RO115446B1 - Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c - Google Patents
Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c Download PDFInfo
- Publication number
- RO115446B1 RO115446B1 RO93-00626A RO9300626A RO115446B1 RO 115446 B1 RO115446 B1 RO 115446B1 RO 9300626 A RO9300626 A RO 9300626A RO 115446 B1 RO115446 B1 RO 115446B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- virus
- hepatitis
- proteins
- protein
- asialoglycoproteins
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 21
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 127
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 94
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 27
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims abstract description 16
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 23
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 13
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 11
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 claims description 4
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 claims description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000234271 Galanthus Species 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 78
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 21
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 21
- 108010076805 snowdrop lectin Proteins 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 8
- 101710132593 Protein E2 Proteins 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- -1 for example Proteins 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 6
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 5
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 5
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Chemical group 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 206010019786 Hepatitis non-A non-B Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 101001007348 Arachis hypogaea Galactose-binding lectin Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 108700010756 Viral Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 241001440741 CHER virus Species 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Natural products CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000234283 Galanthus nivalis Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- AEFLONBTGZFSGQ-VKHMYHEASA-N L-isoglutamine Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AEFLONBTGZFSGQ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000668 effect on calcium Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N glucosamine group Chemical group OC1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003547 hepatic macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940124737 hepatitis-C vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000027380 protein glycosylation in Golgi Effects 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Invenția se referă la un procedeu de obținere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei C (HCV), în scopul utilizării lor în prevenirea și tratamentul hepatitei cu virusul C.
Se cunoaște că virusul hepatitei C (HCV) s-a dovedit a fi agentul etiologic principal al hepatitei serice non-A non-B (EP 388232 A1). Au fost izolate noi secvențe și polipeptide ale virusului hepatitei C care și-au găsit aplicații în teste imunologice, în producerea de anticorpi anti-HCV, în tehnologia DNA recombinant.
De asemenea, se cunoaște că s-a încercat obținerea unor noi polipeptide imunogene codificate cu clone conținând cDNA provenit de la virusul hepatitei C (HCV), și faptul că s-au realizat metode noi pentru purificarea unei polipeptide HCV imunogene.
Din WO 89/146699 se cunoaște că au fost identificate recent noi specii ale virusului hepatitei C, ca fiind, în primul rând, cauza hepatitei non-A non-B transmisibilă prin sânge (hepatita BB- non-A, non-B).
în EP 319216 A1 este descrisă o familie de secvențe cDNA derivate de la virusul hepatitei C (HCV), care codifică antigeni cu proprietatea de a reacționa imunologic cu anticorpi prezenți la indivizi având hepatita non-A non-B (NANBH), dar care, în general, lipsesc de la indivizii infectați cu virusul hepatitei A (HAV) sau virusul hepatitei B (HBV).
Procedeul de obținere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei C(HCV), conform invenției, constă în dezvoltarea pe un mediu de cultură adecvat a unei celule-gazdă transformată cu o genă structurală ce codifică o asialoglicoproteină a virusului hepatitei C selectată din grupul Et și/sau Ea, provocarea expresiei sialilării și izolarea asialoglicoproteinelor virusul hepatitei C(HCV) din cultura de celule prin cuplarea cu o proteină care leagă manoza terminală.
Avantajele pe care le oferă invenția sunt legate de izolarea și purificarea unor proteine ale virusului hepatitei C exprimate fără sialilare, având ca rezultat obținerea de recombinanți proteici similari glicoproteinelor native din virusul hepatitei C și care, se pot utiliza sub formă de agregate de tip like-virus, cu utilizări în obținerea de vaccinuri și teste imunologice.
Hepatita non-A și non-B (NANBH) este o boală transmisibilă (sau o familie de boli) care se pare că este indusă pe cale virală și se distinge de alte forme de boli de ficat asociate cu virusuri, cum ar fi, de exemplu, cele cauzate de virusul hepatitei A (HAV), virusul hepatitei B (HAB), virusul hepatitei delta (HDV), cu citomegalovirus (CMV) sau cu virusul Epstein-Barr (EBV). Evidența epidemiologică sugerează că există trei tipuri de hepatite Non-A și Non-B: tipul epidemic transmisibil prin apă; tipul asociat transmisibil prin sânge-ac de seringă și sporadic se produce tipul dobândit în mod obișnuit. Numărul de agenți cauzativi este necunoscut. Hepatita cu virus C pare să fie forma predominantă de hepatită legată de transfuzie, într-un număr de țări sau de regiuni incluzând Statele Unite, Europa și Japonia.Este evidentă, așadar, implicarea virusului hepatitei C (HCV) în inducerea carcinomului hepatocelular. Astfel, apare necesitatea unei metode eficiente pentru prevenirea și tratamentul infecției în hepatita cu virus C (HCV). Necesitatea unor metode sensibile, specifice pentru screeningul și identificarea transporturilor, în cazul hepatitei cu virusul C (HCV) și în cazul produselor din sânge și a produselor din sânge contaminate cu virusul hepatitei C (HCV) este semnificativă. Hepatita post-transfuzională (PHT) se produce, la aproximativ 10 % din pacienții transfuzați și virusul hepatitei C (HCV) se evidențiază, la peste 90 % din aceste cazuri. Problema majoră în această boală este avansarea frecventă la boli cronice de ficat (25...55 % din cazuri).
RO 115446 Bl îngrijirea pacientului, ca și prevenirea transmiterii virusului hepatitei C prin sânge sau 50 produse din sânge sau printr-un contact personal strâns, necesită instrumente precise de diagnostic și prognostic, pentru detectarea acizilor nucleici, a antigenilor și anticorpilor referitor la virusul hepatitei C (HCV). în plus, există, de asemenea, necesitatea unor vaccinuri eficiente și a unor agenți imunoterapeutici pentru prevenirea și/sau tratamentul bolii. 55
Virusul hepatitei C (HCV) apare în sângele indivizilor infectați în proporții relativ scăzute față de alte tipuri de infecții cu virusuri, ceea ce face ca virusul să fie foarte dificil de detectat. Greutatea virală scade este probabil cauza primară pentru care virusul hepatitei non-A, non-B este dificil de detectat. Chiar dacă,totuși, în prezent acest vector a fost donat, virusul hepatitei C (HCV) s-a dovedit a fi încă dificil de cui- 60 tivat și propagat. în acest sens, există o necesitate acută, în ceea ce privește tehnicile de recombinare pentru producerea proteinelor de diagnostic/tratament și profilaxie a hepatitei cu virusul C.
în plus este foarte necesară existența unui vaccin pentru hepatita cu virus C. Deoarece, însă este extrem de dificilă cultivarea virusului hepatitei C în linii celulare, 65 n-a fost posibil să se producă specii virale atenuate prin treceri seriale în culturi de țesuturi sau culturi de celule.
S-a descoperit că două proteine ce conțin virusul hepatitei C, E1 și E2, par a fi asialiglicoproteine asociate membranei, când sunt exprimate în sisteme recombinante. Acest fapt este surprinzător, deoarece la mamifere glicoproteinele nu rămân, 70 de obicei sub forma cu manoză terminală, fiind modificate, în continuare cu alte tipuri de carbohidrați; forma cu manoză terminală este în mod tipic numai de tanziție. în cazul E1 și E2 (așa cum s-a exprimat în sistemele noastre), asialoglicoproteina pare a fi în formă finită. E1 (proteina 1 de acoperire) este o glicoproteină având o greutate moleculară de aproximativ 35 kD, care este transferată din regiunea E1 prevăzută 75 pentru genomul virusului hepatitei C. E2 (proteina 2 de acoperire) este o glicoproteină având o greutate moleculară, de aproximativ 72 kD, care este transferată de la regiunea NS1 prevăzută (proteina 1 nestructurală) a genomului virusului hepatitei C, pe baza modelului flaviviral al virusului hepatitei C. Deoarece, glicoproteinele virale sunt adesea puternic imunogene, E1 și E2 reprezintă primii candidați pentru utilizare în 80 imunoanalize și pentru tratament și vaccinuri profilactice.
Este semnificativă descoperirea că E1 și E2 nu sunt sialilate. Forma particulară a unei proteine dictează adesea,care celule pot servi ca gazde corespunzătoare pentru exprimarea recombinantă. Procariotele, cum ar fi, de exemplu, Escherichia coli, nu produc glicosilarea proteinelor și, în general nu sunt corespunzătoare pentru produ- 85 cerea glicoproteinelor utilizate ca antigeni, deoarece glicozilarea este adesea importantă pentru completa antigenitate, solubilitate și stabilitate a proteinei. Eucariotele inferioare, cum ar fi, de exemplu, drojdiile și fungii, produc glicozilarea proteinelor, dar sunt, în general, necorespunzătoare, în ceea ce privește adăugarea grupărilor terminale de acid sialic la complecșii de carbohidrați. Astfel, proteinele derivate din drojdii 90 pot fi deosebite din punct de vedere antigenic de corespondenții naturali (nerecombinanți). Pentru aplicațiile în care antigenitatea produsului este importantă, este preferată exprimarea în celulele mamiferelor, deoarece glicozilarea proteinei recombinante poate fi foarte asemănătoare cu cea, în cazul proteinelor virale la animalele sălbatice. 95
Noi date arată că în timpul infecției, virusul hepatitei C (HCV) poate pătrunde în celulele gazdă, fie cu ajutorul receptorului asialoglicoproteinei descoperit pe hepatocite, fie cu ajutorul receptorilor manozei descoperiți pe celulele endoteliale hepatice
RO 115446 Bl și pe macrofagii hepatici (în special celulele Kupffer). S-a descoperit că în mod surprinzător, majoritatea proteinelor naturale E1 și E2 nu conțin grupări terminale de acid sialic, dar că acestea sunt glicozilate, numai în porțiunile inferioare. O fracțiune îngustă conține adițional N-acetil glucozamine terminale. în acest sens, obiectul prezentei invenții este un procedeu de obținere a unor glicoproteine (E1 și E2) de acoperire a virusului hepatitei C, la care lipsesc toate sau aproape toate grupările terminale de acid sialic, denumite de aceea asialoglicoproteine.
Termenul de “asialoglicoproteină” se referă la o proteină glicozilată care este substanțial liberă de resturi de molecule de acid sialic. Asialoglicoproteinele pot fi obținute prin recombinare sau prin purificare dintr-o cultură de celule sau din surse naturale. Asialoglicoproteinele preferate în prezent sunt derivate de la virusul hepatitei C (HCX/J, de preferință glicoproteinele E1 și E2, preferate fiind proteinele recombinante E1 și E2 (rE1 și rE2). □ proteină este “substanțial liberă” de acid sialic conform acestei definiții, dacă numărul de resturi de acid sialic nu interferează substanțial cu legăturile glicoproteinei la proteinele legate de manoză, cum ar fi, de exemplu GNA. Acest grad de sialilare va fi obținut, în general, atunci când mai puțin, de aproximativ 40%, din carbohidratul total legat la azot este acid sialic, mult mai preferabil atunci când există mai puțin, de aproximativ 30 %, mult mai preferabil atunci când exista mai puțin, de aproximativ 20%, mult mai preferabil la mai puțin, de aproximativ 10 %, mult mai preferabil la mai puțin, de aproximativ 5% și mult mai preferabil la mai puțin decât, aproximativ 2 %.
Termenul de Έ1” utilizat în prezenta invenție se referă la o proteină sau la o polipeptidă exprimată ca fiind formată din primii 400 de aminoacizi ai poliproteinei virusului gepatitei C, uneori referindu-se la aceasta ca la proteina E sau proteina S. în forma naturală există o proteină cu greutate moleculară de 35 kD, care s-a găsit a fi puternic asociată la membrană. La majoritatea speciilor naturale de virusuri ale hepatitei C (HCV) proteina E1 este codificată în poliproteina virală, după care urmează proteina C (partea interioară). Proteina E1 se întinde de la, aproximativ aminoacidul 192, la aproximativ aminoacidul 383, din catena totală a poliproteinei. Termenul de E1 așa cum este utilizat în prezenta invenție, include așadar analogi și mutanți secționați care sunt încrucișați din punct de vedere imunologic, cu proteina naturală E1.
Termenul de Έ2 utilizat în prezenta invenție se referă la o proteină sau la o polipeptidă exprimată ca fiind formată din primii 900 de aminoacizi din poliproteina virusului hepatitei C (HCV), iar uneori se referă la proteina NS1. în forma sa naturală aceasta este o glicoproteină cu greutatea moleculară 72 kD, care a fost găsită ca fiind puternic asociată la membrană. în cazul majorității speciilor naturale de virus al hepatitei C, proteina E1 urmează proteina E2. Proteina E2 se întinde, de la aproximativ aminoacidul 384 până la, aproximativ aminoacidul 820. Termenul de Έ2 este utilizat în prezenta invenție incluzând analogi și mutanți secționați,care sunt din punct de vedere imunologic reactiv încrucișați cu proteina naturală E2.
Termenul de “agregat” utilizat în prezenta invenție se referă la un complex de E1 și/sau E2 conținând mai mult decât un monomer E2. Dimerii E1 :E2, dimerii E2:E3 și heterodimerii E1 :E2 sunt toți “agregate” conform scopului prezentei definiții. Compozițiile, conform prezentei invenții, pot include, așadar agregate mai mari și pot avea greutăți moleculare de peste 800 kD.
Termenul de “particulă” utilizat în prezenta invenție se referă la agregatul
E1/E2 sau la E1, la E2 care sunt vizibili prin microscopie electronică și au dimensiuni de cel puțin 20 nm.Particulele preferate sunt cele care au o prezentare sferică, brută și un diametru de aproximativ 40 nm, prin microscopie electronică.
RO 115446 Bl
150
Termenul de “purificat” așa cum este aplicat la proteine, se referă la o compoziție în care proteina dorită cuprinde cel puțin 35% din componentele totale de proteine din compoziție. Proteina dorită cuprinde.de preferință, cel puțin 40%, mult mai preferabil, cel puțin 40 %, mult mai preferabil, cel puțin aproximativ 50 %,chiar mult mai preferabil, cel puțin aproximativ 60%, încă mult mai preferabil, cel puțin aproximativ 70%, chiar mult mai preferabil, cel puțin aproximativ 90% și cel mai preferabil, cel puțin aproximativ 95% din componentele de proteine totale. Compoziția poate conține alți compuși, cum ar fi, de exemplu, carbohidrați, săruri, lipide, solvenți și alți compuși asemănători, fără a fi afectată determinarea procentajului de puritate, așa cum s-a utilizat în prezenta invenție. O asialoglicoproteină “izolată” a virusului hepatitei C (HCV), se referă la o compoziție de asialoglicoproteine HCV, care este cel puțin de puritate 35 %.
“Proteina care leagă manoza” ca termen utilizat în prezenta invenție, se referă la o lecitină sau la o altă proteină, care se leagă, în mod specific, de proteinele având manoza terminală glicozilată (cum sunt asialoglicoproteinele], de exemplu, lectinele legate de manoză, anticorpii specifici pentru manoza terminală glicozilată, proteina receptor conținând manoză, (R.A.B. Ezekowitz și colaboratorii, J.Exp.med. (1990) 176: 1785-94), proteine receptor conținând asialoglicoproteine (H.Kurata și colaboratorii, J.Biol.Chem (1990) 265:11295-98), proteine serice legate la manoză (I.Schuffenecker și colaboratorii, Cytogenet Cell Genet (1991) 56:99-102; K.Sastry și colaboratorii, J.lmunol. (1991) 147:692-97), proteine serice legate de asialoglicoproteine și alți compuși asemănători. Lectinele legate de manoză includ, de exemplu GNA, Concanavalin A (ConA) și alte lectine cu proprietăți de legare similare.
Termenul de “lectină GNA” se referă la aglutinina din Galanthus nivalis, o lectină disponibilă comercial care se leagă la glicoproteinele cu manoză terminală.
O glicoproteină “recombinantă” așa cum este utilizat acest termen în prezenta descriere de invenție, este o glicoproteină exprimată dintr-o polinucleotidă recombinată, în care gena structurală care codifică glicoproteină este exprimată sub controlul secvențelor de reglare nediacente, în mod natural la gena structurală sau în care gena structurală este modificată. De exemplu, una dintre acestea poate forma un vector în care gena structurală E1 este plasată sub controlul unui fragment funcțional al promotorului de gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) de drojdie. Un promotor utilizat, de preferință, în drojdii, este promotorul hibrid ADH2/GAPD, descris în US 4880734, care utilizează un fragment promotor GAPDH în combinație cu o secvență de activare în amonte, derivată de la alcool dehidrogenaza-2. Modificările genei structurale pot include substituirea diferiților codoni, cu codoni degenerați (de exemplu, pentru utilizarea codonilor gazdă preferați, se elimină sau se generează porțiunile de clivaj ale enzimei de restricție, pentru controlul formării formelor aciculare, etc) și substituirea, inserarea sau eliminarea unui număr limitat de codoni pentru codificarea diferiților aminoacizi (de preferință, nu mai mult, de aproximativ 10 %, mult mai preferabil sub, aproximativ 5% dintr-un număr de secvențe de aminoacizi naturali, care pot fi modificate) și altele asemănătoare.
în mod similar, receptorul “recombinant” se referă la o proteină receptor care este exprimată dintr-o polinucleotidă recombinantă, în care gena structurală, care codifică receptorul, este exprimată sub controlul secvențelor de reglare adiacente nu în mod natural, la gena structurală, sau în care gena structurală este modificată.
Termenul de “polipeptidă izolată” se referă la un tip de polipeptidă care poate fi substanțial liberă de alte componente virale în cadrul virusului hepatitei C (HCV), în special nucleotide de tip polinucleotide. O compoziție de polipeptidă poate fi, în mod
155
160
165
170
175
180
185
190
195
RO 115446 Bl “substanțial liberă” de alte componente, dacă greutatea acestei polipeptide în compoziție este, de cel puțin 70 %în greutate polipeptide și alte componente în combinație, mult mai preferabil, de cel puțin, aproximativ 80 %în greutate polipeptide, încă mult mai preferabil, de aproximativ 90 %în greutate polipeptide și, cel mai preferabil, de 95 % sau mai mult. De exemplu, o compoziție care conține 100 pg/ml de E1 și numai 3 pg/ml de alte componente ale virusului hepatitei C (HCV), (de exemplu, acidul dezoxiribonucleic DNA, lipide, etc) care sunt substanțial libere de “alte componente virale ale virusului hepatitei C” și astfel este o compoziție de polipeptide izolate, conform scopului acestei definiții.
Termenul de lider de secreție” se referă la o polipeptidă care, atunci când este codificată la porțiunea N-terminală a proteinei produce o proteină secretată în mediul de cultură celular după translație. Liderul de secreție, în general, va deriva din celula gazdă utilizată. De exemplu, liderii corespunzători de secreție pentru utilizare în drojdii includ factorul a/fa-lieder Saccharomices cerevisiae (US 487008).
Termenul de “eucariote inferioare “ se referă la celule gazdă, cum ar fi drojdii, fungi și altele. Eucariotele inferioare sunt, în general (dar nu în mod necesar) unicelulare. Eucariotele inferioare preferate sunt drojdiile, în special, specii de Saccharomices, Schizosaccharomices, Kluveromices, Pichia, Hansenula și altele. Saccharomices cerecisiae, S. Carlsbergensis și K. lactis sunt cele mai utilizate drojdii cu rol de gazdă, fiind cele mai convenabile gazde pentru fungi.
Termenul de “eucariote superioare” se referă la celule-gazdă derivate de la animale superioare, cum ar fi, de exemplu, mamifere, reptile, insecte și altele. Celulele gazdă de eucariote superioare preferate, în prezent sunt derivate de la hamsterul chinezesc (de exemplu, CHO), maimuțe (de exemplu, celule COS), om și insecte (de exemplu, Spodoptera frugiperda]. Celulele gazdă pot fi utilizate ca suspensii sau culturi la baloane, culturi de țesuturi, culturi de organe și altele.
Termenul de “modulator de calciu” se referă la un compus capabil să capteze sau să lege ionii de calciu în reticulul endoplasmic sau care este capabil să modifice concentrația ionilor de calciu în acesta, prin efectul asupra proteinelor care reglează calciu (de exemplu, proteinele cu canale de calciu, pompe de calciu, etc). Modulatorii de calciu convenabili includ, de exemplu, thapsigargina, EGTA [acid etilenglicol (β-amino etil eter)-N,N,N',N’-tetraacetic). Modulatorul preferat în prezent este thapsigargina (O.Thastrup și colaboratorii, Proc.nat.Acad.Sci. USA (1990) 87:2466-70).
Termenul de “imunogen” se referă la capacitatea unei substanțe de a produce un răspuns imun celular și/sau umoral atunci când este singură sau este legată la un suport, în prezența sau în absența unui adjuvant. “Neutralizarea” se referă la un răspuns imun care blochează infectivitatea, parțial sau total a agentului infecțios. Un vaccin” este o compoziție imunogenă capabilă să confere protecție față de virusul hepatitei C (HCV) fie parțial, fie complet, fiind folositoare pentru tratamentul unui individ.
Termenul de “lichid biologic” se referă la un fluid obținut dintr-un organism, cum ar fi serul, plasma, saliva, secrețiile gastrice, mucusul și altele. în general, un lichid biologic va fi ales pentru prezența particulelor de virus al hepatitei C. Unele fluide biologice sunt utilizate ca sursă a altor produse, cum ar fi, de exemplu, factorii de coagulare (de exemplu, factorul VIII.C), albumina serică, hormonul de creștere și alții.
în astfel de cazuri, este important ca sursa de fluid biologic să fie liberă de contaminare cu virusuri,cum ar fi, de exemplu, virusul hepatitei C.
Regiunea E1 a genomului virusului hepatitei C (HCV), este descrisă în EP
388232, ca regiunea Έ”, în timp ce E2 este descrisă ca “NS1. Regiunea E1
RO 115446 Bl
250 cuprinde aminoacizii 192-383 din catena poliproteinei virale. Regiunea E2 cuprinde, aproximativ aminoacizii 384-820. Secvențele complete ale prototipurilor acestor proteine (tulpina HCV-1) sunt disponibile (EP 388232), ca metode generale pentru donarea și exprimarea dintr-o polinucleotidă codificând primii 850 - 900 aminoacizi ai poliproteinei HCV; procedeele post-translaționale în majoritatea celulelor-gazdă eucariote clivează poliproteina inițială, în C, E1 și E2.
Poate fi secționat capătul 5' a regiunii codificate pentru a se reduce cantitatea de proteină C produsă.
Exprimarea asialoglicoproteinelor poate fi realizată printr-un număr de metode. De exemplu, una din acestea poate obține exprimarea în eucariote inferioare (cum ar fi, drojdiile), care nu adiționează în mod normal resturile de acid sialic la proteinele glicozilate. în sistemele de exprimare la drojdii se preferă să se utilizeze în prezent un lider de secreție, cum ar fi, de exemplu, factorul alfa al liderului de secreție Saccharomices cerevisiae, astfel ca proteina să fie exprimată în mediu de cultură după translație. De asemenea, se preferă, în prezent să se utilizeze mutanți cu deficiențe de glicozilare, ca de exemplu, pmrl, deoarece acești mutanți furnizează numai glicozilarea internă și adesea secretă proteine heteroloage cu eficiență ridicată (Η. K. Rudolph și colaboratorii, Cell (1989) 58: 133 -45). în mod alternativ, una din metode poate utiliza alte specii de drojdii, cum ar fi, de exemplu, Pichia pastoris, care exprimă glicoproteine cu 8 - 9 resturi de manoză, într-un model care se crede că se aseamănă cu modelul glicozilării interne observat la mamifere și la Saccharomices cerevisiae.
în mod alternativ, printr-una din metode se poate obține exprimarea în celulele de mamifere și blocarea glicozilării terminale (adiție de acid sialic). Construcțiile de recombinanți vor include, de preferință, un semnal de secreție pentru a se asigura că proteina este direcționată spre reticulul endoplasmic. Transportul la aparatul Golgi pare a fi blocat chiar de către proteinele E1 și E2; exprimarea la nivel înalt a E1 sau E2 în celulele de mamifere pare să oprească secreția tuturor proteinelor celulare la reticulul endoplasmic sau cis Golgi. în mod adițional, una din metode poate să utilizeze un mutant defectiv de glicozilare (P.Stanley, Ann. Rev.gener, (1984) 18:525-52). în cazul în care mutantul de glicozilare sau de transport exprimă E1 sau E2 cu sialilare, reziduurile terminale de acid sialic pot fi îndepărtate prin tratament cu neuraminidază.
Randamentul poate fi crescut ulterior prin utilizarea unui modulator de calciu pentru a obține eliberarea proteinei din reticulul endoplasmic. Astfel de modulatori includ thapsigargina, EGTA și A23817 (O.Thastrup și colaboratorii, proc.Nat.Acad. Sci. USA (1990), 87, 2466-70). De exemplu, se pot exprima cantități mari de E1 sau E2 intracelulare în celule de mamifere (de exemplu, OHO, COS, celule HeLa și altele), prin transfectarea cu un vector recombinant al virusului vaccinei. După ce se lasă un timp pentru exprimarea proteinei și acumularea în reticulul endoplasmic, celulele sunt expuse la un modulator de calciu într-o concentrație suficient de mare pentru a produce eliberarea conținuturilor reticulului endoplasmic. Proteina este apoi recuperată din mediul de cultură, care este înlocuit pentru ciclul următor.
în plus, este avantajos să se exprime o formă secționată în proteina de acoperire. Atât proteina E1, cât și proteina E2 par a avea un domeniu hidrofobic superior care, aparent, fixează proteina în reticulul endoplasmatic și previne eliberarea sa. Astfel, una din metode prevede eliminarea porțiunilor de secvență găsite într-una sau în mai multe din regiunile conținând aminoacizii 170-190, aminoacizii 260 - 290 sau aminoacizii 330 - 380 ale proteinei E1 (numărând de la începutul poliproteinei) și aminoacizii 660 - 830 din proteina E2 (vezi, de exemplu, fig. 20-1 din EP 388232). Este ca și cum, cel puțin unul din aceste domenii hidrofobe formează o regiune
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 115446 Bl transmembranară, care nu este esențială pentru antigenitatea proteinei și care, astfel, poate să fie eliminată fără nici o consecință. Cea mai bună regiune pentru eliminare, poate fi determinată prin conducerea unui număr mic de experimente de eliminare în cadrul acestei specialități de către specialiștii obișnuiți. Eliminarea porțiunilor hidrofobe 3' terminale ale proteinei E2 are ca rezultat secreția unei porțiuni din proteina E2,exprimată cu sialilarea proteinei secretate.
Pentru obținerea exprimării se poate utiliza orice varietate de vectori. Eucariotele inferioare, cum sunt drojdiile, sunt tipic transformate cu plasmide utilizând metoda de precipitare cu fosfat de calciu sau sunt transfectate cu ajutorul unui virus recombinant. Vectorii pot fi replicați independent în celulele - gazdă sau pot fi integrați în genomul celulei-gazdă. Eucariotele superioare pot fi transformate cu plasmide, dar acestea sunt infectate tipic cu un virus recombinant, de exemplu, virusul recombinant al vaccinei. Este preferată, în special, vaccina, atâta timp cât infectarea cu vaccină oprește exprimarea proteinelor din celula gazdă. Celulele gazdă preferate includ liniile celulare HeLa și plasmocitele. în sistemul prezent, aceasta înseamnă că E1 și E2 se acumulează ca specii glicozilate principale în reticulul endoplasmatic gazdă. Deoarece rE1 și rE2 vor fi glicoproteinele predominante care au manoză terminală, ele vor fi ușor de purificat din celule prin utilizarea lectinelor, cum ar fi, de exemplu, aglutinina din Galanthus nivalis (GNA), care leagă resturile de manoză terminale.
Proteinele, care sunt, în mod natural, exprimate ca glicoproteine cu manoză terminală, sunt relativ rare, în fiziologia maniferelor. în majoritatea cazurilor, o glicoproteină de mamifere este terminată prin manoză, numai în cazul unui produs de tranziție pe parcurusl glicozilării. Faptul că proteinele de acoperire ale virusului hepatitei C(HCV], exprimate recombinant conțin manoză terminală sau (într-un grad mai scăzut] N-acetil glucozamină, înseamnă că proteinele virusului hepatitei C și toți virionii pot fi separați și parțial purificați din proteinele endogene utilizând lectine specifice pentru manoză terminală sau N-acetil glucozamină. Proteinele recombinante apar ca autentice și se consideră esențial identice cu proteinele de acoperire găsite în virionii maturi liberi sau sunt identice cu formele proteinelor de acoperire asociate celulelor. Astfel, se pot utiliza lectine, cum ar fi, de exemplu, GNA pentru proteinele cu manoză terminală și WGA (aglutinina din germeni de grâu] și echivalenții acesteia pentru proteinele terminate cu N-acetil glucozamină. Se pot utiliza, de asemenea, lectine legate pe o fază solidă ( de exemplu, o coloană SepharozaR-lectină] pentru a separa proteinele E1 și E2 din supernatanții culturilor celulare și din alte fluide, de exemplu pentru purificarea în timpul producției de antigeni utilizați la vaccinuri sau în imunoanalize.
Pe de altă parte, se poate stabili o lectină convenabilă pentru izolarea proteinelor E1 și E2 sau a virionilor virusului hepatitei C din fluide sau din probele de țesuturi din subiecții suspectați de infecție cu virusul hepatitei C (HCV). Deoarece glicoproteinele terminate cu manoză sunt relativ rare, un astfel de procedeu va servi pentru purificarea proteinelor prezente în probă, printr-o reducere substanțială a materialelor de bază. Continuând legarea de lectină, proteina virusului hepatitei C(HCV], poate fi detectată utilizându-se anticorpi ai antivirusului hepatitei C. Dacă virionii în întregime sunt prezenți, unii pot fi detectați alternativ în acizii nucleici din virusul hepatitei C(HCV), utilizându-se tehnicile PCR sau alte metode de amplificare ale acidului nucleic, îndreptate către regiunile genomice conservate ale virusului hepatitei C (de exemplu, regiunea necodificată 5']. Această metodă permite izolarea și caracterizarea diferitelor specii de virus al hepatitei C (HCV), fără a se lua în considerare deplasarea antigenică sau variația, cum ar fi, de exemplu, în cazurile în care o nouă specie nu este reactiv
RO 115446 Bl
345 încrucișată imunologic cu specia utilizată pentru prepararea anticorpilor.Există, de asemenea, multe alte căi avantajoase pentru recunoașterea, în mod unic a glicoproteinelor terminate în manoză, cu lectine speciale.De exemplu, se pot utiliza probe incubate, suspectate de contaminare cu virioni de tip virusul hepatitei C, HCV sau proteine cu biotină sau lectine avidin-marcate, prin precipitarea complexului lectinăproteină utilizând avidină sau biotină. Se poate utiliza, de asemenea, afinitatea lectinei pentru proteinele virusului hepatitei C(HCV), față de compușii menționați, la virionii pentru utilizare terapeutică, de exemplu, prin conjugarea unui compus antiviral la GNA. în plus, se pot utiliza lectine corespunzătoare pentru îndepărtarea glicoproteinelor cu manoză terminală, din fracțiunile serice sau din fracțiunile plasmatice, reducându-se sau eliminându-se astfel riscul contaminării cu virusul hepatitei C(HCV). Se preferă, în prezent să se izoleze asialoglicoproteinele E1 și/sau E2 din lizatele celulare brute, prin incubarea cu o proteină imobilizată legată de manoză, în special, o lectină, cum ar fi de exemplu, ConA sau GNA. Celulele sunt lizate, de exemplu, prin distrugerea mecanică într-un mediu tampon hipotonic, după care are loc centrifugarea pentru prepararea unui lizat post-nuclear și prin continuarea centrifugării se obține o fracțiune brută de membrană microzomală. Fracțiunea de membrană brută este, apoi solubilizată într-un mediu tampon conținând un agent tensioactiv de tip detergent, cum ar fi, de exemplu, Triton X-1OO, NP-40 sau altele. Acest extract este clarificat apoi de macroparticule insolubile prin centrifugare și lizatul rezultat, clarificat este incubat întro coloană cromatografică cuprinzând o proteină imobilizată legată de manoză, de preferință GNA, care se leagă pe un suport solid, cum ar fi, de exemplu, agaroza sau SepharozaR pentru o perioadă de timp suficientă pentru legare, care poate fi, de la 16 la 20 h. Suspensia este apoi aplicată pe coloană până ce E1/E2 începe să apară în eluat, apoi aceasta este incubată pe coloană pe o perioadă de timp suficientă pentru legare, cuprinsă între 12 - 24 h. Materialul astfel legat este apoi spălat cu o cantitate adițională de soluție tampon care conține un agent tensioactiv (de exemplu, Triton X100, NP 40 și altele) și se eluează cu manoză pentru a se obține asialoglicoproteina purificată. Este de preferat să se efectueze eluarea numai până când proteina începe să apară în eluat - punct de eluare -, după care eluarea se oprește și coloana se echilibrează, timp de 2 - 3 h, înainte de a se începe eluarea proteinei. Se consideră că există timp suficient pentru a micșora gradul de obținere așteptat pentru agregatele mari de proteine. în cazurile în care E1 și E2 sunt exprimate la un loc în forma nativă (de exemplu, fără secționarea domeniului cu legături de membrană), o fracțiune substanțială de asialoglicoproteine apare sub formă de agregate E1 - E2. Când se face examinarea prin microscopie electronică, o porțiune semnificativă din aceste agregate apare ca particule sferice brute, având un diametru de aproximativ 40 nm, această dimensiune fiind de așteptat pentru virusul intact. Aceste particule par a fi particule subvirale cu autoasamblare. Este de așteptat ca aceste agregate să prezinte o structură cuaternată foarte similară structurii particulelor de virioni autentici pentru virusul hepatitei C și astfel se așteaptă ca ele să poată fi utilizate ca vaccinuri cu imunogenitate superioară.
Complecșii E1/E2 pot fi, în continuare purificați prin gel cromatografie, pe un mediu bazic, de exemplu, pe Fractogel-DEAE-SepharozaR. Utilizându-se gel cromatografic pe Fractogel-DEAE, se pot obține complecși E1/E2 de o puritate de, aproximativ
60...80 %. Se pot purifica în continuare prin tratament cu lizinprotează, deoarece E1 are reziduuri 0-1 Lys. Prin tratamentul complexului cu lizinprotează, se distruge E2 și se permite separarea ușoară a E1. Specificitatea tisulară a virusului hepatitei C, împreună cu observația că glicoproteinele de acoperire a virusului hepatitei C sunt
350
355
360
365
370
375
380
385
390
RO 115446 Bl terminate în manoză, sugerează că virusul utilizează receptorul de manoză sau receptorul asialoglicoproteinei (ASGR) în vederea câștigării pătrunderii în celulele gazdă. Receptorii de manoză se găsesc pe macrofage și celule hepatice sinusoidale, în timp ce ASGR se găsesc pe hepatocitele parenchimale. Astfel, ar fi posibil să se realizeze o cultură cu virusul hepatitei C, prin întrebuințarea celulelor gazdă care exprimă unul sau ambii acești receptori. Se mai pot utiliza, de asemenea, culturi de celule primare care exprimă receptorii în mod natural, utilizându-se condițiile în care receptorul este sau menținut sau poate fi transferat la o altă linie celulară, cum ar fi, de exemplu, HeLa, CHO, COS și altele, cu un vector prevăzut pentru exprimarea receptorului. Clonarea receptorului de manoză și transfectarea acestuia, precum și exprimarea în fibroblaști, a fost demonstrată de către M.E. Taylor și colaboratorii, J.Biol.Chem. (1990] 265: 12156-62. Clonarea și secvențarea ASGR este descrisă de către K.Drickamer și colaboratorii în J.Biol.Chem. (1984) 259: 770 - 78 și M.Spiess și colaboratorii în Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 82: 6465-69; transfectarea și exprimarea funcțională a ASGR în celulele HTC la șobolani este descrisă de către M. Mc-Phaul și P. Berg în Proc. Nat.Acad.Sci. USA (1986) 83: 8863 - 67 și M.Mc-Phaul și P.Berg în Mol.Cell.Biol. (1987) 7: 1841-47. Astfel, este posibil să se transfecteze unul sau ambii receptori în linii celulare corespunzătoare și să se utilizeze celulele care rezultă ca celule gazdă pentru propagarea virusului hepatitei C în cultură. Trecerile seriale ale virusului hepatitei C în astfel de culturi ar avea ca rezultat dezvoltarea speciilor atenuate, corespunzătoare pentru utilizarea ca vaccinuri vii. Se mai pot utiliza, de asemenea, o serie de culturi celulare primare care exprimă în mod natural receptorul, utilizându-se condițiile în care receptorul este sau menținut sau poate fi transferat la o altă linie celulară, cum ar fi, HeLa, CHO, COS și altele, cu un vector prevăzut pentru exprimarea receptorului. Clonarea receptorului de manoză, transfectarea acestuia și exprimarea lui în fibroblaști, a fost demonstrată de către Taylor și colaboratorii, (vezi mai sus), în timp ce transfectarea și exprimarea ASGR funcționarea în celulele HTC la șobolani este descrisă de către McPhaul și colaboratorii, (vezi mai sus). în prezent este de preferat să se utilizeze o linie celulară imortalizată transfectată cu unul sau ambii receptori recombinanți.
Condițiile imunogene pot fi preparate conform metodelor cunoscute în literatura de specialitate. Compozițiile prezente cuprind o cantitate imunogenă de polipeptidă, cum ar fi, de exemplu, E1, E2 sau E1/E2 ca particule în aceste compoziții, de obicei combinate cu un vehicul acceptabil din punct de vedere farmaceutic, de preferință conținând în continuare, un adjuvant. Dacă se dorește un “cocktail”, se poate folosi o combinație de polipeptide ale virusului hepatitei C (HCV), cum ar fi, de exemplu, antigenii E1 plus E2 amestecați pentru a se obține o eficacitate crescută. Se așteaptă ca particulele like-virus ale agregatelor Ε1 /E2 să fie potrivite pentru un anumit antigen al vaccinului util. Compozițiile imunogene pot fi administrate la animale, fie pentru inducerea producerii de anticorpi, fie pentru a se constitui o sursă de anticorpi sau pentru a se induce o imunitate de protecție la animal.
Ca suporturi-vehicul acceptabile, din punct de vedere farmaceutic, pot fi utilizate oricare din suporturile care nu induc ele însele producerea de anticorpi nocivi pentru individul care primește compoziția. Ca suporturi convenabile tipice se pot întrebuința macromolecule mari, ușor metabolizabile, cum ar fi, proteine, polizaharide, acizi polilactici, acizi poliglicolici, acizi aminopolimerici, copolimeri de aminoacizi și particule de virusuri inactive. Astfel de suporturi sunt bine cunoscute în referatele de specialitate. Adjuvanții preferați pentru a produce o mărire a eficacității compoziției, includ, dar fără să se ea acestea, hidroxidul de aluminiu (alumj, N-acetil-muramil-L-threonil-DRO 115446 Bl
445 izoglutamina (thr-MDP) - așa cum este menționat, în US 4605918 N-acetilnormuramil-L-alanil-D-izoglutamina (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutaminil-Lalanin-2-(T,2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) și RIE3I, care conțin trei componente extrase din bacterii, monofosforil lipid A, dimicolat trehaloza și scheletul cu pereți celulari (MPL+TDM+CWS) într-o emulsie 2 % squalen/TweenR 80. în plus, se pot utiliza și adjuvanți, ca, de exemplu, Stimulon (Cambridge, Bioscience, Worcester, MA). în continuare se mai pot utiliza adjuvanți ca Complete Freund's Adjuvant (CFA) și Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA), pentru aplicații neumane și pentru scopuri de cercetare.
Compozițiile imunogene conțin, în mod tipic, suporturi acceptabile din punct de vedere farmaceutic, cum, ar fi de exemplu, apa, soluțiile saline, glicerolul, etanolul, etc. în plus, în aceste suporturi pot fi incluse substanțe auxiliare, cum ar fi, agenții de emulsionare sau agenții de umectare.
în mod tipic, compozițiile imunogene sunt preparate ca produse injectabile, fie sub formă de soluții lichide, fie ca suspensii; se pot prepara, de asemenea, forme sub formă solidă, atât pentru soluții sau suspensii. Prepararea poate fi, de asemenea, sub formă de emulsionare sau încapsulare în lipozomi pentru a se mări astfel efectul adjuvantului.
Compozițiile imunogene utilizate ca vaccinuri cuprind o cantitate efectivă imunologic de polipeptidă a virusului hepatitei C(HCV), ca și oricare alte componente menționate mai sus, dacă este necesar. “Cantitatea efectivă imunologic” reprezintă cantitatea administrată la un individ, fie într-o doză unică, fie ca serii parțiale și care este efectivă pentru tratament, așa cum s-a definit mai înainte. Această cantitate variază dependent de condițiile de sănătate și de condițiile fizice ale individului care trebuie tratat, de gruparea taxonomică a individului care trebuie tratat (de exemplu, primatele neumane, primatele, etc], dependent de capacitatea sistemului imunitar al individului care este tratat, pentru sintetizarea anticorpilor, dependent de gradul de protecție dorit, de formula vaccinului, de aprecierea situației medicale de către medicul care efectuează tratamentul, de specia de infectare cu virusul hepatitei C și de alți factori relevanți. Este de așteptat ca să poată fi determinată prin experimentări de rutină.
Agregatele E1/E2 cu autoasamblare pot servi, așadar, ca suport pentru vaccinuri la haptensul heterolog prezent (non-virusul hepatitei C), în același fel, ca în cazul antigenului de suprafața al hepatitei B (EP 174444], în aceată utilizare, agregatele E1/E2 prevăd un vehicul imunogen capabil să stimuleze un răspuns imun la haptenși sau la antigenii conjugați la agregat. Antigenul poate fi conjugat fie prin metode chimice convenționale, fie poate fi donat în gena care codifică proteinele E1 și/sau E2 la locul corespunzător unei regiuni hidrofile a proteinei.
Compozițiile imunogene sunt, în mod convențional, administrate pe cale parenterală, tipic prin injectare, de exemplu, pe cale subcutanată sau pe cale intramusculară. Formulele adiționale convenabile pentru alte moduri de administrare includ formulele orale și supozitoarele. Dozajul pentru tratament poate fi sub formă de doză unică în serie sau, de asemenea, în serie de doze multiple. Vaccinul poate fi administrat în asociere cu alte agente de imunoreglare.
în continuare, se dau 4 exemple de realizare a invenției.
Exemplul 1. Clonarea și exprimarea (A) Vectorii sunt construiți din plasmidele care conțin porțiunea 5' a genomului hepatitei C(HCV), așa cum este descris în EP 318216 și EP 388232. Caseta virusului hepatitei C, HCV (S”B) conține Stul-Bglll fragment de acid dezoxiribonucleic DNA, care codifică porțiunea terminală 5' a proteinei de la Met 1 până la Leu 906, începând
450
455
460
465
470
475
480
485
490
RO 115446 Bl de la nucleotida 63 cu referire la Met 1. Aceasta include partea interioară a proteinei (C), proteina E1 (care uneori se referă la S), la proteina E2 (care se referă așadar la NS 1) și porțiunea 5' a regiunii NS 2a. După exprimarea construcției, proteinele individuale C, E1 și E2 sunt produse prin procedee proteolitice.
Casa virusului hepatitei C, HCV (A/B) conține fragmentul de acid dezoxiribonucleic DNA ApaLI-BglII care codifică porțiunea terminală 5' a poliproteinei de la met 1 până la Leu 906, începând cu nucleotida 6 în raport cu Met 1. Aceasta include porțiunea interioară a proteinei (C), proteina E1 (uneori se referă la S], proteina E2 (se referă așadar la NS1) și o porțiune 5' din regiunea din regiunea NS2a. După exprimarea construcției, proteinele individuale C, E 1 și E2 sunt produse prin procedee proteolitice.
Caseta C - E (S/B) (o porțiune Stul-BamHI) conține terminația 5' dela Met 1, până la lle 340 (o genă cu porțiunea BamHI). Exprimarea acestei casete are ca rezultat exprimarea lui C și uneori a proteinelor selecționate E1 (WT). Porțiunea selecționată de la partea terminală 3' este o regiune hidrofobă care se crede că servește ca semnal de translocare.
Caseta NS 1 (B/B) (o porțiune BamHI-BglII) conține o porțiune mică 3' de proteină E1 (din Met 364) toate proteinele E2 și o porțiune NS2a (până la Leu 906). în această construcție, fragmentul E1 servește ca semnal de translocare.
Caseta TPA-NSI utilizează un lider activator (PA) plasmogenic din țesutul uman ca semnal de translocare, în loc de porțiunea 3' a proteinei E1. Caseta care conține o formă selecționată de proteină E2, de la Gly 406 până la Glu 661, în care porțiunea 3' terminală hidrofobă, se elimină.
Fiecare casetă care este inserată în vectorul pGEM»Z (Promega)cu și fără secvența necodificată sintetică beta-globulina 5', pentru transcripție și translație, utilizează T7 și exprimarea reticulocitului la iepure, in vitro. Vectorii (rW) virusului vaccinului recombinant sunt preparați prin inserarea casetelor în plasmidul pSC 11 (obținut prin experimentările Domnului B.Moss, NIH), după care urmează recombinarea cu virusul vaccinului, (conform descrierii lui Charkrabarty și colaboratorii, Mol. Cell.Biol. (1985), 5:3403-09.
(B) □ exprimare alternativă a vectorului se prezintă prin construcția realizată prin inserarea virusului hepatitei C, HCV (A/B) între porțiunile Stul și Spel ale pSC% (obținute de către D-nul B.Mess, NIH), după care urmează recombinarea cu virusul de vaccinare (așa cum l-a descris Charkrabarty și colaboratorii, în Mol.Cell.Biol. (1985) 5:3403-09).
(C) Celulele HeLA S3 sunt colectate ca urmare a centrifugării, timp de 7 min, la 2000 rot/min, la temperatura camerei, în flacoane de centrifugare sterile de 500 ml capacitate (cu rotor Ja-10). Paletele sunt resuspendate la o concentrație finală de 2x107 celule/ml în adiție la mediu de cultură (Joklin în mediu modificat MEM Spinner + ser de cal + 5 % și gentamicina) (“mediu spiner”). Stocul brut de virusuri w(S C 59virusul hepatitei C) sonicat, este adăugat la o multitudine de infecții ale celulelor, (pfu/celulă) și amestecul obținut este menținut sub agitare, la temperatura de 37°C, timp de 30 min. Celulele infectate sunt apoi transferate în flaconul de experimentare care conține 8 I mediu spinner și care se inoculează apoi, timp de 3 zile, la temperatura de 37°C.
Celulele din cultură sunt apoi colectate prin centrifugare și peletele sunt suspendate în mediu tampon (10 mM Tris-HCI, la pH=9,0, în 152 ml). Celulele sunt apoi omogenizate, utilizându-se un omogenizator Dounce de 40 ml capacitate (50 stokes) și nucleele sunt peletate prin centrifugare (timp de 5 min, la o viteză de 1600 rot/min,
RO 115446 Bl la temperatura de 4°C, în rotor JA-2O). Peletele nucleare sunt resuspendate în mediu tampon Tris (24 ml), reomogenizate și peletate din nou, după care se comasează toți supernatanții.
Lizatul comasat este divizat în alicoți de 10 ml și se supun sonicării de trei ori a câte 30 min, într-o pâlnie de sonicare la o putere medie. Lizatul sonicat (15 ml] este adus în 17 ml de conținut material de sucroză (36%) în tuburi de centrifugare SW28 și se centrifughează la 135000 rot/min, timp de 80 min, la 4°C, pentru peletarea virusului. Virusul peletat este resuspendat într-un mililitru de amestec tampon tris (1mM tris HCI, la pH=9,0) și se coagelează, la temperatura, de -80°C.
Exemplul 2. Compararea produselor in vitro și in vivo (A) proteinele E1 și E2 sunt exprimate ambele in vitro și in vivo și 35 S-Met este marcat utilizând vectorii, descriși în exemplul 1 de mai sus. Celulele BSC-40 și HeLa sunt infectate cu vectorii rW pentru exprimarea in vitro. Atât mediul, cât și lizatele celulare sunt examinate pentru proteinele recombinate. Produsele au fost imunoprecipitate utilizându-se ser uman imunizat pentru virusul hepatitei C (HCV), în timp ce proteinele in vitro au fost analizate direct. Proteinele sunt analizate prin SDSPAGE.
Sistemul de exprimare reticulocitic (pGEM3Z cu HCV(S/B] sau HCV(A/B] produce proteinele C, E1 și E2 având greutăți moleculare, de aproximativ 18kD, 35kD și respectiv 72 kD. Lizatele din celulele BSC-40 și HeLa sunt transfectate cu vectorii rW și conțin HCV(S/B), HCV(A/B) sau C-E1(S/B) prezentând aceleași proteine. Deoarece sistemul reticulocitic nu prevede un proces Golgi eficient și deci, nu se prevede acidul sialic, atât in vitro cât și in vivo. Numai vectorul rW care conține TPA-NB 1 are ca rezultat orice secreție extracelulară de E2, care prezintă o mobilitate modificată consistentă cu sialilare.
(B) HCV (S/B) este exprimat in vitro și este incubat cu o grupare de lectină biotinilată: GNA, PNA, WGA și ConA. După incubare complecșii sunt colectați pe sfere acrilice de avidin, apoi sunt spălate, eluate cu un mediu tampon laemmli și analizate prin SDS-PAGE. Rezultatele arată că proteinele E1 și E2 se leagă de GNA și ConA, care indică prezența manozei. Legăturile GNA la grupările de manoză terminale au loc odată cu legarea ConA la orice manoză legată în poziția alfa. Absența legăturilor la SNA, PNA și WGA indică faptul că niciuna din proteine nu conține acid sialic, galactoză, N-acetilgalactozamină sau N-acetilglucozamină.
(C) Proteinele E1 și E2 radiomarcate sunt produse în celulele BSC-40 prin infectare cu ser imun față de HCV+. O jumătate din materialul imunoprecipitat este tratat până a doua zi cu neuraminidază pentru a se îndepărta urmele de acid sialic. După tratament, proteinele tratate și proteinele netratate sunt analizate prin SDSPAGE. Nici o diferență semnificativă în mobilitate nu s-a observat, indicând lipsa sialilării in vitro.
(D) Proteinele E1 și E2 radiomarcate sunt produse în celulele BSC-40 prin infectare cu rW conținând HCV (A/B) (w) /SC 59=HCV) și apoi are loc imunoprecipitarea cu ser uman HCV+ sau precipitarea prin biotinilarea lectinei GNA legată la particulele acrilice, și utilizându-se secvențele libere w/SC 11, de HCV, sub formă de control. Precipitatele au fost analizate prin SDS-PAGE. Datele au demonstrat că proteinele E1 și E2 au fost speciile majore de proteine cu terminații de manoză în celulele infectate w/SC 59-HCV. GNA a fost un antiser uman eficient în precipitarea proteinelor E1 și E2 din mediul de cultură celular. Componentul 25kD a fost observat, dar acesta pare a fi specific celulelor infectate cu vaccin.
540
545
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 115446 Bl
Exemplul 3. Purificarea prin utilizarea lectinei (A) Celulele HeLa sunt inoculate cu purificarea stocului de virusuri w/SCS9-HCV cu titru înalt, la o multiplicare de infecții de 5 pfu/celulă și amestecul este agitat, la temperatura, de 37°C timp, de 30 min. Celulele infectate sunt apoi transferate în flaconul de experimentare conținând mediu spiner 8 I și apoi sunt incubate timp de 3 zile, la temperatura de 37°C. Celulele sunt apoi colectate din nou prin centrifugare și resuspendate în soluție hipotonică (20 mM HEPES, 10 mM NaCI, 1 mM MgCI2, 120 ml] pe gheață. Celulele sunt apoi omogenizate cu ajutorul unui omogenizator Duonce (50 stokes] și nucleele sunt peletate prin centrifugare (5 min la 1600 rot/min, la 4°C, cu rotorul JA-20). Peletele sunt comasate, resuspendate în 48 ml tampon hipotonic, reomogenizate, recentrifugate, recomasate și congelate la -80°C. Supernatanții congelați sunt apoi, decongelați și fracțiunea de membrană microzomală a lizatului post-nuclear este izolată prin centrifugare, timp de 20 min, pe rotor JA-20 la o viteză de 13500 rot/min, la temperatura de 4°C. Supernatantul este apoi îndepărtat prin aspirație. Peletele sunt luate apoi cu 96 ml de amestec tampon conținând detergent (20 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,5 % Triton X-100, pH= 7,5] și apoi se omogenizează (la 50 stokes). Produsul este clarificat prin centrifugare, timp de 20 min, la 13500 rot/min, la 4°C și supernatanții sunt colectați. Coloana de agaroză GNA 1x3 cm, 3 mg de sfere GNA per ml, 6 ml volumul stratului (Vector Labs, Burligame, CA) a fost pre-echilibrată cu un amestec tampon cu detergent. Proba de supernatant a fost aplicată pe o coloană cu recirculare într-o proporție de 1 ml /min, timp de 16...20 h, la temperatura de 4°C. Coloana a fost apoi spălată cu amestecul tampon cu detergent. Proteinele E1/E2 purificate sunt eluate cu alfa-Omanozid (0,9M în amestec tampon cu detergent), într-o proporție de 0,5 ml /min. Eluarea este oprită la apariția proteinelor E1/E2 în eluat și coloana este lăsată să se echilibreze din nou, timp de 2...3 h. Fracțiunile sunt analizate prin sistem cu pată Western și prin colorare cu argint. Fracțiunile de vârf sunt reunite și iradiate la ultraviolet pentru inactivarea oricărui virus de vaccină, rezidual.
(B) Agaroza GNA este utilizată pentru purificarea asialoglicoproteinelor E1 și E2 atunci când sunt sedimentate pe gradiente de glicerol 20...60 %. Gradientele sunt fracționate și proteinele sunt analizate prin SDS-PAGE și prin sistemul de pătare Western. Petele sunt probate cu GNA pentru identificarea proteinelor E1 și E2. Rezultatele arată că sunt prezenți dimerii E1 :E2, care se sedimentează în proporția așteptată (de exemplu, în proporția caracteristică a proteinei 110 kD). Agregatele mai mari ale proteinelor de acoperire a virusului hepatitei C sunt așadar aparente, de asemenea, homodimerii proteinelor E1 și E2 sunt aparenți. Proteina E2 pare a fi superior reprezentată într-un număr mai mare de specii față de proteina E1, așadar au fost, de asemenea, detectate specii discrete de E1 :E2. Agregatele mai mari sunt sedimentate mai rapid față de markerul de tiroglobulină.
(C) După purificarea proteinelor E1 și E2 pe GNA-agaroză, acestea sunt sedimentate prin gradient de glicerol 20...60 % conținând 1mM EDTA. Fracțiunile sunt analizate prin SDS-PAGE, cu și fără beta-mercaptoetanol (betaME). Nu s-a observat nici o diferență sau doar o mică diferență în abundența aparenței proteinelor E1 și E2 în prezența sau în absența beta-mercaptoetanolului (beta-ME), indicându-se astfel absența legăturilor bisulfurice între heterodimeri.
(D) Complecșii de proteine E1/E2 (aproximativ, 40 % puritate] sunt analizați într-un analizator de tip Coulter DM-4 submicroni particule). Materialul este detectat, la 20...60 nm.
(E) Complecșii de proteine E1/E2 (aproximativ, 40 % puritate) sunt analizați
RO 115446 Bl prin microscopie electronică utilizându-se colorarea negativă cu acid fosfotungstic. Micrograful electronic demonstrează prezența particulelor, având aparență sferică și un diametru de, aproximativ 40 nm. Complecșii de E1/E2 sunt incubați cu ser imun uman HCV+, apoi sunt analizați prin EM cu colorare negativă. Au fost observați și complecșii anticorpilor conținând agregate mari și particule mici.
Exemplul 4. Purificarea cromatografică (A) Materialul purificat pe lectina GNA preparat, așa cum s-a descris în exemplul 3 (0,5...0,8 ml) s-a diluat de 10 ori cu tampon A (20 mM Tris-CI tampon, la pH=8,0, cu 1 mM EDTA) și s-a aplicat pe o coloană de 1,8 x 1,5 cm de Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersy, nr. Catalog 16883) echilibrată cu tampon A. Fracțiunea de proteină care conține proteinele E1/E2 este eluată cu același amestec tampon într-un gradient de 0,2 ml/min și fracțiunile de 1 ml sunt apoi colectate. Fracțiunile care conțin proteinele E1 și E2 (determinate prin SDS-PAGE) sunt comasate și depozitate, la temperatura, de -80°C.
(B) Materialul purificat în partea (A) de mai sus are o puritate de 60...80 %. Așa cum s-a estimat prin SDS-PAGE. Identificarea benzilor putative E1 și E2 a fost confirmată prin analiza secvențială la N-terminal după utilizarea tehnicii de transfer, în acest scop, Fractogel-DEAE este utilizat pentru purificarea materialului E1/E2, acest material fiind apoi redus prin adăugare de amestec tampon Laemmli (la pH=6,8, cu 0,06 mM tris, 2,3 % SDS, în glicerol de concentrație 10%, cu 0,72 M beta-mercaptoetanol) și apoi se fierbe, timp de 3 min. Proba este apoi încărcată pe gel de poliacrilamida 10%. După SDS-PAGE, proteina s-a transferat pe o membrană de difluorură de poliviniliden de 0,2 pm (PVDF) (Bio-Rad laboratories, Richmond, CA). Benzile respective de proteină putative E1 și E2 sunt excizate din petele respective și supuse analizei acidului aminic N-terminal și astfel, nu este luată nici o măsură specială pentru prevenirea blocajului amino-terminal, în timpul preparării acestui material.Primele 15 cicluri demonstrează că proba E1 are o secvență de:
Tyr-GI n-Va l-Arg-X-Se r-Thr-Gly-X-Ty r-H is-Va l-X-As n-Asp, în timp ce secvența de E2 este:
Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe.
Secvența de aminoacid cuprinde date conform celor prevăzute din secvențele de aminoacid dezoxiribonucleic DNA corespunzătoare. Produsul E1/E2 purificat mai sus prin cromatografie de Fractogel-DEAE se crede a fi agregat, așa cum s-a evidențiat prin faptul că o mare cantitate de E1/E2 este coeluată în zona cu volum nul din coloana cromatografică de permetare a gelului BioSil TSK-4000SW. Aceasta arată, în condiții native, o cantitate semnificativă de complex E1/E2 cu greutatea moleculară, de cel puțin 800 kD. S-a observat, de asemenea, și materialul E1/E2 având o greutate moleculară, de aproximativ 650 kD.
Claims (8)
1. Procedeu de obținere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei C, caracterizat prin aceea că, cuprinde: dezvoltarea pe un mediu de cultură adecvat a unei celule-gazde tansformată cu o genă structurală ce codifică o asiaioglicoproteină a virusului hepatitei C selectată din grupul E1 și/sau E2, provocarea expresiei genei structurale în condiții care favorizează inhibarea sialilări; și izolarea asialoglicoproteinelor virusului hepatitei C din cultura de celule prin cuplarea cu o proteină care leagă manoza terminală.
640
645
650
655
660
665
670
675
680
RO 115446 Bl
2. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că gena structurală, care codifică asialoglicoproteina virusului hepatitei C este legată de o secvență care determină un lieder de secreție cu rolul de a dirija asialoglicoproteinele la reticulul endoplasmatic.
3. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, condițiile care favorizează inhibarea sialilării cuprind expresia proteinelor cu o viteză suficientă pentru inhibarea transportului glicoproteinelor de la reticulul endoplsmatic la aparatul Golgi și prezența unei cantități suficiente dintr-un modulator de calciu, de preferință thapsigargin, care provoacă eliberarea proteinelor în reticulul endoplasmatic al celuleogazdă.
4. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că proteina de legare a manozei terminale este o lectină, de preferință aglutinina din Galanthus nivalus.
5. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că izolarea asiloglicoproteinelor virusului hepatitei C cuprind:incubarea compoziției obținută în primele două faze, timp de 1 h, pe o coloană cu lectina capabilă să lege manoza terminală imobilizată pe un suport și eluarea cu manoză a asialoglicoproteinlor virusului hepatitei C.
6. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se obțin asialoglicproteine de tipul E1 sau E2 sau conținând o secvență de aminoacizi din domeniul E1 sau E2 a virusului hepatitei C.
7. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că asialoglicoproteinele virusului hepatitei C astfel obținute intră în componența unor compoziții ce conțin agregate E1/E2 purificate.
8. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că asialoglicoproteinele virusului hepatitei C astfel obținute sau agregatele lor sunt componente active ale unui vaccin, respectiv ale unui reactiv de imunodeterminare.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61141990A | 1990-11-08 | 1990-11-08 | |
| US61196590A | 1990-11-08 | 1990-11-08 | |
| US75888091A | 1991-09-13 | 1991-09-13 | |
| PCT/US1991/008272 WO1992008734A1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Hepatitis c virus asialoglycoproteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO115446B1 true RO115446B1 (ro) | 2000-02-28 |
Family
ID=27417050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO93-00626A RO115446B1 (ro) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0556292B2 (ro) |
| JP (8) | JPH06504431A (ro) |
| AT (1) | ATE188220T1 (ro) |
| AU (1) | AU668078B2 (ro) |
| CA (2) | CA2095521C (ro) |
| CZ (1) | CZ289006B6 (ro) |
| DE (1) | DE69131882T3 (ro) |
| DK (2) | DK0842947T4 (ro) |
| ES (1) | ES2139591T5 (ro) |
| FI (1) | FI107803B (ro) |
| GR (1) | GR3032771T3 (ro) |
| HU (2) | HUT66063A (ro) |
| NO (2) | NO304380B1 (ro) |
| PT (2) | PT99466B (ro) |
| RO (1) | RO115446B1 (ro) |
| SK (3) | SK286106B6 (ro) |
| WO (1) | WO1992008734A1 (ro) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6274148B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-08-14 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus asialoglycoproteins |
| JP3158177B2 (ja) * | 1991-10-08 | 2001-04-23 | 国立感染症研究所長 | Ｃ型肝炎診断薬 |
| WO1993015193A1 (en) * | 1992-01-31 | 1993-08-05 | Abbott Laboratories | Mammalian expression systems for hcv proteins |
| UA39944C2 (uk) * | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
| ATE249838T1 (de) | 1993-05-12 | 2003-10-15 | Chiron Corp | Konserviertes motiv der hepatitis c virus e2/ns1 region |
| US5514539A (en) * | 1993-06-29 | 1996-05-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines |
| US5610009A (en) * | 1994-01-28 | 1997-03-11 | Abbott Laboratories | Mammalian expression systems for hepatitis C virus envelope genes |
| EP1845108A3 (en) | 1994-07-29 | 2007-10-24 | Innogenetics N.V. | Monoclonal antibodies to purified hepatitis c virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| WO1996004301A2 (en) * | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Chiron Corporation | Novel hepatitis c e1 and e2 truncated polypeptides and methods of obtaining the same |
| DK1510580T3 (da) | 1994-07-29 | 2009-02-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Trunkeret hepatitis C E2-polypeptid og fremgangsmåder til opnåelse heraf |
| IT1271593B (it) * | 1994-11-30 | 1997-06-04 | Sanitaria Scaligera Spa | Procedimento ed apparecchiatura per l'immunoadsorbimento specifico di virus hiv, di antigene gp120 e complesso cd4-gp120. |
| US6127116A (en) * | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
| FR2744725B1 (fr) * | 1996-02-09 | 1998-04-30 | Pasteur Institut | Anticorps specifiques des complexes formes par les glycoproteines e1 et e2 du virus de l'hepatite c, procedes de determination de la presence, et d'isolement de ces complexes |
| US6514731B1 (en) | 1996-05-24 | 2003-02-04 | Chiron Corporation | Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens |
| KR100209095B1 (ko) * | 1996-06-28 | 1999-07-15 | 성재갑 | C형 간염 바이러스의 프로테아제의 활성을 측정할 수 있는 c형 간염 대체 바이러스, 그 재조합 유전자 및 그 용도 |
| JP4021493B2 (ja) | 1996-11-08 | 2007-12-12 | ザ ガヴァメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ、レプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー、 デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サーヴィスィズ | Ｃ型肝炎ウイルス様粒子の合成および精製 |
| US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
| US7049428B1 (en) | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
| ES2328536T3 (es) | 1997-05-06 | 2009-11-13 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Produccion intracelular de polipeptido e2 truncado de la hepatitis c. |
| EP0947525A1 (en) | 1998-03-27 | 1999-10-06 | Innogenetics N.V. | Epitopes in viral envelope proteins and specific antibodies directed against these epitopes: use for detection of HCV viral antigen in host tissue |
| US7108855B2 (en) | 1998-06-24 | 2006-09-19 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| JP5175417B2 (ja) | 2000-08-17 | 2013-04-03 | トリペップ アクチ ボラゲット | リバビリンを含むワクチンおよびその使用方法 |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US7101561B2 (en) | 2000-12-01 | 2006-09-05 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| US7022323B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-04-04 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Uses of DC-SIGN and DC-SIGNR for inhibiting hepatitis C virus infection |
| US20030232745A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-12-18 | Olson William C. | Uses of DC-sign and DC-Signr for inhibiting hepatitis C virus infection |
| AU2003265454A1 (en) * | 2002-08-16 | 2004-03-03 | Ohio University | Hepatitis c viral-like particle purification |
| CA2618429A1 (en) | 2005-05-25 | 2007-03-22 | Tripep Ab | A hepatitis c virus non-structural ns3/4a fusion gene |
| WO2009022236A2 (en) | 2007-08-16 | 2009-02-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| WO2009130588A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Tripep Ab | Immunogen platform |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3886363T3 (de) * | 1987-11-18 | 2004-09-09 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | NANBV-Diagnostika |
| IL88599A0 (en) * | 1987-12-10 | 1989-07-31 | Cell Bio Group Ltd | Glycoprotein cell growth modulating materials,their preparation and compositions containing them |
| UA50829C2 (uk) * | 1989-03-17 | 2002-11-15 | Чірон Корпорейшн | Очищений поліпептид, що містить антиген вірусу гепатиту с, полінуклеотид, вектор, клітини, система експресії, моноклональне антитіло, препарат поліклональних антитіл, нуклеотидна проба, аналітичні набори, спосіб виявлення нуклеїнових кислот, способи імуноаналізу, вакцина, спосіб одержання антитіл |
| KR100206150B1 (ko) * | 1990-04-04 | 1999-07-01 | 로버트 피. 블랙버언 | 항-에이치씨브이 항체에 대한 면역분석용 씨형 간염 바이러스(에이치디브이)항원의 조합체 |
-
1991
- 1991-11-07 SK SK40-2005A patent/SK286106B6/sk unknown
- 1991-11-07 JP JP4500944A patent/JPH06504431A/ja active Granted
- 1991-11-07 DK DK97120661T patent/DK0842947T4/da active
- 1991-11-07 CZ CZ1993824A patent/CZ289006B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 DE DE69131882T patent/DE69131882T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 DK DK92900091T patent/DK0556292T4/da active
- 1991-11-07 EP EP92900091A patent/EP0556292B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 HU HU9301336A patent/HUT66063A/hu unknown
- 1991-11-07 ES ES92900091T patent/ES2139591T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 EP EP97120661A patent/EP0842947B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 HU HU9301336A patent/HU227498B1/hu unknown
- 1991-11-07 CA CA002095521A patent/CA2095521C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 AT AT92900091T patent/ATE188220T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 SK SK442-93A patent/SK285623B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 CA CA002203443A patent/CA2203443C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 RO RO93-00626A patent/RO115446B1/ro unknown
- 1991-11-07 AU AU90267/91A patent/AU668078B2/en not_active Expired
- 1991-11-07 SK SK690-97A patent/SK285624B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 WO PCT/US1991/008272 patent/WO1992008734A1/en not_active Ceased
- 1991-11-08 PT PT99466A patent/PT99466B/pt not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-05-05 FI FI932025A patent/FI107803B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-05-07 NO NO931680A patent/NO304380B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-14 NO NO972213A patent/NO304381B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-06-26 PT PT102022A patent/PT102022B/pt not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-14 JP JP10317898A patent/JP3207155B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-02-28 GR GR20000400473T patent/GR3032771T3/el unknown
-
2001
- 2001-03-02 JP JP2001059335A patent/JP2001286290A/ja not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-07-08 JP JP2002199317A patent/JP4056306B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-04 JP JP2002353148A patent/JP2003174875A/ja not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-02-10 JP JP2005035317A patent/JP2005187479A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-05-25 JP JP2006145982A patent/JP2006219503A/ja not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-10-12 JP JP2007267258A patent/JP2008031181A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RO115446B1 (ro) | Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c | |
| US6274148B1 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| RU2175657C2 (ru) | Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа | |
| RO117920B1 (ro) | Asialoglicoproteina provenind de la virusul hepatitei c, compozitie imunogena si metoda de inducere a unui raspuns imun | |
| JP2945759B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 | |
| FI107804B (fi) | Immunomäärityksissä käytettäviä hepatiitti-C-viruksen asialoglykoproteiineja | |
| CZ289923B6 (cs) | Hepatitis C virový, zkrácený asialoglykoprotein, farmaceutická kompozice s jeho obsahem a jeho pouľití | |
| IE84479B1 (en) | Hepatitis C Virus Asialoglycoproteins |