. Se añadió dihidrocloruro de
o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno para desarrollo de
color de HRP. Los resultados se leyeron usando un lector de placa a
492 nm/620 nm (ELISA). Los valores OD de corte de ELISA para
antígenos de regiones SOD, C25, c22, E1, E2, c33c y
NS-5 fueron 0,40 más la OD media de tres sueros de
control negativos incluidos en cada ensayo. Si el antígeno de SOD de
control fue reactivo, entonces esa muestra se consideró no reactiva
o indeterminada. El porcentaje de inhibición de unión se calculó
mediante la fórmula siguiente: 100 x (A492 nm para muestra de
pacientes sin antígeno MEFA añadido) - (A492 nm para muestra de
pacientes con antígeno MEFA añadido)/(A492 nm para muestra de
pacientes sin antígeno MEFA añadido). El porcentaje de inhibición de
unión a péptidos específicos del tipo causado por
MEFA-3 añadido indica la capacidad de los epítopos
de MEFA-3 de unirse a anticuerpos
anti-VHC de las muestras de pacientes (véase Tabla
6).
| Muestra de pacientes | ||||
| ID | Dilución | Control OD | MEFA-3 añadido OD | % Inhibición |
| Antígeno c22 | ||||
| LL57366 | 1:4 | 1,614 | 0,163 | 90% |
| LL57454 | 1:16 | 1,370 | 0,212 | 84,5% |
| FF25946 | 1:16 | 2,013 | 0,205 | 90% |
| Antígeno c33c | ||||
| LL57366 | 1:64 | 2,525 | 0,07 | 99% |
| LL57454 | 1:64 | 1,839 | 0,075 | 96% |
| FF25946 | 1:128 | 0,842 | 0,061 | 93% |
| Antígeno c100 | ||||
| LL57454 | 1:4 | 1,666 | 0,484 | 71% |
| FF25946 | 1:16 | 2,364 | 0,092 | 96% |
| Antígeno NS-5 | ||||
| LL57454 | Neto | 2,319 | 1,820 | 20% |
| FF25912 | Neto | 1,490 | 0,873 | 41% |
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de MEFA-3 de
interaccionar con anticuerpos anti-VHC de tipo 1 y
anti-VHC de tipo 2 se demostró por estudios de
inhibición que usaban un protocolo ELISA para MEFA. Se inmovilizaron
péptidos sintéticos de regiones
5-1-1 de VHC de tipo 1a, 1b, 2a y 2b
en soportes sólidos separados. Se determinó la capacidad de los
péptidos sintéticos de la región
5-1-1 para unir los anticuerpos
específicos del tipo por competencia con MEFA-3
añadido. Los resultados de la Tabla 7 muestran que
MEFA-3 inhibe la unión de VHC 1a, 1b, 2a y 2b a
epítopos específicos individuales del tipo (aminoácidos
1.689-1.718 de la región
5-1-1). La capacidad de un MEFA para
unir anticuerpos a dos cepas diferentes de VHC fue la misma para
MEFA-3, MEFA-5 y
MEFA-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una comparación entre la sensibilidad
de dilución entre ELISA de MEFA (MEFA3) y ELISA de C25. La
poliproteína de VHC C-25
(c33c-c100-3-c22) y
los procedimientos de ensayo fueron según se describe en Chien, D.Y.
y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:10.011-10.015, más arriba) usando un tampón de
recubrimiento de solución salina con tampón de fosfato (PBS) 1 x, pH
7,0-7,2. Se recubrieron antígenos en la superficie
de pocillos de microlitro de placa Immulon I a 100 ng de antígeno
por pocillo más 5 \mug/ml de BSA. El tamaño de muestra fue de 5
\mul por ensayo. Se diluyó el anticuerpo de IgG antihumana de
cabra (específico de cadena pesada y ligera) conjugado con
peroxidasa de rábano picante a 1:60.000 para el ensayo de
MEFA-3, y a 1:40.000 para el ensayo de C25. Los
resultados de la Tabla 8 muestran que son detectables anticuerpos de
suero usando ELISA de MEFA-3 en diluciones en las
que ELISA de C25 no mostró reacción. Se compararon las
sensibilidades de CLIA de MEFA-3, -5, y -6 entre sí
y con ELISA de C25. Los resultados de la Tabla 9 muestran que CLIA
de MEFA-5 y MEFA-6 proporcionaba una
sensibilidad superior a CLIA de MEFA-3, mientras que
CLIA de MEFA-3 era más sensible que ELISA
de C25.
de C25.
| ELISA de MEFA-3 | ELISA de C-25 | ||
| Placa Immulon I | Placa Immulon I | ||
| ID panel de muestra | 100 ng/pocillo + 5 \mug/ml BSA | 100 ng/pocillo + 5 \mug/ml BSA | |
| Conjugado: 1:60.000 | Conjugado: 1:40.000 | ||
| Tamaño de muestra: | Tamaño de muestra: | ||
| 5 \mul/ensayo | 5 \mul/ensayo | ||
| OD | OD | ||
| Muestra | Dilución | ||
| LL57454 | |||
| 1:512 | 0,983 | 0,734 | |
| 1:1.024 | 0,652 | NR | |
| 1:2.048 | 0,463 | NR | |
| LL57366 | |||
| 1:512 | 0,609 | 0,425(+/-) | |
| 1:1.024 | 0,522(+/-) | NR | |
| 1:2.048 | 0,203 | NR | |
| FF25946 | |||
| 1:100 | 1,818 | 1,736 | |
| 1:1000 | 0,763 | 0,525 | |
| 1:2000 | 0,718 | NR | |
| 1:4000 | 0,455 | NR | |
| Fecha de sangrado panel C de seroconversión | |||
| C7 (29/8/88) día 1 | 0,562 | NR | |
| C8 (01/9/88) día 4 | 1,035 | 0,667 | |
| C9 (28/9/88) día 32 | 2,762 | 2,145 | |
| Hombres de muestra negativa OD | 0,124 | 0,086 | |
| Corte OD | 0,55 | 0,45 | |
| (+/-) = OD cerca de valor de corte | |||
| NR = No reactivo | |||
| ELISA de C-25 es equivalente a ELISA de VCH 2G (Segunda Generación) |
| Panel de sensibilidad | |||||
| Muestra de pacientes | CLIA MEFA-3 | CLIA MEFA-5 | CLIA MEFA-6 | ELISA c25 | |
| S/C.O. | S/C.O. | S/C.O. | S/C.O. | ||
| FF25946 | 1:16 | 1,71 | 2,72 | 2,67 | 1,32 |
| 1:32 | 1,64 | 2,59 | 2,48 | 1,35 | |
| 1:64 | 1,50 | 1,89 | 2,11 | 1,20 | |
| 1:128 | 1,34 | 1,92 | 1,68 | 0,92 | |
| 1:256 | 1,11 | 1,48 | 1,68 | 0,91 | |
| 1:512 | 0,84 | 1,14 | 1,28 | 0,69 | |
| 1:1.024 | 0,58 | 0,82 | 1,11 | 0,63 | |
| LL57385 | 1:16 | 1,73 | 2,74 | 2,68 | 1,49 |
| 1:32 | 1,56 | 2,41 | 2,18 | 1,04 | |
| 1:64 | 1,20 | 1,76 | 1,79 | 1,00 | |
| 1:128 | 0,87 | 1,10 | 1,03 | 0,61 | |
| 1:256 | 0,76 | 0,93 | 0,90 | 0,57 | |
| 1:512 | 0,51 | 0,68 | 0,64 | 0,48 | |
| 1:1.024 | 0,38 | 0,47 | 0,45 | 0,39 | |
| 1:2.048 | 0,23 | 0,33 | 0,29 | 0,20 | |
| FF25879 | 1:16 | 1,70 | 2:79 | 2,54 | 1,46 |
| 1:32 | 1,66 | 2,73 | 2,38 | 1,03 | |
| 1:64 | 1,30 | 1,82 | 1,88 | 0,86 | |
| 1:128 | 1,21 | 1,35 | 1,17 | 0,73 | |
| 1:256 | 0,96 | 1,20 | 1,14 | 0,66 | |
| 1:512 | 0,60 | 0,88 | 0,73 | 0,52 | |
| 1:1.024 | 0,48 | 0,76 | 0,36 | 0,50 | |
| 1:2.048 | 0,42 | 0,65 | 0,44 | 0,40 | |
| L157366 | 1:16 | 1,67 | 2,71 | 2,59 | 1,59 |
| 1:32 | 1:32 | 2,30 | 1,92 | 1,15 | |
| 1:64 | 1,11 | 1,65 | 1,57 | 0,96 | |
| 1:128 | 1,19 | 1,35 | 1,09 | 0,77 |
| Panel de sensibilidad | |||||
| Muestra de pacientes | CLIA MEFA-3 | CLIA MEFA-5 | CLIA MEFA-6 | ELISA c25 | |
| S/C.O. | S/C.O. | S/C.O. | S/C.O. | ||
| L157366 | 1:256 | 0,84 | 1,02 | 1,11 | 0,63 |
| 1:512 | 0,55 | 0,83 | 0,88 | 0,50 | |
| 1:1.024 | 0,55 | 0,60 | 0,54 | 0,47 | |
| 1:2.048 | 0,38 | 0,49 | 0,58 | 0,37 | |
| LL57454 | 1:16 | 1,87 | 3,10 | 2,59 | 1,80 |
| 1:32 | 1,57 | 2,82 | 2,16 | 1,33 | |
| 1:64 | 1,30 | 2,17 | 1,38 | 1,14 | |
| 1:128 | 1,11 | 1,66 | 1,38 | 0,79 | |
| 1:256 | 0,63 | 1,07 | 1,04 | 0,60 | |
| 1:512 | 0,51 | 0,76 | 0,74 | 0,43 | |
| 1:1.024 | 0,41 | 0,52 | 0,54 | 0,34 | |
| 1:2.048 | 0,22 | 0,45 | 0,56 | 0,30 | |
| S/CO = sensibilidad (OD)/corte (OD) |
Un ensayo de sensibilidad de seroconversión mide
la sensibilidad del procedimiento para detectar anticuerpos
específicos de patógenos según aumenta la valoración como respuesta
a la infección. En la Tabla 8 se proporciona la sensibilidad de
ELISA de MEFA-3 comparada con ELISA de C25 para
muestras de sangre de un único paciente infectado por VHC con el
tiempo. En MEFA-3 se detectaron anticuerpos con
mayor sensibilidad en un tiempo postinfección anterior que en ELISA
de C25.
Se usó antígeno recombinante de
MEFA-6 para diseñar un inmunoensayo de
inmunodeficiencia manual (CLIA), así como un CLIA automatizado en el
sistema ACS-NG de Ciba Corning (modelo F).
Se desarrolló un CLIA, designado como CLIA de VHC
r-Ag-DMAE (inmunoensayo de
quimioluminiscencia de antígeno recombinante de VHC-éster de
dimetilacridinio) (Fig. 5). Se marcó un antígeno de polipéptido o
péptido sintético con DMAE por reacción de cadenas laterales de
aminoácidos (por ejemplo, cadena de lisina o cisteína tiol) con una
fracción reactiva unida covalentemente (véase documento WO 95/27702,
publicado el 19 de octubre de 1995, Ciba Corning Diagnostics Corp.).
Los MEFA de VHC descritos en la presente memoria descriptiva se
marcaron por reacción con los grupos amino de las cadenas laterales
de lisina con NSP-DMAE-NHS
(10-(3'-sulfopropil)-acridinio-9-carboxilato)
de
2',6'-dimetil-4'-(N-succinimidiloxicarbonil)fenilo)
obtenido de Ciba Corning. Los tioles de cadenas laterales de
aminoácidos pueden marcarse usando
DMAE-ED-MCC o
NSP-DMAE-PEG-BrAc
(Ciba Corning). Los procedimientos de marcado fueron generalmente
según se describe en el documento WO 95/27702 (más arriba) con
variaciones en las condiciones según era necesario para que cada
antígeno proporcionara detección y antigenicidad óptimas. Se
entiende que otros marcadores detectables son útiles en la
invención, como compuestos fluorescentes, compuestos de rodamina,
anticuerpos, antígenos, enzimas y similares. El marcado con
cualquier marcador se realiza en condiciones para obtener detección
y antigenicidad óptimas del MEFA o de otro epítopo.
Cuando DMAE es el marcador detectable en un
ensayo, el conjugado de VHC
r-Ag-DMAE resultante es el trazador,
con DMAE detectable por fotoemisión cuando se hace reaccionar con
NaOH/H_{2}O_{2}. Cuando en el ensayo se usó un MEFA particular,
como MEFA-6, se diseñó el CLIA
MEFA-6-DMAE.
Ensayo manual. Se describe primero un
protocolo CLIA manual de VHC
r-Ag-DMAE para los estudios
desvelados en la presente memoria descriptiva. Se usó un Sistema
Magic Lite Analyzer II (MLA II) para el ensayo manual. Se
proporcionan como orientación parámetros como el volumen, la
concentración, el tiempo y la temperatura. La variación de estos
parámetros para obtener detección de anticuerpos está dentro del
ámbito de la invención. A los tubos correspondientes se añadieron
partes alícuotas de 2 a 10 \mul. La muestra de prueba fue
preferentemente un líquido biológico (por ejemplo, plasma o suero)
que contenía anticuerpos anti-VHC. A cada tubo se
añadieron 50 \mul de agua seguido de 100 \mul de antígenos
recombinantes bitinilados, péptidos sintéticos o directamente DMAE
conjugados a los polipéptidos
(MEFA-6-DMAE,
c33c-DMAE, c200-DMAE y
c22-DMAE, por ejemplo). Se diluyeron los antígenos
en diluyente de reactivo de ligando (RL) a concentraciones de
aproximadamente entre 0,1 \mug/ensayo y 1 \mug/ensayo.
Preferentemente, se añadió una cantidad de reactivo de ligando a
cada muestra de forma que estaban presentes aproximadamente 25 x
10^{6} equivalentes de unidades luminosas (unidades luminosas
relativas, ULR) por ensayo. Esta cantidad aproximada de equivalentes
de unidades luminosas se prefirió para la adición de un solo
ligando, o múltiples ligandos. El diluyente RL contenía tampón Tris,
pH 8,0, NaCl 150 mM, BSA al 1,0%, Tween-20 al 0,1%,
NaN_{3} al 0,09%, EDTA 1 mM. Se añadieron partes alícuotas de 100
a 150 \mul de PMP (partículas paramagnéticas) unidas a IgG Fc
antihumana a cada tubo para una concentración final de
aproximadamente 60 \mug/ensayo. Preferentemente, las partículas
paramagnéticas fueron de menos de aproximadamente 10 \mum de
diámetro. Se diluyeron las partículas
anti-IgGFc-PMP en un diluyente que
contenía tampón Tris, pH 8,0, NaCl 150 mM, BSA al 2,75%, caseína al
0,1%, Tween-20 al 0,1%, extracto de levadura al
0,1%, extracto de E. coli al 0,25%, SOD al 0,005%, NaN_{3}
al 0,09%, EDTA 1 mM. Para asegurar un mezclado completo, se agitaron
los tubos en una mezcladora Vortex 6 veces a entre 5 y 10 segundos
cada vez. Se incubaron los tubos de muestra a 37ºC durante 18
minutos. Se colocaron los tubos de muestra en un imán durante 3
minutos, para que hubiera tiempo suficiente de que se sedimentaran
las partículas PMP. Se decantaron las muestras usando un imán para
retener las partículas PMP. Se lavaron dos veces las partículas PMP
con agitación en remolino en 1 ml de PBS. La solución de lavado fue
PBS, Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} al 0,09%, EDTA 1
mM. Las etapas de mezclado, incubación, sedimentación y decantación
pueden repetirse al menos una vez. A cada tubo se añadieron 100
\mul de agua para volver a suspender las partículas PMP. Se
colocaron entonces los tubos en un instrumento de
MLA-II y se midió la fotoemisión durante 2
segundos.
El procedimiento CLIA manual de
MEFA-6-DMAE proporcionó sensibilidad
de detección mejorada con respecto a ELISA de
MEFA-6. Después del estudio de ocho paneles de
sensibilidad de dilución, se encontró que CLIA de
MEFA-6-DMAE mostró una mejor
sensibilidad de dilución que ELISA en seis de los ocho paneles.
Es importante que el procedimiento CLIA de
MEFA-6-DMAE detectó la presencia de
anticuerpos de VHC en todas las muestras de pacientes infectados
crónicamente por VHC sometidos a prueba. Por ejemplo, de 29
individuos infectados por hepatitis C crónica, 26 mostraron positivo
usando ELISA de C25, mientras que los 29 mostraron positivo usando
el CLIA de MEFA-6-DMAE de la
invención. Además, no se encontraron resultados de falsos positivos
durante la prueba de 200 muestras aleatorias por CLIA de
MEFA-6-DMAE. Otras ventajas del
procedimiento CLIA son la precisión inter-ensayo e
intra-ensayos con covarianzas inferiores al 10%.
Además, el CLIA tuvo un ámbito de respuesta más amplio y mejoró la
linealidad con respecto a ELISA.
Ensayo automatizado. Se usó también un
ensayo automatizado de MEFA-DMAE que tenía el
siguiente protocolo. Se usó un analizador automatizado de modelo F
para el ensayo. Se añadió a cada tubo de muestra una muestra de 10
\mul (por ejemplo, un líquido biológico que contenía anticuerpos
anti-VHC humanos). El muestreador automatizado
dispensó entonces automáticamente en cada tubo de muestra lo
siguiente: 100 \mul de conjugado de VHC
r-Ag-DMAE (que tenía un total de
aproximadamente 25 x 10^{6} equivalentes de unidad luminosa por
prueba) más 150 \mul IgG Fc antihumana unida a partículas
paramagnéticas (60 \mug de IgG Fc por ensayo) más un soporte de 40
\mul de agua. El diluyente de ligando y el diluyente de
IgG-PMP fueron según se ha descrito anteriormente
para el ensayo manual. No requirió mezclado por remolino. Las
muestras se calentaron a 37ºC durante 18 min en un bloque de
calentamiento. Las partículas PMP de IgG Fc antihumana que se
unieron a anticuerpos VHC presentes en la muestra de suero se
lavaron tres veces con resuspensión en un tampón de lavado de PBS
que contenía Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} al 0,09%,
EDTA 1 mM. Se usó un imán para retener las partículas PMP mientras
se aspiraban los sobrenadantes de la muestra. Se resuspendieron las
partículas en 500 \mul de tampón de lavado. Usando el
procedimiento automatizado, no fue necesario repetir las etapas de
mezclado, incubación, sedimentación y decantación, haciendo así el
ensayo de CLIA de VHC r-Ag-DMAE
eficiente (20 minutos frente a 40 minutos), sensible y preciso en
relación con los ensayos comerciales existentes.
El CLIA de
MEFA-6-DMAE y el CLIA de
MEFA-6-DMAE +
c33c-DMAE tuvieron sensibilidades y especificidades
mejores o equivalentes cuando se compararon con las pruebas ELISA de
multiantígeno VHC 2.0G (Chiron Corp., Emeryville, CA), que contienen
los péptidos recombinantes separados c100-3,
c22-3 y c200 (c33c unido a c100-3)
(véase Fig. 7). Además, el procedimiento de ensayo de la invención
es fácil de realizar porque es un ensayo simultáneo de un solo paso
en un único instrumento que usa un antígeno de captura recombinante
conveniente. Según otras formas de realización de la invención, el
epítopo adicional puede ser un epítopo diferente del MEFA, como, por
ejemplo, epítopos conformacionales CHO E1 o CHO E2 (epítopos de VHC
E1 o E2 expresados a partir de células de ovario de hámster chino) y
marcados con un marcador detectable según se describe para el
epítopo adicional c33c en el ejemplo anterior. Dichos epítopos
conformacionales de VHC y los inmunoensayos implicados con ellos se
describen en los documentos WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053,
WO 92/08734, más arriba.
La sensibilidad de seroconversión de antígeno
quimérico MEFA-6 se determinó también por CLIA (DMAE
como marcador detectable) y se comparó con procedimientos ELISA
comerciales. Además de usar el
MEFA-6-DMAE en solitario como
antígeno, se sometió a prueba de sensibilidad de seroconversión una
mezcla de MEFA-6-DMAE +
c33c-DMAE como otra forma de realización de la
invención. Se obtuvieron muestras de sangre de un paciente infectado
crónicamente por VHC con el tiempo, se ensayó mediante CLIA usando
el procedimiento descrito anteriormente y se comparó con el
rendimiento de EIA Ortho 3.0 (ELISA) (Tabla 10, únicamente) y ELISA
Abbott 2.0 (véase Fig. 8 y Tabla 10). Se comunicó la sensibilidad
como la densidad óptica de la muestra de ensayo dividida por el
corte de detección del ensayo en unidades de densidad óptica
(S/CO).
También se realizó la detección de anticuerpo de
VHC en estas muestras mediante ensayo de inmunotransferencia de
banda comercial (RIBA© 3.0 Chiron Corporation), ensayo que se usó
clínicamente como prueba de confirmación de detección de anticuerpo
de VHC. Según el procedimiento de RIBA©, se separaron antígenos
recombinantes de VHC por electroforesis de gel y se puso en contacto
con suero del paciente. Se realizó la reactividad con los antígenos
separados mediante ensayo de inmunotransferencia usando anticuerpos
marcados secundarios (Eheling, F. y col. (1991) Lancet
337:912-913).
Los resultados de la comparación en la Fig. 8 y
la Tabla 10 indican que el ensayo de
MEFA-6-DMAE +
c33c-DMAE pudo detectar anticuerpos de VHC con mayor
sensibilidad en una fecha de sangrado más temprana. Los ensayos de
MEFA-6-DMAE y
MEFA-6-DMAE +
c33c-DMAE fueron más sensibles en momentos de
sangrado más tempranos que los ensayos comerciales o el ensayo de
RIBA® de confirmación.
Se comparó el procedimiento CLIA de MEFA de la
invención con procedimientos ELISA de fuentes comerciales para
confirmar que la fiabilidad de CLIA de MEFA detecta muestras
positivas verdaderas y negativas verdaderas. Los resultados de la
Fig. 9 muestran que la detección de anticuerpos de VHC que usa
procedimientos CLIA de MEFA de la invención está correlacionada
consistentemente con la detección de anticuerpos de ELISA de VHC de
Segunda Generación que se usa comercialmente (Abbott Laboratories).
En los casos en que se sometió a ensayo una muestra como positivo
para anticuerpos de VHC por el ensayo comercial y negativo por el
CLIA de MEFA, la muestra se encontró negativa (no reactiva) mediante
la prueba de RIBA© de confirmación, lo que apoya más la precisión
del CLIA de MEFA de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| Día de sangrado | CLIA MEFA-6 | CLIA MEFA-6 + | ELISA Ortho | ELISA Abbott | RIBA© 3.0 |
| del paciente | c33c | 3.0 | 2.0 | ||
| 1 | 0,63 | 0,93 | 0,02 | 0,2 | O (No reactivo) |
| 2 | 0,63 | 0,94 | 0,02 | 0,2 | O (No reactivo) |
| 7 | 0,63 | 1,17 | 1,45 | 0,4 | I (Intermedio) |
| 9 | 0,74 | 1,27 | 2,74 | 0,8 | I (Intermedio) |
| 14 | 1,99 | 3,54 | 4,11 | 3,9 | I (Intermedio) |
| 16 | 3,64 | 6,38 | 4,11 | 5 | I (Intermedio) |
| 20 | 6,84 | 10,9 | 4,11 | 5,3 | 4 (Reactivo) |
| ID de panel de seroconversión: Boston Biomedical, Inc. Panel de seroconversión anti-VHC (PHV902) |
\vskip1.000000\baselineskip
La precisión de la detección de anticuerpos de
VHC se demostró aún más usando CLIA de
MEFA-6-DMAE (véase Fig. 10). Se
sometieron a prueba doscientas muestras negativas aleatorias de
centros de donación de sangre y 42 muestras conocidas positivas de
VHC usando el protocolo CLIA de MEFA-DMAE descrito
anteriormente. Como indica la Fig. 10, no se encontraron falsos
positivos cuando se probaron las muestras negativas y no se
obtuvieron resultados negativos cuando se probaron las muestras
positivas conocidas.
\newpage
Se desarrolló un inmunoensayo de
quimioluminiscencia (CLIA) en el que se unió MEFA a biotina como
marcador detectable y se unió indirectamente a DMAE a través de un
enlace biotina-estrepavidina-DMAE.
Según este procedimiento, las partículas PMP de IgG Fc antihumanas
según se han descrito anteriormente se pusieron en contacto con
líquido biológico que contenía anticuerpos de VHC antihumanos. Los
anticuerpos humanos se unieron a las partículas PMP de IgG Fc
antihumanas y la MEFA-biotina a los anticuerpos
anti-VHC humanos. Después de unió el conjugado
estrepavidina-DMAE al MEFA-biotina.
Se añadieron aproximadamente 25 x 10^{6} equivalentes de unidad
luminosa de la estrepavidina-DMAE a cada muestra de
prueba. Se lavó el material no ligado de la muestra y se midió la
luz emitida por la reacción del DMAE unido a partículas PMP con
NaOH/H_{2}O_{2} durante 2 segundos.
Este procedimiento CLIA de MEFA difiere del CLIA
de MEFA-DMAE también descrito en la presente memoria
descriptiva en que el último tiene la molécula trazadora de DMAE
unida directamente al MEFA, mientras que CLIA de MEFA biotinilado
implica un enlace adicional biotina/estrepavidina para unir la
molécula trazadora de DMAE al complejo
anti-VHC/MEFA. En la Fig. 6 se proporciona una
representación esquemática del procedimiento de ensayo.
El CLIA en el que se une un MEFA a biotina puede
automatizarse según se describe para el CLIA de
MEFA-DMAE descrito anteriormente. En estas
circunstancias, la estrepavidina-DMAE se añadiría a
la muestra para unión y detección. A la mezcla de prueba se añaden
preferentemente aproximadamente 25 x 10^{6} equivalentes de unidad
luminosa del conjugado estrepavidina-DMAE.
En la presente memoria descriptiva se ha mostrado
y descrito la presente invención, que se consideró que es la más
práctica, y las formas de realización preferidas.
Claims (10)
1. Una secuencia de epítopos de copias múltiples
para uso en un inmunoensayo, teniendo dicha secuencia de epítopos de
copias múltiples la fórmula estructural general (I):
(I)(A)_{x}-(B)_{y}-(C)_{z}
en la que (I) es una secuencia
lineal de
aminoácidos;
A, B y C son epítopos de un virus;
B es una secuencia de aminoácidos que contiene al
menos cinco y no más de 1.000 aminoácidos, correspondiendo dichos
aminoácidos a un determinante antigénico de ocurrencia natural de un
virus, y al menos un B es un determinante antigénico equivalente de
una cepa diferente de dicho virus;
A y C son cada uno secuencias de aminoácidos
diferentes de B y del otro y son cada uno independientemente una
secuencia de aminoácidos que contiene al menos cinco y no más de
1.000 aminoácidos, representando los aminoácidos un determinante
antigénico o un conglomerado de determinantes antigénicos que es/son
no adyacentes a B por naturaleza;
y es un número entero de 2 o más; y
x y z son cada uno independientemente números
enteros en los que x + z es 1 o más.
2. El epítopo de copias múltiples de la
reivindicación 1, en el que A, B y C son epítopos inmunodominantes
de virus de la hepatitis C.
3. El epítopo de copias múltiples según la
reivindicación 2, en el que A, B y C son epítopos de regiones de la
poliproteína de VHC, en los que dichas regiones se seleccionan del
grupo constituido por NS3, NS4, NS5, c100, C25, central, E1, E2,
c33c, c100-3 y c22.
4. Un procedimiento para producir un
inmunoensayo, que comprende:
identificación de secuencias de nucleótidos que
codifican una pluralidad de epítopos diferentes de un virus;
colocación de las secuencias de nucleótidos en
una casete de expresión en la que al menos dos secuencias que
codifican un determinante antigénico dado de un epítopo de un virus
están colocadas en la casete, y al menos una de dichas secuencias es
un determinante antigénico equivalente de una cepa diferente de
dicho virus;
transformación de un huésped adecuado con la
casete para expresar secuencias que codifican epítopos como
polipéptidos de epítopos múltiples según la fórmula (I) de la
reivindicación 1;
purificación del polipéptido de epítopos
múltiples expresado;
y
modificación del polipéptido de epítopos
múltiples para el inmunoensayo.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el
que los epítopos son epítopos de un virus seleccionado del grupo
constituido por VIH y VHC.
6. Un dispositivo de ensayo, que comprende:
una superficie de soporte; y
epítopos unidos a la superficie de soporte, en
los que los epítopos tienen la fórmula estructural general (I):
(I)(A)_{x}-(B)_{y}-(C)_{z}
en la que (I) es una secuencia
lineal de
aminoácidos;
A, B y C son epítopos de un virus;
B es una secuencia de aminoácidos que contiene al
menos cinco y no más de 1.000 aminoácidos, correspondiendo dichos
aminoácidos a un determinante antigénico de ocurrencia natural de un
virus, y al menos un B es un determinante antigénico equivalente de
una cepa diferente de dicho virus;
A y C son cada uno una secuencia de aminoácidos
diferente de B y del otro y son cada uno independientemente una
secuencia de aminoácidos que contiene al menos cinco y no más de
1.000 aminoácidos, representando dichos aminoácidos un determinante
antigénico o un conglomerado de determinantes antigénicos que es/son
no adyacentes a B por naturaleza;
y es un número entero de 2 o más; y
x y z son cada uno independientemente número
enteros en los que x + z es 1 o más.
7. El dispositivo de ensayo de la reivindicación
6, en el que A, B y C son epítopos del virus de la hepatitis C.
8. El dispositivo de ensayo de la reivindicación
6, en el que A, B y C son epítopos de regiones de la poliproteína de
VHC, en el que dichas regiones se seleccionan del grupo constituido
por NS3, NS4, NS5, c100, C25, central, E1, E2, c33c,
c100-3 y c22.
9. Una composición de ensayo que comprende un
epítopo de copias múltiples de la reivindicación 1 en el que el
epítopo de copias múltiples está unido a un marcador detectable.
10. Un inmunoensayo de una sola etapa que
comprende:
incubación de una muestra con un epítopo de
copias múltiples de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
y
detección de la presencia de un complejo de
antígeno/anticuerpo mediante la unión de un marcador detectable a un
miembro de dicho complejo.
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