RO117920B1 - Asialoglicoproteina provenind de la virusul hepatitei c, compozitie imunogena si metoda de inducere a unui raspuns imun - Google Patents
Asialoglicoproteina provenind de la virusul hepatitei c, compozitie imunogena si metoda de inducere a unui raspuns imun Download PDFInfo
- Publication number
- RO117920B1 RO117920B1 RO97-01809A RO9701809A RO117920B1 RO 117920 B1 RO117920 B1 RO 117920B1 RO 9701809 A RO9701809 A RO 9701809A RO 117920 B1 RO117920 B1 RO 117920B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- virus
- hepatitis
- protein
- hcv
- proteins
- Prior art date
Links
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 107
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 93
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 84
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 83
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 21
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 21
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 20
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 20
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 20
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 12
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 101710132593 Protein E2 Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 8
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 8
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 8
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 6
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 6
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Chemical group 0.000 description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N Thapsigargin Natural products CCCCCCCC(=O)OC1C(OC(O)C(=C/C)C)C(=C2C3OC(=O)C(C)(O)C3(O)C(CC(C)(OC(=O)C)C12)OC(=O)CCC)C HATRDXDCPOXQJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N thapsigargin Chemical compound CCCC(=O)O[C@H]1C[C@](C)(OC(C)=O)[C@H]2[C@H](OC(=O)CCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C(\C)=C/C)C(C)=C2[C@@H]2OC(=O)[C@@](C)(O)[C@]21O IXFPJGBNCFXKPI-FSIHEZPISA-N 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108700010756 Viral Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- -1 beta amino ethyl Chemical group 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003547 hepatic macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 108020003928 mannose binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000036209 mannose binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Natural products CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000234271 Galanthus Species 0.000 description 1
- 241000234283 Galanthus nivalis Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101800000194 Growth hormone-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102400001066 Growth hormone-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 1
- 108010068997 Mannose-Binding Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000001698 Mannose-Binding Lectins Human genes 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940124737 hepatitis-C vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000027380 protein glycosylation in Golgi Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Inventia se refera la o asialoglicoproteina provenind de la virusul hepatitei C, selectata dintr-un grup constituit din glicoproteine exprimate de regiunea E1 a virusului hepatitei C, care contin o deletie intr-o portiune a secventei care cuprinde aminoacizii 330...380 din regiunea E1 si glicoproteine exprimate de regiunea E2 a virusului hepatitei C, care contin o deletie intr-o portiune a secventei care cuprinde aminoacizii 660...830 ai regiunii E2.
Description
Invenția se referă la asialoglicoproteină, compoziție imunogenă și metodă de inducere a unui răspuns imun, cu utilizare în imunoterapie, la tratamentul și profilaxia infecției cu virusul hepatitei C (HCV).
Se cunoaște că hepatita non-A și non-B (NANBH) este o boală transmisibilă (sau o familie de boli), care se consideră a fi indusă pe cale virală și se distinge de alte forme de boli de ficat, asociate cu virusuri, cum ar fi, de exemplu, cele cauzate de virusul hepatitei A (HAV), virusul hepatitei Β (HAB), virusul hepatitei delta (HDV), cu citomegalovirus (CMV) sau cu virusul Epstein-Barr (EBV). Evidența epidemiologică sugerează că există trei tipuri de hepatite Non-A și Non-B: tipul epidemic, transmisibil prin apă; tipul asociat, transmisibil prin sânge, ac de seringă și, sporadic, se produce tipul dobândit în mod obișnuit. Numărul de agenți cauzativi este necunoscut. Cu toate acestea, noi specii virale ale virusului hepatitei C (HCV) au fost recent identificate, ca fiind, în primul rând (și nu numai atât), cauza hepatitei non-A, non-B, transmisibilă prin sânge (hepatita BB-non-A, non-B). Vezi, de exemplu, WO 89/046699. Hepatita cu virus C pare să fie forma majoră de hepatită asociată cu transfuzia, într-un număr de țări sau de regiuni incluzând Statele Unite, Europa și Japonia. Este evidentă, așadar, implicarea virusului hepatitei C (HCV) în inducerea carcinomului hepatocelular. Astfel, apare necesitatea unei metode efective pentru prevenirea și tratamentul infecției cu virusul hepatitei C (HCV). Necesitatea unor metode sensibile, specifice pentru screeningul și identificarea transportorilor în cazul virusului hepatitei C(HCV) și în cazul produselor din sânge și a produselor din sânge, contaminate cu virusul hepatitei C(HCV) este semnificativă. Hepatita post-transfuzională (PTH) se produce la aproximativ 10% din pacienții transfuzați, iar virusul hepatitei C (HCV) se numără la peste 90% din aceste cazuri. Problema majoră, în această boală, este progresarea frecventă la boli cronice de ficat (2555% din cazuri). îngrijirea pacientului, ca și prevenirea transmiterii virusului hepatitei C, prin sânge sau produse din sânge, sau printr-un contact personal strâns, necesită instrumente precise de diagnostic și prognostic, pentru detectarea acizilor nucleici, a antigenelor și anticorpilor referitor la virusul hepatitei C(HCV). In plus, există, de asemenea, necesitatea pentru vaccinuri eficiente și pentru agenți terapeutici de tip imunoterapeutic, pentru prevenirea și/sau tratamentul bolii.
Virusul hepatitei C apare în sângele indivizilor infectați, în proporții, relativ, foarte scăzute față de alte tipuri de infecții cu virusuri, care fac ca virusul să fie foarte dificil de detectat. Greutatea virală scăzută este, probabil, cauza primară pentru care virusul hepatitei non-A, non-B este dificil de detectat. Chiar dacă totuși, în prezent, acest vector a fost donat, virusul hepatitei C, HCV este dovedit a fi încă dificil de cultivat și propagat. In acest sens, există o necesitate acută pentru mijloace de recombinare pentru producerea proteinelor de diagnostic/tratament și profilaxie a virusului hepatitei C.
în plus, există o mare necesitate pentru un vaccin pentru hepatita cu virusul C. Există totuși o situație extrem de dificilă pentru cultivarea virusului hepatitei C, în linii celulare. Astfel, n-a fost posibil să se producă specii virale atenuate prin treceri seriale în culturi de țesuturi sau culturi de celule.
Problema pe care o rezolvă invenția este de a lărgi gama de asialoglicoproteine provenite de la virusul hepatitei C, HCV, capabile să inducă un răspuns imun, la un animal.
Asialoglicoproteină provenind de la virusul hepatiei C, conform invenției, este selectată dintr-un grup constituit din glicoproteine exprimate de regiunea E1 a virusului hepatitei C, care conțin o deleție într-o porțiune a secvenței, care cuprinde aminoacizii 330380 din regiunea E1 și glicoproteine exprimate de regiunea E2 a virusului hepatitei C, care conțin o deleție într-o porțiune a secvenței care cuprinde aminoacizii 660 - 830 a regiunii E2, numerotarea făcându-se de la începutul poliproteinei HCV.
Un alt obiect al invenției este o compoziție imunogenă.
RO 117920 Β1
Compoziția imunogenă, conform invenției, cuprinde o cantitate eficientă de 50 asialoglicoproteină, definită în revendicarea 1, un vehicul acceptabil farmaceutic și, adițional, substanțe auxiliare precum agenți de emulsionare, agenți de umectare și substanțe cu rol de tampon.
Un alt obiect al invenției este o metodă de inducere a unui răspuns imun la un animal. 55
Metoda conform invenției constă în administrarea unei compoziții imunogene, definită în revendicarea 4, pe cale parenterală, de preferință, prin injectare, pe cale subcutanată sau intramusculară, în doză unică sau multiplă.
Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:
- se furnizează noi glicoproteine ale virusului hepatitei C, la care lipsesc resturile 60 terminale de acid sialic;
- se creează noi componente active, pentru vaccinuri anti-hepatita C, obținute prin tehnicile ingineriei genetice.
S-a descoperit că două proteine ce conțin virusul C al hepatitei, E1 și E2, par a fi asialoglicoproteine asociate membranei, când sunt exprimate în sisteme recombinante. 65 Acest fapt este surprinzător, deoarece glicoproteinele nu rămân, de obicei, la mamifere, sub formă terminală de manoză, dar acestea sunt modificate, în continuare, cu alte tipuri de carbohidrați: forma terminală de manoză este, în mod tipic, numai de tranziție. In cazul E1 și E2 (așa cum s-a exprimat în sistemele noastre), asialoglicoproteina pare a fi în forma finită. E1 (proteina 1 de acoperire) este o glicoproteină având o greutate moleculară de 70 aproximativ 35 kD, care este transferată din regiunea E1 prevăzută pentru genomul virusului C de hepatită. E2 (proteina 2 de acoperire) este o glicoproteină, având o greutate moleculară de aproximativ 72 kD, care este transferată de la regiunea NS1 prevăzută (proteina 1 nestructurală) a genomului virusului C de hepatită, pe baza modelului flaviviral al virusului C de hepatită. Deoarece glicoproteinele virale sunt adesea puternic imunogene, E1 și E2 75 reprezintă primii candidați pentru utilizare în imunoanalize și pentru tratament și vaccinuri profilactice.
Descoperirea că E1 și E2 nu sunt sialilate, este semnificativă. Forma particulară a unei proteine dictează adesea care celule pot servi ca gazde corespunzătoare pentru exprimarea recombinantă. Procariotele, cum ar fi, de exemplu, Escherichia coli, nu produc gli- 80 cozilarea proteinelor și, în general, nu sunt corespunzătoare pentru utilizare ca antigeni, deoarece glicozilarea este adesea importantă pentru completa antigenitate, solubilitate și stabilitate a proteinei. Eucariotele inferioare, cum ar fi, de exemplu, drojdiile și fungii, produc glicozilarea proteinelor, dar sunt, în general, necorespunzătoare pentru adăugarea reziduurilor terminale de acid sialic la complecșii de carbohidrați. Astfel, proteinele derivate din 85 drojdii pot fi, din punct de vedere antigenic, deosebite de duplicații naturali (nerecombinanți). Exprimarea în celulele mamiferelor este preferată pentru aplicațiile în care antigenitatea produsului este importantă, deoarece glicozilarea proteinei recombinante poate fi foarte asemănătoare cu cea în cazul proteinelor virale sălbatice.
Noi dovezi arată că virusul hepatitei C(HCV) poate realiza în plus pătrunderea în 90 celulele gazdă în timpul infecției, fie cu ajutorul receptorului asialoglicoproteinei descoperit pe hepatocite, fie cu ajutorul receptorului manozei, descoperit pe celulele endoteliale hepatice și pe macrofagii hepatici (în special, celulele Kupffer). In mod surprinzător, s-a descoperit că proteinele naturale brute, E1 și E2, nu conțin reziduuri terminale de acid sialic, dar că acestea sunt glicozilate, numai în porțiunile interioare. O fracțiune îngustă conține 95 adițional N-acetil glucozamine terminale. în acest sens, un obiect al prezentei invenții este acela de a prevedea glicoproteine de acoperire a virusului hepatitei C, lipsind toate sau aproape toate reziduurile terminale de acid sialic.
RO 117920 Β1
A. Definiții.
Termenul de “asialoglicoproteină” se referă la o proteină glicozilată, care este substanțial liberă de resturi de molecule de acid sialic. Asialoglicoproteinele pot fi preparate prin recombinare sau prin purificare din cultura de celule, sau din surse naturale. Asialoglicoproteinele preferate, în prezent, sunt derivate de la virusul hepatitei C, HCV, de preferință, glicoproteinele E1 și E2, mult mai preferate fiind proteinele recombinante E1 și E2 (rE1 și rE2). O proteină este “substanțial liberă” de acid sialic, conform scopului acestei definiții, dacă cantitatea de reziduuri de acid sialic nu influențează, substanțial, legarea glicoproteinei la proteine de legare a manozei, cum ar fi, de exemplu GNA. Acest grad de sialilare va fi obținut, în general, atunci când mai puțin de aproximativ 40% din carbohidratul total legat la azot este acid sialic, mult mai preferabil atunci când există mai puțin de aproximativ 30%, mult mai preferabil atunci când există mai puțin de aproximativ 20%, mult mai preferabil la mai puțin de aproximativ 10%, mult mai preferabil la mai puțin de aproximativ 5% și mult mai preferabil la mai puțin decât aproximativ 2%.
Termenul de Έ1 utilizat în prezenta invenție se referă la o proteină sau la o polipeptidă exprimată în primii 400 de aminoacizi ai poliproteinei virusului hepatitei C, iar uneori acest termen se referă la proteina E sau la proteina S. In forma sa naturală, există o glicoproteină 35 kD care este găsită a fi asociată puternic la membrană. La majoritatea speciilor naturale de virusuri ale hepatitei C, HCV, proteina E1 este codificată în poliproteina virală, după care urmează proteina C (partea interioară). Proteina E1 se întinde de la aproximativ 192 de aminoacizi, la aproximativ 383 aminoacizi din lungimea completă a poliproteinei. Termenul de Έ1 așa cum este utilizat în prezenta invenție, include așadar analogi și mutanți secționați care sunt încrucișați din punct de vedere imunologic, cu proteina naturală E1.
Termenul de Έ2, utilizat în prezenta invenție, se referă la o proteină sau la o polipeptidă exprimată în primii 900 de aminoacizi din poliproteina virusului hepatitei C, HCV, iar uneori se referă la proteina NS1. în forma sa naturală, aceasta este o glicoproteină 72 kD, care a fost găsită, ca fiind puternic asociată la membrană. In cazul majorității speciilor naturale de virus al hepatitei C, proteina E1 urmează proteina E2. Proteina E2 se întinde de la aproximativ 384 până la aproximativ 820 aminoacizi. Termenul de Έ2 cum este utilizat în prezenta invenție include analogi și mutanți secționați care sunt din punct de vedere imunologic reactiv încrucișați cu proteina naturală E2.
Termenul “agregat” așa cum este folosit aici, se referă la un complex E1 și/sau E2 conținând mai mult de un monomer E1 sau E2. Tot în această definiție intră și dimerii E1 : E1, E2 : E2 ca și heterodimerii E1 : E2. Compozițiile din invenție pot include șl agregate mai mari șl pot avea mase moleculare mai mari de 800 kD.
Termenul de “particulă” utilizat în prezenta invenție se referă la agregatul E1/E2 sau la E1, la E2 care sunt vizibili prin microscopie electronică și au dimensiuni de cel puțin 20 nm. Particulele preferate sunt cele care au o prezentare sferică, rugoasă și un diametru de aproximativ 40 nm, defectate prin microscopie electronică.
Termenul de “purificat” așa cum este aplicat la proteine, se referă la o compoziție în care proteina dorită cuprinde cel puțin 35% din componentele totale de proteine din compoziție. Proteina dorită cuprinde de preferință cel puțin 40%, mult mai preferabil cel puțin aproximativ 50%, chiar mult mai preferabil cel puțin aproximativ 60%, încă mult mai preferabil cel puțin aproximativ 70%, chiar mult mai preferabil cel puțin aproximativ 80%, chiar mult mai preferabil cel puțin aproximativ 90% și cel mai preferabil cel puțin aproximativ 95% din componentele de proteine totale. Compoziția poate conține alți compuși, cum ar fi de exemplu carbohidrați, săruri, lipide, solvenți și alți compuși asemănători, fără a fi afectată determinarea procentajului de puritate, așa cum s-a utilizat în prezenta invenție. O asialoglicoproteină “izolată a virusului hepatitei C, HCV, se referă la o compoziție de asialoRO 117920 Β1
150 glicoproteină HCV care este cel puțin de puritate 35%.
“Proteina legată de manoză” ca termen utilizat în prezenta invenție, se referă la o lectină sau la o altă proteină care se leagă în mod specific de proteinele având manoza terminală glicozilată (de exmeplu asialoglicoproteinele) de exemplu, lectinele legate de manoză, anticorpii specifici pentru glicozilarea manozei terminale, proteina receptor de manoză, așa cum este menționat de către R.A.B. Ezekowitz și colaboratorii, J.Exp.Med. (1990) 176:1785-94), proteine receptor pentru asialoglicoproteine (H. Kurata și colaboratorii, J. Biol.Chem. (1990) 265:11295-98), proteine de legare la manoză serice (I. Schuffenecker și colaboratorii, Cytogenet Cell Genet (1991) 56: 99-102; K. Sastry și colaboratorii, J. Imunol (1991) 147 : 692-97), proteine serice de legare la asialoglicoproteine și alți compuși asemănători. Lectinele de legare la manoză includ de exemplu GNA, Concanavalin A (Con.A) și alte lectine cu proprietăți similare de legare.
Termenul de “lectină GNA” se referă la aglutinina din Galanthus nivalis, o lectină disponibil comercial care se leagă la glicoproteinele cu manoza terminală.
O glicoproteină “recombinantă” așa cum este utilizat acest termen în prezenta descriere de invenție, este o glicoproteină exprimată dintr-o polinucleotidă recombinantă, în care gena structurală care codifică glicoproteină este exprimată sub controlul secvențelor de reglare neadiacente în mod natural la gena structurală sau în care gena structurală este modificată. De exemplu, una dintre acestea poate forma un vector în care gena structurală E1 este plasată sub controlul unui fragment funcțional al promotorului de gliceraldehidă-3 fosfat dehidrogenază (GAPDH din drojdii). Un promotor, în prezent preferabil pentru utilizare în drojdii, este promotorul hibrid ADH2/GAPD, descris în brevetul U.S. 4880734 care utilizează un fragment de promotor al GAPDH în combinație cu o secvență de activare în amonte, derivată de la alcool dehidrogenaza-2. Modificările genei structurale pot include substituirea diferiților codoni, cu codoni degenerați (de exemplu pentru utilizarea codonilor preferați de gazdă pentru eliminarea sau generarea situsurile de clivaj enzimatic, de restricție, pentru controlul formării formelor aciculare, etc.), substituirea, inserarea sau deleția unui număr limitat de codoni pentru codificarea diferiților aminoacizi (de preferință nu mai mult de aproximativ 10%, mult mai preferabil sub aproximativ 5% dintr-un număr de secvențe de aminoacizi naturali, care pot fi modificate) și altele asemănătoare.
în mod similar, receptorul “recombinant” se referă la o proteină receptor care este exprimată dintr-o polinucleotidă recombinantă, în care gena structurală care codifică receptorul este exprimată sub controlul secvențelor de reglare adiacente nu în mod natural, la gena structurală, sau în care gena structurală este modificată.
Termenul de “polipeptidă izolată” se referă la un tip de polipeptidă care poate fi substanțial liberă de alte componente virale în cadrul virusului hepatitei C, HCV, în special polinucleotide. O compoziție de polipeptidă poate fi în mod “substanțial liberă” de alte componente, dacă greutatea acestei polipeptide în compoziție este de cel puțin 70% în greutate polipeptide și alte componente în combinație, mult mai preferabil de cel puțin aproximativ 80% în greutate polipeptide, încă mult mai preferabil de aproximativ 90% în greutate polipeptide și cel mai preferabil de 95% sau mai mult. De exemplu, o compoziție care conține 100 pg/ml de E1 și numai 3 pg/ml de alte componente ale virusului hepatitei C, HCV, (de exemplu acidul dezoxiribonucleic DNA, lipide, etc.) Este substanțial liberă de “alte componente virale ale virusului hepatitei C” și astfel este o compoziție de polipeptide izolate conform scopului acestei definiții.
Termenul de “lider de secreție” se referă la o polipeptidă care, atunci când se codifică la porțiunea N-terminală a proteinei, produce o proteină care este secretată în mediul de cultură al celulei gazdă după translație. Liderul de secreție în general va fi derivat din celula gazdă utilizată. De exemplu, liderii corespunzători de secreție pentru utilizare în drojdii includ liderul α-factor din Saccharomyces cerevisiae (vezi brevetul US 4870008).
155
160
165
170
175
180
185
190
195
RO 117920 Β1
Termenul de “eucariote inferioare” se referă la celulele gazdă cum ar fi drojdiile, fungii și altele. Eucariotele inferioare sunt în general (dar nu în mod necesar) unicelulare. Eucariotele inferioare preferate sunt drojdii, în special specii de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula și altele. Saccharomyces cerevisiae, S.carlsbergensis și K. lactis sunt cel mai mult utilizate drojdii cu rol de gazdă, gazdele convenabile fiind de obicei fungi.
Termenul de “eucariote superioare se referă la celule gazdă derivate de la animale superioare, cum ar fi de exemplu mamifere, reptile, insecte și altele. Celulele gazdă de eucariote superioare preferate în prezent sunt derivate de la hamsterul chinezesc (de exemplu CHO), maimuțe (de exemplu celule COS), oameni și insecte (de exemplu Spodoptera frugiperda). Celulele gazdă pot fi asigurate ca suspensii sau culturi în flacoane, culturi de țesuturi, culturi de organe și altele.
Termenul de “modulator de calciu” se referă la un compus capabil de sechestrarea sau legarea ionilor de calciu în reticulul endoplasmic sau care este capabil de a modifica concentrația ionilor de calciu în ER prin efectul asupra proteinelor care reglează calciul (de exemplu proteinele din canalele de calciu, pompe de calciu, etc.). Moderatorii de calciu convenabili includ, de exemplu, thapsigargina, EGTA (etilen glicol bis(beta amino etil eter) Ν,Ν,Ν’Ν'-acid tetraacetic). Modulatorul preferat în prezent este thapsigargina (vezi de exemplu O. Thastrup și colaboratorii, Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87 : 2466-70).
Termenul de “imunogen “ se referă la ușurința unei substanțe de a provoca un răspuns imun celular și/sau umoral, atunci când este singur sau când este legat la o substanță transportoare, în prezența sau în absența unui adjuvant. “Neutralizarea” se referă la un răspuns imun care blochează infectarea, fie parțial, fie total, cu un agent infecțios. Un “vaccin” este compoziție imunogenică capacilă de elicitarea protecției față de virusul hepatitei c, HCV, fie parțial, fie complet, folositoare pentru tratamentul unui individ.
Termenul de “lichid biologic” se referă la un fluid obținut dintr-un organism, cum ar fi serul, plasma, saliva, secrețiile gastrice, mucusul și altele. în general, un lichid biologic va fi ecranat pentru prezența particulelor devirus al hepatitei C. Unele fluide biologice sunt utilizate ca o sursă a altor produse, cum ar fi de exemplu factorii de acoperire (de exemplu Factorul VIII.C), serum albumina, hormonul dedezvoltare și alții. în astfel de cazuri, este important ca sursa de fluid biologic să fie liberă de contaminare cu virusuri cum ar fi de exemplu virusul hepatitei C.
β. Metode generale
Regiunea E1 a genomului virusului hepatitei C, HCV este descrisă în EP 388232 ca regiunea “E”, în timp ce E2 este descrisă ca “NS1. Regiunea E1 este cuprinsă aproximativ între aminoacizii 192-383 în poliproteina virală cu lungime completă. Regiunea E2 este cuprinsă aproximativ între aminoacizii 384-820. Secvențele complete de prototipuri ale acestor proteine (specia HCV-1) sunt corespunzătoare domeniului de specialitate (vezi EP 388232), așa cum sunt metodele generale pentru donarea și exprimarea proteinelor. Ambele proteine E1 și E2 pot fi exprimate dintr-o polinucleotidă codificând primii 850-900 de aminoacizi ai poliproteinei HCV; procedeele post-translaționale în majoritatea celulelor gazdă eucariotice duc la clivaj în poliproteinele inițiale, C, E1 și E2. Una din aceste poliproteine poate fi secționată pentru regiunea codificată la partea terminală 5’ pentru a se reduce cantitatea de proteină C produsă.
Exprimarea asialoglicoproteinelor poate fi realizată printr-un număr de metode. De exemplu, una din acestea poate obține exprimarea în eucariote inferioare (cum ar fi drojdiile) care nu adiționează în mod normal reziduurile de acid sialic la proteinele glicozilate. în sistemele de exprimare la drojdii se preferă să se utilizeze în prezent un lider de secreție cum ar fi, de exemplu, liderul factorului x din Saccharomices cerevisiae, astfel că proteina
RO 117920 Β1 să fie exprimată în mediu de cultură după translație. De asemenea se preferă în prezent să se utilizeze mutanți cu deficiențe de glicozilare ca, de exemplu, pmrl, deoarece acești mutanți furnizează numai glicozilarea la partea interioară și adesea secretă proteine heteroloage cu eficiență ridicată (Η. K. Rudolph și colaboratorii, Cell (1989) 58 : 133-45). In mod 250 alternativ, una din metode poate utiliza alte specii de drojdii, cum ar fi, de exemplu, Pichia pastoris, care exprimă glicoproteinele care conțin resturi de 8-9 manoză, în probele utilizate, crezându-se în asemănarea cu modelul de glicozilare a porțiunii interioare observată la mamifere și la Saccharomyces cerevisiae. în mod alternativ, printr-una din metode, se poate aranja exprimarea în celulele de mamifere și blocarea glicozilării terminale (adiție de acid 255 sialic). Construcțiile de recombinanți vor include, de preferință, un semnal de secreție pentru a asigura ca proteina este direcționată spre reticulul endoplasmic. Transportul la Golgi pare a fi blocat chiar de către proteinele E1 și E2; exprimarea la nivel înalt pentru E1 și E2 în celulele de mamifere pare să oprească secreția tuturor proteinelor celulare la reticulul endoplasmic sau la cis Golgi. In mod adițional, una din metode utilizează un mutant defectiv de 260 glicosilare. Vezi, de exemplu, P. Stanley, Ann. Rev. Genet. (1984) 18 : 525-52. în cazul în care un mutant de glicozilare sau transport exprimă proteina E1 sau E2 cu sialilare, reziduurile terminale de acid sialic pot fi îndepărtate prin tratament cu neuraminidaze.
în continuare, randamentul poate fi crescut prin utilizarea unui modulator de calciu pentru a obține eliberarea proteinei din reticulul endoplasmic. Astfel de modulatori includ 265 thapsigargina, EGTA și A23817 (vezi, de exemplu, O.Thastrup și colaboratorii, Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87 :2466-70. De exemplu, se pot exprima sub formă de cantități mari de E1 și sau E2 intracelulare în celule de mamifere (de exemplu, CHO, COS, HeLa celule și altele), prin transfectarea cu vectorul recombinant al virusului de vaccinare. După ce se lasă un timp a avea loc exprimarea proteinelor și acumularea în reticulul endoplasmic, 270 celulele sunt expuse la un modulator de calciu într-o concentrație destul de mare pentru a produce eliberarea conținuturilor de ER. Proteina este apoi îndepărtată din mediul de cultură, care este înlocuit pentru ciclul următor.
în mod adițional, este avantajos să se exprime o formă secționată a proteinei de acoperire. Atât proteina E1 cât și proteina E2 par a avea un domeniu hidrofobic superior 275 care este aparent ancorat la proteina în reticulul endoplasmic și se previne o eliberare eficientă. Astfel, se poate dori să se elimine porțiuni de secvență găsită în una sau mai multe din regiunile cu aminoacizii 170-190, aminoacizii 260-290 sau aminoacizii 330-380 ale proteinei E1 (numărând de la începutul poliproteinei) și aminoacizii 660-830 din proteina E2 (vezi, de exemplu figura 20-1 din EP 388232). Este asemănător cu faptul că cel puțin unul 280 din aceste domenii hidrofobe formează o regiune transmembranară care nu este esențială pentru antigenitatea proteinei și care poate astfel să fie eliminată fără un efect detrimental. Cea mai bună regiune pentru eliminare, poate fi determinată prin conducerea unui număr mic de experimente de eliminare în cadrul acestei specialități de către specialiștii obișnuiți. Eliminarea porțiunii terminale 3'hidrofobe a proteinei E2 are, ca rezultat, secreția unei 285 porțiuni din proteina E2 exprimată, cu sialilarea proteinei secretate. Se mai poate utiliza, de asemenea, o varietate de vectori pentru obținerea acestei exprimări. Eucariotele inferioare, cum ar fi de exemplu drojdiile, sunt tipic transformate cu plasmide utilizând metoda de precipitare cu fosfat de calciu sau acestea sunt transfectate cu ajutorul unui virus recombinant.
Vectorii pot fi replicați independent în celulele gazdă sau pot fi integrați în genomul celulei 290 gazdă. Eucariotele superioare pot fi transformate cu plasmide, dar acestea sunt infectate tipic cu un virus recombinant, de exemplu virusul recombinant din vaccin. Vaccinurile se preferă în special, deoarece infectarea cu vaccin duce la oprirea exprimării proteinelor celulei gazdă. Celulele gazdă, preferate în prezent, includ liniile celulare HeLa și celulele plasmacitomatice. In sistemul prezent, aceasta înseamnă că E1 și E2 se acumulează ca specii 295
RO 117920 Β1 glicosilate majore în gazda ER. Deoarece rE1 și rE2 vor fi glicoproteine predominante care sunt terminate prin manoză, acestea vor fi ușor de purificat din celule prin utilizarea lectinelor, cum ar fi de exemplu aglutinina din Galanthus nivalus (GNA) care leagă resturile având manoză terminală.
Proteinele care sunt, în mod natural, exprimate ca glicoproteine cu manoză terminală, sunt relativ rare în fiziologia mamiferelor. In majoritatea cazurilor, o glicoproteină de mamifere este terminată numai printr-o manoză ca un produs de tranziție pe parcursul glicosilării. Faptul că proteinele de acoperire pentru virusul hepatitei C, HCV, exprimate recombinant conțin manoza terminală de glicosilare sau (într-un grad mai scăzut) N-acetil glucozamina, înseamnă că proteinele virusului hepatitei C și virionii în întregime pot fi separate și parțial purificate din proteinele endogene utilizând lectine specifice pentru manoza terminală sau N-acetil glucozamina. Proteinele recombinante par autentice și se crede a fi esențial identice proteinelor de acoperire găsite în virioni maturi liberi sau identice formelor de proteine de acoperire asociate cu celulele. Astfel, se poate utiliza grupa lectinelor cum ar fi de exemplu GNA pentru proteinele cu manoză terminală și WGA (aglutinina germenilor de grâu) și echivalenții acesteia pentru proteinele terminate prin N-acetil glucozamina. Se pot utiliza de asemenea lectine legate de faza solidă (de exemplu o coloană Sepharoza®-lectina) pentru separarea proteinelor E1 și E2 din supernatanții culturilor celulare și din alte fluide, de exemplu pentru purificarea în timpul producției de antigeni pentru utilizarea la vaccinuri sau la imunoanalize. In mod alternativ, se poate prevedea că o lectină convenabilă pentru izolarea proteinelor E1, E2 sau a virionilor virusului hepatitei C din fluide sau din probele de țesuturi de la subiecții suspectați de infecție cu virusul hepatitei C, HCV. Deoarece glicoproteinele terminate prin manoză sunt relativ rare, un astfel de procedeu va servi pentru purificarea proteinelor prezente în probă, printr-ο reducere substanțială a materialelor de bază. Conținând legarea de lectină, proteina virusului hepatitei C, HCV, poate fi detectată utilizându-se ca anticorp antivirusul hepatitei C. Dacă virionii în întregime sunt prezenți, unii pot fi detectați alternativ în acizii nucleici din virusul hepatitei C, HCV, utilizându-se tehnicile PCR sau alte metode de amplificare ale acidului nucleic îndreptate către regiunile conservate genomice ale virusului hepatitei C (de exemplu regiunea necodificată 5'). Această metodă permite izolarea și caracterizarea diferitelor tulpini de virus al hepatitei C, HCV, fără a se lua în considerație deplasarea antigenică sau variația, cum ar fi, de exemplu, în cazurile în care o nouă tulpină nu este reactiv încrucișată imunologic cu tulpina utilizată pentru prepararea anticorpilor. Există de asemenea multe alte căi avantajoase pentru unica recunoaștere a glicoproteinelor terminate prin manoză, cu lectine speciale. De exemplu, se pot utiliza probe incubate, suspectate de contaminare cu virioni de tipul virusului hepatitei C, HCV sau proteine cu biotină sau lectine avidin-marcate, prin precipitarea complexului lecitin-proteină utilizând avidină sau biotină. Se poate utiliza de asemenea afinitatea lectinei pentru proteinele virusului hepatitei C, HCV, față de compușii țintă la virionii pentru utilizare terapeutică, de exemplu prin conjugarea unui compus antiviral la GNA. în mod alternativ, se pot utiliza lectine corespunzătoare pentru îndepărtarea glicoproteinelor cu terminații de manoză, din fracțiunile serice sau din fracțiunile plasmatice, reducându-se sau eliminându-se astfel riscul contaminării cu virusul hepatitei C, HCV. Se preferă în prezent să se izoleze asialoglicoproteinele E1 și/sau E2 din lizatele celulare brute, prin incubarea cu o proteină legată de manoză imobilizată, în special o lectină cum ar fi de exemplu ConA sau GNA. Celulele sunt lizate de exemplu prin ruperea mecanică într-un mediu de tampon hipotonic, după care are loc centrifugarea pentru prepararea unui lizat post-nuclear și prin continuarea centrifugării se obține o fracțiune brută de membrană microzomală. Fracțiunea de membrană brută este apoi solubilizată într-un mediu tampon conținând un detergent, cum ar fi de exemplu Triton X-100, NP40 sau altele.
RO 117920 Β1
345
Acest extract în detergent este separat apoi de particulele insolubile prin centrifugare și lizatul clarificat rezultat, este incubat într-o coloană cromatografică cuprinzând o proteină imobilizată legată de manoză, de preferință GNA legat la un suport solid cum ar fi de exemplu agaroza sau Sepharoza® pentru o perioadă de timp suficientă pentru legare, care este tipic de la 16 la 20 de ore. Suspensia este apoi aplicată pe coloană până ce E1/E2 începe să apară în eluent, apoi aceasta este incubată în coloană o perioadă de timp suficientă pentru legare, tipic de aproximativ 12-24 h. Materialul de legătură este apoi spălat cu o cantitate adițională de soluție tampon care conține detergent (de exemplu Triton X-100, NP 40 și altele) și se eluează cu manoză pentru a se obține asialoglicoproteina purificată. La eluare, este de preferat să se efectueze eluarea numai până când proteina începe să apară în eluat, punct de la care eluarea se oprește și coloana este lăsată să se echilibreze timp de 2 - 3 h înainte de a se începe eluarea proteinei. Aceasta se crede că lasă un timp suficient pentru a micșora viteza așteptată pentru agregatele mari de proteine. în cazurile în care E1 și E2 sunt exprimate la un loc în forma nativă (de exemplu fără secționarea domeniului de legare a membranei), o fracțiune substanțială de asialoglicoproteine apare sub formă de agregate E1-E2. Când se face examinarea prin microscopie electronică, o porțiune semnificativă din aceste agregate apare ca particule sferice, rugoase având un diametru de aproximativ 40 nm, această dimensiune fiind de așteptat pentru virusul intact. Aceste particule par a fi particule subvirale cu autoasamblare. Aceste agregate sunt de așteptat a prezenta o structură cuaternară foarte similară structurii particulelor de virioni autentici pentru hepatita cu virus C și astfel se așteaptă ca să servească ca vaccinuri cu superioritate imunogenă. Complecșii E1/E2 pot fi în continuare purificați prin gel-cromatografie pe un mediu bazic, de exemplu pe Fractogel-DEAE sau DEAE-Sepharoza®. Utilizându-se gel cromatografia pe Fractogel-DEAE, se pot obține complecși E1/E2 de o puritate aproximativ 60-80%. Se poate purifica E1 în continuare prin tratament cu lizinprotează, deoarece E1 are resturi 0-1 Lys. Prin tratamentul complexului cu lizinproteaza, se distruge E2 și se permite separarea ușoară a E1. Specificitatea tisulară a virusului hepatitei C, în combinație cu observația că glicoproteinele de acoperire ale virusului hepatitei C sunt terminate prin manoză, sugerează că virusul utilizează receptorul de manoză sau receptorul asialoglicoproteinei (ASGR) în vederea realizării pătrunderii în celulele gazdă. Receptorii de manoză sunt găsiți pe macrofagi și pe celulele hepatice sinusoidale, în timp ce ASGR sunt găsiți pe hepatocitele parenchimale. Astfel, ar fi posibil să se realizeze o cultură cu virusul hepatitei C, prin întrebuințarea celulelor gazdă care exprimă unul sau ambii dintre acești receptori. Se mai pot utiliza de asemenea culturi de celule primare care exprimă receptorii în mod natural, utilizându-se condițiile în care receptorul este menținut sau unul poate fi transfectat la o altă linie celulară, cum ar fi exemplu HeLa, CHO, COS și altele, cu un vector care asigură exprimarea receptorului. Clonarea receptorului de manoză și transfectarea acestuia, precum și exprimarea în fibroblaști, a fost demonstrată de către M.E. Taylor și colaboratorii,
J. Biol. Chem. (1990) 265 :12156-62. Clonarea și secvențierea ASGR este descrisă de către
K. Drickamer și colaboratorii în J.Biol.Chem. (1984) 259 : 770-78 și M. Spiess și colaboratorii în Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 82 : 6465-69; transfectarea și exprimarea unui ASGR funcțional în celulele HTC la șobolani este descrisă de către M. Mc-Phaul și P. Berg în Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8863-67 și M. Mc-Phaul și P. Berg în Mol. Cell. Biol. (1987) 7 : 1841-47. Astfel, este posibil să se transfecteze unul sau ambii receptori în linii celulare corespunzătoare și să se utilizeze celulele care rezultă ca celule gazdă pentru propagarea virusului hepatitei C în cultură. Trecerile seriale ale virusului hepatitei C în astfel de culturi ar avea ca rezultat dezvoltarea tulpinilor atenuate corespunzătoare pentru utilizarea ca vaccinuri vii. Se mai poate utiliza de asemenea o serie de culturi celulare primare care exprimă în mod natural receptorul, utilizându-se condițiile în care receptorul este menținut sau se mai
350
355
360
365
370
375
380
385
390
RO 117920 Β1 poate de asemenea transfecta o altă linie celulară cum ar fi HeLa, CHO, COS și altele, cu un vector care asigură exprimarea receptorului. Clonarea receptorului manozei, transfectarea acestuia și exprimarea în fibroblaști au fost demonstrate de către Taylor și colaboratorii, supra, în timp ce trasfectarea și exprimarea ASGR funcțional în celulele HTC la șobolani este descrisă de către Mc-Phaul și colaboratorii, supra. în prezent, se preferă să se utilizeze o linie celulară imortalizată transfectată cu unul sau ambii receptori recombinanți.
Compozițiile imunogene pot fi preparate conform metodelor cunoscute în literatura de specialitate. Compozițiile prezente cuprind o cantitate imunogenă de polipeptidă, cum ar fi, de exemplu, Ε1, E2 sau compoziții sub formă de particule, de E1/E2, de obicei combinate cu un vehicul acceptabil din punct de vedere farmaceutic, de preferință conținând în continuare, un adjuvant. Dacă se dorește un “cocktail”, o combinație de polipeptide ale virusului hepatitei C, HCV, cum ar fi, de exemplu, antigenii E1 plus E2, poate fi amestecată la un loc pentru o eficacitate crescută. Particulele de virus ale agregatelor E1/E2 se așteaptă să furnizeze un antigen al vaccinului utilizat în special. Compozițiile imunogene pot fi administrate la animale pentru inducerea producerii de anticorpi, fie pentru a se asigura o sursă de anticorpi sau pentru a se induce o imunitate de protecție la animal.
Ca vehicule acceptabile din punct de vedere farmaceutic se pot include oricare din vehiculele care nu induc ele însele producerea de anticorpi nocivi pentru individul care primește compoziția. Ca vehicule convenabile tipice se pot întrebuința macromolecule mari, încet metabolizate, cum ar fi proteinele, polizaharidele, acizii polilactici, acizii poliglicolici, amicoacizii polimerici, copolimerii de aminoacizi și particule de virusuri, inactive. Astfel de vehicule sunt bine cunoscute în referințele de specialitate. Adjuvanții preferați pentru a produce o mărire a eficacității compoziției, includ, dar fără să se limiteze la acestea, hidroxidul de aluminiu (alum), N-acetil-muramil-L-threonil-D-izoglutamina (thr-MDP) așa cum este menționat în brevetul U.S. 4606918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamina (norMDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanină-2-(1*,2*-dipalmitoil-sn-glicero-3hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) și RIBI, care conțin trei componente extrase din bacterii, monofosforil lipide A, dimicolat trehaloza și structura din perete celular (MPL+TDMCWS) într-o emulsie 2% squalen/Tween® 80. în mod adițional, se pot utiliza și adjuvanți ca de exemplu Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). în continuare se mai pot utiliza adjuvanți precum Complete Freund’s Adjuvant (CFA) și Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA), pentru aplicații neumane și pentru scopuri de cercetare.
Compozițiile imunogene conțin, în mod tipic, vehicule acceptabile din punct de vedere farmaceutic, cum ar fi, de exemplu, apa, soluțiile saline, glicerolul, etanolul etc. Adițional, substanțe auxiliare, cum ar fi agenții de emulsionare sau agenții de umectare, substanțele cu rol de tampon al pH-ului și altele, pot fi incluse în aceste vehicule.
în mod tipic, compozițiile imunogene sunt preparate ca produse injectabile, atât sub formă de soluții lichide cât și ca suspensii lichide; înainte de injectare pot fi de asemenea preparate forme solide adecvate utilizării în vehicule lichide ca soluții sau suspensii. Preparatele pot fi, de asemenea, emulsionate sau încapsulate în lipozomi pentru a se mări astfel efectul adjuvantului.
Compozițiile imunogene utilizate ca vaccinuri cuprind o cantitate eficientă imunologic, de polipeptidă a virusului hepatitei C, HCV, ca și oricare alte componente menționate mai sus, dacă este necesar. “Cantitatea eficientă imunologic” reprezintă cantitatea administrată la un individ, fie într-o doză unică sau ca parte dintr-o serie și care este eficientă pentru tratament, așa cum s-a definit mai înainte. Această cantitate variază dependent de condițiile de sănătate și de starea fizică ale individului care trebuie tratat, de gruparea taxonomică a individului care trebuie tratat (de exemplu primatele cu excepția omului, primatele, etc.), dependent de capacitatea sistemului imunitar al individului care este tratat de a sintetiza
RO 117920 Β1 anticorpi, dependent de gradul de protecție dorit, de formularea vaccinului, de aprecierea situației medicale de către medicul care efectuează tratamentul, de tulpina de infectare cu virusul hepatitei C și de alți factori relevanți. Este de așteptat ca această cantitate să scadă în limite relativ largi astfel ca ea să poată fi determinată prin experimentări de rutină.
Agregatele E1/E2 cu autoasamblare pot servi așadar ca suport pentru vaccinuri la haptensul heterolog prezent (non-virusul hepatitei C), în aceeași manieră ca în cazul antigenului de suprafață al hepatitei B (vezi Cererea de brevet european 174444). In această utilizare, agregatele E1/E2 asigură un vehicul imunogen capabil de stimularea unui răspuns imun la hapten și sau la antigenii conjugați la agregat. Antigenul poate fi conjugat fie prin metode chimice convenționale sau poate fi donat în gena care codifică proteinele E1 și/sau E2 la locul corespunzător unei regiuni hidrofile a proteinei.
Compozițiile imunogene sunt în mod convențional administrate pe cale parenterală, tipic prin injectare de exemplu pe cale subcutanată sau pe cale intramusculară. Formulările adiționale convenabile pentru alte moduri de administrare includ formulări orale și supozitoarele. Dozajul pentru tratament poate fi sub schema de doză unică sau de asemenea o schemă de doză multiplă. Vaccinul poate fi administrat în conjugare cu alți agenți de imunoreglare.
Se dau, în continuare, 4 exemple în legătură cu invenția.
Exemplele prezentate mai departe sunt furnizate, ca ghid mai departe, pentru specialiștii în domeniu și nu sunt construite ca fiind limitative ale aceastei invenții, în nici un caz.
Exemplul 1. (Clonarea și exprimarea) (A) Vectorii sunt construiți din plasmidele care conțin porțiunea 5' a genomului virusului hepatitei C, HCV, așa cum este descris în EP 318216 și EP 388232. Caseta virusului hepatitei C, HCV (S/B) conține un fragment Stul-BglllI de acid dezoxiribonucleic DNA care codifică porțiunea terminală 5' a poliproteinei din Met 1 până la Leu 906, începând de la nucleotidă 63 față de Met 1. Aceasta include partea interioară a proteinei (C), proteina E1 (care uneori se notează ca S), la proteina E2 (care se notează de asemeni ca NS 1) și porțiunea 5' a regiunii NS2a. După exprimarea constructului, proteinele individuale C, E1 și E2 sunt produse prin procedee proteolitice.
Caseta virusului hepatitei C, HCV (A/B) conține fragmentul de acid dezoxiribonucleic ApaLI-BglII care codifică porțiunea terminală 5' a poliproteinei din Met 1 până la Leu 906, începând cu nucleotidă 6 în raport cu Met 1. Aceasta include porțiunea interioară a proteinei (C), proteina E1 (uneori notată ca S), proteina E2 (notată ca NS1) și o porțiune 5' din regiunea NS2a. După exprimarea constructului, proteinele individuale C, E1 și E2 sunt produse prin procedee proteolitice.
Caseta C-E1(S/B) (o porțiune Stul-BamHI) conține terminația 5' de la Met 1 până la lle340 (un situs BamHI în genă). Exprimarea acestei casete are ca rezultat exprimarea lui C și a proteinelor secționate E 1(ET). Porțiunea secționată de la partea terminală 3' este o regiune hidrofobă care se crede că servește ca un semnal de translocare.
Caseta NS1 (B/B) (o porțiune BamHI-BglII) conține o porțiune mică 3' de proteină E1 (de la Met 364), toate proteinele E2 și o porțiune din NS2a (până la Leu 906). în această construc, fragmentul E1 servește ca un semnal de translocare.
Caseta TPA-NS1 utilizează un lider activator (?PA) plasminogen din țesutul uman ca semnal de translocare în loc de porțiunea 3' a proteinei E1. Caseta care conține o formă secționată de proteină E2, de la Gly 406 până la Glu 661, în care porțiunea terminală 3' hidrofobă, este ștearsă.
Fiecare casetă care este inserată în vectorul pGEM3Z (Promega) cu și fără secvență necodificată sintetică betaglobulina 5', pentru transcripție și translație, utilizează T7 și exprimarea reticulocitului la iepure, în vitro. Vectorii (rW) virusului vaccinului recombinant
445
450
455
460
465
470
475
480
485
490
RO 117920 Β1 sunt preparați prin inserarea casetelor în plasmidul pSC 11 (obținut prin experimentările Dr.
B. Moss, NIH), după care urmează recombinarea cu virusul vaccinului, așa cum este descris de către Charkrabarty și colaboratorii, Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3403-09.
(B) O exprimare alternativă a vectorului a fost realizată prin inserarea virusului hepatitei C, HCV (A/B) între porțiunile Stul și Spel ale pSC59 (obținute de către Dr. B. Mess, NIH), după care urmează recombinarea cu virusul vaccinului așa cum l-a descris Charkrabarty și colaboratorii, în Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3403-09.
(C) Celulele HeLA S3 sunt colectate prin centrifugare timp de 7 min la 2000 rotații pe minut, la temperatura camerei, în flacoane de centrifugare sterile de 500 ml capacitate (cu rotor Ja-10). Peletele sunt resuspendate la o concentrație finală de 2x107 celule per ml într-un mediu de cultură suplimentar (mediu MEMSpinner modificat Joklik + ser de cal - 5% și gentamicina) (“mediu spiner”). Stocul brut de virusuri vv(S C 59-virusul hepatitei C) supus ultrasunetelor, este adăugat la o multitudine de infectare de 8pfu/celula și amestecul obținut este menținut sub agitare la temperatura de 37°C, timp de 30 min. Celulele infectate sunt apoi transferate în flaconul de experimentare care conține 8 I mediu spinner și care se incubează apoi, timp de 3 zile, la temperatura de 37°C.
Celulele din cultură sunt apoi colectate prin centrifugare și peletele sunt suspendate în mediu tampon (10 mM Tris-HCI pH 9,0 152 ml). Celulele sunt apoi omogenizate, utilizându-se un omogenizator Dounce de 40 ml capacitate (50 strokes) și nucleele sunt peletate prin centrifugare (timp de 5 min , la o viteză de 1600 rotații pe minut, la temperatura de 4°C, în rotor JA-20). Peletele nucleare sunt resuspendate în mediu tampon Tris (24 ml), reomogenizate și peletate din nou, după care se reunesc toți supernatanții.
Lizatul reunit este divizat în porții de 10 ml și se supun ultrasonării de trei ori a câte 30 min într-o pâlnie de sonicare la o putere medie. Lizatul sonicat (15 ml) este adus în 17 mililitri de conținut material de sucroză (36%) în tuburi de centrifugare SW28 și se centrifughează la 13.500 rotații pe minut timp de 80 min la 4°C pentru peletarea virusului. Virusul peletat este resuspendat într-un ml de tampon Tris (1mM TrisHCI, la pH 9,0) și se congelează la temperatura de -80°C.
Exemplul 2. (Compararea produselor - in vitro - și - in vivo -) (A) Proteinele E1 și E2 sunt exprimate ambele in vitro și in vivo și 35 S-Met este marcată utilizând vectorii descriși în exemplul 1 de mai sus. Celulele BSC-40 și HeLa sunt infectate cu vectorii rW pentru exprimarea - in vivo -. Atât mediul cât și lizatele celulare sunt examinate pentru proteinele recombinate. Produsele au fost imunoprecipitate utilizându-se ser uman imunizat pentru virusul hepatitei C, HCV, în timp ce proteinele - in vitro - au fost analizate direct. Proteinele rezultate au fost analizate prin SDS-PAGE.
Sistemul de exprimare reticulocitic (pGEM3Z cu HCV (S/B) sau HCV (A/B) produce proteinele C, E1 și E2 având greutăți moleculare de aproximativ 18 kD, 35kD și respectiv 72kD. Lizatele din celulele BSC-40 și HeLa transfectate cu vectorii rW care conțin HCV (S/B), HCV (A/B) sau C-E1 (S/B) prezintă aceleași proteine. Deoarece sistemul reticulocitic nu asigură procesoare golgi eficientă și deci nu se asigură acidul sialic, faptul că atât in vitro cât și in vivo produsele prezintă mobilități identice care sugerează că proteinele nu sunt sialilate -in vivo-. Numai vectorul rW care conține TPA-NS 1 are ca rezultat orice secreție extracelulară de E2, care prezintă o mobilitate modificată consistentă cu sialilare. (B). HCV (S/B) este exprimat -in vitro- și este incubat cu o grupare de lectine biotinilate: GNA, SNA, PNA, WGA și ConA. După incubare complecșii sunt colectați pe sfere acrilice de avidin, apoi sunt spălate, eluate cu un mediu tampon Laemmli și analizate prin SDS-PAGE. Rezultatele arată că proteinele E1 și E2 se leagă de GNA și ConA, care indică prezența manozei. GNA se leagă la grupările de manoză terminale, în timp ca legarea ConA la orice manoză legată în poziția alfa.
RO 117920 Β1
545
Absența legăturilor la SNA, PNA și WGA indică faptul că nici una din proteine nu conține acid sialic, galactoză-N-acetilgalactozamina sau N-acetilglucozamina.
(C) Proteinele E1 și E2 radiomarcate sunt produse în celulele BSC-40 prin infectare rW care conține HCV(S/B)(W/SC11-HCV) șl sunt imunoprecipitate cu ser imun față de HCV+. O jumătate din materialul imunoprecipitat este tratat peste noapte zi cu neuraminidaza pentru a se îndepărta acidul sialic în urme. După tratament, proteinele tratate și proteinele netratate sunt analizate prin SDS-PAGE. Nici o diferență semnificativă în mobilitate nu s-a observat, indicând lipsa sialilării - in vitro -.
(D) Proteinele E1 și E2 radiomarcate sunt produse în celulele BSC-40 prin infectare cu rW conținând HCV (A/B) ((w)/SC 59-HCV) și apoi are loc imunoprecipitarea cu ser uman HCV+ sau precipitarea prin biotinilarea lectinei GNA legată la sferele acrilice, și utilizându-se secvențele de HCV libere w/SC 11, sub formă de control. Precipitatele au fost analizate prin SDS-PAGE. Datele au demonstrat că proteinele E1 și E2 au fost speciile majore de proteine cu manoză terminală în celulele infectate vv/SC 59-HCV. GNA a fost eficient ca antiser uman în precipitarea proteinelor E1 și E2 din mediul de cultură celular. Componentul de 25 kD a fost observat, dar acesta pare a fi specific celulelor infectate cu vaccin.
Exemplul 3 (Purificarea prin utilizarea lectinei).
(A) Celulele HeLa sunt inoculate cu stocul de virusuri W/SC59-HCV purificat cu titru înalt, la o multiplicitate de infectare de 5pfu/celulă și amestecul este agitat la temperatura de 37°C timp de 30 min . Celulele infectate sunt apoi tranferate în flaconul de experimentare conținând mediu spiner 8 I și apoi sunt incubate timp de 3 zile la temperatura de 37°C. Celulele sunt apoi colectate din nou prin centrifugare și resuspendate în tampon hipotonică (20 mM HEPES, 10 mM NaCI, 1mM MgCI2,120 mililitri) pe gheață. Celulele sunt apoi omogenizate cu ajutorul unui omogenizator Dounce (50 strokes) și nucleele sunt peletate prin centrifugare (5 min la 1600 rotații pe minut, la 4°C, cu rotorul JA-20). Peletele sunt reunite, resuspendate în tampon hipotonic 48 ml, reomogenizate, recentrifugate, comasate din nou și congelate la -80°C. Supernatanții congelați sunt apoi decongelați și fracțiunea de membrană microzomală a lizatului post-nuclear este izolată prin centrifugare timp de 20 min pe rotor JA-20 la o viteză de 13.500 rotații pe minut la temperatura de 4°C. Supernatantul este apoi îndepărtat prin aspirație. Peletele sunt luate apoi cu 96 ml de amestec tampon conținând detergent (20 mM Tris-HCI, 100 mM NaCI, 1mM EDTA, 1mM DDT, 0,5% Triton X-100, pH 7,5) și apoi se omogenizează (la 50 strokes). Produsul este clarificat prin centrifugare timp de 20 min la 13.500 rotații pe minut, la 4°C și supernatanții sunt colectați. Coloana de agaroză GNA (1 cm X 3 cm, 3 mg de sfere GNA per ml, 6 ml volumul stratului, Vector Labs, Burligame, CA), a fost pre-echilibrată cu un amestec tampon cu detergent. Proba de supernatant a fost aplicată pe coloană cu recirculare la un debit de 1 ml per minut timp de 16-20 ore la temperatura de 4°C. Coloana a fost apoi spălată cu amestecul tampon cu detergent. Proteinele E1/E2 purificate sunt eluate cu alfa-D-manozid (0,9M în amestec tampon cu detergent), la un debit de 0,5 ml per minut. Eluarea este oprită la apariția proteinelor E1/E2 în eluent și coloana este lăsată să se echilibreze din nou timp de 2-3 h. Fracțiunile sunt analizate prin sistem Western blot și prin colorare cu argint. Fracțiile de vârf sunt comasate și iradiate la ultra-violet pentru inactivarea oricărui virus de vaccin, rezidual.
(B) Asialoglicoproteinele E1 și E1 purificate pe GNA-agaroză sunt sedimentate pe gradiente de glicerol 20-60%. Gradientele sunt fracționate și proteinele sunt analizate prin SDS-PAGE și prin sistemul Western blottine.. Petele sunt analizate GNA pentru identificarea proteinelor E1 șiE2. Rezultatele arată că este prezent heterodimerul E1:E2 care sedimentează în poroporția așteptată (de exemplu în poziția caracteristică a proteinei 110kD). Agregatele mai mari ale proteinelor de acoperire a virusurilor hepatitei C sunt așadar evidente, de asemenea homodimerii proteinelor E1 și E2 sunt evidențiați. Proteina E2 pare a
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 117920 Β1 fi superior reprezentată în speciile mai mari față de proteina E1, deși au fost de asemenea detectate specii discrete de ET.E2. Agregatele mai mari sedimentează mai rapid față de markerul de tiroglobulină.
(C) Proteinele E1 și E2 purificate pe GNA-agaroză sunt sedimentate prin gradiente glicerol 20-60% conținând 1mM EDTA. Fracțiunile sunt analizate prin SDS-PAGE cu și fără beta-mercaptoetanol (beta ME). O mică diferență sau nici una au fost observate în abundența proteinelor E1 șl E2 în prezența sau absența BME, indicându-se astfel absența legăturilor bisulfurice între heterodimeri.
(D) Complecșii de proteine E1/E2 (aproximativ 40% puritate) sunt analizați într-un analizator de particule submicronice de tip Coulter DM-4 submicroni particule). Materialul este detectat la 20-60 nm.
(E) Complecșii de proteine E1/E2 (aproximativ 40% puritate) sunt analizați prin microscopie electronică utilizându-se colorarea negativă cu acid fosfotungstic. Micrograful electronic desvăluie prezența particulelor având aspect sferic și un diametru de aproximativ 40 nm. Complecșii E1/E2 sunt incubați cu ser imun uman HCV', apoi sunt analizați prin EM cu colorare negativă. Complecșii anticorpilor conținând agregate mari și particule mici au fost de asemenea observații.
Exemplul 4. (Purificarea cromatografică) (A) Materialul purificat pe GNA lectina preparat așa cum s-a descris în exemplul 3 (0,5-0,8 ml) s-a diluat de 10 ori cu tampon A (20 mM Tris-CI tampon, la pH 8,0, 1mM EDTA) și s-a aplicat pe o coloană de 1,8x1,5 cm de Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, nr. de catalog 16883) echilibrată în amestecul tampon A. Fracțiunea de proteină care conține proteinele E1/E2 este eluată cu același amestec tampon la un debit de 0,2 ml per minut și fracțiuni de 1 ml sunt apoi colectate. Fracțiunile care conțin proteinele E1 și E2 (determinate prin SDS-PAGE) sunt comasate și depozitate la temperatura de 80°C.
(B) Materialul purificat în partea (A) de mai sus are puritatea de 60-80%, așa cum s-a estimat prin SDS-PAGE. Identificarea benzilor putative E1 și E2 a fost confirmată prin analiza secvențială la N-terminal după utilizarea tehnicii de transfer. în acest scop, materialul E1/E2 purificat pe fractogelul-DEAE a fost redus prin adăugare de amestec tampon Laemmli (la pH 6,8, 0,06 mM Tris-CI, 2,3% SDS, glicerol de concentrație 10%, 0,72M beta-mercaptoetanol) și apoi se fierbe timp de 3 min. Proba este apoi încărcată pe gel de poliacrilamidă de 10%. După prelucrare prin SDS-PAGE, proteina este transferată pe o membrană 0,2 pm de difluorură de poliviniliden (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Benzile respective de proteină putative E1 și E2 sunt excizate din petele respective și supuse analizei de N-terminal din aminoacid deși nu este luată nici o măsură specială pentru prevenirea blocajului amino-terminal în timpul preparării acestui material. Primele 15 cicluri demonstrează ca proba E1 are o secvență Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-AsnAsp; în timp ce secvența de E2 este Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe.
Secvența de aminoacizi cuprinde date conform celor așteptate din secvențele de DNA corespunzătoare:
Produsul E1/E2 purificat mai sus prin cromatografie pe fractogel-DEAE se crede a fi agregat așa cum s-a evidențiat prin faptul că o mare cantitate de E1 și E2 este coeluată în zona cu volum vid din coloana cromatografică de permeație a gelului BioSil TSK-4000SW. Aceasta arată că în condiții native, o cantitate semnificativă de complex E1/E2 cu greutatea moleculară de circa 650 kD este de asemeni observate.
Claims (5)
- Revendicări1. Asialoglicoproteină provenind de la virusul hepatitei C, caracterizată prin aceea că este selectată dintr-un grup constituit din glicoproteine, exprimate de regiunea E1 a virusului hepatitei C, care conțin o deleție într-o porțiune a secvenței care cuprinde aminoacizii 330-380, din regiunea E1 și glicoproteine exprimate de regiunea E2 a virusului hepatitei C, care conțin o deleție într-o porțiune a secvenței care cuprinde aminoacizii 660 830 a regiunii E2, numerotarea făcându-se de la începutul poliproteinei HCV.
- 2. Asialoglicoproteină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este extrasă din regiunea E1 a virusului hepatitei C și conține o deleție într-o secvență care se găsește într-o porțiune cuprinsă între aminoacizii 330 - 380 din regiunea E1.
- 3. Asialoglicoproteină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este extrasă din regiunea E2 a virusului hepatitei C și conține o deleție într-o secvență care se găsește într-o porțiune cuprinsă între aminoacizii 660 - 830 din regiunea E2.
- 4. Compoziție imunogenă, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde o cantitate eficientă de asialoglicoproteină definită în revendicarea 1, un vehicul acceptabil farmaceutic și, adițional, substanțe auxiliare, precum agenți de emulsionare, agenți de umectare și substanțe cu rol de tampon.
- 5. Metodă de inducere a unui răspuns imun la un animal, caracterizată prin aceea că aceasta constă în administrarea unei compoziții imunogene, definită în revendicarea 4, pe cale parenterală, de preferință, prin injectare, pe cale subcutanată sau intramusculară, în doză unică sau multiplă.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61141990A | 1990-11-08 | 1990-11-08 | |
| US75888091A | 1991-09-13 | 1991-09-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO117920B1 true RO117920B1 (ro) | 2002-09-30 |
Family
ID=27086508
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO97-01809A RO117920B1 (ro) | 1990-11-08 | 1991-11-07 | Asialoglicoproteina provenind de la virusul hepatitei c, compozitie imunogena si metoda de inducere a unui raspuns imun |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1471073B1 (ro) |
| AT (2) | ATE264868T1 (ro) |
| DE (2) | DE69133609D1 (ro) |
| DK (1) | DK1471073T3 (ro) |
| ES (2) | ES2218629T5 (ro) |
| IE (1) | IE913916A1 (ro) |
| PL (1) | PL175610B1 (ro) |
| RO (1) | RO117920B1 (ro) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0185373B1 (ko) * | 1989-03-17 | 1999-05-01 | 로버트 피. 블랙버언 | Hcv 폴리단백질에서 유래되는 hcv 아미노산 서열 부분을 포함하는 폴리펩티드 및 그 사용 |
-
1991
- 1991-11-07 DE DE69133609T patent/DE69133609D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 DK DK04076119T patent/DK1471073T3/da active
- 1991-11-07 ES ES97120661T patent/ES2218629T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 DE DE69133382T patent/DE69133382T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 PL PL91300038A patent/PL175610B1/pl unknown
- 1991-11-07 RO RO97-01809A patent/RO117920B1/ro unknown
- 1991-11-07 AT AT97120661T patent/ATE264868T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 EP EP04076119A patent/EP1471073B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 AT AT04076119T patent/ATE414102T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-07 ES ES04076119T patent/ES2314334T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-08 IE IE391691A patent/IE913916A1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2314334T3 (es) | 2009-03-16 |
| IE913916A1 (en) | 1992-05-20 |
| IE970761A1 (en) | 2000-02-23 |
| DE69133382T2 (de) | 2005-05-04 |
| DE69133382T3 (de) | 2009-10-08 |
| ATE414102T1 (de) | 2008-11-15 |
| DE69133609D1 (de) | 2008-12-24 |
| PL175610B1 (pl) | 1999-01-29 |
| DE69133382D1 (de) | 2004-06-03 |
| DK1471073T3 (da) | 2009-01-26 |
| ES2218629T3 (es) | 2004-11-16 |
| EP1471073B1 (en) | 2008-11-12 |
| EP1471073A3 (en) | 2004-12-01 |
| ES2218629T5 (es) | 2009-06-02 |
| EP1471073A2 (en) | 2004-10-27 |
| ATE264868T1 (de) | 2004-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6274148B1 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| AU668078B2 (en) | Hepatitis C virus asialoglycoproteins | |
| RU2175657C2 (ru) | Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа | |
| RO117920B1 (ro) | Asialoglicoproteina provenind de la virusul hepatitei c, compozitie imunogena si metoda de inducere a unui raspuns imun | |
| FI107804B (fi) | Immunomäärityksissä käytettäviä hepatiitti-C-viruksen asialoglykoproteiineja | |
| JP2945759B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 | |
| CZ289923B6 (cs) | Hepatitis C virový, zkrácený asialoglykoprotein, farmaceutická kompozice s jeho obsahem a jeho pouľití | |
| IE84479B1 (en) | Hepatitis C Virus Asialoglycoproteins |