ITMI991451A1 - Unh sistema diagnostico per il rilevamento di anticorpi specifici anti-hgv con l'uso complementare di due peptidi sintetici del virus dell'e - Google Patents

Description

Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Un sistema diagnostico per il rilevamento di anticorpi specifici anti-HGV con l’uso complementare di due peptidi sintetici del virus dell'epatite G

CAMPO DI APPLICAZIONE

Formano oggetto del presente trovato un sistema diagnostico per il rilevamento di anticorpi specifici anti-HGV in siero e/o plasma umano ad usi diagnostico generale a scopi di ricerca scientifica e applicativa-clinica e/o epidemiologica delle fasi dell’infezione causata dal virus dell’epatite G ed in particolare nello screening di sieri di donatori di sangue.

GLOSSARIO ELISA: enzyme linked immunoadsorbent assay (saggio immunoenzimatico)

HGV: virus dell’epatite G

Anti-HGV ELISA doppio: metodo immunodiagnostico oggetto della presente invenzione

RP-HPLC: reverse-phase high-performance chromatography (cromatografia liquida ad alta pressione con colonna a fase inversa) PCR: polymerase Chain Reaction

IgG: immunoglobuline di tipo G

STATO DELLA TECNICA

Recenti ricerche hanno portato all’identificazione ed alla clonazione di un nuovo virus associato all’epatite umana e denominato virus dell’epatite G (HGV) (Simans J.N. et al. Nat. Med. 1995, 1, 564-569; Linnen J.J. et al. Science, 1996, 271, 505-508).

La presenza del virus in donatori di sangue stimata con ricerche preliminari è compresa tra Γ1 ed il 2% della popolazione generale; maggiori livelli di infezione sono stati riscontrati in gruppi ad alto rischio. In più del 50% dei casi il virus può persistere nell’ospite per un lungo periodo di tempo senza dare alcun sintomo patologico evidente. E’ stato anche osservato che molte infezioni da HGV possono regredire spontaneamente con lo sviluppo di una immunità protettiva. Anche questi anticorpi anti-HGV sono in grado di persistere per anni dopo l'eliminazione del virus e quindi la loro presenza nel siero può essere considerata come un marcatore del recupero dall’infezione. Solo in alcuni casi e per periodi di tempo molto limitati il virus e gli anticorpi possono essere simultaneamente presenti e determinabili attraverso dosaggi immunoenzimatici per gli anticorpi e di amplificazione genica con la polymerase Chain reaction (PCR) del RNA genomico del virus stesso.

La via di trasmissione accertata è quella ematica (Linnen J.J. et al. Science, 1996, 271, 505-508), ed altrettanto certa è la trasmissibilità verticale del virus (Feueht H.H. et al. Lancet, 1996, 374, 615-616). La sua associazione con altri virus dell’epatite, ed in particolare il virus dell’epatite B (HBV) e C (HCV), ed il suo rilevamento in popolazioni a rischio (Kao J.H. et al. J. Med. Virai. ,1997, 52, 381-384; Stark K.U. et al. J. Infect. Dis., 1996. 174, 1320-1323) non escludono che siano molto probabili anche vie di trasmissione simili a quelle degli altri virus dell’epatite, come d’altra parte sembra confermare l’alta prevalenza deH'HGV nella popolazione generale.

La sua relativa asintomaticità e l'alta prevalenza già ricordata sono quindi elementi molto importanti da tenere in considerazione per una corretta valutazione del rischio patogenetico associato a questa infezione, in relazione anche al fatto che il ruolo patogenico di questo virus ed il suo epatotropismo sono ancora oggetto di studio. Non si può escludere infatti a priori che la sua infezione possa indurre esiti patologici del tutto simili a quelli di altri virus dell'epatite o anche altre sue proprie ad oggi non note. Tutto ciò rende perciò necessario un attento monitoraggio del rischio infettivo associato alia accertata via di trasmissione per via ematica e quindi in via cautelativa il monitoraggio per lo meno dei possibili portatori di questa infezione tra i donatori di sangue.

Attualmente è commercialmente disponibile un dosaggio di tipo ELISA atto rilevare la presenza di immunoglobuline umane anti-HGV (nome commerciale μPLATE Anti-HGenv della Boehrìnger Mannheim). In questo sistema diagnostico vengono rilevati anticorpi contro diversi epitopi dalla proteina E2 della capsula virale. La proteina E2 è adsorbita alla fase solida e gli anticorpi del campione in esame si legano di conseguenza alla stessa. La comparsa di anticorpi anti- E2 è ritenuta un’indicazione della regressione dell’infezione da HGV (Dille B.J. et al. J.

Infect. Dis. 1997, 175, 458-461) e questi anticorpi sembrano rappresentare dei marcatori dell’immunità protettiva al HGV, sebbene in alcuni casi si possa riscontrare una doppia positività al HGV RNA (indicatore della presenza virale) e degli anticorpi anti-E2. E’ quindi evidente che questo dosaggio immunoenzimatico, sia pure sensibile ed ampiamente usato, presenta una evidente limitazione diagnostica dovuta alla mancata discriminazione tra risposta anticorpale e viremia. Altri epitopi delle proteine del HGV, oltre alla proteina E2, possono stimolare una risposta immunitaria di tipo umorale. Kim J.P. et al. (Genelabs Technologies Ine. US Patent n° 5,824,507 20 ottobre 1998) hanno clonato il genoma virale del HGV e testato alcuni polipeptidi ricombinanti per immunoreattività contro un panel di sieri provenienti da donatori di sangue e pazienti negativi agli anticorpi anti-HBV e anti-HCV allo scopo di determinare gli antigeni immunoreattivi alle sequenze peptidiche clonate, senza per altro identificare la corrispondenza tra immunoreattività e decorso dell'infezione o risposta anticorpale.

OGGETTO DELL’INVENZIONE

Ora la Richiedente ha identificato due epitopi localizzati in due proteine non strutturali del HGV, e sintetizzato i corrispondenti due peptidi allo scopo di impiegarli per la messa a punto e io sviluppo di un nuovo dosaggio immunoenzimatico. I vantaggi del sistema diagnostico sviluppato anti-HGV rispetto a quello attualmente commercializzato mPLATE Anti-Genv sono molteplici e consistono in : 1 ) tempi di sviluppo del saggio molto ridotti essendo questi di due ore rispetto alle quattro ore necessarie per il mPLATE Anti-Genv; 2) una migliore discriminazione fra assenza di virus e presenza di anticorpi; 3) una discriminazione tra presenza di virus ed assenza di anticorpi.

L'oggetto dell'invenzione è quindi un nuovo sistema diagnostico caratterizzato da due saggi ELISA complementari (anti-HGV ELISA doppio) per il rilevamento di anticorpi umani specifici anti-HGV in siero e/o plasma umano. Per il saggio immunoenzimatico di rilevamento di anticorpi specifici anti-HGV sono impiegati due peptidi sintetici adsorbiti separatamente su fase solida ed un reporter costituito da un anticorpo secondario marcato con un enzima.

Preferibilmente i peptidi sono caratterizzati rispettivamente dalle seguenti sequenze amminoacidiche corrispondenti alla regione nonstrutturale (2156-2192 amminoacidi della poliproteina) NS5a del HGV (peptide 1) ed alla regione non-strutturale (1685-1721 amminoacidi della poliproteina) NS4 del

(peptide 2).

La composizione del sistema diagnostico è un ulteriore oggetto dell’invenzione.

E’ inoltre oggetto dell'invenzione l’impiego di tale sistema a scopi diagnostici generali ed in particolare nello screening di plasma e/o siero di donatori di sangue.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Il virus dell’epatite G HGV recentemente identificato e clonato appartiene alla famiglia delle flaviviridiae ed è considerato un genere distinto dagli altri virus dell’epatite. Il genoma del virus HGV è costituto da 9400 ribonucleotidi di un filamento di RNA e contiene una unica e continua sequenza di lettura aperta. Tale sequenza codifica per una poliproteina di circa 3000 aminoacidi, che viene successivamente processata in proteine strutturali (C, E1 e E2) e proteine non-strutturali (NS2, NS3, NS5a e NS5b) mediante proteasi specifiche. La presenza del virus è caratterizzata da: a) alti livelli di alanina aminotransferasi nel siero di primati infettati e b) immunoreattività distinta rispetto ai virus dell’epatite A, dell’epatite B, dell’epatite C, dell’epatite D ed dell’epatite E.

La richiedente, allo scopo di mettere a punto e sviluppare un nuovo sistema per la diagnosi dell’epatite G in grado di discriminare tra presenza di anticorpi anti-HGV e presenza o assenza del virus HGV, ha condotto indagini volte ad identificare peptidi, diversi da quelli in uso ed in particolare peptidi contenuti in proteine virali non-strutturali, idonei al rilevamento di anticorpi umani specifici anti-HGV.

Procedura sperimentale

La selezione di nuovi epitopi putativi per i linfociti B di poliproteine del HGV è stata condotta con il confronto per allineamento di quattro sequenze pubblicate di HGV (GenBank accession n° HGU 36380, HGU 44402, HGU 45966, HGU75356) e con il metodo di Welling (Welling G.W. et al. FEBS Lett.1985, 188, 215-218) è stata studiata la possibile antigenicità. Questo ha portato ad identificare un epitopo putativo per le B-cellule nella regione non-strutturale 4 (NS4) e tre epitopi putativi per le B-cellule nella regione non-strutturale 5 (NS5a) della poliproteina del HGV. I corrispondenti peptidi sintetici

a.a. da 2280 a 2319) sono stati sintetizzati con un sintetizzatore di peptidi e purificati con una HPLC in fase inversa. I peptidi sintetizzati sono stati quindi impiegati come antigeni secondo il metodo ELISA già a punto nel laboratorio (Ferroni P. et al. J. Clin. Microbiol. 1993, 31, 1586-1591) per la preparazione del dosaggio di immunoassorbimento degli anticorpi serici dei campioni in esame. La sensibilità dell’ELISA, misurata come densità ottica con uno spettrofotometro con un filtro da 450 a 620 nm, era di 0,015 unità OD; per confronto è stata misurata anche la reattività agli anticorpi anti-E2 con il kit commercializzato dalla Boerhinger Mannheimm, mentre la presenza del virus è stata misurata come HGV RNA con la PCR a transcriptasi inversa.

Risultati

Sono stati esaminati 239 campioni di siero provenienti da diversi soggetti: 45 con cirrosi epatica, 62 con carcinoma epatocellulare, 45 con tumori extraepatici, 34 con coagulopatie e 53 controlli con i seguenti risultati:

a) HGV RNA circolante : è stato rilevato in 53 dei soggetti considerati ed in particolare in 8/45 (18%) dei pazienti con cirrosi, in 23/62 (37%) dei pazienti con carcinoma epatocellulare, 14/45 (31%) dei pazienti con tumori extraepatici, 3/34 (9%) dei pazienti con coagulopatie e 5/53 (9%) dei controlli

b) grado di reattività dei peptidi sintetici: C40P 29/238 (12%); V36S 64/238 (27%); V37D 27/239 (11%); P37R 23/239 (10%), mentre il grado di reattività degli anticorpi anti-E2 era di 62/239 (26%).

Dalla comparazione dei risultati ottenuti sui 53 campioni positivi al HGV RNA circolante ed sul grado di reattività dei peptidi sintetici e contro anticorpi anti-E2 si ottenevano i seguenti risultati: C40P 5/53 (9%); V36S 20/53 (38%); V37D 2/53 (4%); P37R 1/53 (2%), E2 9/53 (17%), mentre il grado di reattività sui campioni negativi al HGV RNA circolante era di C40P 24/185 (13%); V36S 44/185 (24%); V37D 25/186 (13%); P37R 22/186 (12%), E2 53/186 (29%).

Da questi risultati risulta quindi che, benché il peptide V36S sia l'epitopo immunodominante tra i quattro peptidi identificati, gli anticorpi contro questo peptide sono più frequenti nei campioni sia positivi che negativi al HGV RNA circolante. La sua capacità discriminativa risulta essere quindi limitata, rispetto alla presenza di anticorpi anti-HGV e presenza o assenza del virus. Gli anticorpi contro i peptidi V37D e P37R invece erano raramente determinabili in presenza del HGV RNA circolante. La duplice reattività contro questi due peptidi non era invece mai riscontrata in presenza del virus.

Essendo lo scopo dell’invenzione quello di realizzare per la determinazione di anticorpi umani anti-HGV specifici un nuovo sistema immunodiagnostico, più rapido e con un maggiore potere di discriminazione tra presenza di anticorpi ed assenza del virus, i peptidi impiegabili allo scopo sono quindi quelli corrispondenti alla regione nonstrutturale (2156-2192 amminoacidi della poliproteina) NS5a del HGV di sequenza (peptide 1) e alla regione non-strutturale (1685-1721 amminoacidi della poliproteina) NS4 del HGV

Procedimento per la preparazione del sistema diagnostico anti-HGV ELISA doppio

I peptidi possono essere sintetizzati con un sintetizzatore di peptidi (ad esempio il 432A Peptide Synthetizer Appled Biosystem Perkin Elmer) e purificati tramite RP-HPLC. Due unità del saggio vengono preparate tramite adsorbimento dei due peptidi su fasi solide distinte. Queste possono essere qualsiasi supporto adatto allo scopo ed in particolare a scopo esemplificativo e non limitativo possono essere piastre da microtitolazione (micropiastre), provette di polistirene, strisce di nitrocellulosa o altro materiale simile. All’adsorbimento su fase solida viene fatta seguire una saturazione con una varietà di saturanti. Questi possono essere qualsiasi soluzione proteica ed a titolo di esempio possono essere menzionate soluzioni di latte scremato, di albumina bovina e di gelatina. Il saggio può essere implementato con l'aggiunta alle due unità distinte in fase solida di campioni di siero e/o plasma umano diluiti o non diluiti.

Gli anticorpi specifici possono essere determinati tramite l'aggiunta di un reporter che può essere un’anticorpo anti-immunoglobuline umane marcato con un enzima ad esempio fosfatasi alcalina, perossidasi e bgalattosidasi. Dopo l'aggiunta di un opportuno substrato cromogeno, l'enzima del reporter catalizza una reazione colorimetrica e l’intensità di tale colorazione può essere misurata come assorbanza tramite una lettura spettrofotometrica ad una opportuna lunghezza d’onda e con un filtro corrispondente in un lettore di piastre. L’intensità di colorazione delle due unità, che corrisponde ad un dato di assorbanza, è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi specifici antipeptide 1 ed anti-peptide 2 di HGV presenti nel siero e/o plasma in esame.

La valutazione di sieropositività viene effettuata in base al rapporto tra il valore dell’assorbanza del campione in esame ed il valore deil’assorbanza di un campione di un siero di riferimento. Il siero di riferimento può essere un qualsiasi siero con un qualsiasi valore di assorbanza, la cui media viene confrontata con un valore di cut-off. Il valore di cut-off (valore discriminante tra sieropositività e sieronegatività) viene identificato in seguito ad uno screening di un maggior numero possibile di individui sieronegativi. Da tale screening viene calcolata la media delle assorbanze dei sieri negativi e la deviazione standard. Il valore di cut-off viene calcolato sommando alla media tre deviazioni standard. Per esempio se il valore di cut-off per ambedue i peptidi è 0,35 e quello del siero di riferimento inteso come media è 1 ,4 ciò significa che il valore di cut-off è 4 volte inferiore di quello del siero di riferimento.

Se l’assorbanza del campione è minore del valore di cut-off, il siero è negativo, se è maggiore il siero è positivo.

Esempio

Preparazione di una piastra di microtitolazione

I due peptidi vengono preparati con un sintetizzatore di peptidi (ad esempio il 432A Peptide Synthetizer Applied Biosystem Perkin Elmer) e purificati tramite RP-HPLC. Si preparano due soluzioni di coating risospendendo separatamente i due peptidi in tampone di coating (10 mM Na2HP04 portato a pH 7,4 con acido fosforico) alla concentrazione di 2 mg/ml. 100ml delle due soluzioni di coating si distribuiscono separatamente in pozzetti di una piastra di microtitolazione o micropiastra (fase solida). La piastra viene incubata per 16-18 ore alla temperatura di 37° C in ambiente umido saturo. La piastra viene lavata due volte con una soluzione di lavaggio composta da acqua distillata e Tween-20 allo 0,1 %. Ai pozzetti della piastra vengono aggiunti 200 mi di soluzione di saturazione composta da Tris-base 0,2 M, idrolizzato di caseina 2% portata a pH 6,0 con acido maleico. Dopo un periodo di saturazione di 4 ore a temperatura ambiente si scarica la soluzione di saturazione e si essicca la piastra sottovuoto per 4 ore a temperatura ambiente. La piastra è a questo punto pronta per il saggio.

Procedura del saggio

I campioni di siero o plasma umano si diluiscono 40 volte nel diluente per campioni (sodio tetraborato 0,1 M, idrolizzato di caseina 2%, NP-40 0,2%, Na2EDTA 2mM corretto a pH 6,0 con acido maleico ed addizionato con sodio azide 0,2% e siero di capra 1%); 100 ml di ogni campione si addizionano a due pozzetti (uno con il peptide 1 e l'altro con il peptide 2). Ad ogni seduta analitica si carica, analogamente ai campioni, anche il siero di controllo. Dopo un'incubazione di 1 ora a temperatura ambiente, si scarica il contenuto della micropiastra che viene lavata 4 volte con tampone di lavaggio diluito 25 volte in acqua distillata (composizione: imidazolo 4,25%; NaCI 21,916%; Tween-20 2,5% in acqua distillata). Si addizionano a tutti i pozzetti della micropiastra 100 mi di anticorpo secondario coniugato a perossidasi diluito 8000 volte in diluente del coniugato (sodio tetraborato 0,1 M, idrolizzato di caseina 2%, Tween-20 0,1%, corretto a pH 7,8 con acido maleico ed addizionato con 1% di siero di capra ). Dopo un'incubazione di 1 ora a temperatura ambiente, la piastra si lava come già descritto sopra; quindi si dispensano nei pozzetti 100 ml di substrato cromogeno (per esempio una soluzione contenente tetrametibenzidina). Dopo un’ulteriore incubazione di sviluppo della reazione cromogena, la reazione si blocca aggiungendo 100 ml di soluzione di arresto (per esempio H2S04 2M). Si esegue la lettura di assorbenza tramite un lettore di micropiastre alla lunghezza d’onda 450.

Con il sistema diagnostico anti-HGV ELISA doppio descritto in dettaglio ed oggetto dell’invenzione l’immunoreattività sierologica in ognuno dei due distinti saggi è correlata al 96-98 % (P<0,05 secondo il test chi quadrato) negativamente alla presenza del virus, mentre la duplice positività nei due test corrisponde all’assenza del virus (P=0,008 secondo il test chi quadrato).

In conclusione il nuovo sistema diagnostico immunoenzimatico per l’epatite G risulta particolarmente vantaggioso ed originale per quanto attiene al principio innovativo alla base del saggio. Infatti con l'identificazione di due specifici epitopi localizzati in due proteine nonstrutturali del HGV e con la sintesi dei corrispondenti due peptidi si è potuto realizzare un saggio immunodiagnostico anti-HGV che presenta i seguenti vantaggi:

1) tempi di sviluppo del saggio ridotti;

2) una migliore discriminazione fra assenza di virus e presenza di anticorpi;

3) una discriminazione tra presenza di virus ed assenza di anticorpi, permettendo in tal modo nello screening diagnostico sui donatori di sangue nel caso ripetuto di doppia positività di evitare l’esecuzione di una specifica ricerca del RNA virale con una metodica complessa e costosa come la PCR.

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un sistema diagnostico per il rilevamento di anticorpi umani specifici contro il virus dell’epatite G (HGV) in siero e/o plasma umano caratterizzato da due saggi ELISA complementari in grado di discriminare la presenza o assenza del virus con la sola determinazione del rilevamento degli anticorpi anti-HGV.
2. 2. Un sistema diagnostico per il rilevamento degli anticorpi anti-HGV secondo la rivendicazione 1 comprendente: a) due peptidi sintetici adsorbiti separatamente alla fase solida; b) un reporter costituito da un anticorpo secondario marcato con un enzima; c) specifici reagenti di saggio.
3. 3. Un sistema diagnostico per il rilevamento degli anticorpi anti-HGV secondo la rivendicazione 2 in cui i due peptidi sintetici sono di sequenza corrispondente alla regione non-strutturale (2156-2192 amminoacidi della poliproteina) NS5a del HGV PAAAALQAIENAARILEPHIDVIMEDCSTPSLCGSSR (peptide 1) ed alla regione non-strutturale (1685-1721 amminoacidi della poliproteina) NS4 del HGV VLSLAQAKTAEAYTATAKWLAGCYTGTRAVPTVSIVD (peptide 2).
4. 4. Un sistema diagnostico per il rilevamento degli anticorpi anti-HGV secondo la rivendicazione 2 comprendente: a) due fasi solide distinte adsorbite con due peptidi sintetici; b) un reporter costituito da un anticorpo secondario marcato con un enzima; c) specifici reagenti di saggio costituti da: un tampone di coating 10 mM Na2HP04 corretto a pH7,4 con acido fosforico; soluzione di saturazione costituita da TRIS-base 0,2 M, idrolizzato di caseina 2% portato a pH 6,0 con acido maleico; diluente per . campioni sodio tetraborato 0,1 IVI, idrolizzato di caseina 2%, NP400,2% Na2 EDTA 2mM corretto a pH 6,0 con acido maleico ed addizionato con sodio azide 0, 2% e siero di capra 1 %; un tampone di lavaggio diluito 25 volte in acqua distillata composto da imidazolo 4,25%; NaCI 21,916%; Tween-20 2,5% in acqua distillata; diluente del coniugato enzimatico sodio tetraborato 0,1 M, idrolizzato di caseina 2%, TWEEN-200,1% corretto a pH 7,8 con acido maleico ed addizionato con 1% di siero di capra.
5. 5. Uso dei peptidi di sequenza corrispondente alla regione nonstrutturale (2156-2192 amminoacidi della poliproteina) NS5a del HGV PAAAALQAIENAARILEPHIDVIMEDCSTPSLCGSSR (peptide 1) ed alla regione non-strutturale (1685-1721 amminoacidi della poliproteina) NS4 del HGV VLSLAQAKTAEAYTATAKWLAGCYTGTRAVPTVSIVD (peptide 2) per la preparazione del sistema diagnostico secondo una delle rivendicazioni 1 , 2, 3 e 4.
6. 6. Impiego del sistema diagnostico secondo una delle rivendicazioni 1, 2, 3 e 4 a scopi diagnostici generali.
7. 7. Impiego dei sistema diagnostico secondo una delle rivendicazioni 1, 2, 3 e 4 per le screening sierologico e/o piasmatico di donatori di sangue.