DE69133382T2

DE69133382T2 - Asialoglycoproteine des Hepatitis C Virus

Info

Publication number: DE69133382T2
Application number: DE69133382T
Authority: DE
Inventors: Robert O. Ralston; Frank Marcus; Kent B. Thudium; Barbara A. Gervase; John A. Hall
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-07
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2011-11-08
Also published as: DK1471073T3; ATE414102T1; IE913916A1; EP1471073B1; EP1471073A3; ATE264868T1; ES2218629T3; PL175610B1; IE970761A1; EP1471073A2; DE69133609D1; ES2218629T5; RO117920B1; ES2314334T3; DE69133382T3; DE69133382D1

Description

Diese Erfindung betrifft die allgemeinen Gebiete der Expression von rekombinantem Protein und der Virologie. Genauer betrifft die Erfindung Glycoproteine, die bei Diagnose, Behandlung und Prophylaxe der Infektion mit Hepatitis C-Virus (HCV) hilfreich sind und Verfahren zur Herstellung solcher Glycoproteine.
Hintergrund der Erfindung
Nicht-A, Nicht-B Hepatitis (NANBH) ist eine übertragbare Krankheit (oder Familie von Krankheiten), von der angenommen wird, dass sie Virus-induziert ist, und die von anderen Formen Virus-assoziierter Lebererkrankungen wie etwa jenen, die vom Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis delta-Virus (HDV), Cytomegalievirus (CMV) oder Epstein-Barr-Virus (EBV) verursacht werden, unterschieden werden können. Das epidemiologische Erscheinungsbild legt nahe, dass es drei Typen der NANBH geben kann: den durch Wasser übertragenen epidemischen Typ; den Blut- oder Nadel-assoziierten Typ und den sporadisch auftretenden, von einer Gemeinschaft erworbenen Typ. Die Anzahl der verursachenden Agenzien ist unbekannt. Eine neue Virusart, Hepatitis C-Virus, ist jedoch kürzlich als die primäre (möglicherweise einzige) Ursache der durch Blut übertragenen NANBH (BB-NANBH) identifiziert worden. Vgl. zum Beispiel PCT WO89/046699. Hepatitis C scheint in einer Reihe von Ländern oder Regionen, einschließlich der Vereinigten Staaten, Europa und Japan, die Hauptform der mit Transfusion assoziierten Hepatitis zu sein. Es bestehen ebenso Anhaltspunkte, die HCV mit der Induktion von Leberzellkarzinom in Zusammenhang bringen. Daher besteht ein Bedarf für ein wirksames Verfahren zur Verhinderung und Behandlung von HCV-Infektion.
Der Bedarf für empfindliche, spezifische Verfahren zur Durchmusterung und Identifizierung von HCV-Trägern und HCV kontaminiertem Blut oder Blutprodukten ist bedeutend. Post-Transfusions-Hepatitis (PTH) tritt bei annähernd 10% der Patienten auf, die ein Transfusion erhalten, und HCV ist für bis zu 90% dieser Fälle verantwortlich. Das Hauptproblem bei dieser Erkrankung ist das häufige Fortschreiten hin zu einer chronischen Leberschädigung (25–55%).
Sowohl Patientenfürsorge als auch die Verhinderung der Übertragung von HCV durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen Kontakt erfordern zuverlässige diagnostische und prognostische Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren, Antigenen und Antikörpern, die zu HCV in Beziehung stehen. Zusätzlich besteht ebenso ein Bedarf für wirksame Impfstoffe und immuntherapeutische Mittel zur Verhinderung und/oder Behandlung der Erkrankung.
HCV erscheint in dem Blut infizierter Personen im Vergleich zu anderen infektiösen Viren in sehr geringen Mengen, was den Nachweis des Virus sehr erschwert. Die niedrige Virusbelastung ist wahrscheinlich der Hauptgrund dafür, dass das verursachende Agens der NANB-Hepatitis so lange unentdeckt blieb. Obwohl es jetzt cloniert worden ist, erweist sich HCV immer noch als schwer zu kultivieren und zu vermehren. Demzufolge besteht ein hoher Bedarf für rekombinante Verfahren zur Herstellung von diagnostischen/therapeutischen/prophylaktischen HCV-Proteinen.
Zusätzlich besteht ein großer Bedarf für einen HCV-Impfstoff. Es ist jedoch extrem schwierig, HCV in Zelllinien zu kultivieren. Es ist daher bisher nicht möglich gewesen, abgeschwächte Virusstämme durch serielle Passage in Gewebe/Zell-Kulturen herzustellen.
Offenlegung der Erfindung
Man fand heraus, dass zwei HCV-Proteine, E1 und E2, Membran gebundene Asialoglycoproteine zu sein scheinen, wenn sie in rekombinanten Systemen exprimiert werden. Dies ist überraschend, denn Glycoproteine verbleiben in Säugerarten normalerweise nicht in Mannose terminierter Form, sondern werden weiter mit anderen Kohlenhydraten modifiziert: die Mannose terminierte Form ist typischerweise nur ein Zwischenstadium. Im Fall von E1 und E2 (wie sie in unseren Systemen exprimiert wurden), scheint das Asialoglycoprotein die Endform zu sein. E1 (Hüllprotein 1) ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 35 kD, das von. der vorhergesagten E1-Region des HCV-Genoms translatiert wird. E2 (Hüllprotein 2) ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 72 kD, das von der vorhergesagten NS1(nicht strukturelles Protein 1)-Region des HCV-Genoms translatiert wird, basierend auf dem flaviviralen HCV-Modell. Da virale Glycoproteine oft hoch immunogen sind, sind E1 und E2 wichtigste Kandidaten zur Verwendung in Immuntests und therapeutischen/prophylaktischen Impfstoffen.
Die Entdeckung, dass E1 und E2 nicht sialyliert sind, ist signifikant. Die spezielle Form eines Proteins diktiert oft, welche Zellen als geeignete Wirtszellen zur rekombinanten Expression dienen könnten. Prokaryonten wie etwa E. coli glycosylieren Proteine nicht und sind allgemein nicht für die Produktion von Glycoproteinen zur Verwendung als Antigene geeignet, weil die Glycosylierung oft für die volle Antigenität, Löslichkeit und Stabilität des Proteins wichtig ist. Einfachere Eukaryonten wie etwa Hefe und Pilze glycosylieren Proteine, sind aber allgemein nicht in der Lage, endständige Sialinsäure-Reste an die Kohlenhydratkomplexe anzufügen. Daher können Proteine, die aus Hefe stammen, sich als Antigene von ihren natürlichen (nicht rekombinanten) Gegenstücken unterscheiden. Expression in Säugerzellen wird für Anwendungen bevorzugt, bei denen die Antigenität des Produktes wichtig ist, da die Glycosylierung des rekombinanten Proteins die des Wildtyp-Virusproteins möglichst genau widerspiegeln sollte.
Neue Erkenntnisse weisen darauf hin, dass sich das HCV-Virus während der Infektion entweder durch den Asialoglycoprotein-Rezeptor, der auf Hepatocyten gefunden wird, oder durch den Mannose-Rezeptor, der auf Hepato-Endothelzellen und Makrophagen (besonders Kupfferschen Zellen) gefunden wird, Eingang in Wirtszellen verschaffen kann. Überraschend wurde herausgefunden, dass der größte Teil von natürlichem E1 und E2 keine endständigen Sialinsäure-Reste enthält, sondern nur im Kern glycosyliert ist. Ein kleiner Teil enthält zusätzlich endständiges N-Acetylglucosamin. Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Hüll-Glycoproteine des HCV bereit zu stellen, denen alle oder nahezu alle endständigen Sialinsäure-Reste fehlen.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Asialo-E1 oder -E2 unter Bedingungen, die die Addition von endständiger Sialinsäure verhindern, z. B. durch Expression in Hefe oder durch Expression in Säugerzellen, wobei Antibiotika zur Vereinfachung von Sekretion oder Freisetzung verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von E1 oder E2 durch die Affinität zu Lektinen, die endständige Mannose-Reste oder endständige N-Acetylglucosamin-Reste binden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine immunogene Zusammensetzung, die ein rekombinantes Asialoglycoprotein, ausgewählt aus der aus HCV-E1 und -E2 bestehenden Gruppe, in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Optional kann man bei Bedarf ein immunologisches Adjuvans einschließen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Immuntest-Reagenz, das ein rekombinantes Asialoglycoprotein, ausgewählt aus der aus HCV-E1 und -E2 bestehenden Gruppe, in Verbindung mit einem geeigneten Träger umfasst. Ein anderes Immuntest-Reagenz der Erfindung umfasst ein rekombinantes Asialoglycoprotein, ausgewählt aus der aus HCV-E1 und -E2 bestehenden Gruppe, in Verbindung mit einer geeigneten nachweisbaren Markierung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Dimere und Aggregate höherer Ordnung von E1 und/oder E2. Ein spezieller Gegenstand der Erfindung ist ein E2-Komplex. Ein anderer spezieller Gegenstand der Erfindung ist ein E1:E2-Heterodimer.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammensetzung eines HCV-Impfstoffes, der E1:E2-Aggregate und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von E1:E2-Komplexen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Vermehrung von HCV in Zellkultur, umfassend (a) Bereitstellung einer Zelle, die einen Rezeptor exprimiert, ausgewählt aus der Gruppe, die aus dem Mannose-Rezeptor und dem Asialoglycoprotein-Rezeptor besteht; (b) Infizierung der Zelle mit HCV; und (c) Kultivierung der infizierten Zelle. Bevorzugt exprimiert die Zelle einen rekombinanten Rezeptor.
Verfahren zur Ausführung der Erfindung
A. Definitionen
Der Ausdruck „Asialoglycoprotein" bezeichnet ein glycosyliertes Protein, das im Wesentlichen frei von Sialinsäure-Einheiten ist. Asiaoglycoproteine können rekombinant oder durch Reinigung aus Zellkultur oder aus natürlichen Quellen hergestellt werden. Zur Zeit stammen bevorzugte Asialoglycoproteine von HCV, bevorzugt die Glycoproteine E1 und E2, am meisten bevorzugt rekombinantes E1 und E2 (rEl und rE2). Ein Protein ist im Rahmen dieser Definition „im Wesentlichen frei" von Sialinsäure, wenn die Sialinsäure-Reste in ihrer Menge die Bindung des Glycoproteins an Mannose-Bindungsproteine wie etwa GNA nicht wesentlich stören. Dieser Grad an Sialysierung wird allgemein erreicht werden, sobald weniger als etwa 40% der gesamten N-gebundenen Kohlenhydrate Sialinsäure ist, mehr bevorzugt weniger als etwa 30%, mehr bevorzugt weniger als etwa 20%, mehr bevorzugt weniger als etwa 10%, mehr bevorzugt weniger als etwa 5% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 2%.
Der hierin verwendete Ausdruck „E1" bezeichnet ein Protein oder Polypeptid, das innerhalb der ersten 400 Aminosäuren eines HCV-Polyproteins exprimiert wird, es wird manchmal auch als E- oder S-Protein bezeichnet. In seiner natürlichen Form ist es ein Glycoprotein mit 35 kD, das in hohem Maß Membran gebunden vorliegt. In den meisten natürlichen HCV-Stämmen ist das E1-Protein im viralen Polyprotein im Anschluss an das C-(Kern-)Protein codiert. Das E1-Protein erstreckt sich etwa von Aminosäure 192 bis etwa As383 des Gesamtlängen-Polyproteins. Der hierin verwendete Ausdruck „E1" umschließt auch Analoga und verkürzte Mutanten, die immunologisch kreuzreaktiv mit natürlichem E1 sind.
Der hierin verwendete Ausdruck „E2" bezeichnet ein Protein oder Polypeptid, das innerhalb der ersten 900 Aminosäuren eines HCV-Polyproteins exprimiert wird, es wird manchmal auch als NS1-Protein bezeichnet. In seiner natürlichen Form ist es ein Glycoprotein mit 72 kD, das in hohem Maß Membran gebunden vorliegt. In den meisten natürlichen HCV-Stämmen folgt das E2-Protein auf das E1-Protein. Das E2-Protein erstreckt sich von etwa As384 bis etwa As820. Der hierin verwendete Ausdruck „E2" umschließt auch Analoga und verkürzte Mutanten, die immunologisch kreuzreaktiv mit natürlichem E2 sind.
Der hierin verwendete Ausdruck „Aggregat" bezeichnet einen Komplex aus E1 und/oder E2, der mehr als ein E1- oder E2-Monomer enthält. E1:E1-Dimere, E2:E2-Dimere und E1:E2-Heterodimere sind alle im Rahmen dieser Definition "Aggregate". Zusammensetzungen der Erfindung können auch größere Aggregate umschließen und können Molekulargewichte von über 800 kD aufweisen.
Der hierin verwendete Ausdruck „Partikel" bezeichnet ein E1-, E2- oder E1/E2-Aggregat, das im Elektronenmikroskop sichtbar ist und eine Größe von mindestens 20 nm aufweist. Bevorzugte Partikel sind jene, die ein annähernd sphärisches Erscheinungsbild und einen Durchmesser von etwa 40 nm im Elektronenmikroskop haben.
Der hierin für Proteine verwendet Ausdruck „gereinigt" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, bei der das gewünschte Protein mindestens 35% des gesamten Proteinanteils in der Zusammensetzung umfasst. Das gewünschte Protein umfasst bevorzugt mindestens 40%, mehr bevorzugt mindestens etwa 50%, mehr bevorzugt mindestens etwa 60%, noch mehr bevorzugt mindestens etwa 70%, sogar noch mehr bevorzugt mindestens etwa 80%; sogar noch mehr bevorzugt mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% des gesamten Proteinanteils. Die Zusammensetzung kann andere Verbindungen wie etwa Kohlenhydrate, Salze, Lipide, Lösungsmittel und dergleichen enthalten, ohne die Bestimmung der hierin verwendeten prozentualen Reinheit zu beeinträchtigen. Ein „isoliertes" HCV-Asialoglycoprotein bezeichnet eine Zusammensetzung von HCV-Asialoglycoprotein, die eine Reinheit von mindestens 35% aufweist.
Der hierin verwendete Ausdruck „Mannose-Bindungsprotein" bezeichnet ein Lektin oder ein anderes Protein, das spezifisch Proteine bindet, die eine Mannose terminierte Glycosylierung (z. B. Asialoglycoproteine) aufweisen, zum Beispiel Mannose-bindende Lektine, Antikörper, die für Mannose-terminierte Glycosylierung spezifisch sind, Mannose-Rezeptorprotein (R. A. B. Ezekowitz et al., J Exp Med (1990) 176: 1785–94), Asialoglycoprotein-Rezeptorproteine (H. Kurata et al., J Biol Chem (1990) 265: 11295–98), Serum-Mannose-Bindungsprotein (I. Schuffenecker et al., Cytogenet Cell Genet (1991) 56: 99–102; K. Sastry et al., J Immunol (1991) 147: 692–97), Serum-Asialoglycoprotein-Bindungsprotein und dergleichen. Mannose-Bindungslektine umschließen zum Beispiel GNA, Concanavalin A (ConA) und andere Lektine mit ähnlichen Bindungseigenschaften.
Der Ausdruck „GNA-Lektin" bezeichnet Agglutinin von Galanthus nivalus, ein im Handel erhältliches Lektin, das Mannose terminierte Glycoproteine bindet.
Ein „rekombinantes" Glycoprotein bezieht sich hierin auf ein von einem rekombinanten Polynucleodid exprimiertes Glycoprotein, in dem das Strukturgen, das das Glycoprotein codiert, unter der Kontrolle von Regulatorsequenzen exprimiert wird, die dem Strukturgen natürlich vorkommend nicht benachbart sind, oder in dem das Strukturgen modifiziert ist. Zum Beispiel kann man einen Vektor herstellen, in dem das E1-Srukturgen unter die Kontrolle eines funktionalen Fragments des Glycerindehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-(GAPDH-)Promotors der Hefe gestellt wird. Ein zur Zeit bevorzugter Promotor zur Verwendung in Hefe ist der ADH2/GAP-Hybridpromotor, beschrieben im US-Patent Nr. 4,880,734, der ein Fragment des GAPDH-Promotors in Kombination mit der von der Alkoholdehydrogenase 2 stammenden, stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenz verwendet. Modifikationen des Strukturgens können Substitution von verschiedenen Codons mit degenerierten Codons (z. B. um von der Wirtszelle bevorzugte Codons zu verwenden, um Spaltstellen für Restriktionsenzyme zu eliminieren oder zu schaffen, um Haarnadelbildung zu kontrollieren etc.) und Substitution, Insertion oder Deletion einer begrenzten Anzahl von Codons, die unterschiedliche Aminosäuren codieren (bevorzugt sollten nicht mehr als etwa 10%, mehr bevorzugt weniger als etwa 5% der Anzahl der natürlichen Aminosäuresequenz geändert werden) und dergleichen umfassen. In ähnlicher Weise bezeichnet ein „rekombinanter" Rezeptor ein Rezeptorprotein, das von einem rekombinanten Polynucleotid exprimiert wird, in dem das Strukturgen, das den Rezeptor codiert, unter der Kontrolle von Regulatorsequenzen exprimiert wird, die natürlich vorkommend dem Strukturgen nicht benachbart sind, oder in dem das Strukturgen modifiziert ist.
Der Ausdruck „isoliertes Polypeptid" bezeichnet ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen HCV-Virusbestandteilen, besonders Polynucleotiden, ist. Eine Polypeptid-Zusammensetzung ist „im Wesentlichen frei" von anderen Bestandteilen, wenn das Gewicht des Polypeptids in der Zusammensetzung mindestens 70% des Gewichtes des Polypeptids und anderen Bestandteilen zusammen beträgt, mehr bevorzugt mindestens etwa 80%, noch mehr bevorzugt etwa 90% und am meisten bevorzugt etwa 95% oder mehr. Zum Beispiel ist eine Zusammensetzung, die 100 μg/ml E1 und nur 3 μg/ml andere HCV-Bestandteile (z. B. DNA, Lipide etc.) enthält, im Wesentlichen frei von „anderen HCV-Virusbestandteilen", und daher befindet sich eine Zusammensetzung eines isolierten Polypeptids innerhalb des Rahmens dieser Definition.
Der Ausdruck „Sekretionsleader" bezeichnet ein Polypeptid, das, wenn es am N-terminalen Ende eines Proteins codiert ist, verursacht, dass das Protein nach der Translation in das Kulturmedium der Wirtszelle sekretiert wird. Der Sekretionsleader wird allgemein von der verwendeten Wirtszelle abstammen. Zum Beispiel umschließen zur Verwendung in Hefe geeignete. Sekretionsleader den α-Faktor-Leader von Saccharomyces cerevisiae (vgl. US-Patent Nr. 4,870,008).
Der Ausdruck „niederer Eukaryont" bezeichnet Wirtszellen wie Hefe, Pilze und dergleichen. Niedere Eukaryonten sind allgemein (aber nicht notwendigerweise) einzellig. Bevorzugte niedere Eukaryonten sind Hefen, besonders Arten von Saccharomyces, Schizosaccaromyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula und dergleichen. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis und K. lactis sind die am häufigsten verwendeten Hefewirte, und sie sind gebräuchliche Pilzwirte.
Der Ausdruck „höherer Eukaryont" bezeichnet Wirtszellen, die von höheren Tieren wie etwa Säugerarten, Reptilien, Insekten und dergleichen abstammen. Zur Zeit bevorzugte Wirtszellen höherer Eukaryonten stammen vom chinesischen Hamster (z. B. CHO), Affen (z. B. COS- Zellen), Menschen und Insekt (z. B. Spodoptera frugiperda). Die Wirtszellen können in Suspensions- oder Flaschenkulturen, Gewebekulturen, Organkulturen und dergleichen bereit gestellt werden.
Der Ausdruck „Calcium-Modulator" bezeichnet eine Verbindung, die in der Lage ist, Calcium-Ionen innerhalb des endoplasmatischen Retikulums zu komplexieren oder zu binden, oder sie beeinträchtigt die Konzentration der Calcium-Ionen innerhalb des ER. durch ihre Wirkung auf Calcium-Regulatorproteine (z. B. Calciumkanal-Proteine, Calciumpumpen etc.). Geeignete Calcium-Modulatoren umschließen zum Beispiel Thapsigargin, EGTA (Ethylenglycolbis[β-aminoethylether] N,N,N',N'-Tetraessigsäure). Der zur Zeit bevorzugte Modulator ist Thapsigargin (vgl. z. B. O. Thastup et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87: 2466–70).
Der Ausdruck „imunogen" betrifft die Fähigkeit einer Substanz, entweder allein oder in Verbindung mit einem Trägerstoff, in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Adjuvans, eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort auszulösen. „Neutralisation" bezeichnet eine Immunantwort, die die Infektiösität eines infektiösen Agens entweder zum Teil oder vollständig blockiert. Ein „Impfstoff" ist eine immunogene Zusammensetzung, die in der Lage ist, Schutz gegen HCV aufzubauen, entweder zum Teil oder vollständig, der nützlich zur Behandlung eines Individuums ist.
Der Ausdruck „biologische Flüssigkeit" bezeichnet eine Flüssigkeit, die von einem Organismus erhalten wurde, wie etwa Serum, Plasma, Speichel, Verdauungssekret, Schleim und dergleichen. Allgemein wird eine biologische Flüssigkeit auf die Anwesenheit von HCV-Partikeln durchmustert. Einige biologische Flüssigkeiten werden als Quelle für andere Produkte verwendet, wie etwa Gerinnungsfaktoren (z. B. Faktor VIII:C), Serumalbumin, Wachstumshormone und dergleichen. In solchen Fällen ist es wichtig, dass die Quelle der biologischen Flüssigkeit frei von Viruskontamination wie etwa dem HCV ist.
B. Grundsätzliches Verfahren
Die E1-Region des HCV-Genoms wird in EP 388,232 als Region "E" beschrieben, während E2 als „NS1" beschrieben wird. Die E1-Region umfasst etwa die Aminosäuren 192–383 im viralen Polyprotein mit voller Länge. Die E2-Region umfasst etwa die Aminosäuren 384–820. Die vollständigen Sequenzen von Prototypen dieser Proteine (Stamm HCV-1) stehen in dem Fachgebiet zu Verfügung (vgl. EP 388,232 ), ebenso wie allgemeine Verfahren zur Clonierung und Expression der Proteine. Sowohl E1 als auch E2 können von einem Polynucleotid exprimiert werden, das die ersten 850–900 Aminosäuren des HCV-Polyproteins codiert: in den meisten eukaryontischen Wirtszellen wird das anfängliche Polyprotein in der posttranslationalen Prozessierung in C, E1 und E2 gespalten. Man kann das 5'-Ende der Codierungsregion verkürzen, um die Menge an produziertem Protein C zu vermindern.
Die Expression von Asialoglycoproteinen kann mit einer Reihe von Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann man Expression in niederen Eukaryonten (wie etwa Hefe) erreichen, die normalerweise Sialinsäure-Reste nicht an glycosylierte Proteine anfügen. Bei Hefe-Expressionssystemen wird zur Zeit bevorzugt, einen Sekretionsleader wie etwa den α-Faktor-Leader von S. cerevisiae einzusetzen, sodass das Protein nach der Translation in das Kulturmedium exprimiert wird. Ebenso wird zur Zeit bevorzugt, Mutanten zu verwenden, denen die Fähigkeit zur Glycosylierung fehlt, wie etwa pmr1, da diese Mutanten nur die Kern-Glycosylierung durchführen und oft heterologe Proteine mit höherer Effizienz sekretieren (H. K. Rudolph et al., Cell (1989) 58: 133–45). Alternativ kann man andere Hefearten einsetzen, wie etwa Pichia pastoris, die Glycoproteine exprimieren, die 8–9 Mannose-Reste in einem Muster enthalten, von dem man annimmt, dass es das Kern-Glycosylierungsmuster widerspiegelt, das in Säugerarten und bei S. cerevisiae beobachtet wird.
Alternativ kann man Expression in Säugerzellen veranlassen und die endständige Glycosylierung (Addition von Sialinsäure) blockieren. Rekombinante Konstruktionen werden bevorzugt ein Sekretionssignal einschließen, um sicher zu stellen, dass das Protein zum endoplasmatischen Retikulum gelenkt wird. Der Transport zum Golgi-Apparat scheint von E1 und E2 selbst blockiert zu werden: Expression von E1 oder E2 auf hohem Niveau in Säugerzellen scheint die Sekretion aller zellulären Proteine am endoplasmatischen Retikulum oder cis-Golgi-Apparat zum Stillstand zu bringen. Man kann zusätzlich eine Mutante mit einem Glycolsylierungsdefekt verwenden. Vgl. zum Beispiel P. Stanley. Ann. Rev. Genet. (1984) 18: 525–52. In dem Fall, dass eine Glycosylierungs- oder Transport-Mutante E1 oder E2 mit Sialylierung exprimiert, können die endständigen Sialinsäure-Reste durch Behandlung mit Neuraminidase entfernt werden.
Der Ertrag sollte durch die Verwendung eines Calcium-Modulators weiter erhöht werden, um die Freisetzung des Proteins aus dem Inneren des endoplasmatischen Retikulums zu erreichen. Geeignete Modulatoren umschließen Thapsigargin, EGTA und A23817 (vgl. z. B. O. Thastrup et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990) 87: 2466–70). Zum Beispiel kann man eine große Menge E1 oder E2 intrazellulär in Säugerzellen (z. B. CHO-, COS-, HeLa-Zellen und dergleichen) durch Transfektion mit einem rekombinanten Vaccinia-Virusvektor exprimieren. Nachdem den Zellen Zeit zur Proteinexpression und Akkumulation im endoplasmatischen Retikulum gegeben wurde, werden sie einem Calcium-Modulator in einer Konzentration ausgesetzt, die groß genug ist, die Freisetzung des ER-Inhalts zu verursachen. Das Protein wird darauf aus dem Kulturmedium zurück gewonnen, welches für den nächsten Durchlauf erneuert wird.
Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, eine verkürzte Form des Hüllproteins zu exprimieren. Sowohl E1 als auch E2 scheinen eine stark hydrophobe Domäne zu haben, die das Protein anscheinend innerhalb des endoplasmatischen Retikulums verankert und eine wirksame Freisetzung verhindert. Es kann daher der Wunsch bestehen, Teile der Sequenz zu entfernen, die in einer oder mehreren der Regionen As170-190, As260-290 oder As330-380 von E1 (Nummerierung vom Anfang des Polyproteins) und As660-830 von E2 vorkommen (vgl. zum Beispiel 20-1 in EP 388,232 ). Es ist wahrscheinlich, dass mindestens eine dieser hydrophoben Domänen eine Transmembran-Region bildet, die für die Antigenität des Proteins nicht essentiell ist und die daher ohne nachteilige Wirkung entfernt werden kann. Die am besten zu entfernende Region kann durch Durchführung einer begrenzten Anzahl von Deletionsexperimenten im Rahmen des normalen Fachwissens bestimmt werden. Deletion des hydrophoben 3'-Endes von E2 hat die Sekretion eines Teils des exprimierten E2 mit Sialylierung des sekretierten Proteins zur Folge.
Man kann jeden aus einer Vielzahl von Vektoren verwenden, um Expression zu erhalten. Niedere Eukaryonten wie Hefe werden typischerweise mit Plasmiden unter Verwendung des Verfahrens der Calciumphosphatfällung transformiert, oder sie werden mit einem rekombinanten Virus transfiziert. Die Vektoren können sich unabhängig innerhalb der Wirtszelle replizieren, oder sie können in das Genom der Wirtszelle integriert werden. Höhere Eukaryonten können mit Plasmiden transformiert werden, werden aber typischerweise mit einem rekombinanten Virus infiziert, zum Beispiel einem rekombinanten Vaccinia-Virus. Vaccinia ist besonders bevorzugt, da die Infektion mit Vaccinia die Expression von Proteinen der Wirtzelle zum Stoppen bringt. Zur Zeit bevorzugte Wirtszellen umschließen HeLa- und Plasmacytom-Zelllinien. Für das vorliegende System bedeutet dies, dass E1 und E2 wie bei den meisten glycosylierten Arten im ER der Wirtszelle akkumuliert werden. Da rEl und rE2 die vorherrschenden Glycoproteine sein werden, die Mannose terminiert sind, können sie leicht unter Verwendung von Lektinen wie etwa Agglutinin von Galanthus nivalus (GNA), das endständige Mannose-Reste bindet, aus den Zellen gereinigt werden.
Proteine, die natürlich als Mannose terminierte Glycoproteine exprimiert werden, sind in der Physiologie von Säugerarten relativ selten. In den meisten Fällen ist ein Säuger-Glycoprotein nur in einem unbeständigen Zwischenstadium in der Glycosylierungs-Reaktionskette Mannose terminiert. Die Tatsache, dass rekombinant exprimierte HCV-Hüllproteine Mannose-terminierte Glycosylierung oder (in geringerem Maße) N-Acetylglucosamin enthalten, bedeutet, dass HCV-Proteine und ganze Virionen abgetrennt und zum Teil von endogenen Proteinen gereinigt werden können, indem Lektine verwendet werden, die für endständige Mannose oder N-Acetylglucosamin spezifisch sind. Die rekombinanten Proteine scheinen authentisch zu sein, und es wird angenommen, dass sie im Wesentlichen mit den Hüllproteinen identisch sind, die im reifen, freien Virion oder als eine Form von Zell-assoziiertem Hüllprotein angetroffen werden. Daher kann man Lektine wie etwa GNA für Mannose terminierte Proteine und WGA (Weizenkeim-Agglutinin) und seine Äquivalente für N-Acetylglucosamin terminierte Proteine verwenden. Man kann an eine feste Phase (z. B. eine Lektin-Sepharose^®-Säule) gebundenes Lektin verwenden, um E1 und E2 aus Zellkultur-Überständen und anderen Flüssigkeiten abzutrennen, z. B. zur Reinigung während der Produktion von Antigenen zur Verwendung als Impfstoff oder im Immuntest.
Alternativ kann man ein geeignetes Lektin einsetzen, um E1, E2 oder HCV-Virionen aus Flüssig- oder Gewebeproben von Individuen zu isolieren, die unter dem Verdacht stehen, HCV-infiziert zu sein. Da Mannose terminierte Glycoproteine relativ selten sind, sollte eine solche Prozedur dazu dienen, die in der Probe anwesenden Proteine zu reinigen, wobei der Hintergrund wesentlich reduziert wird. Nach der Bindung an Lektin kann das HCV-Protein unter Verwendung von anti-HCV-Antikörpern nachgewiesen werden. Wenn ganze Virionen vorliegen, kann man alternativ HCV-Nucleinsäuren nachweisen, indem PCR-Techniken oder andere Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren verwendet werden, die auf die konservierten Regionen des HCV-Genoms gerichtet sind (zum Beispiel die nicht-codierende 5'-Region). Dieses Verfahren erlaubt Isolierung und Charakterisierung von sich unterscheidenden HCV-Stämmen ohne Berücksichtigung von Antigen-Drift oder Variation, z. B. in Fällen, in denen ein neuer Stamm immunologisch nicht kreuzreaktiv mit dem Stamm ist, der zur Herstellung der Antikörper verwendet wurde. Es gibt viele weitere Wege, Vorteile der einzigartigen Erkennung von Mannose terminierten Glycoproteinen durch bestimmte Lektine zu nutzen. Zum Beispiel kann man Proben, die im Verdacht stehen, HCV-Virionen oder -Proteine zu enthalten, mit Biotin oder Avidin markierten Lektinen inkubieren und den Protein-Lektin-Komplex mit Avidin oder Biotin ausfällen. Man kann die Affinität von Lektin für HCV-Proteine auch dafür nutzen, um Verbindungen für therapeutische Zwecke auf Virionen zu lenken, zum Beispiel durch Bindung einer antiviralen Verbindung an GNA. Alternativ kann man geeignete Lektine verwenden, um Mannose terminierte Glycoproteine aus Serum- oder Plasmafraktionen zu entfernen, um auf diese Weise das Risiko der HCV-Kontaminierung zu reduzieren oder auszuschließen.
Es wird zur Zeit bevorzugt, E1- und/oder E2-Asialoglycoproteine aus rohen Zelllysaten zu isolieren, indem sie mit einem immobilisierten Mannose-Bindungsprotein, besonders einem Lektin wie etwa ConA oder GNA inkubiert werden. Die Zellen werden z. B. durch mechanischen Aufbruch in einer hypotonischen Pufferlösung mit anschließender Zentrifugation lysiert, um ein postnukleäres Lysat herzustellen, und weiter zentrifugiert, um eine rohe mikrosomale Membranfraktion zu erhalten. Die rohe Membranfraktion wird anschließend in einer Pufferlösung solubilisiert, die ein Detergenz wie etwa Triton X-100, NP40 oder dergleichen enthält. Dieser Detergenz-Extrakt wird durch Zentrifugation von unlöslichen Bestandteilen weiter geklärt, und das resultierende, geklärte Lysat wird in einer Chromatographiesäule, die ein immobilisiertes Mannose-Bindungsprotein enthält, bevorzugt GNA, gebunden an eine feste Unterlage wie etwa Agarose oder Sepharose^®, für einen zur Bindung ausreichenden Zeitraum inkubiert, typischerweise 16 bis 20 Stunden. Die Suspension wird dann auf die Säule gegeben, bis E1/E2 im Eluent zu erscheinen beginnen, sie wird dann in der Säule für einen Zeitraum inkubiert, der für die Bindung ausreichend ist, typischerweise etwa 12–24 Stunden. Das gebundene Material wird dann mit einer zusätzlichen, ein Detergenz (z. B. Triton X-100, NP40 oder dergleichen) enthaltenden Pufferlösung gewaschen und mit Mannose eluiert, um gereinigtes Asialoglycoprotein zu erhalten. Während der Eluierung ist es bevorzugt, nur so lange zu eluieren, bis das Protein im Eluat zu erscheinen beginnt; an diesem Punkt wird die Eluierung gestoppt und der Säule erlaubt, über 2–3 Stunden zu äquilibrieren, bevor die Eluierung des Proteins fortgeführt wird. Man nimmt an, dass auf diese Weise der langsamen Ablösungsrate, die für umfangreiche Proteinaggregate erwartet wird, ausreichend Zeit gegeben wird. In Fällen, in denen E1 und E2 zusammen in ihrer natürlichen Form (d. h. ohne Verkürzung der Membranbindungs-Domäne) exprimiert werden, erscheint eine wesentliche Fraktion der Asialoglycoproteine als E1:E2-Aggregate. Werden diese Aggregate im Elektronenmikroskop untersucht, erscheint ein signifikanter Anteil von ihnen als annähernd sphärische Partikel mit einem Durchmesser von etwa 40 nm, was der für ein intaktes Virus erwarteten Größe entspricht. Diese Partikel scheinen selbst-aggregierende subvirale Partikel zu sein. Es wird erwartet, dass diese Aggregate eine quartäre Struktur aufweisen, die der Struktur authentischer HCV-Virionpartikel sehr ähnlich ist, und es wird daher erwartet, dass sie sich als hoch immunogene Impfstoffe eignen.
Die E1/E2-Komplexe können durch Gelchromatographie auf einem basischen Medium, zum Beispiel Fractogel-DEAE oder DEAE-Sepharose^®, weiter gereinigt werden. Bei der Verwendung von Fractogel-DEAE-Gelchromatographie kann man E1/E2-Komplexe in einer Reinheit von annähernd 60–80% erhalten. Man kann E1 weiter durch Behandlung mit Lysin-Protease reinigen, denn E1 besitzt 0–1 Lys-Reste. Die Behandlung des Komplexes mit Lysin-Protease zerstört E2 und ermöglicht eine leichte Abtrennung von E1.
Die Gewebespezifität von HCV, in Verbindung mit der Beobachtung, dass HCV-Hüll-Glycoproteine Mannose terminiert sind, legt nahe, dass das Virus den Mannose-Rezeptor oder den Asialoglycoprotein-Rezeptor (ASGR) benutzt, um sich Eintritt in Wirtszellen zu verschaffen. Mannose-Rezeptoren finden sich auf Makrophagen und sinusoidalen Leberzellen, während der ASGR auf parenchymatischen Leberzellen angetroffen wird. Es sollte daher möglich sein, HCV in Kultur zu halten, indem man Wirtszellen verwendet, die einen oder beide dieser Rezeptoren exprimieren. Man kann entweder Primärzell-Kulturen, die den Rezeptor natürlicherweise exprimieren, unter Bedingungen verwenden, bei denen der Rezeptor erhalten bleibt, oder man kann eine andere Zelllinie wie etwa HeLa, CHO, COS und dergleichen, mit einem Vektor transfizieren, der die Expression des Rezeptors zur Verfügung stellt. Clonierung des Mannose-Rezeptors und seine Transfektion und Expression in Fibroblasten ist von M. E. Taylor et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 12156–62 gezeigt worden. Clonierung und Sequenzierung des ASGR wurden von K. Drickamer et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 770–78 und M. Spiess et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 82: 6465–69 gezeigt; Transfektion und Expression eines funktionalen ASGR in HTC-Zellen der Ratte wurden von M. McPhaul und P. Berg. Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8863–67 und M. McPhaul und P. Berg, Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 1841–47 beschrieben. Es ist daher möglich, einen oder beide Rezeptoren in geeignete Zelllinien zu transfizieren und die entstehenden Zellen als Wirte zur Zucht von HCV in Kultur zu verwenden. Serielle Passage von HCV in solchen Kulturen sollte in der Entwicklung von abgeschwächten Stämmen münden, die zur Verwendung als Lebendimpfstoff geeignet sind. Man kann statt dessen auch Primärzell-Kulturen, die den Rezeptor natürlicherweise exprimieren, unter Bedingungen verwenden, bei denen der Rezeptor erhalten bleibt, oder man kann eine andere Zelllinie wie etwa HeLa, CHO, COS und dergleichen mit einem Vektor transfizieren, der die Expression des Rezeptors zur Verfügung stellt. Clonierung des Mannose-Rezeptors und seine Transfektion und Expression in Fibroblasten sind von Taylor et al., vorstehend, gezeigt worden, während Transfektion und Expression eines funktionalen ASGR in HTC-Zellen der Ratte von McPhaul et al., vorstehend, beschrieben wurden. Es wird zur Zeit bevorzugt, eine immortalisierte Zelllinie zu verwenden, die mit einem oder beiden rekombinanten Rezeptoren transfiziert ist.
Immunogene Zusammensetzungen können nach den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen enthalten eine immunogene Menge eines Polypeptids, z. B. E1, E2 oder E1/E2-Partikel-Zusammensetzungen, gewöhnlich kombiniert mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, der bevorzugt darüber hinaus ein Adjuvans enthält. Falls ein „Cocktail" erwünscht ist, kann eine Kombination von HCV-Polypeptiden wie etwa zum Beispiel E1- plus E2-Antigene für eine erhöhte Wirksamkeit zusammengemischt werden. Von den Virus-ähnlichen Partikeln der E1/E2-Aggregate wird erwartet, dass sie ein besonders nützliches Impfstoff Antigen liefern. Immunogene Zusammensetzungen können Tieren verabreicht werden, um die Produktion von Antikörpern anzuregen, entweder um als Quelle für Antikörper zu dienen oder um schützende Immunität im Tier hervor zu rufen.
Pharmazeutisch verträgliche Träger umschließen jeden Träger, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern hervor ruft, die gefährlich für das Individuum sind, das die Zusammensetzung erhält. Geeignete Träger sind typischerweise große Makromoleküle, die langsam abgebaut werden, wie etwa Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Bevorzugte Adjuvantien zur Verstärkung der Wirksamkeit der Zusammensetzung umschließen, sind aber nicht auf diese begrenzt, Aluminiumhydroxid („alum"), N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), wie im US-Patent Nr. 4,606,918 beschrieben, N-acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamin (MTP-PE) und RIBI, das in einer 2%igen Squalen/Tween^®80-Emulsion drei Bestandteile, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalose-dimycolat und Zellwandskelett (MPL + mM + CWS), enthält, die aus Bakterien extrahiert wurden. Zusätzlich können Adjuvantien wie etwa Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) verwendet werden. Darüber hinaus können Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) und inkomplettes Freundsches Adjuvans (IFA) für nicht-menschliche Anwendungen und zu Forschungszwecken eingesetzt werden.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise pharmazeutisch verträgliche Vehikel wie etwa Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol etc. enthalten. Zusätzlich können unterstützende Substanzen wie etwa benetzende oder emulgierende Agenzien, den pH-Wert puffernde Substanzen und dergleichen in solche Vehikel eingeschlossen sein.
Typischerweise werden die immunogenen Zusammensetzungen als Injektionslösungen hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen; feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch zur Verstärkung der Adjuvanswirkung emulgiert oder in Liposomen eingeschlossen werden.
Immunogene Zusammensetzungen, die als Impfstoffe verwendet werden, enthalten eine immunologisch wirksame Menge des HCV-Polypeptids sowie einen anderen der vorstehend genannten Bestandteile, falls notwendig. „Immunologisch wirksame Menge" bedeutet, dass die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum, entweder in einer einzelnen Dosis oder als Teil einer Serie, eine wirksame Behandlung, wie vorstehend definiert, darstellt. Diese Menge variiert in Abhängigkeit von der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht menschlicher Primat, Primat etc.), der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, dem gewünschten Grad des Schutzes, der Formulierung des Impfstoffes, der Einschätzung der medizinischen Situation vom behandelnden Arzt, des Stammes des infizierenden HCV und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einem relativ breiten Bereich liegen wird, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Die selbst-organisierenden E1/E2-Aggregate können ebenfalls als Impfstoffträger dienen, um heterologe (nicht-HCV) Haptene zu präsentieren, in gleicher Weise wie das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (vgl. Europäische Patentanmeldung 174,444). Bei dieser Anwendung liefern die E1/E2-Aggregate einen immunologischen Träger, der in der Lage ist, eine Immunantwort auf Haptene oder Antigene, die an die Aggregate gebunden sind, zu stimulieren. Das Antigen kann entweder durch herkömmliche chemische Verfahren gebunden sein, oder es kann in das E1 und/oder E2 codierende Gen an eine Stelle cloniert sein, die einer hydrophilen Region des Proteins entspricht.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden gewöhnlich parenteral verabreicht, typischerweise durch Injektion, zum Beispiel subkutan oder intramuskulär. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, umschließen orale Formulierungen und Zäpfchen. Dosierungen können nach einem Einzeldosen-Zeitplan oder einem Vielfachdosen-Zeitplan vorgenommen werden. Der Impfstoff kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Agenzien verabreicht werden.
C. Beispiele
Die nachstehend angeführten Beispiele werden als weitere Anleitung für die anwendenden Fachleute auf dem Gebiet gegeben und dienen nicht dazu, die Erfindung in irgendeiner Weise einzugrenzen.
Beispiel 1
Clonierung und Expression
(A) Vektoren werden aus Plasmiden konstruiert, die den 5'-Abschnitt des HCV-Genoms enthalten, wie in EP 318,216 und EP 388,232 beschrieben wurde. Die Kassette HCV(S/B) enthält ein StuI-BglII-DNA-Fragment, das das 5'-Ende des Polyproteins von Met₁ bis zu Leu₉₀₆ codiert, beginnend bei Nucleotid –63, bezogen auf Met₁. Dies umschließt das Kernprotein (C), das E1-Protein (gelegentlich auch als S bezeichnet), das E2-Protein (auch als NS 1 bezeichnet) und einen 5'-Abschnitt der NS2a-Region. Während der Expression der Konstruktion werden die einzelnen C-, E1- und E2-Proteine durch proteolytische Prozessierung gebildet.
Kassette HCV(A/B) enthält ein ApaLI-BglII DNA-Fragment, das das 5'-Ende des Polyproteins von Met₁ bis zu Leu₉₀₆ codiert, beginnend bei Nucleotid –6, bezogen auf Met₁. Dies umschließt das Kernprotein (C), das E1-Protein (gelegentlich auch als S bezeichnet), das E2-Protein (auch als NS1 bezeichnet) und einen 5'-Abschnitt der NS2a-Region. Während der Expression der Konstruktion werden die einzelnen C-, E1- und E2-Proteine durch proteolytische Prozessierung gebildet.
Kassette C-E1(S/B) (ein StuI-BamHI-Abschnitt) enthält das 5'-Ende von Met₁ bis zu Ile₃₄₀ (eine BamHI-Stelle im Gen). Expression dieser Kassette führt zur Expression von C und einem etwas verkürzten E1 (E1'). Der am 3'-Ende verkürzte Abschnitt ist eine hydrophobe Region, von der man annimmt, dass sie als Translokationssignal dient.
Kassette NS1(B/B) (ein BamHI-BglII-Abschnitt) enthält einen kleinen 3'-Abschnitt von E1 (von Met₃₀₆₄), das gesamte E2 und einen Abschnitt von NS2a (bis zu Leu₉₀₆). In dieser Konstruktion dient das E1-Fragment als Translokationssignal.
Kassette TPA-NS1 verwendet anstatt des 3'-Abschnitts von E1 einen Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA)-Leader des Menschen als ein Translokationssignal. Die Kassette enthält eine verkürzte Form von E2, von Gly₄₀₆ bis Glu₆₆₁, in der das hydrophobe 3'-Ende deletiert ist.
Jede Kassette wurde zur Transkription und Translation unter Verwendung von T7- und Retikulocyten vom Kaninchen zur Expression in vitro, mit einer und ohne eine synthetische, nicht-codierende 5'-β-Globulin-Sequenz, in den Vektor pGEM3Z (Promega) inseriert. Rekombinante Vektoren des Vaccinia-Virus (rVV) wurden durch Insertion der Kassetten in das Plasmid pSC11 (erhalten von Dr. B. Moss, NIH) und anschließender Rekombination mit dem Vaccinia-Virus hergestellt, wie von Charkrabarty et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3403–09 beschrieben wurde.
(B) Ein anderer Expressionsvektor wurde durch Insertion von HCV(A/A) zwischen die StuI- und SpeI-Stellen von pSC59 (erhalten von Dr. B. Moss, NIH) und anschließender Rekombination mit dem Vaccinia-Virus hergestellt, wie von Charkrabarty et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3403–09 beschrieben wurde.
(C) HeLa-S3-Zellen wurden durch Zentrifugation über 7 Minuten bei 2000 UpM bei Zimmertemperatur in sterilen 500 ml-Zentrifugenflaschen (JA-10 Rotor) gesammelt. Die Pellets wurden auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml in zusätzlichem Kulturmedium (von Joklik modifiziertes MEM-Spinner-Medium + 5% Pferdeserum und Gentamicin) („Spinner-Medium") resuspendiert. Ein Ultraschall behandelter wilder vv/SC59-HCV-Virusstamm wurde bei einer Multiplizität der Infektion von 8 PBE/Zelle zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C über 30 Minuten gerührt. Die infizierten Zellen wurden dann in eine Spinner-Flasche überführt, die 8 1 Spinner-Medium enthielt und über 3 Tage bei 37°C inkubiert.
Die kultivierten Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt, und die Pellets in Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 9,0, 152 ml) resuspensiert. Die Zellen. wurden darauf unter Verwendung eines 40 ml-Dounce-Homogenisators (50 Hübe) homogenisiert und die Kerne durch Zentrifugation (5 Minuten, 1600 UpM, 4°C, JA-20 Rotor) pelletiert. Die Kernpellets wurden in Tris-Pufferlösung (24 ml) resuspendiert, rehomogenisiert und wiederum pelletiert, wobei alle Überstände vereinigt wurden.
Das zusammengegebene Lysat wurde in 10 ml-Aliquots aufgeteilt und 3 × 30 Minuten in einem Cuphorn-Ultraschallgerät bei mittlerer Stärke mit Ultraschall behandelt. Das Ultraschall behandelte Lysat (15 ml) wurde auf 17 ml-Saccharose-Kissen (36%) in SW28-Zentrifugengefäßen geschichtet und bei 13.000 UpM über 80 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um das Virus zu pelletieren. Das Viruspellet wurde in 1 ml Tris-Pufferlösung (1 mM Tris-HCl, pH-Wert 9,0) resuspendiert und bei –80°C tiefgefroren.
Beispiel 2
Vergleich von in vitro- und in vivo-Produkten
(A) E1 und E2 wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 vorstehend beschriebenen Vektoren sowohl in vitro als auch in vivo exprimiert und mit ³⁵S-Met markiert. BSC-40- und HeLa-Zellen wurden mit den rVV-Vektoren zur in vivo-Expression infiziert. Sowohl das Medium als auch die Zelllysate wurden auf rekombinante Proteine untersucht. Die Produkte wurden unter Verwendung von menschlichem HCV-Immunserum immunpräzipitiert, während in vitro-Proteine direkt analysiert wurden. Die resultierenden Proteine wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
Das Retikulocyten-Expressionssystem (pGEM3Z mit HCV(S/B) oder HCV(A/B) produzierte C-, E1- und E2-Proteine, die Molekulargewiehte von etwa 18 kD, 35 kD, bzw. 72 kD aufwiesen. Lysate von BSC-40- und HeLa-Zellen, die mit HCV(S/B), HCV(A/B) oder C-E1(S/B) enthaltenden rVV transfiziert worden waren, zeigten die gleichen Proteine. Da das Retikulocyten-System keine wirksame Golgi-Prozessierung liefert und daher keine Sialinsäure liefert, legt die Tatsache, dass sowohl in vitro- als auch in vivo-Produkte identische Mobilitäten aufweisen, nahe, dass die Proteine in vivo nicht sialyliert werden. Nur der TPA-NS1 enthaltende rVV-Vektor führte zu einer extrazellulären Sekretion von E2, das, übereinstimmend mit der Sialylierung, eine veränderte Mobilität zeigte.
(B) HCV(S/B) wurde in vitro exprimiert und mit einer Reihe biotinylierter Lektine inkubiert: GNA, SNA, PNA, WGA und ConA. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Komplexe auf Avidin-Acryl-Perlen gesammelt, gewaschen, mit Laemmli-Probenpufferlösung eluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass E1 und E2 sich an GNA und ConA banden, was die Anwesenheit von Mannose anzeigt. GNA bindet endständige Mannose-Gruppen, während ConA jede α-gebundene Mannose bindet. Das Fehlen der Bindungen an SNA, PNA und WGA zeigt an, dass keines der Proteine Sialinsäure, Galactose-N-acetylgalactosamin oder N-Acetylglucosamin enthielt.
(C) Radiomarkiertes E1 und E2 wurden in BSC-40-Zellen durch Infektion mit rVV, der HCV(S/B) (vv/SC11-HCV) enthielt, produziert und mit menschlichem HCV⁺-Immunserum immunpräzipitiert. Eine Hälfte des durch die Immunfällung erhaltenen Materials wurde über Nacht mit Neuraminidase behandelt, um jegliche Sialinsäure zu entfernen. Nach der Behandlung wurden die behandelten und nicht behandelten Proteine mittels SDS-PAGE analysiert. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Mobilität beobachtet, was auf das Fehlen von Sialylierung in vivo hinweist.
(D) Radiomarkiertes E1 und E2 wurden in BSC-40-Zellen durch Infektion mit rVV, der HCV(A/B) (vv/SC59-HCV) enthielt, produziert und entweder mit menschlichem HCV⁺-Serum immunpräzipitiert oder unter Verwendung von biotinyliertem GNA-Lektin, das an Acrylperlen gebunden war, ausgefällt, wobei von HCV-Sequenzen freies vv/SC11 als Kontrolle verwendet wurde. Die Niederschläge wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Die Daten zeigten, dass E1 und E2 die überwiegenden Arten von Mannose terminierten Proteinen in vv/SC59-HCV infizierten Zellen waren. Bei der Fällung von E1 und E2 aus dem Zellkultur-Medium war GNA ebenso wirksam wie menschliche Antiseren. Es wurde eine 25 kD-Komponente beobachtet, die jedoch spezifisch für Vaccinia infizierte Zellen zu sein scheint.
Beispiel 3
Reinigung unter Verwendung von Lektin
(A) HeLa-S3-Zellen wurden mit gereinigtem vv/SC59-HCV-Virusstamm mit hohem Titer mit einer Multiplizität der Infektion von 5 PBE/Zelle angeimpft, und das Gemisch wurde bei 37°C über 30 Minuten gerührt. Die infizierten Zellen wurden dann in eine Spinner-Flasche übertragen, die 8 1 Spinner-Medium enthielt, und über 3 Tage bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation wieder gesammelt und in hypotonischem Puffer (20 mM HEPES, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 120 ml) auf Eis resuspendiert. Die Zellen wurden darauf mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert (50 Hübe), und die Kerne durch Zentrifugation (5 Minuten, 1600 UpM, 4°C, JA-20 Rotor) gefällt. Die Pellets wurden zusammengegeben, in 48 ml hypotonischer Pufferlösung resuspendiert, rehomogenisiert, rezentrifugiert, wiederum zusammengegeben und bei –80°C tiefgefroren.
Die tiefgefrorenen Überstände wurden dann aufgetaut, und die mikrosomale Membranfraktion des post-nukleären Lysats wurde durch Zentrifugation über 20 Minuten mit einem JA-20 Rotor mit 13.500 UpM bei 4°C isoliert. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt.
Die Pellets wurden in 96 ml Detergens-Pufferlösung (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,5% Triton X-100, pH-Wert 7,5) aufgenommen und homogenisiert (50 Hübe). Das Produkt wurde durch Zentrifugation über 20 Minuten bei 13.500 UpM, 4°C geklärt, und die Überstände wurden gesammelt.
Eine GNA-Agarose-Säule (1 cm × 3 cm, Perlen mit 3 mg GNA/ml, 6 ml Bettvolumen, Vector Labs, Burlingame, CA) wurde mit Detergens-Pufferlösung prä-äquilibriert. Die Überstand-Probe wurde unter Rezirkulation bei einer Flussrate von 1 ml/min über 16–20 Stunden bei 4°C auf die Säule gegeben. Die Säule wurde dann mit Detergens-Pufferlösung gewaschen.
Die gereinigten E1/E2-Proteine wurden mit α-D-Mannosid (0,9 M in Detergens-Pufferlösung) mit einer Flussrate von 0,5 ml/Minute eluiert. Die Eluierung wurde beim Erscheinen von E1/E2 im Eluat gestoppt, und der Säule wurde gestattet, über 2–3 Stunden zu reäquilibrieren. Die Fraktionen wurden mittels Western-Blot-Analyse und Silberfärbung analysiert. Peak-Fraktionen wurden vereinigt und UV-Strahlung ausgesetzt, um noch bestehende Vaccinia-Viren zu inaktivieren.
(B) Mit GNA-Agarose gereinigte E1- und E2-Asialoglycoproteine wurden durch 20–60% Glycerin-Gradienten sedimentiert. Die Gradienten wurden fraktioniert, und die Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse analysiert. Die Blots wurden mit GNA-Sonden untersucht, um E1 und E2 zu identifizieren. Die Ergebnisse weisen auf die Anwesenheit eines E1:E2-Heterodimers hin, das mit der erwarteten Rate sedimentiert (d. h. in einer für ein 110 kD-Protein charakteristischen Position). Größere Aggregate von HCV-Hüllproteinen sind gleichfalls vorhanden. E2:E2-Homodimere waren gleichfalls vorhanden. E2 schien bei den größeren Arten in Bezug zu E1 überrepräsentiert zu sein, obwohl auch diskrete E1:E2-Arten nachgewiesen wurden. Die größeren Aggregate sedimentierten signifikant schneller als der Thyroglobulin-Marker.
(C) Mit GNA-Agarose gereinigtes E1 und E2 wurde durch 20–60% Glycerin-Gradienten, die 1 mM EDTA enthielten, sedimentiert. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE mit und ohne β-Mercaptoethanol (βME) analysiert. Es wurde ein geringer oder kein Unterschied bei der apparenten Häufigkeit von E1 und E2 in Anwesenheit von oder ohne βME beobachtet, was auf das Fehlen von Disulfid-Bindungen zwischen Heterodimeren hinweist.
(D) E1/E2-Komplexe (etwa 40% Reinheit) wurden in einem Coulter DM-4-Sub-Micron-Partikel-Analysator untersucht. Material im Bereich von 20–60 nm wurde nachgewiesen.
(E) E1/E2-Komplexe (etwa 40% Reinheit) wurden unter Verwendung von Negativfärbung mit Phosphorwolframsäure unter dem Elektronenmikroskop untersucht. Das elektronenmikroskopische Bild zeigte die Anwesenheit von Partikeln, die eine sphärische Erscheinungsform und einen Durchmesser von etwa 40 nm aufwiesen. E1/E2-Komplexe wurden mit menschlichem HCV⁺-Immunserum inkubiert und dann im EM mit Negativfärbung analysiert. Es wurden Antikörperkomplexe beobachtet, die große Aggregate und kleinere Partikel enthielten.
Beispiel 4
Chromatographische Reinigung
(A) Das wie in Beispiel 3 hergestellte, mit GNA-Lektin gereinigte Material (0,5–0,8 ml) wurde 10-fach mit Pufferlösung A (20 mM Tris-Cl-Pufferlösung, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) verdünnt und auf eine 1,8 × 1,5 cm große Säule mit Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, Kat. Nr. 16883) gegeben, die mit Pufferlösung A äquilibriert worden war. Die E1/E2 enthaltende Proteinfraktion wurde mit der selben Pufferlösung mit einer Flussrate von 0,2 ml/Minute eluiert, und 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt. E1 und E2 enthaltende Fraktionen (bestimmt durch SDS-PAGE) wurden vereinigt und bei –80°C gelagert.
(B) Das im vorstehenden Teil (A) gereinigte Material hat eine Reinheit von 60–80%, wie durch SDS-PAGE abgeschätzt wurde. Die Identifizierung der vermuteten E1- und E2-Banden wurde durch eine Analyse der N-terminalen Sequenz nach Anwendung eines Transfer-Verfahrens bestätigt. Zu diesem Zweck wurde das durch Fractogel-DEAE gereinigte E1/E2-Material durch Zugabe von Laemmli-Pufferlösung (pH-Wert 6,8, 0,06 M Tris-Cl, 2,3% SDS, 10% Glycerin, 0,72 M β-Mercaptoethanol) reduziert und für 3 Minuten gekocht. Die Probe wurde dann auf ein 10% Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Nach SDS-PAGE-Analyse wurde das Protein auf eine 0,2 μm-Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) übertragen. Die jeweiligen vermuteten E1- und E2-Proteinbanden wurden aus dem Blot ausgeschnitten und der N-terminalen Aminosäure-Analyse unterworfen, obgleich keine besondere Vorsorge getroffen wurde, aminoterminale Blockierung während der Präparation des Materials zu verhindern. Die ersten 15 Zyklen zeigten, dass die E1-Probe eine Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp-Sequenz aufwies, während die Sequenz von E2 Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X- Val-X-GIy-Phe war. Diese Daten zur Aminosäure-Sequenz stimmen mit denen überein, die aus den zugehörigen DNA-Sequenzen erwartet wurden.
Es wird angenommen, dass das vorstehend durch Fractogel-DEAE-Chromatographie gereinigte E1/E2-Produkt als Aggregat vorliegt, was durch die Tatsache ersichtlich wird, dass eine große Menge E1 und E2 gemeinsam in dem Hohlraumvolumen einer Gel-Permeations-Bio-Sil TSK-4000-SW-Chromatographiesäule eluiert. Dies zeigt an, dass unter natürlichen Bedingungen eine signifikante Menge des E1/E2-Komplexes ein Molekulargewicht von mindestens 800 kD aufweist. E1/E2-Material mit einem Molekulargewicht von etwa 650 kD wurde ebenfalls beobachtet.

Claims

Hepatitis C-Virus (HCV)-Asialoglycoprotein, ausgewählt aus einem von der HCV-E1-Region exprimierten, verkürzten Glycoprotein, welches eine Deletion in einem Abschnitt der Sequenz umfasst, die in einer die Aminosäuren 330 bis 380 der E1-Region überspannenden Region zu finden ist, nummeriert vom Anfang der HCV-Polyproteine, und einem von der HCV-E2-Region exprimierten Glycoprotein, welches eine Deletion in einem Abschnitt der Sequenz umfasst, die in einer die Aminosäuren 660 bis 830 der E2-Region überspannenden Region gefunden wird, nummeriert vom Anfang des HCV-Polyproteins.
Asialoglycoprotein nach Anspruch 1, wobei das verkürzte Glycoprotein von der HCV-E1-Region exprimiert wird und eine Deletion in einem Abschnitt der Sequenz umfasst, die in einer die Aminosäuren 330 bis 380 der E1-Region überspannenden Region gefunden wird, nummeriert vom Anfang des HCV-Polyproteins.
Asialoglycoprotein nach Anspruch 1, wobei das verkürzte Glycoprotein von der HCV-E2-Region exprimiert wird und eine Deletion in einem Abschnitt der Sequenz umfasst, die in einer die Aminosäuren 660 bis 830 der E2-Region überspannenden Region gefunden wird, nummeriert vom Anfang des HCV-Polyproteins.
Zusammensetzung, umfassend ein HCV-Asialoglycoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, umfassend eine wirksame Menge eines HCV-Asialoglycoproteins in einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Verwendung in einem Verfahren zur Induktion einer Immunantwort in einem Tier.
Immuntestverfahren, umfassend das Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einem Asialoglycoprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Asialoglycoprotein eine nachweisbare Markierung trägt.