JPS60259937A - 微量蛋白質の化学発光分析法 - Google Patents
微量蛋白質の化学発光分析法Info
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- JPS60259937A JPS60259937A JP11575084A JP11575084A JPS60259937A JP S60259937 A JPS60259937 A JP S60259937A JP 11575084 A JP11575084 A JP 11575084A JP 11575084 A JP11575084 A JP 11575084A JP S60259937 A JPS60259937 A JP S60259937A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
「産業上の利用分野」
本発明は微量蛋白質の簡便な化学発光分析法に関する句
「従来の技術」
近年の化学分析法は微量化の傾向が増々高まっているが
、これは微量成分の検出が要求されていることは勿論の
こと、また分析法を微量化することで幾つかの面で負担
を軽減する目的のあるのも見逃せない。臨床化学の領域
ではラジオアイソトープを用いて微量分析が多く打力わ
れているが放射能の人体に対する影響が重大で、それを
防ぐための設備に投資する経済的負担は並大抵ではない
。
、これは微量成分の検出が要求されていることは勿論の
こと、また分析法を微量化することで幾つかの面で負担
を軽減する目的のあるのも見逃せない。臨床化学の領域
ではラジオアイソトープを用いて微量分析が多く打力わ
れているが放射能の人体に対する影響が重大で、それを
防ぐための設備に投資する経済的負担は並大抵ではない
。
そこで最近−躍脚光を浴びてきたのが化学発光を利用し
た分析法である。この方法による検出感度はラジオアイ
ソトープ法に匹敵し、しかも装置は特に高価なものを必
要としないという利点がある。
た分析法である。この方法による検出感度はラジオアイ
ソトープ法に匹敵し、しかも装置は特に高価なものを必
要としないという利点がある。
「発明が解決しようとする問題点」
本発明者等はさきにこの化学発光分析法を用いて微量蛋
白質の定量方法について報告したが（特願昭５８−１５
７７０ ）、それらは他の従来の化学発光分析法と同様
、化学発光試薬と反応させた蛋白質を何らかの方法で分
離精製した後その化学発光量を測定しなければならない
という点において繁雑さがあった。本発明者等（はこれ
らの欠点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果本発明を完
成した。
白質の定量方法について報告したが（特願昭５８−１５
７７０ ）、それらは他の従来の化学発光分析法と同様
、化学発光試薬と反応させた蛋白質を何らかの方法で分
離精製した後その化学発光量を測定しなければならない
という点において繁雑さがあった。本発明者等（はこれ
らの欠点を改善すべく鋭意研究を重ねた結果本発明を完
成した。
「問題点を解決するための手段」
本発明は蛋白質を化学発光試薬と混合させたものを用い
その化学発光量を測定して蛋白質を定量する化学発光分
析法において、アルカリ性尿素メルカプト酢酸エチルを
存在させることにより測定時に影響を及ぼす過剰の化学
発光試薬を測定系よυ分離することなく蛋白質を定量す
ることを特徴とする微量蛋白質の化学発光分析法である
。
その化学発光量を測定して蛋白質を定量する化学発光分
析法において、アルカリ性尿素メルカプト酢酸エチルを
存在させることにより測定時に影響を及ぼす過剰の化学
発光試薬を測定系よυ分離することなく蛋白質を定量す
ることを特徴とする微量蛋白質の化学発光分析法である
。
本発明の方法は、ルミノール、イソルミノールおよびそ
れらの誘導体例えばＮ−（４−インチオンアナドブチル
）−Ｎ−エチルイソルミノール（以下ＡＢｇｌ−ＮＣ８
と称す。）等の化学発光物質を発光させる場合、還元性
物質の一種であるメルカプト酢酸エチルを添加すると、
これらの化学発光反応が著しく妨害されるということが
一般であるが、この混合液に蛋白質を加えると、加えた
蛋白質の量に比例して発光反応が進行するという新しい
知見に基づいたものである。ここで蛋白質としては未変
性のものよりも強アルカリ性８Ｍ尿素液中で反応させた
方が本現象の著しい増強が見られる。
れらの誘導体例えばＮ−（４−インチオンアナドブチル
）−Ｎ−エチルイソルミノール（以下ＡＢｇｌ−ＮＣ８
と称す。）等の化学発光物質を発光させる場合、還元性
物質の一種であるメルカプト酢酸エチルを添加すると、
これらの化学発光反応が著しく妨害されるということが
一般であるが、この混合液に蛋白質を加えると、加えた
蛋白質の量に比例して発光反応が進行するという新しい
知見に基づいたものである。ここで蛋白質としては未変
性のものよりも強アルカリ性８Ｍ尿素液中で反応させた
方が本現象の著しい増強が見られる。
また本現象は蛋白質以外のアミノ酸および低分子のベゾ
チド、グルコースおよび核酸等では生じないことから蛋
白質に特異的なものであるといえる。
チド、グルコースおよび核酸等では生じないことから蛋
白質に特異的なものであるといえる。
一方添加する還元物質としてはメルカプト酢酸を用いる
場合が最も良い結果を与え、同族の含イオウ還元物質で
あるシスティンおよびそのエステル、シスタミン、メル
カプトエタノール等でも、またアスニルビン酸およびグ
ルタチオン等ヲ添加した時でも本現象は全く見られない
か、または極く僅かな増強が見られるのみである。
場合が最も良い結果を与え、同族の含イオウ還元物質で
あるシスティンおよびそのエステル、シスタミン、メル
カプトエタノール等でも、またアスニルビン酸およびグ
ルタチオン等ヲ添加した時でも本現象は全く見られない
か、または極く僅かな増強が見られるのみである。
第１図、第２図に本発明方法を用いて各種蛋白質を定量
した際の標準曲線を示しである。第１図は化学発光物質
として０．３１ ｍＭルミノール溶液５００μｔ１蛋白
質として０．２１ ｐｇ 〜０．２１ ’ｎ’ｉ／ｙｎ
！牛血清アルブミン溶液５００μｔおよび１００ｍＭメ
ルカプト酢酸エチル溶液５０μｔを用いて、メルカプト
酢酸エチルの存在下におけるルミノールの化学発光に対
する添加蛋白質量との関係（検量線〕を表わしている。
した際の標準曲線を示しである。第１図は化学発光物質
として０．３１ ｍＭルミノール溶液５００μｔ１蛋白
質として０．２１ ｐｇ 〜０．２１ ’ｎ’ｉ／ｙｎ
！牛血清アルブミン溶液５００μｔおよび１００ｍＭメ
ルカプト酢酸エチル溶液５０μｔを用いて、メルカプト
酢酸エチルの存在下におけるルミノールの化学発光に対
する添加蛋白質量との関係（検量線〕を表わしている。
第２図は化学発光物質として０．３１ ｍＭ ＡＢＥＩ
−ＮＣ８溶液５００μｔ１蛋白質として、牛血清アルブ
ミン、牛γ−グロブリン、血清アルブミン、卵アルブミ
ン、サルミインの１．０５μｇ〜１，０５１ｎｇ蛋白溶
液５００μｔおよび１０ ｍＭメルカゾト酢酸エチル溶
液５０μｔを用いて、メルカプト酢酸エチルの存在下に
おけるＡＢＩｉ：１−ＮＣ８の化学発光に対する添加蛋
白量との関係（検量線）を表わしている。
−ＮＣ８溶液５００μｔ１蛋白質として、牛血清アルブ
ミン、牛γ−グロブリン、血清アルブミン、卵アルブミ
ン、サルミインの１．０５μｇ〜１，０５１ｎｇ蛋白溶
液５００μｔおよび１０ ｍＭメルカゾト酢酸エチル溶
液５０μｔを用いて、メルカプト酢酸エチルの存在下に
おけるＡＢＩｉ：１−ＮＣ８の化学発光に対する添加蛋
白量との関係（検量線）を表わしている。
なお、第２図中各記号は以下の意味を表わす。
・：牛血清アルブミン、○：牛γ−グロブリン、×：人
血清グロブリン、Ｃ：卵アルブミン、（：サルミイン その結果どの蛋白質も０．１〜５０μｇ／１ｕｂｅの範
囲で直線性が得られ、現在まで最も高感度な分析法とさ
れている螢光法やアイソトープを用いた方法と同程度の
検出感度を示した。しかも、これらの従来法では螢光物
質やラジオアイソトープで標識した蛋白質をメンブラン
フィルタ−等にょシ分離しなければなら々いのに対し、
その点本発明方法は標識された蛋白質を分離する必要が
なく操作が著しく簡略化されるようになった。
血清グロブリン、Ｃ：卵アルブミン、（：サルミイン その結果どの蛋白質も０．１〜５０μｇ／１ｕｂｅの範
囲で直線性が得られ、現在まで最も高感度な分析法とさ
れている螢光法やアイソトープを用いた方法と同程度の
検出感度を示した。しかも、これらの従来法では螢光物
質やラジオアイソトープで標識した蛋白質をメンブラン
フィルタ−等にょシ分離しなければなら々いのに対し、
その点本発明方法は標識された蛋白質を分離する必要が
なく操作が著しく簡略化されるようになった。
つぎに表１に現在まで一般的に使用されているローリ−
法と比較した結果を示しであるが、各蛋白質の差をＳＯ
（標準偏差）で表わすとローリ−法では２９．８である
のに本発明方法では７．０で明らか釦優れている。
法と比較した結果を示しであるが、各蛋白質の差をＳＯ
（標準偏差）で表わすとローリ−法では２９．８である
のに本発明方法では７．０で明らか釦優れている。
ただしＢＳＡ ：牛血清アルブミン
ＢＧＧ ：牛ｒ−グロブリン
ＢＳＡ ：人血清アルブミン
Ｏｖ：卵アルブミン
ＳＡＬ ：サルミイン
ＢＳＡを１００に換算して衣わした筐
また本発明方法へ及ぼす妨害物質について検討したとこ
ろ高濃度のジチオスレトールおよび２−メルカプトエタ
ノール等の還元性物質によって発光が抑制されるのを認
めたが、還元型のグルタチオンは１μＭ以下では全く影
響を受けなかった。
ろ高濃度のジチオスレトールおよび２−メルカプトエタ
ノール等の還元性物質によって発光が抑制されるのを認
めたが、還元型のグルタチオンは１μＭ以下では全く影
響を受けなかった。
また通常の蛋白質精製時に混入されると考えられる０、
０１％以下のラウリル酸ナトリウム（ＳＤＳ ）および
ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソ−オクチルフェ
ニルニーテール（トリトンＸ−１００）のような界面活
性剤、さらにナトリウムイオンおよびカリウムイオンで
も全く阻害が見出され々かりた。
０１％以下のラウリル酸ナトリウム（ＳＤＳ ）および
ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソ−オクチルフェ
ニルニーテール（トリトンＸ−１００）のような界面活
性剤、さらにナトリウムイオンおよびカリウムイオンで
も全く阻害が見出され々かりた。
つぎに実施例について説明する。
「実施例」
（１） 試薬の調製
試薬（Ｉ） 尿素 ４８ｇ
水酸化カリウム ３３０■
脱塩蒸留で１００−とし８Ｍ尿素液とする。
試薬（ｌＩ） ルラノール ０．５５〜を試薬（Ｉ）で
１０ｍ１とし１０．３１ｍＭ溶液とする。
１０ｍ１とし１０．３１ｍＭ溶液とする。
Ｅ薬（Ｉｆ’） ＡＢＦ：ｌ−ＮＣ８１ηをジメチルス
ルホオキシド１ｍｌに混合溶解したものを試薬（Ｉ）で
１０ゴと１０．３１ｍＭ溶液とする。
ルホオキシド１ｍｌに混合溶解したものを試薬（Ｉ）で
１０ゴと１０．３１ｍＭ溶液とする。
試薬（ホ） チオグリコール酸エチル２１８μを試薬（
１）でｌＱｍＪとし１０ｍＭ溶液とし使用時に２０倍希
釈する。
１）でｌＱｍＪとし１０ｍＭ溶液とし使用時に２０倍希
釈する。
試薬（財） ミクロベルオキシターゼ２ｍｇ１０ ｍＷ
）リス緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解して５ｍｌとし４
℃で保存する。
）リス緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解して５ｍｌとし４
℃で保存する。
使用時に試薬（Ｉ）で１００倍希釈して２μＭ溶液とす
る。
る。
試薬（Ｖ） ３１％過酸化水素水１０１ｎｌ！トリス緩
衝液（ｐＨ７，４）で１００倍希釈して７０ｍＭ水溶液
とする。
衝液（ｐＨ７，４）で１００倍希釈して７０ｍＭ水溶液
とする。
（２）分析操作 試薬（ＩＩ）又１ｄ （ＩＩ’） ５
０ μＬ、 試薬（ｔＤ５μｔおよび各種濃度の８Ｍ尿
素蛋白溶液５０μｔを６咽φ×５０簡の試験官に入れ混
合する。これに発光反応の触媒となる試薬ｖ）５０μを
加え混和後２５℃で５０分間放置後ケミグロホトメータ
ー（アミンコ社製）のサンプル室に入れ、試薬（Ｖ）１
０μｔを注入して発光反応を開始させる。発光は減衰曲
線となって進行するので試薬注入から１０秒間の発光量
を積算して測定値とする。
０ μＬ、 試薬（ｔＤ５μｔおよび各種濃度の８Ｍ尿
素蛋白溶液５０μｔを６咽φ×５０簡の試験官に入れ混
合する。これに発光反応の触媒となる試薬ｖ）５０μを
加え混和後２５℃で５０分間放置後ケミグロホトメータ
ー（アミンコ社製）のサンプル室に入れ、試薬（Ｖ）１
０μｔを注入して発光反応を開始させる。発光は減衰曲
線となって進行するので試薬注入から１０秒間の発光量
を積算して測定値とする。
「発明の効果」
以上から明らかな如く、本発明によれば蛋白質を化学発
光物質で標識した後、該標識蛋白質を分離することなく
、そのまま発光量を測定することにより、微量蛋白質の
量を極めて簡便に且つ正確に測定できる従来にない優れ
た分析法を提供できる効果がある。
光物質で標識した後、該標識蛋白質を分離することなく
、そのまま発光量を測定することにより、微量蛋白質の
量を極めて簡便に且つ正確に測定できる従来にない優れ
た分析法を提供できる効果がある。
第１図はエチルチオグリコレイトの存在下におけるルミ
ノールの化学発光に対する添加蛋白量との関係（検量線
）を表わすグラフである。 第２図はエチルチオグリコレイトの存在下におけるＡＢ
ＥＩ−ＮＣ８の化学発光に対する添加蛋白量との関係（
検量線）を表わすグラフである。 ＠ １ 図 蛋白質（戸９／↑ｕｂｅ ）
ノールの化学発光に対する添加蛋白量との関係（検量線
）を表わすグラフである。 第２図はエチルチオグリコレイトの存在下におけるＡＢ
ＥＩ−ＮＣ８の化学発光に対する添加蛋白量との関係（
検量線）を表わすグラフである。 ＠ １ 図 蛋白質（戸９／↑ｕｂｅ ）
Claims (3)
- （１）蛋白質を化学発光試薬と混合させたものを用いそ
の化学発光量を測定して蛋白質を定量する化学発光分析
法において、アルカリ性尿素、メルカグト酢酸エチルを
存在させることによυ測定時に影響を及ぼす過剰の化学
発光試薬を測定系よシ分離することなく蛋白質を定量す
ることを特徴とする微量蛋白質の化学発光分析法。 - （２）定量可能な蛋白質が天然物、合成物、修飾された
ものである特許請求の範囲第（１）項に記載の微量蛋白
質の化学発光分析法。 - （３） 化学発光試薬がルミノール、イソルミノールあ
るいはそれらの誘導体である特許請求の範囲第（１）項
に記載の微量蛋白質の化学発光分析法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11575084A JPS60259937A (ja) | 1984-06-06 | 1984-06-06 | 微量蛋白質の化学発光分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11575084A JPS60259937A (ja) | 1984-06-06 | 1984-06-06 | 微量蛋白質の化学発光分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60259937A true JPS60259937A (ja) | 1985-12-23 |
| JPH0410981B2 JPH0410981B2 (ja) | 1992-02-27 |
Family
ID=14670123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11575084A Granted JPS60259937A (ja) | 1984-06-06 | 1984-06-06 | 微量蛋白質の化学発光分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60259937A (ja) |
-
1984
- 1984-06-06 JP JP11575084A patent/JPS60259937A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0410981B2 (ja) | 1992-02-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |