FI107804B - Immunomäärityksissä käytettäviä hepatiitti-C-viruksen asialoglykoproteiineja - Google Patents

Description

107804

Immunomäärityksissä käytettäviä hepatiitti-C-viruksen asialoglykoproteiinej a (Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta nro 932025) 5 Tämä keksintö koskee yhdistelmäproteiinien ilmentymisen ja virologian yleisiä aloja. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee glykoproteiineja, mitkä ovat hyödyllisiä hepatiitti-C-viruksen (HCV) aiheuttaman infektion diagnosoimiseksi.

Non-A, non-B -hepatiitti (NANBH) on siirtyvä tauti (tai tautiperhe), jonka uskottiin olevan ίο virusperäinen ja joka oli erotettavissa muista virusperäisistä maksasairauksien muodoista, kuten niistä joita aiheuttavat hepatiitti-A-virus (HAV), hepatiitti-B-virus (HBV), delta-hepatiittivirus (HDV), sytomegalovirus (CMV) tai Epstein-Barr-virus (EBV). Epidemiologinen näyttö viittaa siihen, että saattaa olla kolme NANBH-tyyppiä: vesiperäinen tarttuva tyyppi; vereen tai neulaan liittyvä tyyppi; sekä yksittäisesti esiintyvä, yhteisön hankkima tyyppi. Aiheuttavien aineiden 15 lukumäärä on tuntematon. Kuitenkin uusi viruslaji, hepatiitti-C-virus (HCV) on identifioitu äskettäin primääriseksi (ellei ainoaksi) syyksi veriperäiseen NANBH.een (BB-NANBH). Ks. esimerkiksi PCT WO89/046699. Hepatiitti-C näyttää olevan pääasiallinen muoto verensiirtoon liittyvään hepatiittiin lukuisissa maissa tai alueilla, mukaanlukien USA, Eurooppa ja Japani. On myös todisteita siitä, että HCV on sotkeutunut maksasolukarsinooman syntyyn.

• · • ·· * * 20 • ·

Tarve herkistä, spesifisistä menetelmistä HCV:n kantajien ja HCV-kontaminoituneen veren tai • · · *.,,; verituotteiden seulomiseksi ja tunnistamiseksi on merkittävä. Verensiirron jälkeinen hepatiitti :·. (Post transfusion hepatitis ΡΊΉ) esiintyy suunnilleen 10 % verensiirron saaneista potilaista ja * · · . ·: ·. HC V:n osuus näistä tapauksista on jopa 90 %. Pääasiallinen ongelma tässä taudissa on usein 25 tapahtuva eteneminen krooniseksi maksavaurioksi (25 - 55 %).

• ·

Potilashuolto ja myös HCV :n siirtymisen estäminen veren ja verituotteiden välityksellä tai « : läheisessä henkilökohtaisessa kosketuksessa vaatii luotettavia diagnostisia ja ennustavia välineitä • · · · nukleiinihappojen, antigeenien ja vasta-aineiden, mitkä liittyvät HCV:een, osoittamiseksi.

h ··· 30 ψ ···· ....: HCV esiintyy tartunnan saaneiden yksilöiden veressä hyvin alhaisina pitoisuuksina muiden infektiovirusten suhteen, mikä tekee viruksen osoittamisen hyvin vaikeaksi. Alhainen virus- 2 107804 kuorma on todennäköisesti pääasiallinen syy siihen, että NANB-hepatiitin aiheuttaja-aine meni niin pitkään havaitsemattomana. Vaikka se on nyt kloonattu, HCV osoittautuu yhä vaikeaksi viljellä ja kasvattaa. Niinpä on vahva tarve yhdistelmävälineestä diagnostisten HCV-proteiinien tuottamiseksi.

5

Lisäksi on suuri tarve HCV-rokotteesta. On kuitenkin äärimmäisen vaikeaa viljellä HCV:tä solulinjoissa. Täten ei ole ollut mahdollista tuottaa heikennettyjä viruskantoja saijaviennillä kudos/soluviljelmään.

io On havaittu, että kaksi HCV-proteiinia, E1 ja E2 näyttävät olevan membraaniin liittyviä asialoglykoproteiineja ilmennettynä yhdistelmäjärjestelmissä. Tämä on hämmästyttävää, koska glykoproteiinit eivät tavallisesti jää mannoosipäätteiseen muotoon imettäväisiin, vaan niitä muovataan edelleen muilla hiilihydraateilla: mannoosipäätteinen muoto on tyypillisesti vain siirtymämuoto. El:n ja E2:n tapauksessa (kuten ilmaistaan meidän jäijestelmissämme) 15 asialoglykoproteiini näyttää olevan lopullinen muoto. El (kuoriproteiini 1) on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 35 kD, mikä luetaan HCV-genomin ennustetulta El-alueelta. E2 (kuoriproteiini 2) on glykoproteiini, minkä molekyylipaino on noin 72 kD, mikä luetaan HCV-genomin ennustetulta NSl-alueelta (ei-rakenneproteiini 1), perustuen HCV:n flavivirusmalliin. Koska virusglykoproteiinit ovat usein erittäin immunogeenisiä, El ja E2 # ’.. | 20 ovat tärkeimpiä ehdokkaita käytettäväksi immunoanalyyseissä ja • · : * * *; terapeuttisissa/ennaltaehkäisevissä rokotteissa.

• · « • · • · • · · *:·*: Keksintö, että El ja E2 eivät ole sialyloituja, on merkittävä. Proteiinin erityinen muoto sanelee • · • * · · usein sen, mitkä solut toimivat sopivina isäntinä yhdistelmäilmentämistä varten. Prokariootit, • · · · 25 kuten Ecoli eivät glykosyloi proteiineja, eivätkä ne ole yleensä sopivia glykoproteiinien tuot tamiseen käytettäväksi antigeeneinä, koska glykosylaatio on usein tärkeä täyttä proteiinin • * antigeenisyyttä, liukoisuutta ja stabiilisuutta varten. Alemmat eukariootit, kuten hiiva ja sienet, »·· • t • · · * glykosyloivat proteiineja, mutta eivät yleensä kykene lisäämään siaalihappotähteitä • · •. · · hiilihydraattikomplekseihin. Täten hiivaperäiset proteiinit voivat olla antigeenisesti erilaisia • · · :... · 30 kuin niiden luonnolliset (ei-yhdistelmä) vastineet. Ilmentämistä imettäväissoluissa pidetään » *: · ·: parhaana käyttöihin, niissä tuotteen antigeenisyys on tärkeä, koska yhdistelmäproteiinin *: * ·: glykosylaation tulisi muistuttaa läheisesti villien virusproteiinien vastaavaa.

3 107804

Mitkään todisteet eivät merkitse sitä, että HCV-virus pääsisi isäntäsoluihin infektion aikana joko hepatosyyteissä löydettävien asialoglykoproteiinien tai maksan endoteelisoluissa löydettävien mannoosireseptorien ja makrofaagien (erityisesti Kupffer-solut) kautta. Yllättävästi on havaittu, että luonnon El :n ja E2:n näyte ei sisällä terminaalisia siaalihappotäh-5 teitä, vaan ne ovat vain kuoriglykosyloituneita. Pieni fraktio sisältää lisäksi terminaalista N-asetyyliglukosamiinia. Niinpä on tämän keksinnön tarkoitus aikaansaada HCV-kuoriglykoproteiineja, joista puuttuu kaikki tai olennaisesti kaikki terminaaliset siaalihappotähteet.

jo Asialo-El tai -E2 voidaan tuottaa olosuhteissa, mitkä estävät terminaalisen siaalihapon lisäyksen, esim. ilmentämällä hiivassa tai ilmentämällä imettäväissoluissa käyttäen antibiootteja helpottamaan erittymistä tai vapautumista.

El tai E2 voidaan puhdistaa affiniteetilla lektiineihin, mitkä sitovat terminaalisia 15 mannoositähteitä tai terminaalisia N-asetyyliglukosamiinitähteitä.

Immunogeeninen koostumus, mikä käsittää yhdistelmäasialoglykoproteiinia, mikä on valittu ryhmästä, minkä muodostavat HCV:n El ja E2 voidaan valmistaa yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen kanssa. Se voi mahdollisesti sisältää immunologista tehosteainetta • · ·.*·· 20 haluttaessa.

·«· • i • » • · · • · : '·· Voidaan valmistaa myös imunoanalyysiareagenssi, mikä käsittää * * yhdistelmäasialoglykoproteiinia valittuna ryhmästä, mikä muodostuu HCV:n El:stä ja E2:sta • « • · : yhdistelmänä sopivan kantajan kanssa. Toinen immunoanalyysireagenssi käsittää • · « ’ * * * 25 yhdistelmäasialoglykoproteiinia, mikä on valittu ryhmästä, mikä muodostuu HCV:n E1 :stä ja . E2:sta yhdistelmänä sopivan osoitettavan leiman kanssa.

• · ***** • · · * * t f · HCV voidaan kasvattaa soluviljelmässä, mikä käsittää sen että (a) varataan solu, mikä • » ‘f’ 30 ilmentää reseptoria, mikä on valittu ryhmästä, mikä käsittää mannoosireseptorin ja # * * asialoglykoproteiinireseptorin; (b) infektoidaan solu HCV:llä; ja (c) viljellään infektoitua solua. Solu ilmentää mieluummin yhdistelmäreseptoria.

4 107804 A. Määritelmät

Termi "asialoglykoproteiini" viittaa glykosyloituneeseen proteiiniin, mikä on olennaisen vapaa 5 siaalihappo-osista. Asialoglykoproteiineja voidaan valmistaa yhdistelmämenetelmillä tai puhdistamalla soluviljelmästä tai luonnon lähteistä. Nykyään ovat parhaina pidetyt asialoglykoproteiinit peräisin HCV:stä, mieluummin glykoproteiinit Eija E2, kaikkein mieluiten yhdistelmä-El ja -E2 (rEl ja rE2). Proteiini on olennaisen vapaa siaalihaposta tämän määritelmän mukaisesti, jos siaalihappotähteiden määrä ei olennaisesti häiritse glykoproteiinin jo sitoutumista mannoosia sitoviin proteiineihin, kuten GNA. Sialylaation tämä aste saadaan yleensä silloin, kun vähemmän kuin noin 40 % kokonais-N-liitetystä hiilihydraatista on siaalihappoa, mieluummin alle noin 30 %, vielä mieluummin alle noin 20 %, vielä mieluummin alle noin 10%, vielä mieluummin alle noin 5 % ja kaikkein mieluiten alle noin 2 %.

15

Termi "El" tässä käytettynä viittaa proteiiniin tai polypeptidiin ilmennettynä HCV- polyproteiinin 400 ensimmäisen aminohapon sisällä, johon joskus viitataan E- tai S- proteiinina. Luonnon muodossaan se on 35 kD glykoproteiini, mikä löydetään voimakkaasti membraaniin liittyneenä. Useimmissa luonnon HCV-kannoissa El-proteiini on kooditettu . * ·. j 20 viruspolyproteiinissa, mikä seuraa C-proteiinia (ydinproteiini). E1 -proteiini ulottuu • · summilleen aminohaposta 192 noin aa383:een täysmittaisessapolyproteiinissa. Termi "El"

• M

: *.. tässä käytettynä sisältää myös analogit ja typistetyt mutantit, mitkä ovat immunologisesti ristireagoivia luonnon E1 :n kanssa.

• · • · • · ♦ ♦ ♦ · :; ; 25 Termi "E2" tässä käytettynä viittaa proteiiniin tai polypeptidiin ilmennettynä HCV- polyproteiinin 900 ensimmäisen aminohapon sisällä, johon joskus viitataan NS 1-proteiinina. Luonnon muodossaan se on 72 kD glykoproteiini, mikä löydetään voimakkaasti membraaniin • · ··/ liittyneenä. Useimmissa luonnon HCV-kannoissa E2-proteiini seuraa E1 -proteiinia. E2- * · :.i i proteiini ulottuu suunnilleen aa384:stä noin aa820:een. Termi "E2" tässä käytettynä sisältää • · · 30 myös analogit ja typistetyt mutantit, mitkä ovat immunologisesti ristireagoivia luonnon E2:n *:*·: kanssa.

• · 5 107804

Termi "aggregaatti" tässä käytettynä viittaa El:n ja/tai E2:n kompleksiin, mikä sisältää enemmän kuin yhtä El- tai E2-monomeeriä. El :El-dimeerit, E2:E2-dimeerit ja El :E2-heterodimeerit ovat kaikki "aggregaatteja" tämän määritelmän mukaan. Koostumukset voivat sisältää myös suurempia aggregaattejaja niillä voi olla 800 kD ylittäviä molekyylipainoj a.

5

Termi "partikkeli" tässä käytettynä viittaa El-, E2- tai El/E2-aggregaattiin, mikä on elektronimikroskoopilla näkyvä ja minkä mitta on ainakin 20 nm. Parhaina pidettyjä partikkeleita ovat ne, joilla on karkeasti pallomainen ulkonäköjä suunnilleen 40 nm:n halkaisija elektronimikroskoopilla nähtynä.

10

Termi "puhdistettu" käytettynä proteiineihin viittaa tässä koostumukseen, missä haluttu proteiini käsittää ainakin 35 % kokonaisproteiinikomponentista koostumuksessa. Haluttu proteiini käsittää ainakin 40 %, mieluummin ainakin noin 50 %, vielä mieluummin ainakin noin 60 %, yhä vielä mieluummin ainakin noin 70 %, jopa vielä mieluummin ainakin noin 80 is %, jopa vielä mieluummin ainakin noin 90 % ja kaikkein mieluiten ainakin noin 95 % kokonaisproteiinikomponentista. Koostumus voi sisältää muita komponentteja, kuten hiilihydraatteja, suoloja, lipideitä, liuottimia ja sen kaltaisia vaikuttamatta prosentuaalisen puhtauden määritelmään niinkuin sitä käytetään tässä. "Eristetty" HCV-asialoglykoproteiini tarkoittaa HCV-asialoglykoproteiinikoostumusta, mikä on ainakin 35 % puhdasta.

• · 20 • ·· "Mannoosia sitova proteiini" tässä käytettynä tarkoittaa lektiiniä tai muuta proteiinia, mikä • · • » ·* * · sitoutuu spesifisesti proteiineihin, joilla on mannoosipäätteinen glykosylaatio (esim.

♦ asialoglykoproteiinit), esimerkiksi mannoosia sitovat lektiinit, vasta-aineet, mitkä ovat • · spesifisiä mannoosipäätteiselle glykosylaatiolle, mannoosireseptoriproteiini (R.A.B.

• · **’ * 25 Ezekowitz et ai. J Exp med (1990) 176:1785-94). asialoglykoproteiiniresptoriproteiinit , (H.Kurata et ai.. J Biol Chem (1990) 265:11295-98). seerumin mannoosia sitova proteiini (I.Schuffenecker et ai.. Cvtoeenet Cell Genet (1991) 56:99-102; K. Sastry et ai.. J Immunol ’·* (1991) 147:692-97). seerumin asialoglykoproteiinia sitova proteiini ja sen kaltaiset.

* *

Mannoosia sitovat lektiinit sisältävät esimerkiksi GNA:n, konkavaliini A:n (ConA) ja muut • » *"* 30 lektiinit, joilla on samanlaisia sitomisominaisuuksia.

• « * * Termi "GNA"-lektiini" viittaa Galanthus nivalus-agglutiniiniin. kaupallisesti saatavaan lektiiniin, mikä sitoutuu mannoosipäätteisiin glykoproteiineihin.

6 107804 "YhdisteImä"glykoproteiini tässä käytettynä on glykoproteiini, mikä ilmennetään yhdistelmäpolynukleotidista, missä rakennegeeni, mikä koodittaa glykoproteiinia, ilmennetään säätösekvenssien, mitkä eivät ole luonnossa rakennegeenin viereisiä, ohjaamina tai missä 5 rakennegeeni on muunnettu. Esimerkiksi voidaan muodostaa vektori, missä El-rakennegeeni pannaan hiivan glyseraldehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasipromoottorin (GAPDH) toiminnallisen fragmentin ohjaukseen. Nykyään parhaana pidetty promoottori hiivassa käytettäväksi on hybridi ADH2/GAP-promoottori, mikä on kuvattu US-patentissa 4,880,734, mikä käyttää GAPDH-promoottorin fragmenttia yhdessä alkoholidehydrogenaasi-2:sta jo peräisin olevan ylävirran puolen aktivointisekvenssin kanssa. Rakennegeenin muunnelmat voivat sisältää eri kodonien korvaamisen degenerointikodoneilla (esim. käyttää isännän suosimia kodoneita, eliminoida tai luoda restriktioentsyymien pätkimispaikkoja, ohjata hiuspinnirakenteen muodostusta jne.) ja kodonien, jotka koodittavat eri aminohappoja (mieluummin ei enempää kuin 10 %, vielä mieluummin alle 5 % luonnollisesta is aminohapposekvenssistä tulisi muuttaa) rajoitetun lukumäärän substituution, insertion tai poiston ja sen kaltaiset. Samoin "yhdistelmä"reseptori viittaa reseptoriproteiiniin, mikä on ilmennetty yhdistelmäpolynukleotidista, missä reseptoria koodittava rakennegeeni ilmennetään sellaisten säätösekvenssien ohjauksen alaisena, mitkä eivät ole luonnossa rakennegeenin viereisiä tai missä rakennegeeni on muunnettu.

• · • · 20 • · ·**’: Termi "eristetty polypeptidi" viittaa polypeptidiin, mikä on olennaisen vapaa muista HCV- • · : viruskomponenteista, erityisesti polynukleotideista. Polypeptidikoostumus on "olennaisen vapaa" muista komponenteista, jos koostumuksen polypeptidien paino on ainakin 70 paino-% • · ; 1 ·. polypeptidien ja muiden komponenttien yhteismäärästä, vielä mieluummin ainakin noin 80 %, • m · :: 25 vielä mieluummin noin 90 % ja kaikkein mieluiten 95 % tai enemmän. Esimerkiksi koostumus, mikä sisältää 100 pg/ml El:tä ja vain 3 Mg/ml muita HCV-komponentteja (esim.

] / DNA:ta, lipidejä jne.) on olennaisen vapaa "muista HCV-viruskomponenteista" ja täten se on • · *; 1 eristetyn polypeptidin koostumus tämän määritelmän alla.

• · • · · • · · ··· · · · • · *·♦·’ 30 Termi "eritysjohtaja" viittaa polypeptidiin mikä, kun se kooditetaan proteiinin N-päässä, aiheuttaa proteiinin erittymisen isäntäsolun viljelyväliaineeseen lukemista seuraten.

*: 1 1 · Eritysjohtaja on yleensä peräisin käytetystä isäntäsolusta. Esimerkiksi sopivat eritysj ohtaj at 7 107804 käytettäväksi hiivassa sisältävät Saccharomvces cerevisiae:n α-tekijäjohtajan (ks. US-patentti 4,870,008).

Termi "alempi eukariootti" viittaa isäntäsoluihin, kuten hiivaan, sieniin ja sen kaltaisiin.

5 Alemmat eukariootit ovat yleensä (mutta eivät välttämättä) yksisoluisia. Parhaimpana alemmat eukariootit ovat hiivoja, erityisesti Saccharomvces. Schizosaccharomvces. Kluveromvces. Pichia. Hansenula ia sen kaltaisia lajeja. Saccharomvces cerevisiae. S. carlsbereensis iaK.lactis ovat kaikkein yleisimmin käytettyjä hiivaisäntiä ja ne ovat mukavia sieni-isäntiä.

10

Termi "ylempi eukariootti" viittaa isäntäsoluihin, mitkä ovat peräisin korkeammista eläimistä, kuten imettäväisistä, matelijoista, hyönteisistä ja sen kaltaisista. Nykyään parhaina pidetyt korkeammat eukariootti-isäntäsolut ovat peräisin marsusta (esim. CHO), apinasta (esim. COS-solut), ihmisestä ja hyönteisestä (esim. Spodoptera frugiperda), Isäntäsolut voidaan panna is suspensio- tai pullo viljelmiin, kudos viljelmiin, elinviljelmiin ja sen kaltaisiin.

Termi "kalsiummodulaattori" viittaa yhdisteeseen, mikä kykenee sekventoimaan tai sitomaan kalsiumioneja solun kalvoverkon sisällä tai vaikuttaa kalsiumionipitoisuuteen solun kalvoverkon sisällä vaikuttamalla kalsiumin säätelyproteiineihin (esim.

• · *· *ί 20 kalsiumkanavaproteiinit, kalsiumpumput,jne.). Sopivat kalsiummodulaattorit sisältävät ♦ ** • · *··· * esimerkiksi tapsigargiinin, EGTArn (etyleeniglykolibis[B-aminoetyylieetteri]-N,N,N',N'- • · • ’ ] tetraetikkahapon). Nykyään parhaana pidetty modulaattori on tapsigargiini (ks. esim.

„ * O.Thastrup et ai., Proc Nat Acad Sei USA (Ί990Ί 87:2466-701.

• * • ·· • · · « · · « * » 25 Termi "immunogeeninen" viittaa aineen kykyyn aiheuttaa neste- ja/tai soluimmuunivasteen joko yksin tai liitettynä kantajaan voimistajan läsnäollessa tai poissaollessa. "Neutralointi" • · . · · ·. viitaa immuunivasteeseen, mikä sulkee infektoivan aineen infektointikyvyn joko osittain tai • · · . ·. kokonaan. "Rokote" on immunogeeninen koostumus, mikä kykenee houkuttelemaan esiin ' * · · • · · *II,* suojan HCV:tä vastaan, joko osittaisen tai täydellisen, ja mikä on hyödyllinen yksilön * « - **' 30 hoitamiseen.

• ·

Termi "biologinen neste" viittaa nesteeseen, mikä saadaan organismista, kuten seerumi, plasma, sylki, mahan eritteet, lima ja sen kaltaiset. Yleensä biologisia nesteitä seulotaan HCV- 8 107804 partikkeleiden läsnäolon varalta. Joitakin biologisia nesteitä käytetään muiden tuotteiden lähteinä, kuten hyytymätekijät (esim. Tekijä VIII:C), seerumin albumiini, kasvuhormoni ja sen kaltaiset. Sellaisessa tapauksessa on tärkeää, että lähteenä käytetty biologinen neste on viruskontaminaatiosta, kuten HCV :stä, vapaa.

5 B. Yleinen menetelmä HCV-genomin El-aluetta kuvataan EP 388,232:ssa alueena "E", kun taas E2:ta kuvataan "NS 1 ":nä. El-alue käsittää suunnilleen aminohapot 192-383 täyspitkässä 10 viruspolyproteiinissa. E2-alue käsittää suunnilleen aminohapot 384-820. Näiden proteiinien (kanta HCV-1) prototyyppien täydelliset sarjat ovat saatavilla tekniikan tasossa (ks. EP 388,232), kuten ovat yleiset menetelmätkin proteiinien kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi.

Sekä El että E2 voidaan ilmentää polynukleotidista, mikä koodittaa HCV-polyproteiinin ensimmäisiä 850-900 aminohappoa: luennan jälkeinen käsittely useimmissa eukariootti-15 isäntäsoluissa lohkaisee alkuperäisen polyproteiinin C:ksi, Elrksi ja E2:ksi. Kooditusalueen 5'-päätä voidaan typistää tuotetun C-proteiinin määrän alentamiseksi.

Asialoglykoproteiinien ilmentäminen voidaan aikaansaada lukuisilla menetelmillä.

Esimerkiksi ilmentäminen voidaan aikaansaada alemmissa eukariooteissa (kuten hiiva), mitkä • · •. * · · 20 eivät normaalisti lisää siaalihappotähdettä glykosyloituihin proteiineihin.

• · · *... · Hiivailmentämisjäijestelmissä pidetään nykyään parhaana käyttää eritysjohtajaa, kuten • · • · ** cerevisiaern α-tekijäjohtajaa niin, että proteiini ilmennetään viljelyväliaineeseen seuraten ^ ] * luentaa. Nykyään myös pidetään parempana käyttää glykosylaatiopuutteellisia mutantteja, • · \t" kuten pmr 1, koska nämä mutantit antavat vain ytimen glykosylaation ja erittävät usein • · · • · · * 25 heterologisia proteiineja suuremmalla tehokkuudella (H.K.Rudolph et ai. Cell (1989) 58:133- . 45). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita hiivalajeja, kuten Pichia oatoris. mikä ilmentää • · <# glykoproteiineja, mitkä sisältävät 8-9 mannoositähdettä kuviossa, minkä uskotaan « muistuttavan ydinglykosylaatiokuviota, mikä on havaittu imettäväisissä ja S. cerevisiae:ssa.

• · · I I I • · · · • · · • · • · *;* 30 Vaihtoehtoisesti voidaan jäljestää ilmentäminen imettäväissoluissaja sulkea terminaalinen * * glykosylaatio (siaalihapon lisäys). Yhdistelmärakenteet sisältävät mieluummin erityssignaalin sen varmistamiseksi, että proteiini kohdistetaan kohti solun kalvoverkkoa. Siirto golgiin näyttää olevan suljettu itse El:llä ja E2:lla: El :n tai E2:n korkean tason ilmentäminen imet- 9 107804 täväissoluissa näyttää pidättävän kaikkien soluproteiinien erittämistä solun kalvoverkolla tai cis-golgissa. Voidaan lisäksi käyttää glykosylaatiopuutteellista mutanttia. Ks. esimerkiksi P.Stanley, Ann Rev Genet (1984) J8:525-52. Glykosylaation tai siirron tapauksessa mutantti ilmentää E1 :tä tai E2:ta sialylaation kanssa, terminaaliset siaalihappotähteet voidaan poistaa 5 käsittelemällä neuraminidaasilla.

Saantoa tulisi edelleen lisätä käyttämällä kalsiummodulaattoria, jotta saataisiin proteiini vapautumaan solun kalvoverkon sisältä. Sopivat modulaattorit sisältävät tapsigargiinin, EGTA:n ja A23817:n (ks. esim. O.Thastmp et ai.. Proc Nat Acad Sei USA (1990) 87:2466-10 70). Esimerkiksi voidaan ilmentää suuri määrä El:tä tai E2:ta solun sisäisesti imettäväisso- luissa (esim. CHO, COS, HeLa-solut ja sen kaltaiset) transfektoimalla yhdistelmälehmänrokkovirusvektorilla. Sen jälkeen kun on annettu aikaa proteiinin ilmentämiselle ja kerääntymiselle solun kalvoverkolle, soluille viedään kalsiummodulaattori tarpeeksi suurena pitoisuutena aiheuttamaan solun kalvoverkon sisällön vapautumisen.

15 Proteiini otetaan sitten talteen viljelyväliaineesta, mikä vaihdetaan seuraavaa sykliä varten.

Voi olla lisäksi edullista ilmentää kuoriproteiinin typistettyä muotoa. Sekä El:ssä että E2:ssa näyttää olevan hyvin hydrofobinen alue, mikä ilmeisesti ankkuroi proteiinin solun kalvoverkon sisälle ja estää tehokkaan vapautumisen. Täten voidaan haluta poistaa osia . \ · 20 sekvenssistä, mikä löytyy yhdellä tai useammalla E1 :n alueista aa170-190, aa260-290 tai • · ·***: aa330-380 (numerointi on polyproteiinin alusta lähtien) ja E2:n alueella aa660-830 (ks. esim.

··· EP 388,232:n kuvio 20-1). On todennäköistä, että ainakin yksi näistä hydrofobisista alueista •: * ‘ i muodostaa transmembraanialueen, mikä ei ole välttämätön proteiinin antigeenisyydelle ja ·· • * · · mikä voidaan täten poistaa ilman haitallista vaikutusta. Paras poistettava alue voidaan • * · V ·* 25 määrittää suorittamalla pieni lukumäärä poistokokeita, mitkä ovat alan keskitason ammattilaisen taidoissa. E2:n hydrofobisen 3'-pään poisto antaa tuloksena ilmennetyn E2:n * * osan erittymisen eritetyn proteiinin ollessa sialyloitu.

• · · • · • W · • · :,: : Voidaan käyttää mitä tahansa eri vektoreista ilmentämisen saamiseen. Alemmat eukariootit, «Il *... * 30 kuten hiiva, transformoidaan tyypillisesti plasmideilla käyttäen kalsiumfosfaatti-saostus- •: · ·: menetelmää tai ne transfektoidaan yhdistelmäviruksella. Vektorit voivat replikoitua isäntäsolun sisällä itsenäisesti tai ne voivat integroitua isäntäsolun genomiin. Korkeammat eukariootit voidaan transformoida plasmideilla, mutta tyypillisesti ne tartutetaan 10 107804 yhdistelmäviruksella, esimerkiksi yhdistelmälehmänrokkoviruksella. Lehmänrokkoa pidetään erityisen parhaana, koska lehmänrokolla tartuttaminen pysäyttää isäntäsoluproteiinien ilmentymisen. Nykyään parhaina pidetyt isäntäsolut sisältävät HeLa-ja plasmasolukasvainsolulinjat. Tässä jäijestelmässä tämä merkitsee sitä, että El ja E2 5 kerääntyvät pääasiallisina glykosyloituneina lajeina isäntäsolun kalvoverkolla. Koska rEl ja rE2 tulevat olemaan vallitsevat glykoproteiinit, mitkä ovat mannoosipäätteisiä, ne voidaan puhdistaa helposti soluista käyttäen lektiinejä, kuten Galanthus nivalus-agglutiniinia (GNA), mikä sitoo terminaalimannoositähteitä.

i o Proteiinit, j otka luonnostaan ilmennetään mannoosipäätteisinä glykoproteiineina, ovat suhteellisen harvinaisia imettäväisfysiologiassa. Useimmissa tapauksissa imettäväisglykoproteiini on mannoosipäätteinen vain lyhytaikaisena välituotteena glykosylaation tiellä. Se tosiasia, että HCV-kuoriproteiinit, mitkä ilmennetään yhdistelmänä, sisältävät mannoosipäätteisen glykosylaation tai (vähemmässä määrin) N-asetyyliglukosamii-15 nin, merkitsee, että HCV-proteiinit ja koko virionit voidaan erottaa ja osittain puhdistaa endogeenisistä proteiineista käyttäen lektiineitä, mitkä ovat spesifisiä terminaaliselle mannoosille tai N-asetyyliglukosamiinille. Yhdistelmäproteiinit ilmenevät autenttisina ja niiden uskotaan olevan olennaisen identtisiä niiden kuoriproteiinien kanssa, mitkä löydetään kypsässä, vapaassa virionissa tai soluun liittyvän kuoriproteiinin muodon kanssa. Täten 20 voidaan käyttää lektiineitä, kuten GNA:ta mannoosipäätteisille proteiineille, ja WGA:ta • · » · * · * * (vehnänalkioagglutiniinia) ja sen ekvivalenttia N-asetyyliglukosamiinipäätteisille proteiineille.

• ·

Voidaan käyttää lektiineitä, mitkä on kiinnitetty kiintofaasiin (esim. lektiini-Sepharose®- • · • «« * . pylväs) El :n ja E2:n erottamiseksi soluviljelynesteistä ja muita nesteitä, esim. puhdistukseen • · .. antigeenien tuottamisen aikana rokote- tai immunologiseen analyysikäyttöön.

• ♦· ··♦ 25 • · · * · #

Vaihtoehtoisesti voidaan ottaa sopiva lektiini El :n, E2:n tai HCV-virionien eristämiseksi ....: neste- tai kudosnäytteistä kohteista, joita epäillään HCV-infektiosta. Koska mannoosipäät- ♦ · . * * *. teiset glykoproteiinit ovat suhteellisen harvinaisia, sellainen menettely toimisi näytteessä • · · . läsnäolevien proteiinien puhdistamiseksi vähentäen olennaisesti taustaa. Seuraten lektiiniin • · · 30 sitomista voidaan HCV-proteiini osoittaa käyttäen anti-HCV-vasta-aineita. Jos läsnä on • · • · · _ • p kokonaisia virioneita, HCV-nukleiinihapot voidaan vaihtoehtoisesti osoittaa käyttäen PCR- • · . tekniikkaa tai muita nukleiinihappojen monistusmenetelmiä, mitkä ovat suunnattuja HCV - • · genomin säilyviin alueisiin (esim. 5'-eikoodittava alue). Tämä menetelmä sallii eri HCV- 11 107804 kantojen eristämisen ja karakterisoimisen ottamatta huomioon antigeenistä poikkeamaa tai vaihtelua, esim. tapauksissa, missä uusi kanta ei ole immunologisesti ristireagoiva vasta-aineiden valmistuksessa käytetyn kannan kanssa. On monia muitakin tapoja hyötyä ainutkertaisesta mannoosipäätteisten glykoproteiinien tunnistamisesta erityisillä lektiineillä.

5 Esimerkiksi voidaan inkuboida näytteitä, joiden epäillään sisältävän HCV-virioneja tai -proteiineja biotiini- tai avidiinileimattujen lektiinien kanssa ja saostaa proteiini-lektiinikompleksi käyttäen avidiinia tai biotiinia. Voidaan käyttää myös lektiiniafSniteettia HCV-proteiineille yhdisteiden kohdentamiseksi virioneihin terapeuttista käyttöä varten, esimerkiksi konjugoimalla viruksenvastainen yhdiste GNArhan. Vaihtoehtoisesti voidaan jo käyttää sopivia lektiineitä mannoosipäätteisten glykoproteiinien poistamiseen seerumi- tai plasmafraktioista täten alentaen HCV-kontaminaation vaaraa tai poistaen sen.

Nykyään pidetään parhaana El-ja/tai E2-asialoglykoproteiinien eristämistä raakasolulysaateista inkuboimalla immobilisoidun mannoosia sitovan proteiinin, erityisesti is lektiinin, kuten ConA:n tai GNA:n kanssa. Solut liuotetaan esimerkiksi mekaanisella rikkomisella hypotoniseen puskuriin, mitä seuraa linkous postnukleaarisen lysaatin saamiseksi ja edelleen se lingotaan, jotta saadaan raaka mikrosomimembraanifraktio. Raaka membraanifraktio liuotetaan sen jälkeen puskuriin, mikä sisältää pinta-aktiiviainetta, kuten Triton X-100:aa, NP40:tä tai sen kaltaista. Tämä pinta-aktiiviaineuutos kirkastetaan edelleen 20 liukenemattomista osasmaisista aineista linkoamalla ja tulokseksi saatua kirkastettua lysaattia • · •, 1 · · inkuboidaan kromatografiapylväässä, mikä käsittää immobilisoitua mannoosia sitovaa • · · :... · proteiinia, mieluummin GNArta, mikä on kiinnitetty kiinteään kantajaan, kuten agaroosiin tai • · : ’ · · Sepharoseen® sellaisen ajanjakson verran, mikä on riittävä sitoutumista varten, tyypillisesti * 1 16-20 tuntia. Suspensiota käytetään sitten pylvääseen, kunnes E1/E2 alkaa ilmestyä eluaattiin, • · • · • ’ ‘ 25 sitten suoritetaan inkubointia pylväässä sellaisen ajanjakson verran, mikä riittää sitoutumiseen, • · • · · *♦' tyypillisesti 12-24 tuntia. Sitoutunut materiaali pestään sitten lisäpuskurilla, mikä sisältää pinta-aktiiviainetta (esim. Triton X-100, NP40 tai sen kaltainen) ja eluoidaan mannoosilla • · ... antamaan puhdistettua asialoglykoproteiinia. Eluoitaessa pidetään parhaana eluoida vain niin • » *!1 kauan että proteiinia alkaa ilmestyä eluaattiin, missä pisteessä eluointi pysäytetään ja pylvään • · • · ♦ ; : : 30 annetaan tasapainottua 2-3 tuntia ennenkuin jatketaan proteiinin eluoimisella. Tämän uskotaan *···1 antavan riittävästi aikaa suurten proteiiniaggregaattien odotetulle hitaalle poistumisnopeudelle.

Tapauksessa, missä El ja E2 ilmennetään yhdessä natiivimuodossa (s.o. ilman membraaniin « 1 1 sitoutuvan alueen typistystä), olennainen osa asialoglykoproteiineista esiintyy El :E2- 12 107804 äggregaatteina. Elektronimikroskoopilla tutkittuna merkittävä osa näistä aggregaateista ilmenee karkeasti pallomaisina partikkeleina, joiden läpimitta on noin 40 nm, mikä on koskemattoman viruksen odotettu koko. Nämä partikkelit näyttävät olevan itsekokoontulevia aliviruspartikkeleita. Näiden aggregaattien odotetaan osoittavan kvatemääristä rakennetta, s mikä on hyvin samantapainen autenttisten HCV-virionipartikkeleiden rakenteen kanssa j a täten niiden odotetaan toimivan erittäin immunogeenisinä rokotteina.

El/E2-kompleksit voidaan edelleen puhdistaa geelikromatografialla emäksisessä väliaineessa, esimerkiksi Fractogel-DEAE:ssa tai DEAE-Sepharosessa®. Käyttäen Fractogel-DEAE-i o geelikromatografiaa voidaan saada E1 /E2-kompleksej a suunnilleen 60-80 % puhtaudella. E1 voidaan edelleen puhdistaa käsittelemällä lysiiniproteaasilla, koska Elrssä on 0-1 Lys-tähdettä. Kompleksin käsittely lysiiniproteaasilla tuhoaa E2:n ja sallii helpon El:n erottamisen.

15 HCV:n kudosspesifisyys yhdessä sen havainnon kanssa, että HCV-kuoriglykoproteiinit ovat mannoosipäätteisiä, ehdottaa että virus käyttää mannoosireseptoria tai asialoglykoproteii-nireseptoria (ASGR) päästäkseen isäntäsoluihin. Mannoosireseptoreja löydetään makrofaageissa ja maksan hiussuonipoukamasoluissa, kun taas ASGR:ja löydetään perushepatosyyteissä. Täten tulisi olla mahdollista viljellä HCV:tä käyttämällä isäntäsoluja, 20 mitkä ilmentävät yhtä tai molempia näistä reseptoreista. Voidaan käyttää joko primäärisiä • · *; *· soluviljelmiä, mitkä ilmentävät luonnostaan reseptoria käyttäen olosuhteita, missä reseptoria • · . ” * * pidetään tai toinen solulinja, kuten HeLa, CHO, COS ja sen kaltaiset voidaan transfektoida • · • · · vektorilla, mikä antaa reseptorin ilmentymisen. Mannoosireseptorin kloonauksen ja sen • · transfektion ja ilmentymisen fibroblasteissa on demonstroinut M.E.Taylor et ai.. J Biol Chem • · · ] ·:. # 25 (1990) 265:12156-62. ASGR:n kloonauksen j a sekventoimisen kuvasi K. Drickamer et ai.. J_ * · m ' Biol Chem (1984) 259:770-78 ja M. Spiess etal, Proc Nat Acad Sei USA (1985) 82:6465- ....: 69; funktionaalisen ASGR:n transfektion ja ilmentämisen rotan HTC-soluissa kuvasi M.

.*··. McPhaul ja P. Berg, Proc Nat Acad Sei USA (1986) 83:8863-67 ja M. McPhaul ja P. Berg, • · · . ’. < Mol Cell Biol (1987) 7:1841 -47. Täten on mahdollista transfektoida yksi tai molemmat • · · /··' 30 reseptorit sopiviin solulinjoihin ja käyttää tulokseksi saatuja soluja isäntäsoluina HCV:n • ♦ • · · * # kasvattamiseen viljelmässä. HCV:n saijaviennin sellaisiin viljelmiin tulisi antaa tuloksena . sellaisten heikennettyjen kantojen kehittymistä, mitkä ovat käyttökelpoisia elävinä rokotteina.

• ·

Voidaan käyttää joko primäärisiä soluviljelmiä, mitkä ilmentävät reseptoria luonnostaan 13 107804 käyttäen olosuhteita, joissa reseptori säilyy tai muita solulinjoja, kuten HeLa, CHO, Cos ja sen kaltaisia voidaan transfektoida vektorilla, mikä antaa reseptorin ilmentymän. Mannoosireseptorin kloonauksen ja sen transfektion ja ilmentämisen fibroblasteissa on demonstroinut Taylor et ai, yllä, kun taas transfektion ja funktionaalisen ASGR:n s ilmentämisen rotan HTC-soluissa kuvasi McPhaul et ai., yllä. Nykyään pidetään parhaimpana käyttää kuolemattomaksi tehtyä solulinj aa, mikä on transfektoitu yhdellä tai molemmilla yhdistelmävektoreilla.

Immunogeenisiä koostumuksia voidaan valmistaa alalla tunnetuin menetelmin. Nämä 10 koostumukset käsittävät immunogeenisen määrän polypeptidiä, esim. Eritä, E2:ta tai E1/E2-partikkelikoostumuksia, tavallisesti yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, mieluummin edelleen käsittäen apuainetta. Jos halutaan "cocktail", voidaan HCV-poly-peptidien yhdistelmä, kuten esimerkiksi El - plus E2-antigeenit, sekoittaa yhteen voimistettua tehoa varten. El/E2-aggregaattien viruksenkaltaisten partikkeleiden odotetaan antavan is erityisen hyödyllisen rokoteantigeenin. Immunogeenisiä koostumuksia voidaan antaa eläimille vasta-aineiden tuotannon indusoimiseen joko antamaan vasta-aineiden lähteen tai indusoimaan suojaavan immuniteetin eläimessä.

Farmaseuttisesti hyväksyttävät kantajat sisältävät minkä tahansa kantajan, mikä ei itse indusoi 20 vasta-aineiden tuotantoa, mikä on haitallinen yksilölle, mikä saa koostumusta. Sopivat kantajat • · *. ’ ·: ovat tyypillisesti suuria, hitaasti metaboloituvia makromolekyylejä, kuten proteiineja, • · · polysakkarideja, polymaitohappoja, polyglykolihappoja, polymeerisiä aminohappoja, • · • * ; * * aminohappokopolymeerejä ja inaktiivisia viruspartikkeleita. Sellaiset kantajat ovat alan t’ * keskitason ammattilaisille hyvin tunnettuja.

• · « · · • · · • · ♦

Parhaina pidetyt apuaineet, mitkä vahvistavat koostumuksen tehoa sisältävät, mutteivät ole ____. niihin rajoitettuj a: alumiinihydroksidin (alum), N-asetyylimuramyyli-L-treonyyli-D-isogluta- ♦ · ,···_ miinin (thr-MDP), kuten esitetään US-patentissa 4,606,918, N-asetyylinormuramyyli-L- . . alanyyli-D-isoglutamiinin (nor-MDP), N-asetyylimuramyyli-L-alanyyli-D-isoglutaminyyli-L- • · · • · · 1 alaniini-2-(l'-2'-dipalmitoyyli-sn-glysero-3-hydroksifosforyylioksi)etyyliamiinin (MTP-PE) ja * · · • · * * * RJOBIn, mikä sisältää kolmea komponenttia, mitkä on uutettu bakteereista, monofos- [ foryylilipidi A:ta, trehaloosidimykolaattia ja soluseinämän runkoainetta (MPL+TDM+CWS) 2 %:ssa skvaleeni/Tween® 80-emulsiossa. Lisäksi voidaan käyttää lisäaineita, kuten 14 107804

Stimuloida (Cambridge Bioscience, Worchester, MA). Lisäksi voidaan käyttää Complete Freund's Adjuvant'ia ja Incomplete Freund's Adjuvant'ia (IFA) ei-ihmisille tarkoitettuun käyttöön ja tutkimustarkoituksiin.

s Immunogeeniset koostumukset sisältävät tyypillisesti farmaseuttisesti hyväksyttäviä vehikkeleitä, kuten vettä, suolaliuosta, glyserolia, etanolia jne. Lisäksi voidaan sellaisiin vehikkeleihin sisällyttää apuaineita, kuten kostutus- tai emulgointiaineita, pH-puskuriaineita ja sen kaltaisia.

10 Immunogeeniset koostumukset valmistetaan tyypillisesti injektoitaviksi joko nesteliuoksina tai suspensioina; kiinteitä muotoja, mitkä ovat sopivia liuotettavaksi tai suspendoitavaksi nestemäisiin vehikkeleihin ennen injektiota, voidaan myös valmistaa. Valmiste voidaan myös emulgoida tai kapseloida liposomeihin voimistunutta apuainevaikutusta varten.

is Rokotteina käytetyt immunogeeniset koostumukset käsittävät immunologisesti tehokkaan määrän HCV-polypeptidiä ja myös mitä tahansa yllämainituista komponenteista tarpeen mukaan. "Immunologisesti tehokas määrä" merkitsee että tuon määrän antaminen yksilölle joko yhtenä annoksena tai Saijan osana on tehokas hoitoa varten, kuten määriteltiin yllä. Tämä määrä vaihtelee riippuen hoidettavan yksilön terveydestä ja fyysisestä kunnosta, hoidettavien 20 yksilöiden taksonomisesta ryhmästä (esim. ei-ihmiskädelliset, kädelliset, jne.) yksilön • · . *: immuunij äij estelmän kapasiteetista syntetisoida vasta-aineita, halutun suoj an asteesta, • · * · · · * rokotteen formulaatiosta, hoitavan lääkärin arviosta lääketieteellisestä tilanteesta, infektoivan • · • · • * ] HCV:n kannasta ja muista relevanteista tekij öistä. Odotetaan, että se määrä on suhteellisen ^ * laaja-alainen, mikä voidaan määrittää rutiinikokeiden avulla.

• · • · · 25 • · · • · ·

Itsekokoontuvat E1 /E2-aggregaatit voivat myös toimia rokotekantajina esittääkseen _ . heterologisia (ei-HCV) hapteenej a samalla tavalla kuin hepatiitti-B-pinta-antigeenit (ks. EP- • · . · · ·. patenttihakemus 174,444). Tässä käytössä E1 /E2-aggregaatit antavat immunogeenisen • · · . *. kantajan, mikä kykenee stimuloimaan immuunivasteen hapteeneille tai antigeeneille, jotka on • · · • · · ‘Il.* 30 konjugoitu aggregaattiin. Antigeeni voi olla konjugoitu joko tavanomaisilla kemiallisilla • · • · * * * menetelmillä tai se voidaan kloonata geeniin, mikä koodittaa E1 :tä ja/tai E2 :ta asemassa, mikä [ vastaa proteiinin hydrofiilistä aluetta.

• * 15 107804

Immunogeeniset koostumukset annetaan tavanomaisesti parenteraalisesti, tyypillisesti injektiona, esimerkiksi ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti. Muut koostumukset, mitkä ovat sopivia muihin antotapoihin, sisältävät suun kautta annettavat koostumukset ja peräpuikot. Annoshoito voi olla yhden annoksen suunnitelman tai monien annoksien suunnitelman 5 mukainen. Rokote voidaan antaa muiden immunologiaa säätelevien aineiden yhteydessä.

C. Esimerkit

Alla esitetyt esimerkit annetaan lisäohjeena alan keskitason ammattilaiselle, eikä niitä ole ίο tulkittava rajoittamaan keksintöä millään tavalla.

Esimerkki 1 (Kloonaus j a ilmentäminen) is (A) Rakennettiin vektoreja plasmideista, mitkä sisälsivät HCV-genomin 5-osan, kuten on kuvattu julkaisuissa EP-318,216 ja EP-388,232. Kasetti HCV(S/B) sisältää StuI-Bglll-DNA-fragmentin, mikä koodittaa polyproteiinin 5'-päätä Meti :sta Leu^een alkaen nukleotidista -63 Meti:n suhteen. Tämä sisältää ydinproteiinin (C), El-proteiinin (johon joskus viitataan S:nä), E2-proteiinin (johonmyös viitataanNSlrnä) jaNS2a-alueen 5-osan. Rakennetta 20 ilmennettäessä yksittäisiä C-, El- ja E2-proteiineja tuotetaan proteolyyttisella käsittelyllä.

• · • · • · · • · • · ·

Kasetti HCV(A/B) sisältää ApaLI-Bg 1 II-DNA-fragmentin, mikä koodittaa polyproteiinin 5'- • · • · : * ’ päätä Meti :sta Leu^een alkaen nukleotidista -6 Meti :n suhteen. Tämä sisältää ydinproteiinin ‘ (C), El-proteiinin (johon joskus viitataan S:nä), E2-proteiinin (johon myös viitataan NS l:nä) • · 25 ja NS2a-alueen 5-osan. Rakennetta ilmennettäessä yksittäisiä C-, El-ja E2-proteiineja • · • · · tuotetaan proteolyyttisella käsittelyllä.

• · . ·... Kasetti C-E1 (S/B) (StuI-BamHI-osa) sisältää 5'-pään Meti :sta Ile3o4.'ään (BamHI-paikka . ·. geenissä). Tämän kasetin ilmentäminen antaa tuloksena C:n ja jonkin verran typistetyn El :n • t · 1 (EΓ) ilmentymisen. 3'-päästä typistetty osa on hydrofobinen alue, minkä uskotaan toimivan - · · • · translokaatiosignaalina.

• · « • ·

Kasetti NS 1 (B/B) (BamHI-Bglll-osa) sisältää pienen 3'-osan El :tä (alkaen Metsistä), kaiken E2:n ja osan NS2a:ta (Leugoö asti). Tässä rakenteessa El-fragmentti toimii translokaatio- signaalina.

16 107804 5 Kasetti TPA-NS1 käyttää ihmisen kudoksen plasminogeeniaktivaattori- (tPA)-johtajaa translokaatiosignaalina E1 :n 3'-osan sijasta. Kasetti sisältää E2:n typistetyn muodon Gly406:sta Glu^i-’een, missä hydrofobinen 3'-pää poistettu.

Kukin kasetti pantiin vektoriin pGEM3Z (Promega) synteettisen β-globiinin 5'-ei-koodittavan ίο sekvenssin kanssa ja ilman sitä kopiointia ja luentaa varten käyttäen T7-ja kanin retikulo- syytin ilmentämistä in vitro. Yhdistelmälehmänrokkovirusvektoreita (rVV) valmistettiin insertoimalla kasetit plasmidiin pSCl 1 (saatu Dr. B. Mossilta, NIH), mitä seurasi yhdistäminen lehmänrokkovirukseen, kuten on kuvannut Charkrabarty et ai.. Mol Cell Biol (1985) 5:403-09.

is (B) Rakennettiin vaihtoehtoinen ekspressiovektori insertoimalla HCV(A/B) pSC59:n Stul-ja Spel-paikkojen väliin (saatu Dr. B. Mossilta, NIH), mitä seurasi yhdistäminen lehmänrokkovirukseen, kuten on kuvannut Charkrabarty et ai.. Mol Cell Biol (1985) 5:403-09.

(C) Kerättiin HeLa S3-soluja linkoamalla 7 minuuttia 2000 kierroksella minuutissa huoneen lämpötilassa steriilissä 500 ml linkouspulloissa (JA-10-roottori). Pelletit suspendoitiin 20 loppupitoisuuteen 2 x 107 solua/ml lisäviljelynesteeseen (Joklik muunnettu MEM Spinner- • · . * · · väliaine + 5 % hevosseerumia ja gentamysiiniä) ("Sekoitusväliaine"). Ultraäänirikottu raaka • · · w/SC59-HCV-viruserä lisättiin moninkertaisessa infektointimäärässä 8 pfu/solu ja seosta • · • · : ** sekoitettiin 37°C:ssa 30 minuuttia. Infektoituneet solut siirrettiin sitten linkouspulloon, mikä ^ * sisälsi 8 1 sekoitusväliainetta ja sitä inkuboitiin 3 päivää 37°C:ssa.

• · • · · *... 25 « · · « · ·

Viljellyt solut kerättiin sitten linkoamalla ja pelletit suspendoitiin uudelleen puskuriin (10 mM

# # φ 4. Tris-HCl, pH 9,0,152 ml). Solut homogenoitiin sitten käyttäen 40 ml:n Dounce-homogenoijaa • · . · · ·. (50 iskua) j a ytimet pelletoitiin linkoamalla (5 minuuttia, 1600 ipm, 4°C, JA-20-roottori).

·«· . *. Ydinpelletit suspendoitiin uudelleen Tris-puskuriin (24 ml), homogenoitiin uudelleen ja < i · • · · “!. ’ 30 pelletoitiin taas siirtäen varastoon kaikki liuokset.

• · ** • « ·»· ] Varastoitu ly saatti jaettiin 10 ml.n eriin ja ultraäänirikottiin 3 x 30 minuutin ajan kuppisarvisonikaattorilla keskiteholla. Ultraäänikäsitelty lysaatti (15 ml) pantiin kerroksiksi 17 17 107804 ml:n sukroosipatjalle (36 %) SW28-linkousputkissa ja niitä lingottiin 13500 kierroksella minuutissa 80 minuutin ajan 4°C:ssa viruksen pelletoimiseksi. Viruspelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan Tris-puskuria (1 nM Tris-HCl, pH 9,0) ja pakastettiin -80°C:ssa.

5 Esimerkki 2 (In vitro- ia irrvivo-tuotteiden vertailu) (A) El ja E2 ilmennettiin sekä in vitro että in vivo ia 35S-Met leimattiin käyttäen yllä esimerkissä 1 kuvattuja vektoreita. BSC-40- ja HeLa-soluja infektoitiin rW-vektoreilla in.

10 vivo-ilmentämistä varten. Sekä viljelyväliaine että solulysaatit tutkittiin yhdistelmäproteiinien varalta. Tuotteet immunosaostettiin käyttäen ihmisen HCV-immuuniseerumia, kun taas jn_ vitro-proteiinit analysoitiin suoraan. Tulokseksi saadut proteiinit analysoitiin SDS-PAGElla.

Retikulosyytti-ilmentämisjäijestelmä (pGEM3Z HCV(S/B):n tai HCV(A/B):n kanssa) tuotti 15 C-, El-ja E2-proteiineja, joiden molekyylipainot olivat suunnilleen 18 kD, 35 kD ja vastaavasti 72 kD. BSC-40-ja HeLa-soluista saadut lysaatit transfektoitiin rW:llä sisältäen HCV(S/B):tä, HCV(A/B):tä tai C-El(S/B):tä osoittivat samoja proteiineja. Koska retikulosyyttijärjestelmä ei anna tehokasta golgikäsittelyä ja siksi se ei anna siaalihappoa, se tosiasia, että sekä in vitro- että in vivo-tuotteet antoivat identtisiä liikkuvuuksia ehdottaa, että 20 proteiinit eivät ole sialyloituj a in vivo. Vain rVV-vektori, mikä sisälsi TPA-NS1 :tä antoi • · tuloksena solunulkoisen E2 :n erittymisen, millä oli muuttunut liikkuvuus, mikä oli yhtäpitävä • · • · sialylaation kanssa.

• · • · · (B) HCV(S/B) ilmennettiin in vitro ia inkuboitiin biotinyloitujen lektiinien paneelin kanssa: • · GNA, SNA, PNA, WGA ja ConA. Inkubaatiota seuraten kerättiin kompleksit avidiini- • · · , ·: ·. 25 akryylipallosille, pestiin, eluoitiin Laemmlin näytepuskurilla j a analysoitiin SDS-PAGElla.

• t ·

Tulokset osoittivat, että El ja E2 sitoutuivat GNA:han ja ConA:han, mikä merkitsee man- ....: noosin läsnäoloa. GNA sitoutuu terminaalisiin mannoosiryhmiin, kun taas Con A sitoutuu v · “*; mihin tahansa α-linkittyvään mannoosiin. Sitoutumisen puuttuminen SNA:han, PNArhan ja ·*· : WGA:han merkitsee, että mikään näistä proteiineista ei sisältänyt siaalihappoa, galaktoosi-N- ··« · '.·*·. 30 asetyyligalaktosamiinia tai N-asetyyliglukosamiinia.

··· * . (C) Radioleimattuja E1 :tä ja E2:ta tuotettiin BSC-40-soluissa infektoimalla rVV:llä, mikä • · ##t>. sisälsi HCV(S/B):tä (w/SCll-HCV)jaimmunosaostamalla ihmisenHCV+-immuuniseem- ♦ · . millä. Puolta immunosaostetusta materiaalista käsiteltiin yli yön neuraminidaasilla siaalihapon 18 107804 poistamiseksi. Käsittelyä seuraten analysoitiin käsitellyt ja käsittelemättömät proteiinit SDS-PAGElla. Liikkuvuudessa ei havaittu mitään merkittävää eroa, mikä merkitsi sialylaation puuttumista in vivo.

(D) Radioleimattuja El:täja E2:ta tuotettiin BSC-40-soluissa infektoimalla rW:llä, mikä 5 sisälsi HCV(A/B):tä (w/SC59-HCV) ja joko immunosaostettiin ihmisen HCV*-immuuni-seerumilla tai saostettiin käyttäen biotinyloitua GNA-lektiiniä, mikä oli liitetty akryylipallosiin käyttäen w/SCl l:tä, mikä oli vapaa HCV-sekvensseistä, kontrollina. Saostumat analysoitiin SDS-PAGElla. Tiedot osoittavat, että El ja E2 olivat pääasialliset lajit mannoosipäätteisiä proteiineja w/SC59-HCV-infektoiduissa soluissa. GNA oli yhtä tehokas kuin ihmisen jo antiseerumi E1 :n ja E2:n saostamisessa soluviljelyväliaineesta. Havaittiin 25 kD komponentti, mutta se näytti olevan spesifinen lehmänrokkoinfektoiduille soluille.

Esimerkki 3 (Puhdistus lektiiniä käyttäen) 15 (A) HeLa S3-soluja tartutettiin puhdistetulla korkean tiitterin w/SC59-HCV-viruserällä 5 pfu/solu infektiomäärässä ja seosta sekoitettiin 37°C:ssa 30 minuuttia. Infektoidut solut siirrettiin sitten sekoitusastiaan, mikä sisälsi 81 sekoitusväliainetta ja sitä inkuboitiin 3 päivää 37°C:ssa. Solut kerättiin taas linkoamalla ja suspendoitiin uudelleen hypotoniseen puskuriin 20 (20 mM HEPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgCb, 120 ml) jäähauteessa. Solut homogenoitiin • · 4. ': sitten Dounce-homogenisoijassa (50 iskua) ja ytimet pelletoitiin linkoamalla (5 minuuttia, ··· • · • · ·' 1600 rpm, 4°C, JA-20-roottori). Pelletit yhdistettiin, suspendoitiin uudelleen 48 mlraan • · * * \ hypotonista puskuria, homogenoitiin uudelleen, lingottiin uudelleen, yhdistettiin uudelleen j a ♦ · .. pakastettiin -80°C:ssa.

* ·· ·♦· 25 • ♦ · • · ·

Pakastetut liuokset sulatettiin sitten ja postnukleaarisen lysaatin mikrosomimembraanifraktio ....: eristettiin linkoamalla 20 minuuttia JA-20-roottorissa 13500 rpm:llä 4°C:ssa. Liuos poistettiin ·***; imulla.

·«· • · ♦ · · * « · . · · ·. 30 Pelletit otettiin 96 mlraan pinta-aktiivisen aineen puskuria (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 • · 4 . mM EDTA, 1 mM DDT, 0,5 % Triton X-100, pH 7,5) ja homogenoitiin (50 iskua). Tuote • · . selkeytettiin linkoamalla 20 minuuttia 13500 rpmrllä, 4°C ja liuokset kerättiin.

• ♦ 19 107804 GNA-agaroosipylväs (1 cm x 3 cm, 3 mg GNA/ml pallosia, 6 ml pallostilavuus, Vector Labs, Burlingame, CA) esitasapainotettiin pinta-aktiivisen aineen puskurilla. Liuosnäyte pantiin pylvääseen kierrätyksellä virtausnopeudella 1 ml/min 16-20 tunniksi 4°C:ssa. Pylväs pestiin sitten pinta-aktiivisen aineen puskurilla.

5

Puhdistetut E1 /E2-proteiinit eluoitiin a-D-mannoosilla (0,9 M pinta-aktiiviaineen puskurissa) virtausnopeudella 0,5 ml/min. Eluointi pysäytettiin El/E2:n ilmestyessä eluenttiin ja pylvään annettiin tasapainottua uudelleen 2-3 tuntia. Fraktioita analysoitiin Westem-blottauksellaja hopeaväij äyksellä. Piikkifraktiot yhdistettiin ja UV-säteilytettiin kaiken jäljellä olevan jo lehmänrokkoviruksen inaktivoimiseksi.

(B) GNA-agaroosipuhdistettuja El-ja E2-asialoglykoproteiineja sedimentoitiin 20-60 % glyseroligradienttien kautta. Gradientit fraktioitiin ja proteiinit analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Westem-blottauksella. Täpliä koetettiin GNA:lla El:n ja E2:n identifioimiseksi. Tulokset merkitsevät El :E2-heterodimeerin läsnäoloa, mikä sedimentoituu odotetulla nopeudella (s.o.

js 110 kD:n proteiinin asemaominaisuudet). HCV-kuoriproteiinien suuremmat aggregaatit ovat myös ilmeisiä. Myös E2:E2-homodimeerit olivat ilmeisiä. E2 näytti olevan yliedustettu suuremmissa lajeissa El:n suhteen, vaikka erillisiä El :E2-lajeja osoitettiin myös. Suuremmat aggregaatit sedimentoituivat merkittävästi nopeammin kuin tyroglobuliinimerkkiaine.

(C) GNA-agaroosipuhdistettuja El ja E2 sedimentoitiin 20-60 % glyseroligradienttien, jotka 20 sisälsivät 1 mM EDTA:aa, kautta. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGElla β-merkaptoetanolin • · ·. *: (βΜΕ) kanssa ja ilman sitä. Havaittiin vähän tai ei ollenkaan eroa E1 :n ja E2:n ilmeisessä ··· • · ... * runsaudessa βΜΕ:η ollessa läsnä tai poissa, mikä merkitsee, ettei heterodimeerien välillä ole • · • · • ** disulfidisidoksia.

, \ * (D) E1 /E2-kompleksej a (suunnilleen 40 % puhtaita) analysoitiin Coulterin DM-4-tyyppisessä • Φ *,,, 25 alle mikrometrin partikkelin analysaattorissa. Havaittiin materiaalia 20-60 nm alueella.

• · · • · · (E) El/E2-komplekseja (suunnilleen 40 % puhtaita) analysoitiin elektronimikroskopialla käyttäen negatiivista väijäystä fosfovolframihapolla. Elektronimikrografi paljasti sellaisten • · , · · ·, partikkeleiden läsnäolon, joilla oh pallomainen ulkonäkö ja noin 40 nm halkaisija. E1/E2- komplekseja inkuboitiin ihmisen HCV+-immuuniseerumin kanssa, sitten ne analysoitiin • · · • · < 1 elektronimikroskopialla negatiivisella värjäyksellä. Havaittiin vasta-ainekomplekseja, mitkä *· · · • · *! * sisälsivät suuria aggregaatteja ja pienempiä partikkeleita.

• · • « 20 107804

Esimerkki 4 (Kromatografinen puhdistus) (A) Esimerkissä 3 kuvatusti valmistettua GNA-lektiinipuhdistettua materiaalia (0,5-0,8 ml) 5 laimennettiin 10 x puskurilla A (20 mM Tris-HCl-puskuri, pH 8,0,1 mM EDTA) ja pantiin 1,8 x 1,5 cm Fractogel EMD DEAE-650-pylvääseen (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, luettelonumero 16883), mikä oli tasapainotettu puskurilla A. Proteiinifraktio, mikä sisälsi E1/E2, eluoitiin samalla puskurilla 0,2 ml/min nopeudella ja 1 ml fraktioita kerättiin. Fraktiot, mitkä sisälsivät El:n ja E2:n (määritettynä SDS-PAGElla) yhdistettiin ja varastoitiin ίο -80°C:een.

(B) Osassa (A) puhdistetulla materiaalilla on 60-80 % puhtaus arvioituna SDS-PAGElla. Oletettujen El-ja E2-nauhojen identifiointi vahvistettiin N-pään sekvenssianalyysillä sen jälkeen, kun oli käytetty siirtotekniikkaa. Tätä tarkoitusta varten Fractogel-DEAE-puhdistettu El/E2-materiaalia vähennettiin lisäämällä Laemmli-puskuria (pH 6,8,0,06 M Tris-HCl, 2,3 % is SDS, 10 % glyseroli, 0,72 M β-merkaptoetanoli) ja sitä keitettiin 3 minuuttia. Näyte ladattiin sitten 10 % polyakiyyliamidigeelille. SDS-PAGEn jälkeen proteiini siirrettiin polyvinylideenidifluoridin (PVDF) 0,2 pm:n membraanille (Bio-Rad Laboratorie, Richmond, CA). Vastaavat oletetut El- ja E2-proteiinikaistat leikattiin sitten täplistä ja niille tehtiin N- pään aminohappoanalyysi, vaikkei pidettykään mitenkään erityisesti huolta aminopään 20 blokkauksen estämisestä materiaalin valmistelun aikana. Ensimmäiset 15 sykliä paljastivat, '. j että E1 -näytteellä oli sekvenssi Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp, • · kun taas E2:n sekvenssi oli Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe. Tämä • · · : ’ ·.. aminohapposekvenssitieto on sopusoinnussa sen kanssa, mitä odotettiin vastaavista DNA- ·:**: sekvensseistä.

25 • ·· •, · * E l/E2-tuotteen, mikä puhdistettiin yllä Fractogel-DEAE-kromatografialla, uskotaan olevan aggregoitunut, kuten todistaa se seikka, että suuri määrä El :tä ja E2:ta eluoituu samalla * * geeliläpäisykromatografisen Bio-Sil TSK-4000 SW-pylvään tyhjän tilavuuden alueella. Tämä • · · • · • y * merkitsee, että luonnonolosuhteissa merkittävällä määrällä E1 /E2-kompIeksia on ainakin 800 • · •.: · 30 kD molekyylipaino. Havaittiin myös El/E2-materiaalia, minkä molekyylipaino oli noin 650 O kD.

• · • m

Claims (3)

107804

1. Stympat asialoglykoprotein som används i immunobestämningar, kännetecknat därav, att det har uttryckts frän HCVs El-omräde och omfattar en deletion i den del av sekvensen, 20 som forekommer pä ett omräde, som täcker aminosyroma 338-380 i El-omrädet när ·, : numreringen startar frän böijan av HCV-polyproteiner. • · ♦ • · • · · • · • · • · ·

1. Immunomäärityksissä käytettävä typistetty asialoglykoproteiini, tunnettu siitä, että se on ilmennetty HCV:n E1 -alueelta ja käsittää poiston sekvenssin osassa, joka esiintyy 5 alueella joka kattaa El-alueen aminohapot 338-380 numeroinnin alkaessa HCV-polyproteiinien alusta.

2. Immunomäärityksissä käytettävä typistetty asialoglykoproteiini, tunnettu siitä, että se on ilmennetty HCV:n E2-alueelta ja käsittää poiston sekvenssin osassa, joka esiintyy ίο alueella joka kattaa E2-alueen aminohapot 660-830, numeroinnin alkaessa HCV-polyproteiinien alusta.

3. Immunomäärityksissä käytettävä koostumus, tunnettu siitä, että käsittää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen hepatiitti-C-viruksen asialoglykoproteiinin. 15

2. Stympat asialoglykoprotein som används i immunobestämningar, kännetecknat därav, • att det har uttryckts frän HCVs E2-omräde och omfattar en deletion i den del av sekvensen, • 1 · s # 25 som forekommer pä ett omräde, som täcker aminosyroma 660-830 i E2-omrädet när • ; 1 · 1; numreringen startar frän böq an av HCV-polyproteiner. *:1·:

3. Kompositionen som används i immunobestämningar, kännetecknad därav, att den ' omfattar ett hepatit-C-virus asialoglykoprotein enligt patentkrav 1 eller 2. • · • · · « · · , »M ♦ · · • · • · • · · • · • ·