ES2314334T3 - Asialoglicoproteinas del virus de la hepatitis c. - Google Patents
Asialoglicoproteinas del virus de la hepatitis c. Download PDFInfo
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Abstract
Una asialoglicoproteína del virus de la hepatitis C (VHC) seleccionada de una glicoproteína truncada expresada a partir de la región E1 del VHC que comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 330-380 de la región E1, numerados desde el principio de las poliproteínas del VHC, y una glicoproteína expresada a partir de la región E2 del VHC que comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los aminoácidos 660-830 de la región E2, numerados desde el principio de la poliproteína del VHC.
Description
Asialoglicoproteínas del virus de la hepatitis
C.
Esta invención se refiere a los campos generales
de la expresión de proteínas recombinantes y la virología. Más
particularmente, la invención se refiere a glicoproteínas útiles
para el diagnóstico, el tratamiento y la profilaxis de infección
por el virus de la hepatitis C (VHC) y a procedimientos para
producir tales glicoproteínas.
La hepatitis no A no B (HNANB) es una enfermedad
transmisible (o familia de enfermedades) que se cree que se induce
viralmente y puede distinguirse de otras formas de enfermedad
hepática asociada a virus tales como aquellas producidas por el
virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus
de la hepatitis delta (VHD), citomegalovirus (CMV) o virus de
Epstein-Barr (VEB). Las pruebas epidemiológicas
sugieren que puede haber tres tipos de HNANB: el tipo epidémico
transmitido por el agua; el tipo asociado a sangre o agujas; y el
tipo extrahospitalario que se produce esporádicamente. Se desconoce
el número de agentes causales. Sin embargo, recientemente se ha
identificado una nueva especie viral, el virus de la hepatitis C
(VHC), como la causa principal (si no la única) de la HNANB
transmitida por la sangre (HNANB-TS). Véase, por
ejemplo, el documento PCT WO89/046699. La hepatitis C parece ser la
forma principal de hepatitis asociada a transfusión en varios
países o regiones que incluyen los Estados Unidos, Europa y Japón.
También hay pruebas que implican al VHC en la inducción de
carcinoma hepatocelular. Por tanto, existe la necesidad de un
procedimiento eficaz para prevenir y tratar la infección por
VHC.
Es significativa la demanda de procedimientos
específicos sensibles para seleccionar e identificar portadores del
VHC y sangre o hemoderivados contaminados con el VHC. La hepatitis
postransfusional (HPT) se produce en aproximadamente el 10% de los
pacientes transfundidos y el VHC representa hasta el 90% de estos
casos. El problema principal en esta enfermedad es la frecuente
progresión a lesión hepática crónica (25-55%).
La atención al paciente, además de la prevención
de la transmisión del VHC por sangre y hemoderivados o por contacto
personal íntimo requiere herramientas diagnósticas y pronósticas
fidedignas para detectar ácidos nucleicos, antígenos y anticuerpos
relacionados con el VHC. Además, también existe la necesidad de
vacunas y agentes terapéuticos inmunoterapéuticos eficaces para la
prevención y/o el tratamiento de la enfermedad.
El VHC aparece en la sangre de individuos
infectados a tasas muy bajas con respecto a otros virus infecciosos
que hace que el virus sea muy difícil de detectar. La baja carga
viral es probablemente la razón principal de que el agente causal
de la hepatitis NANB permaneciera tanto tiempo sin detectar. Aún
cuando ahora se ha clonado, el VHC todavía resulta difícil de
cultivar y propagar. Por consiguiente, existe una fuerte necesidad
de medios recombinantes para producir proteínas del VHC
diagnósticas/terapéuticas/profilácticas.
Adicionalmente, existe una gran necesidad de una
vacuna contra el VHC. Sin embargo, es extremadamente difícil
cultivar el VHC en líneas celulares. Por tanto, no ha sido posible
producir cepas virales atenuadas mediante pase seriado en cultivo de
tejido/celular.
Se ha encontrado que dos proteínas del VHC, E1 y
E2, parecen ser asialoglicoproteínas asociadas a membrana cuando se
expresan en sistemas recombinantes. Esto es sorprendente porque las
glicoproteínas normalmente no se quedan en forma terminada en
manosa en mamíferos, sino que se modifican adicionalmente con otros
carbohidratos: la forma terminada en manosa es normalmente sólo
transitoria. En el caso de E1 y E2 (como se expresan en nuestros
sistemas), la asialoglicoproteína parece ser la forma final. La E1
(proteína de la envuelta 1) es una glicoproteína que tiene un peso
molecular de aproximadamente 35 kD que se traduce de la región E1
predicha del genoma del VHC. La E2 (proteína de la envuelta 2) es
una glicoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 72
kD que se traduce de la región NS1 predicha (proteína no estructural
1) del genoma del VHC, basado en el modelo flaviviral del VHC. Como
las glicoproteínas virales son frecuentemente sumamente
inmunogénicas, E1 y E2 son excelentes candidatas para uso en
inmunoensayos y vacunas terapéuticas/profilácticas.
El descubrimiento de que E1 y E2 no están
sialiladas es significativo. La forma particular de una proteína
dicta frecuentemente qué células pueden servir de huéspedes
adecuados para la expresión recombinante. Los procariotas tales
como E. coli no glicosilan proteínas, y generalmente no son
adecuados para la producción de glicoproteínas para uso como
antígenos porque la glicosilación es frecuentemente importante para
la completa antigenicidad, solubilidad y estabilidad de la
proteína. Los eucariotas inferiores tales como levadura y hongos
glicosilan proteínas, pero generalmente no pueden añadir residuos de
ácido siálico terminal a los complejos de carbohidrato. Por tanto,
las proteínas procedentes de levadura pueden ser antigénicamente
distintas de sus homólogos naturales (no recombinantes). Se
prefiere la expresión en células de mamífero para aplicaciones en
las que es importante la antigenicidad del producto ya que la
glicosilación de la proteína recombinante debe parecerse fielmente a
la de las proteínas virales
salvajes.
salvajes.
Nuevas pruebas indican que el virus VHC puede
conseguir entrar en células huésped durante la infección por o el
receptor de asialoglicoproteína encontrado en hepatocitos o por el
receptor de manosa encontrado en células endoteliales hepáticas y
macrófagos (particularmente células de Kupffer). Sorprendentemente
se ha encontrado que la mayoría de E1 y E2 naturales no contienen
residuos de ácido siálico terminal, sino que sólo están glicosilados
en el núcleo. Una pequeña fracción contiene adicionalmente
N-acetilglucosamina terminal. Por consiguiente, un
objeto de la presente invención es proporcionar glicoproteínas de la
envuelta del VHC que carecen de todos o sustancialmente todos los
residuos de ácido siálico terminal.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para producir asialo-E1 o E2 en condiciones que
inhiban la adición de ácido siálico terminal, por ejemplo, mediante
expresión en levadura o mediante expresión en células de mamífero
usando antibióticos para facilitar la secreción o liberación.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para purificar E1 o E2 mediante afinidad por lectinas que se unen a
residuos de manosa terminal o residuos de
N-acetilglucosamina terminal.
Otro aspecto de la invención es una composición
inmunogénica que comprende una asialoglicoproteína recombinante
seleccionada del grupo que está constituido por E1 y E2 del VHC en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Opcionalmente puede incluirse un adyuvante inmunológico, si se
desea.
Otro aspecto de la invención es un reactivo de
inmunoensayo que comprende una asialoglicoproteína recombinante
seleccionada del grupo que está constituido por E1 y E2 del VHC en
combinación con un soporte adecuado. Otro reactivo de inmunoensayo
de la invención comprende una asialoglicoproteína recombinante
seleccionada del grupo que está constituido por E1 y E2 del VHC en
combinación con un marcador detectable adecuado.
Otro aspecto de la invención se refiere a
dímeros y conjuntos de orden superior de E1 y/o E2. Una especie de
la invención es un complejo de E2. Otra especie de la invención es
un heterodímero E1:E2.
Otro aspecto de la invención es una composición
de vacuna contra el VHC que comprende conjuntos E1:E2 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para purificar complejos E1:E2.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para propagar el VHC en cultivo celular que comprende (a)
proporcionar una célula que expresa un receptor seleccionado del
grupo que está constituido por el receptor de manosa y el receptor
de asialoglicoproteína, (b) infectar la célula con el VHC; y (c)
cultivar la célula infectada. Preferentemente, la célula expresa un
receptor recombinante.
El término "asialoglicoproteína" se refiere
a una proteína glicosilada que está sustancialmente libre de restos
de ácido siálico. Las asialoglicoproteínas pueden prepararse
recombinantemente o mediante purificación de cultivo celular o
fuentes naturales. Las asialoglicoproteínas actualmente preferidas
proceden del VHC, preferentemente las glicoproteínas E1 y E2, lo
más preferentemente E1 y E2 recombinantes (E1r y E2r). Una proteína
está "sustancialmente libre" de ácido siálico dentro del
alcance de esta definición si la cantidad de residuos de ácido
siálico no interfiere sustancialmente con la unión de la
glicoproteína a proteínas de unión a la manosa tales como GNA. Este
grado de sialilación se obtendrá generalmente cuando menos de
aproximadamente el 40% del carbohidrato ligado a N total sea ácido
siálico, más preferentemente menos de aproximadamente el 30%, más
preferentemente menos de aproximadamente el 20%, más
preferentemente menos de aproximadamente el 10%, más preferentemente
menos de aproximadamente el 5%, y lo más preferentemente menos de
aproximadamente el 2%.
El término "E1" como se usa en este
documento se refiere a una proteína o polipéptido expresado dentro
de los primeros 400 aminoácidos de una poliproteína del VHC,
algunas veces se denomina en lo sucesivo la proteína E o S. En su
forma natural es una glicoproteína de 35 kD que se encuentra
fuertemente asociada a la membrana. En la mayoría de las cepas
naturales del VHC, la proteína E1 se codifica en la poliproteína
viral que sigue a la proteína C (núcleo). La proteína E1 se
extiende desde aproximadamente el aminoácido 192 hasta
aproximadamente el aa 383 de la poliproteína de longitud completa.
El término "E1" como se usa en este documento también incluye
análogos y mutantes truncados que son inmunológicamnte reactivos de
forma cruzada con E1 natural.
El término "E2" como se usa en este
documento se refiere a una proteína o polipéptido expresado dentro
de los primeros 900 aminoácidos de una poliproteína del VHC,
algunas veces se denomina en lo sucesivo la proteína NS1. En su
forma natural es una glicoproteína de 72 kD que se encuentra
fuertemente asociada a la membrana. En la mayoría de las cepas
naturales del VHC, la proteína E1 sigue a la proteína E1. La
proteína E2 se extiende desde aproximadamente el aa 384 hasta
aproximadamente el aa 820. El término "E2" como se usa en este
documento también incluye análogos y mutantes truncados que son
inmunológicamente reactivos de forma cruzada con E2 natural.
\newpage
El término "conjunto" como se usa en este
documento se refiere a un complejo de E1 y/o E2 que contiene más de
un monómero de E1 o E2. Los dímeros E1:E1, dímeros E2:E2 y
heterodímeros E1:E2 son todos "conjuntos" dentro del alcance
de esta definición. Las composiciones de la invención también pueden
incluir conjuntos más grandes y pueden tener pesos moleculares
superiores a 800 kD.
El término "partícula" como se usa en este
documento se refiere a un conjunto de E1, E2 o E1/E2 visible por
microscopía electrónica y que tiene una dimensión de al menos 20 nm.
Partículas preferidas son aquellas que tienen un aspecto
aproximadamente esférico y un diámetro de aproximadamente 40 nm por
microscopía electrónica.
El término "purificada" como se aplica a
proteínas en este documento se refiere a una composición en la que
la proteína deseada comprende al menos el 35% del componente de
proteína total en la composición. La proteína deseada comprende
preferentemente al menos el 40%, más preferentemente al menos
aproximadamente el 50%, más preferentemente al menos
aproximadamente el 60%, todavía más preferentemente al menos
aproximadamente el 70%, incluso más preferentemente al menos
aproximadamente el 80%, incluso más preferentemente al menos
aproximadamente el 90% y lo más preferentemente al menos
aproximadamente el 95% del componente de proteína total. La
composición puede contener otros compuestos tales como
carbohidratos, sales, lípidos, disolventes y similares sin afectar
la determinación de la pureza en porcentaje como se usa en este
documento. Una asialoglicoproteína del VHC "aislada" quiere
decir una composición de asialoglicoproteína del VHC que tiene al
menos el 35% de pureza.
"Proteína de unión a la manosa" como se usa
en este documento quiere decir una lectina u otra proteína que se
une específicamente a proteínas que tienen glicosilación terminada
en manosa (por ejemplo, asialoglicoproteínas), por ejemplo,
lectinas de unión a la manosa, anticuerpos específicos para
glicosilación terminada en manosa, proteína del receptor de manosa
(R.A.B. Ezekowitz y col., J Exp Med (1990)
176:1785-94), proteínas del receptor de
asialoglicoproteína (H. Kurata y col., J Biol Chem (1990)
265:11295-98), proteína del suero de unión a la
manosa (I. Schuffenecker y col., Cytogenet Cell Genet (1991)
56:99-102; K. Sastry y col., J Immunol (1991)
147:692-97), proteína del suero de unión a
asialoglicoproteína y similares. Las lectinas de unión a la manosa
incluyen, por ejemplo, GNA, concanavalina A (ConA) y otras lectinas
con propiedades de unión similares.
El término "lectina GNA" se refiere a
aglutinina de Galanthus nivalis, una lectina comercialmente
disponible que se une a glicoproteínas terminadas en manosa.
Una glicoproteína "recombinante" como se
usa en este documento es una glicoproteína expresada a partir de un
polinucleótido recombinante en la que el gen estructural que
codifica la glicoproteína se expresa bajo el control de secuencias
reguladoras no naturalmente adyacentes al gen estructural o en la
que el gen estructural está modificado. Por ejemplo, puede formarse
un vector en que el gen estructural de E1 se pone bajo el control
de un fragmento funcional del promotor
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) de la levadura. Un promotor actualmente
preferido para uso en levadura es el promotor híbrido ADH2/GAP
descrito en la patente de EE.UU. nº 4.880.734 que emplea un
fragmento del promotor GAPDH en combinación con la secuencia de
activación aguas arriba procedente del alcohol deshidrogenasa 2.
Modificaciones del gen estructural pueden incluir la sustitución de
diferentes codones con codones degenerados (por ejemplo, para
utilizar codones preferidos para huéspedes, eliminar o generar
sitios de escisión de enzimas de restricción, para controlar la
formación de horquillas, etc.) y la sustitución, inserción o
deleción de un número limitado de codones que codifican diferentes
aminoácidos (debe alterarse preferentemente no más de
aproximadamente el 10%, más preferentemente menos de
aproximadamente el 5% en número de la secuencia de aminoácidos
naturales) y similares. Similarmente, un receptor
"recombinante" se refiere a una proteína del receptor expresada
a partir de un polinucleótido recombinante en la que el gen
estructural que codifica el receptor se expresa bajo el control de
las secuencias reguladoras no naturalmente adyacentes al gen
estructural, o en las que el gen estructural está modificado.
El término "polipéptido aislado" se refiere
a un polipéptido que está sustancialmente libre de otros componentes
virales del VHC, particularmente polinucleótidos. Una composición
de polipéptidos está "sustancialmente libre" de otro
componente si el peso del polipéptido en la composición es al menos
el 70% del peso del polipéptido y otro componente combinado, más
preferentemente al menos aproximadamente el 80%, todavía más
preferentemente aproximadamente el 90%, y lo más preferentemente el
95% o superior. Por ejemplo, una composición que contiene 100
\mug/ml de E1 y sólo 3 \mug/ml de otros componentes del VHC (por
ejemplo, ADN, lípidos, etc.) está sustancialmente libre de "otros
componentes virales del VHC", y por tanto, es una composición de
un polipéptido aislado dentro del alcance de esta definición.
El término "líder de la secreción" se
refiere a un polipéptido que, cuando se codifica en el extremo N de
una proteína, hace que la proteína se secrete dentro del medio de
cultivo de la célula huésped tras la traducción. El líder de la
secreción procederá generalmente de la célula huésped empleada. Por
ejemplo, líderes de la secreción adecuados para uso en levadura
incluyen el líder del factor \alpha de Saccharomyces
cerevisiae (véase la patente de EE.UU. nº 4.870.008).
El término "eucariota inferior" se refiere
a células huésped tales como levadura, hongos y similares. Los
eucariotas inferiores son generalmente (pero no necesariamente)
unicelulares. Eucariotas inferiores preferidos son levaduras,
particularmente especies dentro de Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula y
similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y
K. lactis son los huéspedes de levadura más comúnmente usados
y son huéspedes fúngicos convenientes.
El término "eucariota superior" se refiere
a células huésped procedentes de animales superiores tales como
mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huésped de
eucariotas superiores actualmente preferidas proceden de hámster
chino (por ejemplo, CHO), mono (por ejemplo, células COS), ser
humano e insecto (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las
células huésped pueden proporcionarse en cultivos en suspensión o en
matraz, cultivos de tejido, cultivos de órganos y similares.
El término "modulador del calcio" se
refiere a un compuesto que puede secuestrar o unirse a iones calcio
dentro del retículo endoplásmico o afecta la concentración de iones
calcio dentro del RE mediante su efecto en las proteínas
reguladoras del calcio (por ejemplo, proteínas de los canales de
calcio, bombas de calcio, etc.). Moduladores del calcio adecuados
incluyen, por ejemplo, tapsigargina, EGTA (ácido
etilenglicol-bis[\beta-aminoetiléter]-N,N,N',N'-tetraacético).
El modulador actualmente preferido es tapsigargina (véase, por
ejemplo, O. Thastrup y col., Proc Nat Acad Sci USA (1990)
87:2466-70).
El término "inmunogénico" se refiere a la
capacidad de una sustancia para producir una respuesta inmunitaria
humoral y/o celular, tanto si está sola como cuando se liga a un
vehículo, en presencia o ausencia de un adyuvante.
"Neutralización" se refiere a una respuesta inmunitaria que
bloquea la infectividad, bien parcialmente o completamente, de un
agente infeccioso. Una "vacuna" es una composición inmunogénica
que puede provocar protección contra el VHC, tanto si es parcial
como completa, útil para el tratamiento de un individuo.
El término "líquido biológico" se refiere a
un fluido obtenido de un organismo tal como suero, plasma, saliva,
secreciones gástricas, mucosidad y similares. En general se
detectará un líquido biológico para la presencia de partículas del
VHC. Algunos fluidos biológicos se usan como fuente de otros
productos tales como factores de coagulación (por ejemplo, factor
VIII:C), albúmina de suero, hormona de crecimiento y similares. En
tales casos es importante que el fluido biológico fuente esté libre
de contaminación por virus tales como el VHC.
La región E1 del genoma del VHC se describe en
el documento EP 388.232 como la región "E", mientras que la E2
se describe como "NS1". La región E1 comprende aproximadamente
los aminoácidos 192-383 en la poliproteína viral de
longitud completa. La región E2 comprende aproximadamente los
aminoácidos 384-820. Las secuencias completas de
prototipos de estas proteínas (cepa VHC-1) están
disponibles en la técnica (véase el documento EP 388.232) ya que
son procedimientos generales para clonar y expresar las proteínas.
Tanto E1 como E2 pueden expresarse a partir de un polinucleótido
que codifica los primeros 850-900 aminoácidos de la
poliproteína del VHC: el procesamiento posterior a la traducción en
la mayoría de las células huésped eucariotas escinde la
poliproteína inicial en C, E1 y E2. Puede truncarse el extremo 5' de
la región codificante para reducir la cantidad de proteína C
producida.
La expresión de asialoglicoproteínas puede
lograrse por varios procedimientos. Por ejemplo, puede obtenerse la
expresión en eucariotas inferiores (tales como levadura) que
normalmente no añaden residuos de ácido siálico a proteínas
glicosiladas. En sistemas de expresión en levaduras actualmente se
prefiere emplear un líder de la secreción tal como el líder del
factor \alpha de S. cerevisiae de manera que la proteína se
expresa en el medio de cultivo tras la traducción. Actualmente
también se prefiere emplear mutantes deficientes en glicosilación
tales como pmr1 ya que estos mutantes sólo proporcionan la
glicosilación del núcleo y frecuentemente secretan proteínas
heterólogas con mayor eficiencia (H.K. Rudolph y col., Cell (1989)
58:133-45). Alternativamente, pueden emplearse
otras especies de levadura, tales como Pichia pastoris, que
expresan glicoproteínas que contienen 8-9 residuos
de manosa en un patrón que se cree que se asemeja al patrón de
glicosilación del núcleo observado en mamíferos y S.
cerevisiae.
Alternativamente, la expresión puede disponerse
en células de mamífero y bloquear la glicosilación terminal
(adición de ácido siálico). Los constructos recombinantes incluirán
preferentemente una señal de secreción para asegurar que la
proteína se dirige hacia el retículo endoplásmico. El transporte al
golgi parece estar bloqueado por las propias E1 y E2: parece que la
expresión de alto nivel de E1 o E2 en células de mamífero detiene
la secreción de todas las proteínas celulares en el retículo
endoplásmico o cis golgi. Adicionalmente puede emplearse un
mutante defectuoso para la glicosilación. Véase, por ejemplo, P.
Stanley, Ann Rev Genet (1984) 18:525-52. En el caso
de que un mutante de glicosilación o de transporte exprese E1 o E2
con sialilación, los residuos de ácido siálico terminal pueden
eliminarse mediante tratamiento con neuraminidasa.
El rendimiento debe aumentarse adicionalmente
mediante el uso de un modulador del calcio para obtener la
liberación de proteína de dentro del retículo endoplásmico.
Moduladores adecuados incluyen tapsigargina, EGTA y A23817 (véase,
por ejemplo, O. Thastrup y col., Proc Nat Acad Sci USA (1990)
87:2466-70). Por ejemplo, puede expresarse una gran
cantidad de E1 o E2 intracelularmente en células de mamífero (por
ejemplo, células CHO, COS, HeLa y similares) mediante transfección
con un vector de virus de la variolovacuna recombinante. Después de
dejar un tiempo para la expresión y acumulación de proteínas en el
retículo endoplásmico, las células se exponen a un modulador del
calcio en concentración suficientemente grande para producir la
liberación del contenido del RE. La proteína se recupera luego del
medio de cultivo, que se sustituye para el siguiente ciclo.
Adicionalmente puede ser ventajoso expresar una
forma truncada de la proteína de la envuelta. Parece que tanto E1
como E2 tienen un dominio sumamente hidrófobo que aparentemente
ancla la proteína dentro del retículo endoplásmico y evita la
liberación eficaz. Por tanto, puede desearse eliminar porciones de
la secuencia encontrada en una o más de las regiones de aa
170-190, aa 260-290 o aa
330-380 de E1 (numerando desde el principio de la
poliproteína) y aa 660-830 de E2 (véase, por
ejemplo, la figura 20-1 del documento EP 388.232).
Es probable que al menos uno de estos dominios hidrófobos forme una
región transmembrana que no es esencial para la antigenicidad de la
proteína y que, por tanto, puede eliminarse sin efecto perjudicial.
La mejor región para eliminar puede determinarse realizando un
pequeño número de experimentos de deleción dentro de la destreza del
médico general. La deleción del extremo 3' hidrófobo de E2 da como
resultado la secreción de una porción de la E2 expresada, con
sialilación de la proteína secretada.
Puede usarse cualquiera de una variedad de
vectores para obtener la expresión. Los eucariotas inferiores tales
como la levadura se transforman normalmente con plásmidos usando el
procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, o se
transfectan con un virus recombinante. Los vectores pueden
replicarse independientemente dentro de la célula huésped o pueden
integrarse dentro del genoma de la célula huésped. Los eucariotas
superiores pueden transformarse con plásmidos, pero normalmente se
infectan con un virus recombinante, por ejemplo un virus de la
variolovacuna recombinante. Se prefiere particularmente
variolovacuna ya que la infección con variolovacuna detiene la
expresión de proteínas de células huésped. Células huésped
actualmente preferidas incluyen líneas celulares HeLa y de
plasmacitoma. En el presente sistema, esto significa que E1 y E2 se
acumulan como las principales especies glicosiladas en el RE
huésped. Como las E1r y E2r serán las glicoproteínas predominantes
que terminan en manosa, pueden purificarse fácilmente a partir de
las células usando lectinas tales como aglutinina de Galanthus
nivalis (GNA) que se unen a residuos de manosa terminal.
Las proteínas que se expresan naturalmente como
glicoproteínas terminadas en manosa son relativamente raras en la
fisiología de los mamíferos. En la mayoría de los casos, una
glicoproteína de mamífero termina en manosa sólo como producto
intermedio transitorio en la ruta de glicosilación. El hecho de que
las proteínas de la envuelta del VHC, expresadas recombinantemente,
contengan glicosilación terminada en manosa o (en menor grado)
N-acetilglucosamina significa que las proteínas del
VHC y los viriones completos pueden separarse y purificarse
parcialmente a partir de proteínas endógenas usando lectinas
específicas para manosa o N-acetilglucosamina
terminal. Las proteínas recombinantes parecen auténticas y se cree
que son esencialmente idénticas a las proteínas de la envuelta
encontradas en el virión libre maduro o a una forma de proteína de
la envuelta asociada a células. Por tanto, pueden emplearse
lectinas tales como GNA para proteínas terminadas en manosa y WGA
(aglutinina del germen de trigo) y sus equivalentes para proteínas
terminadas en N-acetilglucosamina. Pueden emplearse
lectinas unidas a una fase sólida (por ejemplo, una columna de
lectina-Sepharose®) para separar E1 y E2 de los
sobrenadantes del cultivo celular y otros fluidos, por ejemplo, para
la purificación durante la producción de antígenos para uso en
vacunas o inmunoensayo.
Alternativamente, puede proporcionarse una
lectina adecuada para aislar E1, E2 o viriones del VHC de muestras
de fluido o tejido de sujetos sospechosos de infección por el VHC.
Como las glicoproteínas terminadas en manosa son relativamente
raras, un procedimiento tal debería servir para purificar las
proteínas presentes en una muestra, reduciéndose sustancialmente el
fondo. Tras la unión a lectina, la proteína del VHC puede detectarse
usando anticuerpos anti-VHC. Si están presentes
viriones completos, alternativamente pueden detectarse ácidos
nucleicos del VHC usando técnicas de PCR u otros procedimientos de
amplificación de ácidos nucleicos dirigidos hacia regiones
conservadas del genoma del VHC (por ejemplo, la región no
codificante en 5'). Este procedimiento permite el aislamiento y la
caracterización de cepas diferentes del VHC sin considerar
desplazamiento o variación antigénica, por ejemplo, en casos en los
que una nueva cepa no sea inmunológicamente reactiva de forma
cruzada con la cepa usada para preparar anticuerpos. Hay muchos
otros modos de aprovechar el único reconocimiento de glicoproteínas
terminadas en manosa por lectinas particulares. Por ejemplo, pueden
incubarse muestras sospechosas de contener viriones o proteínas del
VHC con lectinas marcadas con biotina o avidina, y precipitar el
complejo proteína-lectina usando avidina o biotina.
También puede usarse la afinidad de lectinas por proteínas del VHC
para elegir como diana compuestos respecto a viriones para uso
terapéutico, por ejemplo, conjugando un compuesto antivírico a GNA.
Alternativamente, pueden usarse lectinas adecuadas para eliminar
glicoproteínas terminadas en manosa de fracciones de suero o plasma
reduciéndose o eliminándose así el riesgo de contaminación por el
VHC.
Actualmente se prefiere aislar
asialoglicoproteínas E1 y/o E2 de lisados celulares brutos mediante
incubación con una proteína de unión a la manosa inmovilizada,
particularmente una lectina tal como ConA o GNA. Las células se
lisan, por ejemplo, mediante destrucción mecánica en un tampón
hipotónico seguido de centrifugación para preparar un lisado
posnuclear, y se centrifugan adicionalmente para obtener una
fracción de membrana microsomal bruta. La fracción de membrana
bruta se solubiliza posteriormente en un tampón que contiene un
detergente, tal como Triton X-100, NP40 o
similares. Este extracto de detergente se clarifica adicionalmente
de partículas insolubles mediante centrifugación y el lisado
clarificado resultante se incuba en una columna de cromatografía
que comprende una proteína de unión a la manosa inmovilizada,
preferentemente GNA, unida a un soporte sólido tal como agarosa o
Sepharose® durante un periodo de tiempo suficiente para la unión,
normalmente 16 a 20 horas. Entonces, la suspensión se aplica a la
columna hasta que empieza a aparecer E1/E2 en el eluyente, luego se
incuba en la columna durante un periodo de tiempo suficiente para la
unión, normalmente aproximadamente 12-24 horas.
Entonces, el material unido se lava con tampón adicional que
contiene detergente (por ejemplo, Triton X-100,
NP40 o similares) y se eluye con manosa para proporcionar
asialoglicoproteína purificada. En la elución se prefiere eluir
sólo hasta que la proteína empiece a aparecer en el eluato, momento
en el que la elución se detiene y la columna se deja equilibrar
durante 2-3 horas antes de continuar con la elución
de la proteína. Se cree para esto deja tiempo suficiente para la
lenta disociación esperada de grandes conjuntos de proteínas. En
los casos en los que E1 y E2 se expresan juntas en forma nativa (es
decir, sin truncar el dominio de unión a membrana), una fracción
sustancial de las asialoglicoproteínas aparece como conjuntos E1:E2.
Cuando se examinan mediante microscopía electrónica, una porción
significativa de estos conjuntos aparecen como partículas
aproximadamente esféricas que tienen un diámetro de aproximadamente
40 nm, que es el tamaño esperado para virus intactos. Parece que
estas partículas son partículas subvirales de autoensamblado. Se
espera que estos conjuntos presenten una estructura cuaternaria muy
similar a la estructura de partículas de viriones del VHC auténticos
y, por tanto, se espera que sirvan de vacunas sumamente
inmunogénicas.
Los complejos E1/E2 pueden purificarse
adicionalmente mediante cromatografía en gel sobre un medio básico,
por ejemplo, Fractogel-DEAE o
DEAE-Sepharose®. Usando cromatografía en gel de
Fractogel-DEAE pueden obtenerse complejos E1/E2 de
aproximadamente el 60-80% de pureza. E1 puede
purificarse adicionalmente mediante tratamiento con lisina proteasa
porque E1 tiene 0-1 residuos Lys. El tratamiento del
complejo con lisina proteasa destruye E2 y permite la fácil
separación de E1.
La especificidad por tejido del VHC, en
combinación con la observación de que las glicoproteínas de la
envuelta del VHC terminan en manosa, sugiere que el virus emplea el
receptor de manosa o el receptor de asialoglicoproteína (ASGR) con
el fin de conseguir la entrada en células huésped. Los receptores de
manosa se encuentran en macrófagos y células sinusoidales
hepáticas, mientras que el ASGR se encuentra en hepatocitos
parenquimatosos. Por tanto, debe ser posible cultivar el VHC
empleando células huésped que expresan uno o ambos de estos
receptores. O pueden emplearse cultivos celulares primarios que
expresan naturalmente el receptor usando condiciones bajo las que
se mantiene el receptor, o puede transfectarse otra línea celular
tal como HeLa, CHO, COS y similares con un vector que proporciona
la expresión del receptor. La clonación del receptor de manosa y su
transfección y expresión en fibroblastos se ha demostrado por M.E.
Taylor y col., J Biol Chem (1990) 265:12156-62. La
clonación y la secuenciación del ASGR se describió por K. Drickamer
y col., J Biol Chem (1984) 259:770-78 y M. Spiess y
col., Proc Nat Acad Sci USA (1985) 82:6465-69; la
transfección y la expresión del ASGR funcional en células HTC de
rata se describió por M. McPhaul y P. Berg, Proc Nat Acad Sci USA
(1986) 83:8863-67 y M. McPhaul y P. Berg, Mol Cell
Biol (1987) 7:1841-47. Por tanto, es posible
transfectar uno o ambos receptores en líneas celulares adecuadas y
usar las células resultantes como huéspedes para la propagación del
VHC en cultivo. El pase seriado del VHC en tales cultivos debe dar
como resultado el desarrollo de cepas atenuadas adecuadas para uso
como vacunas vivas. O pueden emplearse cultivos celulares primarios
que expresan naturalmente el receptor usando condiciones bajo las
que se mantiene el receptor, o puede transfectarse otra línea
celular tal como HeLa, CHO, COS y similares con un vector que
proporciona la expresión del receptor. La clonación del receptor de
manosa y su transfección y expresión en fibroblastos se ha
demostrado por Taylor y col., anteriormente, mientras que la
transfección y la expresión del ASGR funcional en células HTC de
rata se describió por McPhaul y col., anteriormente. Actualmente se
prefiere emplear una línea celular inmortalizada transfectada con
uno o varios receptores recombinantes.
Las composiciones inmunogénicas pueden
prepararse según procedimientos conocidos en la técnica. Las
presentes composiciones comprenden una cantidad inmunogénica de un
polipéptido, por ejemplo, E1, E2, o composiciones de partículas
E1/E2, normalmente combinado con un vehículo farmacéuticamente
aceptable que preferentemente comprende además un adyuvante. Si se
desea una "mezcla", puede mezclarse junta una combinación de
polipéptidos del VHC tales como, por ejemplo, antígenos de E1 más
E2, para aumentar la eficacia. Se espera que las partículas
similares a virus de conjuntos E1/E2 proporcionen un antígeno de
vacuna particularmente útil. Las composiciones inmunogénicas pueden
administrarse a animales para inducir la producción de anticuerpos,
o para proporcionar una fuente de anticuerpos o para inducir
inmunidad protectora en el animal.
Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen
cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de
anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la
composición. Vehículos adecuados son normalmente macromoléculas
grandes lentamente metabolizadas tales como proteínas,
polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos,
aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos; y partículas de
virus inactivos. Tales vehículos son muy conocidos para aquellos
expertos en la materia.
Adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia
de la composición incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de
aluminio (alumbre),
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP) como se encuentra en la patente de EE.UU.
nº 4.606.918,
N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(nor-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes
extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de
trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión
de escualeno al 2%/Tween® 80. Adicionalmente pueden usarse
adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester,
MA). Además, puede usarse adyuvante completo de Freund (ACF) y
adyuvante incompleto de Freund (AIF) para aplicaciones a no seres no
humanos y fines de investigación.
Las composiciones inmunogénicas contendrán
normalmente vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agua,
solución salina, glicerina, etanol, etc. Adicionalmente, en tales
vehículos pueden incluirse sustancias auxiliares tales como agentes
humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH y
similares.
Normalmente, las composiciones inmunogénicas se
preparan como inyectables, bien como disoluciones o suspensiones
líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para
disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la
inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse
en liposomas para potenciar el efecto adyuvante.
Composiciones inmunogénicas usadas como vacunas
comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz del polipéptido
del VHC, además de cualquier otro de los componentes anteriormente
mencionados, si se necesitan. "Cantidad inmunológicamente
eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un
individuo, bien en una dosis única o como parte de una serie, es
eficaz para el tratamiento, como se define anteriormente. Esta
cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del
individuo que va a tratarse, el grupo taxonómico de individuos que
va a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la
capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar
anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la
vacuna, la evaluación del médico de cabecera de la situación
médica, la cepa de VHC infectante y otros factores relevantes. Se
espera que la cantidad entre dentro de un intervalo relativamente
amplio que pueda determinarse mediante ensayos rutinarios.
Los conjuntos E1/E2 de autoensamblado también
pueden servir de vehículos de vacuna para presentar haptenos
heterólogos (sin VHC) del mismo modo que el antígeno de superficie
de la hepatitis B (véase la solicitud de patente europea 174.444).
En este uso, los conjuntos E1/E2 proporcionan un vehículo
inmunogénico que puede estimular una respuesta inmunitaria a
haptenos o antígenos conjugados al conjunto. El antígeno puede
conjugarse o mediante procedimientos químicos convencionales, o
puede clonarse dentro del gen que codifica E1 y/o E2 en una
localización correspondiente a una región hidrófila de la
proteína.
Las composiciones inmunogénicas se administran
convencionalmente parenteralmente, normalmente mediante inyección,
por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente. Formulaciones
adicionales adecuadas para otras vías de administración incluyen
formulaciones orales y supositorios. El tratamiento de dosificación
puede ser un programa de dosis únicas o un programa de dosis
múltiples. La vacuna puede administrarse conjuntamente con otros
agentes inmunoreguladores.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos presentados a continuación se
proporcionan como una guía adicional para el médico general experto
en la materia y de ningún modo deben interpretarse como limitantes
de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
- (A)
- Los vectores se construyeron a partir de plásmidos que contenían la porción 5' del genoma del VHC como se describe en los documentos EP 318.216 y EP 388.232. El casete VHC(S/B) contiene un fragmento de ADN StuI-BgIII que codifica el extremo 5' de la poliproteína desde Met_{1} hasta Leu_{906} empezando en el nucleótido -63 con respecto a Met_{1}. Éste incluye la proteína del núcleo (C), la proteína E1 (también se denomina algunas veces en lo sucesivo S), la proteína E2 (también se denomina en lo sucesivo NS1) y una porción 5' de la región NS2a. Con la expresión del constructo, las proteínas C, E1 y E2 individuales se producen mediante procesamiento proteolítico.
- El casete VHC(A/B) contiene un fragmento de ADN ApaLI-BgIII que codifica el extremo 5' de la poliproteína desde Met_{1} hasta Leu_{906} empezando en el nucleótido -6 con respecto a Met_{1}. Éste incluye la proteína del núcleo (C), la proteína E1 (también se denomina algunas veces en lo sucesivo S), la proteína E2 (también se denomina en lo sucesivo NS1) y una porción 5' de la región NS2a. Con la expresión del constructo, las proteínas C, E1 y E2 individuales se producen mediante procesamiento proteolítico.
- El casete C-E1(S/B) (una porción de StuI-BamHI) contiene el extremo 5' desde Met_{1} hasta Ile_{340} (un sitio BamHI en el gen). La expresión de este casete da como resultado la expresión de C y una E1 algo truncada (E1'). La porción truncada desde el extremo 3' es una región hidrófoba que se cree sirve de señal de translocación.
- El casete NS1(B/B) (una porción de BamHI-BgIII) contiene una pequeña porción 3' de E1 (desde Met_{364}), toda la E2 y una porción de NS2a (hasta Leu_{906}). En este constructo, el fragmento de E1 sirve de señal de translocación.
- El casete TPA-NS1 emplea un líder del activador de plasminógeno de tejido humano (tPA) como señal de translocación en lugar de la porción 3' de E1. El casete contiene una forma truncada de E2, desde Gly_{406} hasta Glu_{661}, en la que se elimina el extremo 3' hidrófobo.
- Cada casete se introdujo dentro del vector pGEM3Z (Promega) con y sin una secuencia no codificante en 5' de \beta-globina sintética para la transcripción y traducción usando T7 y expresión de reticulocitos de conejo in vitro. Los vectores del virus de la variolovacuna recombinante (VVr) se prepararon introduciendo los casetes dentro del plásmido pSC11 (obtenido del Dr. B. Moss, NIH) seguido de recombinación con virus de la variolovacuna, como se describe por Charkrabarty y col. Mol Cell Biol (1985) 5:3403-09.
- (B)
- Se construyó un vector de expresión alterno introduciendo VHC(A/B) entre los sitios StuI y SpeI de pSC59 (obtenidos del Dr. B. Moss, NIH) seguido de recombinación con virus de la variolovacuna, como se describe por Charkrabarty y col., Mol Cell Biol (1985) 5:3403-09.
- (C)
- Se recogieron células HeLa S3 por centrifugación durante 7 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente en botellas de centrífuga de 500 ml estériles (rotor JA-10). Las suspensiones se volvieron a suspender a una concentración final de 2 x 10^{7} células/ml en medio de cultivo adicional (medio para centrífuga MEM modificado con Joklik + 5% de suero de caballo y gentamicina) ("medio para centrífuga"). Se añadió caldo del virus vv/SC59-VHC bruto sonicado a una multiplicidad de infección de 8 ufp/célula y la mezcla se agitó a 37ºC durante 30 minutos. Entonces, las células infectadas se transfirieron a un matraz para centrífuga que contenía 8 l de medio para centrífuga y se incubaron durante 3 días a 37ºC. Entonces, las células cultivadas se recogieron por centrifugación y las suspensiones se volvieron a suspender en tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, 152 ml). Entonces, las células se homogeneizaron usando un homogeneizador Dounce de 40 ml (50 golpes) y los núcleos se suspendieron por centrifugación (5 minutos, 1600 rpm, 4ºC, rotor JA-20). Las suspensiones nucleares se volvieron a suspender en tampón Tris (24 ml), se volvieron a homogeneizar y se suspendieron de nuevo, recogiéndose todos los sobrenadantes.
- El lisado reunido se dividió en alícuotas de 10 ml y se sonicaron 3 x 30 minutos en un sonicador de copa de cuerno a potencia media. El lisado sonicado (15 ml) se aplicó en capas sobre colchones de sacarosa de 17 ml (36%) en tubos de centrífuga SW28 y se centrifugó a 13.500 rpm durante 80 minutos a 4ºC para suspender el virus. La suspensión de virus se volvió a suspender en 1 ml de tampón Tris (Tris HCl 1 mM, pH 9,0) y se congeló a -80ºC.
- (A)
- E1 y E2 se expresaron tanto in vitro como in vivo y se marcaron con ^{35}S-Met usando los vectores descritos en el ejemplo 1 anterior. Las células BSC-40 y HeLa se infectaron con los vectores del VVr para la expresión in vivo. Tanto el medio como los lisados celulares se examinaron para proteínas recombinantes. Los productos se inmunoprecipitaron usando suero inmune del VHC humano, mientras que las proteínas in vitro se analizaron directamente. Las proteínas resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE.
- El sistema de expresión en reticulocito (pGEM3Z con VHC(S/B) o VHC(A/B)) produjo proteínas C, E1 y E2 que tenían pesos moleculares de aproximadamente 18 kD, 35 kD, y 72 kD, respectivamente. Los lisados de células BSC-40 y HeLa transfectados con el VVr que contenía VHC(S/B), VHC(A/B) o C-E1(S/B) presentaron las mismas proteínas. Debido a que el sistema de reticulocito no proporciona procesamiento de golgi eficaz y, por tanto, no proporciona ácido siálico, el hecho de que tanto los productos in vitro como in vivo presenten movilidades idénticas sugiere que las proteínas no se sialilan in vivo. Sólo el vector del VVr que contiene TPA-NS1 dio como resultado secreción extracelular de E2, que presentó una movilidad alterada consistente con la sialilación.
- (B)
- Se expresó VHC(S/B) in vitro y se incubó con un panel de lectinas biotiniladas: GNA, SNA, PNA, WGA y ConA. Tras la incubación, los complejos se recogieron sobre perlas acrílicas de avidina, se lavaron, se eluyeron con tampón de muestra Laemmli y se analizaron por SDS-PAGE. Los resultados mostraron que E1 y E2 se unieron a GNA y ConA, que indica la presencia de manosa. GNA se une a los grupos de manosa terminal, mientras que ConA se une a cualquier manosa ligada en \alpha. La falta de unión a SNA, PNA y WGA indica que ninguna de las proteínas contenía ácido siálico, galactosa-N-acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina.
- (C)
- Se produjeron E1 y E2 radiomarcadas en células BSC-40 mediante infección con el VVr que contenía VHC(S/B) (w/SC11-VHC) y se inmunoprecipitaron con suero inmune del VHC^{+} humano. La mitad del material inmunoprecipitado se trató durante la noche con neuraminidasa para eliminar cualquier ácido siálico. Tras el tratamiento, las proteínas tratadas y sin tratar se analizaron por SDS-PAGE. No se observó diferencia significativa en la movilidad, que indica falta de sialilación in vivo.
- (D)
- Se produjeron E1 y E2 radiomarcadas en células BSC-40 mediante infección con el VVr que contenía VHC(A/B) (vv/SC59-VHC) y o se inmunoprecipitaron con suero del VHC^{+} humano o se precipitaron usando lectina GNA biotinilada unida a perlas acrílicas usando w/SC11 libre de secuencias del VHC como control. Los precipitados se analizaron por SDS-PAGE. Los datos demostraron que E1 y E2 eran las especies principales de proteínas terminadas en manosa en células infectadas con vv/SC59-VHC. GNA era tan eficaz como los antisueros humanos en la precipitación de E1 y E2 del medio de cultivo celular. Se observó un componente de 25 kD, pero parece ser específico para células infectadas por variolovacuna.
- (A)
- Se inocularon células HeLa S3 con caldo del virus vv/SC59-VHC de alto título purificado a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula y la mezcla se agitó a 37ºC durante 30 minutos. Entonces, las células infectadas se transfirieron a un matraz para centrífuga que contenía 8 l de medio para centrífuga y se incubaron durante 3 días a 37ºC. Las células se recogieron de nuevo por centrifugación y se volvieron a suspender en tampón hipotónico (HEPES 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, 120 ml) sobre hielo. Entonces, las células se homogeneizaron usando un homogeneizador Dounce (50 golpes) y los núcleos se suspendieron por centrifugación (5 minutos, 1600 rpm, 4ºC, rotor JA-20). Las suspensiones se reunieron, se volvieron a suspender en 48 ml de tampón hipotónico, se volvieron a homogeneizar, se volvieron a centrifugar, se reunieron de nuevo y se congelaron a -80ºC.
- Entonces, los sobrenadantes congelados se descongelaron y la fracción de membrana microsomal del lisado posnuclear se aisló mediante centrifugación durante 20 minutos en un rotor JA-20 a 13.500 rpm a 4ºC. El sobrenadante se eliminó por aspiración.
- Las suspensiones se recogieron en 96 ml de tampón de detergente (Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DDT 1 mM, 0,5% de Triton X-100, pH 7,5) y se homogeneizaron (50 golpes). El producto se clarificó por centrifugación durante 20 minutos a 13.500 rpm, 4ºC, y los sobrenadantes se recogieron.
- Una columna de GNA-agarosa (1 cm x 3 cm, 3 mg de GNA/ml de perlas, volumen del lecho de 6 ml, Vector Labs, Burlingame, CA) se equilibró previamente con tampón de detergente. La muestra de sobrenadante se aplicó a la columna con recirculación a una velocidad de flujo de 1 ml/min durante 16-20 horas a 4ºC. Entonces, la columna se lavó con tampón de detergente.
- Las proteínas E1/E2 purificadas se eluyeron con \alpha-D-manósido (0,9 M en tampón de detergente) a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. La elución se detuvo con la aparición de E1/E2 en el eluyente, y la columna se dejó volver a equilibrar durante 2-3 horas. Las fracciones se analizaron por transferencia de Western y tinción con plata. Las fracciones de pico se reunieron y se irradiaron con UV para inactivar cualquier virus residual de la variolovacuna.
- (B)
- Las asialoglicoproteínas E1 y E2 purificadas con GNA-agarosa se sedimentaron mediante gradientes de glicerina al 20-60%. Los gradientes se fraccionaron y las proteínas se analizaron por SDS-PAGE y transferencia de Western. Las transferencias se probaron con GNA para la identificación de E1 y E2. Los resultados indican la presencia de un heterodímero E1:E2 que sedimenta a la velocidad esperada (es decir, una posición característica de una proteína de 110 kD). También son evidentes conjuntos más grandes de proteínas de la envuelta del VHC. También eran evidentes homodímeros E2:E2. E2 pareció estar sobrerrepresentada en las especies más grandes con respecto a E1, aunque también se detectaron especies E1:E2 diferenciadas. Los conjuntos más grandes sedimentaron significativamente más rápido que el marcador de tiroglobulina.
- (C)
- Se sedimentaron E1 y E2 purificadas con GNA-agarosa mediante gradientes de glicerina al 20-60% que contenían EDTA 1 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE con y sin \beta-mercaptoetanol (\betaME). Se observó poca o ninguna diferencia en la abundancia aparente de E1 y E2 en presencia o ausencia de \betaME, que indica la ausencia de enlaces disulfuro entre heterodímeros.
- (D)
- Los complejos E1/E2 (aproximadamente el 40% de pureza) se analizaron en un analizador de partículas de submicrómetros Coulter DM-4. El material se detectó en el intervalo de 20-60 nm.
- (E)
- Los complejos E1/E2 (aproximadamente el 40% de pureza) se analizaron mediante microscopía electrónica usando tinción negativa con ácido fosfotúngstico. La micrografía electrónica reveló la presencia de partículas que tenían un aspecto esférico y un diámetro de aproximadamente 40 nm. Los complejos E1/E2 se incubaron con suero inmune humano del VHC^{+}, luego se analizaron por EM con tinción negativa. Se observaron complejos de anticuerpos que contenían grandes conjuntos y partículas más pequeñas.
\vskip1.000000\baselineskip
- (A)
- El material purificado con lectina GNA preparado como se describe en el ejemplo 3 (0,5-0,8 ml) se diluyó 10x con tampón A (tampón Tris-Cl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y se aplicó a una columna de 1,8 x 1,5 cm de Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, Nueva Yérsey, nº de cat. 16883) equilibrada en tampón A. La fracción de proteína que contenía E1/E2 se eluyó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,2 ml/minuto y se recogieron fracciones de 1 ml. Las fracciones que contenían E1 y E2 (determinadas por SDS-PAGE) se reunieron y se almacenaron a -80ºC.
- (B)
- El material purificado en la parte (A) anterior tiene una pureza del 60-80% como se estima por SDS-PAGE. La identificación de las bandas de E1 y E2 putativas se confirmó mediante el análisis de la secuencia del extremo N después de usar una técnica de transferencia. Para el fin, el material de E1/E2 purificado en Fractogel-DEAE se redujo mediante la adición de tampón Laemmli (pH 6,8, Tris-Cl 0,06 M, 2,3% de SDS, 10% de glicerina, \beta-mercaptoetanol 0,72 M) y se llevó a ebullición durante 3 minutos. Entonces, la muestra se cargó en un gel de poliacrilamida al 10%. Después de SDS-PAGE, la proteína se transfirió a una membrana de 0,2 \mum de difluoruro un polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Las bandas de las proteínas E1 y E2 putativas respectivas se suprimieron de la transferencia y se sometieron a análisis de aminoácidos del extremo N, aunque no se tomó ningún cuidado especial para evitar el bloqueo del extremo amino durante la preparación del material. Los 15 primeros ciclos revelaron que la muestra de E1 tenía una secuencia Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp, mientras que la secuencia de E2 era Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe. Estos datos de la secuencia de aminoácidos concuerdan con los esperados de las secuencias de ADN correspondientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cree que el producto de E1/E2 purificado
anteriormente por cromatografía en Fractogel-DEAE
está agregado como se demuestra por el hecho de que una gran
cantidad de E1 y E2 se coeluye en la región de volumen vacío de una
columna Bio-Sil TSK-4000 SW
cromatográfica de exclusión molecular. Esto indica que en
condiciones nativas una cantidad significativa del complejo E1/E2
tiene un peso molecular de al menos 800 kD. También se observó
material de E1/E2 que tenía un peso molecular de aproximadamente 650
kD.
Claims (6)
1. Una asialoglicoproteína del virus de la
hepatitis C (VHC) seleccionada de una glicoproteína truncada
expresada a partir de la región E1 del VHC que comprende una
deleción en una porción de la secuencia encontrada en una región que
abarca los aminoácidos 330-380 de la región E1,
numerados desde el principio de las poliproteínas del VHC, y una
glicoproteína expresada a partir de la región E2 del VHC que
comprende una deleción en una porción de la secuencia encontrada en
una región que abarca los aminoácidos 660-830 de la
región E2, numerados desde el principio de la poliproteína del
VHC.
2. Una asialoglicoproteína según la
reivindicación 1, en la que dicha glicoproteína truncada se expresa
a partir de la región E1 del VHC y comprende una deleción en una
porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los
aminoácidos 330-380 de la región E1, numerados desde
el principio de la poliproteína del VHC.
3. Una asialoglicoproteína según la
reivindicación 1, en la que dicha glicoproteína truncada se expresa
a partir de la región E2 del VHC y comprende una deleción en una
porción de la secuencia encontrada en una región que abarca los
aminoácidos 660-830 de la región E2, numerados desde
el principio de la poliproteína del VHC.
4. Una composición que comprende una
asialoglicoproteína del VHC según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
5. Una composición según la reivindicación 4 que
comprende una cantidad eficaz de una asialoglicoproteína del VHC en
un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso en un procedimiento
de inducción de una respuesta inmunitaria en un animal.
6. Un procedimiento de inmunoensayo que
comprende poner en contacto una muestra biológica con una
asialoglicoproteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3 en el que dicha asialoglicoproteína lleva un marcador
detectable.
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
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| US758880 | 1991-09-13 |
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