PT99466B - Processo para a producao e purificacao de asialoglicoproteinas adequadas para uso em vacinas e conjunto de materiais de ensaio para detectar a sua presenca - Google Patents

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A hepatite Não-A e Nâo-B (NANBH) é uma doença transmissível (ou familia de doenças) que se crê ser induzida por virus, e é distinguível das outras formas de doenças do figado associadas a virus, como as causadas pelo virus da hepatite A (HAV), pelo virus da hepatite B (HBV), pelo virus da hepatite delta (HDV), pelo citomegalovirus (CMV) ou pelo virus Epstein-Barr (EBV). Evidências epidemlológicas sugerem que podem existir três tipos de NANBH: o tipo epidémico transportado pela água; o tipo associado ao sangue ou agulhas; ou o tipo de ocorrência esporádica adquirida por comunidades. 0 número de agentes causadores é desconhecido. Contudo, uma nova espécie de virus, o virus da hepatite C (HCV), foi recentemente identificado como a principal (se não a única) causa para a NANBH transportada pelo sangue (BB-NANBH). Ver, por exemplo, a PCT WO89/046699. A Hepatite C parece ser a maior forma de hepatite associada com transfusões num grande número de paises e regiões incluindo os Estados Unidos, a Europa, e o Japão. Há também provas implicando o HCV na indução do carcinoma hepatocelular. Assim, é necessário a existência de um método eficaz para prevenir e tratar a infecçâo por HCV.

A necessidade de métodos específicos e sensíveis para despistar e identificar os transportadores de HCV e sangue, ou produtos sanguíneos contaminados com HCV, é significativa. A hepatite após a tranfusão (PTH) ocorre em aproximadamente 10% dos pacientes que sofreram uma transfusão, e a HCV representa até 90% desses casos. 0 problema principal nesta doença é a frequente progressão para danos crónicos do figado (25 a 55%).

cuidado do paciente, bem como a prevenção da transmissão da HCV pelo sangue e por produtos sanguíneos ou por contacto pessoal intimo, requer diagnósticos de confiança e meios de prognóstico para detectar ácidos núcleicos, antigénios e anticorpos relacionados com o HCV. Adicionalmente, há também a necessidade de vacinas eficazes e agentes imunoterapêuticos para a prevenção e/ou tratamento da doença.

HCV aparece no sangue de indivíduos infectados, a taxas muito baixas relativamente a outros virus infecciosos, o ^r% 1 que torna o virus muito difícil de detectar. A baixa carga virai é provavelmente a primeira razão para que o agente causador da hepatite NANB tenha permanecido tanto tempo sem ser detectado. Mesmo com o facto do virus já ter sido clonado, o HCV ainda causa dificuldades de cultura e de propagação. Consequentemente, há uma grande necessidade de meios recombinantes para produzir proteínas de HCV diagnósticas/terapêuticas/profiláticas.

Ádicionaimente, há uma grande necessidade de uma vacina para o HCV. E, contudo, extremamente dificil pôr o HCV em cultura numa linha celular. Assim, não tem sido possível produzir estirpes virais atenuadas por passagens seriais em culturas de tecido/células.

EXPOSIÇÃO DO INVENTO

Descobriu-se que duas proteínas do HCV, El e E2, aparentam ser asialoglicoproteinas associadas à membrana, quando expressas em sistemas recombinantes. Isto é surprendente porque as glicoproteinas usualmente não permanecem na forma terminada em manose em mamíferos, mas estão mais modificadas com outros hidratos de carbono: a forma terminada em manose é tipicamente apenas uma forma transitória. No caso da El e E2 (como expressas nos nossos sistemas), a asialoglicoproteina parece ser a forma final. A El (proteína do envelope 1) é uma glicoproteina tendo um peso molecular de cerca de 35 kD que é traduzida da região El previsível do genoma do HCV. A E2 (proteína do envelope 2) é uma glicoproteina que tem o peso molecular de 72 kD que é traduzida de uma região NS1 (proteína não estrutural 1) previsível do genoma do HCV, baseado no modelo flaviviral do HCV. Como as glicoproteinas virais são muitas vezes altamente imunogénicas, El e E2 são as primeiras candidatas para usar em imunoensaios e vacinas terapêuticas/profiláticas.

A descoberta que a El e E2 não são sialiladas é significativa. A forma particular de uma proteina muitas vezes dita que células podem servir como hospedeiros apropriados para a expressão recombinante. Procariotas como E.coli não glicosilam as proteínas, e geralmente não são apropriados para a produção de glicoproteinas para usar como antigénios, porque a glicosilação é muitas vezes importante para uma total antigenicidade, solubilidade, e estabilidade da proteina. Eucariotas inferiores tais como leveduras e fungos glicosilam proteinas, mas são geralmente incapazes de adicionar residuos terminais de ácido siálico aos complexos de hidratos de carbono. Assim, as proteinas derivadas de leveduras podem ser antigenicamente distintas das suas respectivas partes naturais (não recombinantes). A expressão em células de mamiferos é preferível para aplicações em que a antigenecidade do produto é importante, da mesma forma que a glicosilação das proteinas recombinantes deve ser bastante semelhante à das proteinas virais selvagens.

Novos indicios indicam que o virus da HCV pode ter acesso às células hospedeiras durante a infecção ou através do receptor de asialoglicoproteinas encontrado em hepatocitos, ou através do receptor da manose encontrado em células hepáticas endoteliais e macrofagos (particularmente células Kupffer). Surprendentemente, descobriu-se que a maioria da El e E2 natural não contém residuos terminais de ácido siálico, mas são apenas glicosiladas core. Uma pequena fracção contém adicionalmente N4 acetil glucosamina terminal. Consequentemente, é um objectivo do presente invento fornecer glicoproteinas do envelope do HCV em que faltam todos ou substancialmente todos os residuos terminais de ácido siálico.

Um outro aspecto do invento consiste num método para produzir El ou E2 sem ácido siálico, em condições que inibem a adição de ácido ciálico terminal, por exemplo, através da expressão em leveduras ou através da expressão em células de mamíferos, usando antibióticos para facilitar a secreção ou a libertação.

Um outro aspecto deste invento consiste num método para purificar El ou E2 através da sua afinidade para lectinas que se ligam a residuos terminais de manose ou residuos terminais de Nacetilglucosamina.

Um outro aspecto do invento refere-se a uma composição imunogénica compreendendo uma asialoglicoproteina recombinante seleccionada do grupo consistindo na El e E2 do HCV, em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Pode opcionalmente incluir-se um adjuvante imunológico, se desejado.

Um outro aspecto do invento consiste num reagente para um imunoensaio, compreendendo uma asialoglicoproteina recombinante seleccionada do grupo consistindo na El e E2 do HCV, em combinação com um suporte adequado. Um outro reagente para imunoensaios do invento compreende uma asilaloglicoproteina recombinante seleccionada do grupo consistindo na El e E2 do HCV em combinação com um marcador detectável apropriado.

Um outro aspecto do invento diz respeito a dimeros e agregados de elevada ordem de El e/ou E2. Uma espécie do invento é o complexo E2. Outra espécie do invento é o heterodimero E1;E2.

Um outro aspecto do invento refere-se a uma composição de vacina de HCV compreendendo agregados E1;E2 e transportadores farmaceuticamente aceitáveis.

Um outro aspecto do invento consiste num método para purificar complexos E1:E2.

Um outro aspecto do invento consiste num método de propagação do HCV em culturas de células, compreendendo (a) o fornecimento de uma célula que expressa um receptor seleccionado do grupo consistindo no receptor da manose e no receptor de asialoglicoproteinas; (b) infectar a célula com HCV; e (c) cultura das células infectadas. Preferencialmente, a célula expressa um receptor recombinante.

MODOS DE REALIZAÇÃO DO INVENTO

A. DEFINIÇÕES termo asialoglicoprotelna refere-se a uma proteina glicosilada que é substancialmente livre de metades de ácido siálico. As asialoglicoproteinas podem ser preparadas por recombinaçâo, ou por purificação a partir de uma cultura de células ou a partir de fontes naturais. As asialoglicoproteinas presentemente preferidas são derivadas do HCV, preferencialmente as glicoproteinas El e E2, mais preferencialmente as recombinantes El e E2 (rEl e rE2). A proteina é substancialmente livre de ácido siálico, no âmbito desta definição, se a quantidade de residuos de ácido siálico não interferir, de forma substancial, com a ligação das glicoproteinas a proteínas com ligação à manose tal como a GNA. Este grau de sialilaçâo será geralmente obtido quando menos de cerca de 40% do total de hidratos de carbono ligados a N é ácido siálico, mais preferencialmente menos de cerca de 30%, mais preferencialmente menos de cerca de 20%, mais preferencialmente menos de cerca de 10%, mais preferencialmente menos de 5%, e mais preferencialmente menos de 2%.

termo El, como aqui usado, refere-se a uma proteina ou polipéptido expresso dentro dos primeiros 400 aminoácidos de uma poliproteina do HCV, por vezes referida como proteina E ou S. Na sua forma natural é uma glicoproteina de 35 kD que se encontra fortemente associada à membrana. Nas estirpes de HCV mais naturais, a proteina El está codificada na poliproteina virai a seguir à proteina C (core). A proteina El estende-se aproximadamente desde do aminoácido 192 até cerca do aa 383 do total do comprimento da poliproteina. 0 termo El, como aqui usado, também inclui análogos e mutantes truncados que são imunológicamente inter-reactivos com a El natural.

termo E2, como aqui usado, refere-se a uma proteina ou polipéptido expresso dentro dos primeiros 900 aminoácidos de uma poliproteina do HCV, por vezes referida como proteina NS1. Na sua forma natural é uma glicoproteina de 72 kD que se encontra fortemente associada à membrana. Nas estirpes mais naturais de HCV, a proteina E2 segue a proteina El. A proteina E2 estende-se aproximadamente do aa 384 até cerca do aa 820. O termo E2, como aqui usado, também inclui análogos e mutantes truncados que são imunológicamente inter-reactivos com a E2 natural.

O termo agregado, como aqui usado, refere-se a um complexo El e/ou E2 contendo mais do que um monómero El ou E2.

Dimeros E1:E1, dimeros E2:E2, e heterodimeros E1:E2 são todos agregados dentro do espirito desta definição. Composições do invento podem também incluir agregados maiores, e podem ter pesos moleculares que excedem os 800 kD.

O termo particula, como aqui usado, refere-se a um agregado El, E2, ou E1/E2, visivel por microscopia electrónica, e tendo uma dimensão de, pelo menos, 20 nm. As partículas preferidas são aquelas que têm uma aparência aproximadamente esférica e um diâmetro de, aproximandamente, 40 nm, através da microscopia electrónica.

termo purificada, como aplicado aqui às proteinas, refere-se a uma composição em que a proteina desejada compreende pelo menos 35% do total do componente proteico na composição. A proteina desejada compreende preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 95% do total de componente proteico. A composição pode conter outros componentes tais como hidratos de carbono, sais, lipidos, solventes, e semelhantes, sem afectar a determinação da percentagem de pureza como usada aqui. Uma asialoglicoproteina de HCV isolada significa uma composição de asialoglicoproteina de HCV que é pelo menos 35% pura.

Proteinas de ligação à manose, como usado aqui, refere-se a uma lectina ou outra proteina que se liga especificamente a proteinas tendo uma glicosilação terminada em manose (por exemplo, asialoglicoproteinas), por exemplo, lectinas de ligação à manose, anticorpos específicos para glicosilações terminadas em manose, proteina receptora da manose (R.A.B. Ezekowitz et al.,J. Exp. Med. (1990) 176:1785-94), proteínas receptoras de asialoglicoproteinas (H. Kurata et al.,J. Biol. Chem. (1990) 265:11295-98), proteina do soro de ligação à manose (I. Schuf fenecker et al., Cytogenet. Cell Genet.(1991) 56:99-102;

K. Sastry et al., J. Immu.no 1. (1991) 147:692-97), proteina de soro de ligação a asialoglicoproteinas, e semelhantes. As

lectinas de ligação à manose	incluem, por	exemplo,	GNA,
Concanavalina A (ConA), e outras	lectinas com	propriedades	de
ligação semelhantes.
0 termo lectina GNA	refere-se à	aglutinina	de

Galanthus nivalus, uma lectina disponível comercialmente que se liga às glicoproteinas terminadas em manose.

Uma glicoproteina recombinante, como aqui usado, é uma glicoproteina expressa a partir de um polinucleótido recombinante, no qual o gene estrutural que codifica a glicoproteina é expresso sob o controlo de sequências reguladoras que não estão normalmente adjacentes ao gene estrutural, ou no qual o gene estrutural está modificado. Por exemplo, pode formarse um vector no qual o gene estrutural El é colocado sob o controlo de um fragmento funcional do promotor da gliceraldeido3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Um promotor presentemente preferido para usar em leveduras é o promotor híbrido ADH2/GAP descrito na Patente Norte Americana com o No. 4.880.734, que utiliza um fragmento do promotor GAPDH em combinação com a sequência de activação a montante derivada da alcoól desidrogenase 2. Modificações do gene estrutural podem incluir a substituição de diferentes codões por codões degenerados (por exemplo, para utilisar codões preferidos pelo hospedeiro, para eliminar ou originar locais de clivagem de enzimas de restrição, para controlar a formação de extremidades livres, etc.), e substituição, inserção ou delecção de um número limitado de codões codificando diferentes aminoácidos (preferencialmente não mais do que 10%, mais preferencialmente não mais do que 5%, por número de aminoácidos naturais na sequência , deve ser alterado), e semelhantes. Similarmente, um receptor recombinante refere-se a uma proteina receptora expressa a partir de um polinucleótido recombinante, no qual o gene estrutural que codifica o receptor está expresso sob o controlo de sequências reguladoras adjacentes de forma não natural ao gene estrutural, ou no qual o gene estrutural está modififiçado.

O termo polipétido isolado refere-se a um polipéptido que está substancialmente livre de outros componentes virais do HCV, particularmente polinucleótidos. Uma composição polipeptidica está substancialmente livre de outros componentes se o peso do polipéptido na composição é pelo menos 70% do peso do polipéptido e outros componentes combinados, mais preferencialmente pelo menos 80%, e ainda mais preferencialmente cerca de 90%, e mais preferencialmente 95% ou mais. Por exemplo, uma composição contendo 100 gg/ml de El e apenas 3 gg/ml de outros componentes de HCV (por exemplo, DNA, lipidos, etc.) está substancialmente livre de outros componentes virais do HCV, e assim é uma composição de um polipéptido isolado dentro do espirito desta definição, termo lider de secreção refere-se a um polipéptido &

s .JL que, quando codificado no terminal N de uma proteina, provoca a secreção da proteina para dentro do meio de cultura da célula hospedeira seguindo-se a tradução. 0 lider de secreção será geralmente derivado da célula hospedeira utilizada. Por exemplo, lideres de secreção apropriados para usar em leveduras incluem o lider factor-α de Saccharomyces cerevisiae (ver Patente Norte Americana com o No. 4.870.008).

termo eucariota inferior refere-se a células hospedeiras tais como leveduras, fungos, e semelhantes. Eucariotas inferiores são geralmente (mas não necessariamente) unicelulares. Eucariotas inferiores preferidos são as leveduras, particularmente as espécies dentro das Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula, e semelhantes. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis e K. lactis são as leveduras hospedeiras mais vulgarmente utilizadas, e são hospedeiros fúngicos convenientes.

O termo eucariota superior refere-se a células hospedeiras derivadas de animais superiores, como mamíferos, répteis, insectos, e semelhantes. As células hospedeiras de eucariotas superiores presentemente preferidas são as derivadas do hamster chinês (por exemplo CHO), de macaco (por exemplo, células COS), humanas, e de insectos (por exemplo, Spodoptera frugiperda). As células hospedeiras podem ser fornecidas em suspensão ou frascos de cultura, culturas de tecidos, culturas de orgâo, e semelhantes.

termo modulador de cálcio refere-se a um composto capaz de reter ou ligar iões cálcio dentro do reticulo endoplasmático, ou afectar a concentração de iões cálcio dentro do RE através do seu efeito nas proteínas reguladoras do cálcio (por exemplo, proteínas do canal de cálcio, bombas de cálcio, etc). Moduladores de cálcio apropriados incluem, por exemplo, tapsigargina, EGTA (ácido etileno glicol bis[β-aminoetil éter] Ν,Ν,Ν',Ν' tetraacético). 0 modulador presentemente preferido é a tapsigargina (ver por exemplo, 0. Thastrup et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1990) 87:2466-70).

termo imunogénico refere-se à capacidade de uma substância provocar uma resposta imunológica humoral e/ou celular, quer quando sózinha ou quando ligada a um transportador, na presença ou ausência de um adjuvante. Neutralização referese a uma resposta imunológica que bloqueia a infecciosidade, quer parcialmente quer totalmente, de um agente infeccioso. Uma vacina é uma composição imunogénica capaz de induzir a protecção contra o HCV, quer parcialmente quer completamente, útil no tratamento de um indivíduo.

termo liquido biológico refere-se a um fluido obtido a partir de um organismo, tal como soro, plasma, saliva, secreções gástricas, mucus, e semelhantes. Em geral, será feita a pesquisa de um liquido biológico quanto à presença de partículas HCV. Alguns líquidos biológicos são utilizados como fontes de outros produtos, tal como faotores de coagulação (por exemplo, Factor VIII:C), albumina do soro, hormona do crescimento, e semelhantes. Em tais casos, é importante que a fonte do fluido biológico esteja livre de contaminações por virus como o HCV.

B. MÉTODO GERAL

A região El do genoma do HCV está descrita na Patente

Χ·ι

Europeia com o No. 388.232 como região E, enquanto que a E2 está descrita como NS1. A região El compreende, aproximadamente, os aminoácidos 192-383 no total do comprimento da poliproteina virai. A região E2 compreende aproximadamente os aminoácidos 384-820. A sequência completa de protótipos destas proteínas (estirpe HCV-1) está disponível no ramo (ver Patente Europeia com No. 388.232), bem como os métodos gerais para a clonagem e expressão das proteínas. Tanto a El como a E2 podem ser expressas a partir de um polinucleótido codificando os primeiros 850-900 aminoácidos da poliproteina do HCV: o processo de pós-tradução na maioria das células eucariotas quebra a proteina inicial em C, El, e E2. Pode truncar-se a extremidade 5' da região codificadora para reduzir a quantidade produzida de proteina C.

A expressão de asialoglicoproteinas pode ser conseguida através de numerosos métodos. Por exemplo, pode obter-se expressão em eucariotas inferiores (tal como leveduras) que normalmente não adicionam residuos de ácido siálico a proteínas glicosiladas. Nos sistemas de expressão de leveduras, é presentemente preferido a utilização de um lider de secreção tal como o lider factor-α de S. cerevisiae, de forma a que proteina seja expressa para dentro do meio de cultura, seguindo-se a tradução. E também presentemente preferido a utilização de mutantes deficientes na glicosilação tal como o pmrl, e estes mutantes fornecem apenas glicosilação do tipo core, e muitas vezes secretam proteínas heterólogas com elevada eficiência (H. K. Rudolph et al., Cell (1989) 58:133-45). Alternativamente podem utilizar-se outras espécies de leveduras, tal como Pichia

4$ pastoris _r que expressa glicoproteinas contendo 8-9 resíduos de manose, num padrão que se crê semelhante ao padrão da glicosilação do tipo core, observado em mamiferos e na S.

cerevisiae.

Alternativamente, pode realizar-se a expressão em células de mamiferos, e bloquear a glicosilação terminal (adição de ácido siálico). Construções recombinantes incluirão, de preferência, um sinal de secreção para assegurar que a proteína está directamente dirigida para o reticulo endoplasmático. 0 transporte para o golgi parece ser bloqueado pelas próprias EI e E2: um elevado nivel de expressão de El e E2 em células de mamiferos parece reter a secreção de todas as proteínas celulares no reticulo endoplasmático ou golgi cis. Adicionalmente pode utilizar-se um mutante deficiente na glicosilação. Ver, por exemplo, P. Stanley, Ann. Rev. Genet. (1984) 18:525-52. No caso de ocorrer glicosilação ou o mutante de transporte expressar El ou E2 com sialilaçâo, os resíduos terminais de ácido siálico podem ser removidos por tratamento com neuraminidase.

A produção pode ser ainda aumentada através do uso de um modulador de cálcio para obter a libertação da proteína a partir do interior do reticulo endoplasmático. Moduladores apropriados incluem tapsigargina, EGTA, e A23817 (ver por exemplo, 0. Thastrup et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1990) 87:2466-70) . Por exemplo, pode expressar-se uma grande quantidade de El ou E2 intracelularmente em células de mamiferos (por exemplo, CHO, COS, células HeLa, e semelhantes) através da transfecção com um vector recombinante do virus da vaccinia. Depois do tempo necessário para a expressão da proteina e ¢1

acumulação no reticulo endoplasmático, as células são expostas a um modulador de cálcio, a uma concentração suficientemente elevada para provocar a libertação dos conteúdos do RE. A proteína é depois recuperada do meio de cultura, que é substituído para o ciclo seguinte.

Adicionalmente, pode ser vantagoso expressar uma forma truncada da proteína do envelope. Tanto a El como a E2 parecem ter um dominio elevadamente hidrofóbico, que aparentemente prende a proteina dentro do reticulo endoplasmático, impedindo uma libertação eficiente. Assim, pode-se querer realizar delecção de porções da sequência encontradas em uma ou mais regiões dos aal70-190, aa260-290 ou aa330-380 da El (numerando a partir do principio da poliproteina), e dos aa660-830 da E2 (ver por exemplo a figura 20-1 da Patente Europeia com o No 388.232). E provável que pelo menos um destes três domínios hidrofóbicos forme uma região transmembranar que não é essencial para a antigenicidade da proteína, e que pode assim sofrer delecção sem efeito prejudicial. A melhor região para se efectuar a delecção pode ser determinada através da realização de um pequeno número de experiências de delecção dentro das técnicas do vulgar praticante. A delecção da extremidade 3' hidrofóbica da E2 resulta na secreção de uma porçaõ da E2 expressa, com sialilação da proteina secretada.

Pode usar-se qualquer uma das variedades de vectores para obter expressão. Eucariotas inferiores como as leveduras são tipicamente transformados com plasmideos usando o método da precipitação em fosfato de cálcio, ou são transfectados com um virus recombinante. Os vectores podem replicar-se independentemente dentro da célula hospedeira, ou podem integrar-se no genoma da célula hospedeira. Eucariotas superiores podem ser transformados com plasmideos, mas são tipicamente infectados com virus recombinantes, por exemplo o virus da vaccinia recombinante. 0 vaccinia é particularmente preferido, já que a infecçâo com vaccinia detém a expressão das proteínas da célula hospedeira. Células hospedeiras presentemente preferidas incluem HeLa e linhas celulares de plasmocitoma. No presente sistema, isto significa que El e E2 são acumuladas como as espécies glicosiladas maioritárias no RE do hospedeiro. Dado que rEl e rE2 serão as glicoproteinas predominantes que são terminadas em manose, elas podem ser facilmente purificadas a partir das células, através do uso de lectinas tal como a aglutinina de Galanthus nivalus (GNA) que liga residuos terminais de manose.

Proteínas que são naturalmente expressas como glicoproteinas terminadas em manose são relativamente raras em fisiologia de mamíferos. Na maioria dos casos, uma glicoproteina de mamifero é terminada em manose, apenas como um intermediário transitório, no percursso da glicosilaçâo. O facto de as proteínas do envelope do HCV, expressas recombinantemente, conterem glicosilaçâo terminada em manose ou (a um nivel inferior) em N-acetil glucosamina, significa que as proteínas do HCV e viriões intactos podem ser separados e parcialmente purificados a partir de proteínas endógenas usando lectinas especificas para a manose ou N-acetil glucosamina terminal. As proteínas recombinantes parecem autênticas, e crê-se que sejam essencialmente idênticas às proteínas do envelope que se encontram em viriões livres e maduros, ou a uma forma de proteina

ρ.

do envelope associada à célula. Assim , podem usar-se lectinas

como a GNA para proteínas terminadas em manose e WGA	(aglutinina
de germen de trigo), e seus equivalentes, para as	proteínas
terminadas em N-acetil glucosamina. Podem usar-se	lectinas
ligadas a uma fase sólida (por exemplo, coluna	lectina-

Sepharosè^j para separar El e E2 dos sobrenadantes da cultura de células e outros fluidos, por exemplo, para purificação durante a produção de antigénios para utilizar em vacinas ou imunoensaios.

Alternativamente, pode fornecer-se uma lectina apropriada para isolar El, E2 ou viriões de HCV de amostras de fluido ou tecido de sujeitos que se suspeite estarem infectados com HCV. Dado que as glicoproteinas terminadas em manose são relativamente raras, tal procedimento deverá servir para purificar as proteínas presentes na amostra, reduzindo substancialmente o ruido. A seguir à ligação à lectina, a proteina do HCV pode ser detectada usando anticorpos anti HCV. Se estão presentes os viriões completos, pode detectar-se, alternativamente, os ácidos nucleicos do HCV usando a técnica de PCR ou outros métodos de amplificação de ácidos nucleicos directamente dirigidos para as regiões conservadas do genoma do HCV (por exemplo, a região 5' não codificante). Este método permite o isolamento e caracterização de diferentes estirpes de HCV sem considerar deriva ou variação antigénica, por exemplo, nos casos em que uma nova estirpe não é imunologicamente interreactiva com a estirpe usada para preparar anticorpos. Há muitas outras maneiras de retirar vantagens do reconhecimento único das glicoproteinas terminadas em manose por lectinas particulares. Por exemplo, podem incubar-se amostras que se suspeitem conter ti

ÍJ

viriões de HCV ou proteínas com lectinas marcadas na avidina e biotina, e precipitar o complexo proteina-lectina usando avidina ou biotina. Pode também usar-se a afinidade da lectina para as proteínas do HCV para marcar compostos para viriões para uso terapêutico, por exemplo, através da conjugação de um composto antiviral com GNA. Alternativamente, podem usar-se lectinas apropriadas para remover glicoproteinas terminadas em manose das fracções de soro ou plasma, reduzindo ou eliminando assim o risco de contaminação por HCV.

E presentemente preferido isolar as asialoglicoproteinas El e/ou E2 a partir de lisados de células em bruto, através da incubação com uma proteina imobilizadora da ligação à manose, particularmente uma lectina tal como a ConA ou GNA. As células são lisadas, por exemplo, por disrupção mecânica num tampão hipotónico seguindo-se centrifugação para preparar um lisado pós-nuclear, e ainda outra centrifugação para obter uma fracção em bruto microsomal de membrana. A fracção em bruto de membrana é subsequentemente solubilizada num tampão contendo um detergente, tal como o Triton X-100, NP40, ou semelhantes. Este extracto de detergente estâ ainda mais clarificado de partículas insolúveis por centrifugação, e o resultante lisado clarificado é incubado numa coluna de cromatografia compreendendo uma proteina imobilizadora de ligação à manose, preferencialmente GNA ligada a

O um suporte sólido como a agarose ou Sepharose^; durante um periodo de tempo suficiente para a ligação, tipicamente 16 a 20 horas. A suspensão ê depois aplicada à coluna até que E1/E2 começam a aparecer no eluente, depois incubada na coluna durante um periodo de tempo suficiente para a ligação, tipicamente cerca de 12 a 24 horas. 0 material ligado é depois lavado com tampão adicional contendo detergente (por exemplo, Triton X-100, NP40, ou semelhantes), e eluido com manose para fornecer asialoglicoproteinas purificadas. Na eluição, é preferível eluir apenas até que as proteínas comecem a aparecer no eluido, e neste ponto a eluição é interrompida e equilibra-se a coluna por 2 ou 3 horas antes de proceder à eluição da proteina. Crê-se que isto permite tempo suficiente para a esperada lenta taxa de saida dos grandes agregados proteicos. Nos casos em que El e E2 estão expressas em conjunto na forma nativa (isto é, sem que o domínio de ligação à membrana esteja truncado), uma fracção substancial das asialoglicoproteinas aparece como agregados E1:E2. Quando examinados por microscopia electrónica, uma porção significativa destes agregados aparece como partículas aproximadamente esféricas tendo um diâmetro de cerca de 40 nm, que é o tamanho esperado para virus intactos. Estas partículas aparentam ser partículas subvirais de auto-construção. Espera-se que estes agregados exibam uma estrutura quaternária muito semelhante à estrutura das partículas virais autênticas do HCV, e por isso espera-se que sirvam como vacinas altamente imunogénicas.

Os complexo E1/E2 podem ser ainda purificados por cromatografia em gel em meio básico, por exemplo, Fractogel-DEAE ou DEAE-Sepharosè-í Usando cromatografia em gel Fractogel-DEAE podem obter-se complexos E1/E2 com uma pureza aproximada de 60 a 80%. Pode purificar-se mais a El por tratamento com lisina protease, porque El tem resíduos de Lys 0-1. O tratamento do complexo pela lisina protease destrói E2, e permite a fácil separação de El.

A especificidade do tecido para o HCV, em conjunto com a observação de que as glicoproteinas do envelope do HCV são terminadas em manose, sugere que o virus utiliza o receptor da manose ou o receptor da asialoglicoproteina (ASGR) com o objectivo de conseguir penetrar na célula hospedeira. Os receptores da manose encontram-se em macrofagos e células hepáticas sinusoidais, enquanto que o ASGR se encontra em hepatocitos parenquimatosos. Assim, deverá ser possivel fazer culturas de HCV através do uso de células hospedeiras que expressem um ou ambos os receptores. Podem usar-se culturas primárias de células que naturalmente expressam o receptor, usando condições nas quais o receptor é mantido, ou pode-se transfectar uma outra linha celular tais como HeLa, CHO, COS, e semelhantes, com um vector que forneça a expressão do receptor. A clonagem do receptor da manose e a sua transfecção e expressão em fibroblastos foi demonstrada por M.E. Taylor et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:12156-62. A clonagem e sequenciação do RASR foi descrita por K. Drickamer et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:77078 e M. Spiess et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1985) 82:646569; a transfecção e expressão de RASR funcionais em células de rato HTC foi descrita por M. McPhaul e P. Berg, Proc. Nat. Acad. Sei USA (1986) 83:8863-67 e M. McPhaul e P. Berg, Mol. Cell. Biol. (1987) 2·^:1841-47. Assim, é possivel transfectar um ou ambos os receptores em linhas celulares adequadas, e usar as células resultantes como hospedeiras para a propagação em cultura do HCV. A passagem em série de HCV em tais culturas deveria resultar no desenvolvimento de estirpes atenuadas adequadas para usar em vacinas vivas. Podem utilizar-se ou culturas primárias de ή

ΛΪ células que naturalmente expressam o receptor, usando condições nas quais o receptor é mantido, ou pode-se transfectar uma outra linha celular tais como HeLa, CHO, COS, e semelhantes, com um vector que forneça a expressão do receptor. A clonagem do receptor da manose e a sua transfecção e expressão em fibroblastos foi demonstrada por Taylor et al., acima, enquanto que a transfecção e expressão de RASR funcionais em células de rato HTC foi descrita por M. McPhaul et al., acima. E presentemente preferido utilizar uma linha celular transfectada imortalizada com um ou ambos os receptores recombinantes.

Composições imunogénicas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. As presentes composições compreendem uma quantidade imunogénica de um polipéptido, por exemplo, El, E2, ou composições de partículas E1/E2, usualmente combinadas com um transportador farmaceuticamente aceitável, de preferência compreendendo mais um adjuvante. Se é desejado um cocktail, uma combinação dos polipéptidos do HCV, como, por exemplo, antigénios El mais E2, pode ser misturada em conjunto para aumentar a eficácia. Espera-se que as partículas semelhantes a virus de agregados E1/E2 forneçam um antigénio para vacina particularmente útil. Composições imunogénicas podem ser administradas a animais para induzir a produção de anticorpos, tanto para fornecer uma fonte de anticorpos, como para induzir protecção imunitária ao animal.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer transportador que por si só não induz a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição. Transportadores adequados são tipicamente grandes macromoléculas de lenta metabolização tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, aminoácidos copoliméricos; e partículas virais inactivas. Tais transportadores são bem conhecidos dos especialistas nesta técnica.

Adjuvantes preferidos para incrementar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a: hidróxido de alumino (alum), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thrMDP), como se encontra na Patente Norte Americana com o No. 4.606.918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2’dipalmitol-sn-glicero-3-hidróxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) e RIBI, que contem três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipido A, trealose dimicolato, e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+EPC), numa emulsão de 2% de esqualeno/Tween 80 Adicionalmente, podem ser usados adjuvantes como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). Também podem ser usados Complete Freund's Adjuvant (CFA) e Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) para aplicações não humanas e propósitos de pesquisa.

As composições imunogénicas conterão, tipicamente, veiculos farmaceuticamente aceitáveis, tal como água, soluções salinas, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente podem ser incluídas em tais veiculos substâncias auxiliares, tais como agentes humidificantes ou emulsificadores, subtâncias tamponizadoras de pH, e semelhantes.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas como injectáveis, ou como soluções liquidas ou como suspensões;

podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em veiculos liquidos antes da injecção. A preparação pode também ser emulsifiçada ou encapsulada em lipossomas para incrementar o efeito do adjuvante.

Composições imunogénicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de polipéptido do HCV, bem como qualquer um dos componentes acima mencionados, quando necessários. Quantidade imunologicamente eficaz, significa que a administração dessa quantidade a um indivíduo, ou como dose única ou como parte de uma série, é eficaz para o tratamento, como definido acima. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição fisica do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primatas não humanos, primatas, etc.), da capacidade do sistema imunológico do indivíduo para sintetizar anticorpos, do grau de protecção desejado, da formulação da vacina, a avaliação do médico responsável em relação à situação médica, a estirpe infectante de HCV, e outros factores relevantes. Espera-se que esta quantidade decresça bastante para que possa ser determinada em ensaios de rotina.

Os agregados E1/E2 de auto construção podem também servir como transportadores de vacinas para os presentes haptens heterólogos (não HCV), da mesma maneira que o antigénio de superfície da Hepatite B (ver Pedido de Patente Europeia com o No 174.444). Para esta utilização, os agregados E1/E2 fornecem um transportador imunogénico capaz de estimular uma resposta imunológica aos haptens ou antigénios conjugados para o agregado. 0 antigénio pode ser conjugado ou por métodos quimicos convencionais ou pode ser clonado dentro do gene que codifica El e/ou E2, numa localização correspondente a uma região hidrofilica da proteina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas parentericamente, tipicamente por injecção, por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente. Formulações adicionais, adequadas para outros modos de administração, incluem formulações orais e supositórios. A dosagem de tratamemto pode ser segundo um plano de dose única ou um plano de doses múltiplas. A vacina pode ser administrada em conjunto com outros agentes imuno-reguladores.

C. EXEMPLOS

Os exemplos que se apresentam a seguir são fornecidos como mais um guia para o praticante de aptidão normal nesta área, e não devem ser considerados, em caso algum como limitações do invento.

Exemplo 1 (Clonagem e Expressão) (A) Os vectores foram construídos a partir de plasmideos contendo a porção 5' do genoma do HCV, como descrito nas Patentes Europeias com os Nos 318.216 e 388.232. A cassete HCV (S/B) contém o fragmento de DNA StuI-BglII codificando a extremidade 5' da poliproteina de Met_r até Leu_g06, começando no núcleotido -63 relativamente ao Metp Isto inclui a proteina core (C), a proteina El (também referida por vezes como S), a proteina ‘ι

E2 (também referida como NS1) e a porção 5' da região NS2a. Na expressão da construção, as proteínas individuais C, El e E2 são produzidas por processos proteoliticos.

A cassete HCV (A/B) contém um fragmento de DNA ApaLIBglII codificando a extremidade 5' da poliproteina de Met₁ até Leugog, começando no núcleotido -6 relativamente a Metplsto inclui a proteina core (C), a proteina El (também referida por vezes como S), a proteina E2 (também referida como NS1) e a porção 5' da região NS2a. Na expressão da construção, as proteínas individuais C, El e E2 são produzidas por processos proteoliticos.

A cassete C-El (S/B) (uma porção StuI-BamHI) contém a extremidade 5' de Met! até Iie₃₄₀ (um local BamHI no gene). A expressão desta cassete resulta na expressão de C e El em parte truncada (El'). A porção truncada a partir da extremidade 3' é uma região hidrofóbica que se crê servir como um sinal de translocação.

A cassete NS1(B/B) (uma porção da BamHI-BglII) contém uma pequena porção 3' da El (de Met₃₆₄), a E2 completa, e uma porção da NS2a (para Leug₀₆) . Nesta construção, o fragmento El serve como um sinal de translocação.

A cassete TPA-NS1 utiliza um lider activador plasminogénico de tecido humano (tPA) como um sinal de translocação em vez da porção 3' de El. Esta cassete contém uma forma truncada de E2, da Gly₄₀₆ até à Glu₆₅₁, em que está delectada a extremidade hidrofóbica 3'.

Cada cassete foi inserida no vector pGEM3Z (Promega) com e sem uma sequência 5' sintética não codificante de β25 globina, para transcrição e tradução, utilizando expressão in vitro em T7 e reticulocito de coelho. Vectores de virus vaccinia recombinante (rW) foram preparados através da introdução das cassetes no plasmideo pSCll (obtido através do Dr. B. Moss, NIH), seguindo-se a recombinação com o virus vaccinia, como descrito por Charkrabarty et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5^:3403-09.

(B) Foi construído um vector de expressão alternativo através da insersão da HCV(A/B) entre os locais StuI e Spel do pSC59 (obtido através do Dr. B. Moss, NHI), seguindo-se a recombinação com o virus vaccinia, como descrito por Charkrabarty et al., Mol. Cell Biol. (1985) 5:3403-09.

(C) As células HeLaS3 foram colhidas por centrifugação, durante 7 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente, em frascos de centrífuga estéreis de 500 ml (rotor JA-10). Os pellets foram ressupensos numa concentração final de 2 X 10⁷ células/ml, em meio de cultura adicional (meio modificado MEM Spinner modificado Joklik + 5% de soro de cavalo e gentamicina) (meio spinner). Um stock bruto de virus W/SC59-HCV sonificado foi adicionado, com uma multiplicidade de infecção de 8 pfu/célula, e a mistura foi agitada a 37°C durante 30 minutos. As células infectadas foram depois transferidas para um frasco spinner contendo 8 L de meio spinner e incubadas durante 3 dias a 37°C.

As células em cultura foram depois colhidas por centrifugação, e os pellets ressuspendidos em tampão (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 152 ml). As células foram depois homogeneizadas usando 40 ml de Dounce Homogenizer (50 golpes), e o pellet nucleico foi recolhido por centrifugação (5 minutos, 1600 rpm, 4°C, rotor JA-20). Os pellets nucleares foram ressuspendidos em tampão Tris (24 ml), re-homogeneizados, o pellet foi de novo recolhido, e os sobrenadantes foram todos agrupados.

lisado armazenado foi dividido em aliquotas de 10 ml e sonifiçado 3 X 30 minutos num sonificador de forma afunilada a potência média. 0 lisado sonifiçado (15 ml) foi estendido em 17 ml de um amortecedor de sucrose (36%) em tubos de centrífuga SW28, e centrifugado a 13500 rpm durante 80 minutos a 4°C, para recolher o pellet do virus. 0 pellet do virus foi ressuspendiddo em 1 ml de tampõ Tris (1 mM tris HCl, pH 9,0) e congelado a -80°C.

Exemplo 2 (Comparação dos produtos in vitro e in vivo) (A) El e E2 foram ambas expressas in vitro e in vivo e 35 marcadas no S-Met usando os vectores descritos no Exemplo 1, acima. As células BSC-40 e HeLa foram infectadas com os vectores rW para expressão in vivo. Tanto o meio como os lisados celulares foram examinados para detectar proteínas recombinantes. Os produtos foram precipitados imunologicamente usando soro imunolôgico humano para o HCV, enquanto que as proteínas in vitro foram analisadas directamente. As proteínas resultantes foram analisadas por SDS-PAGE.

O sistema de expressão reticulocito (pGEM3Z com HCV(S/B) ou HCV(A/B)) produziu proteínas C, El e E2 tendo pesos moleculares de aproximadamente 18 kD, 35 kD e 72 kD, respectivamente. Os lisados das células BSC-40 e HeLa transfectadas com rW contendo HCV(S/B), HCV(A/B) ou C-E1(S/B)

não exibiram as mesmas proteínas. Dado que o sistema reticulocito fornece um processamento eficiente a nivel do golgi e, consequentemente, não fornece ácido siálico, o facto de ambos os produtos in vivo e in vitro exibirem idênticas mobilidades sugere que as proteínas não são sialiladas in vivo. Apenas o vector rW contendo TPA-NS1 resultou em qualquer secreção extracelular de E2, que exibiu uma mobilidade alterada consistente com a sialilaçâo.

(B) 0 HCV(S/B) foi expresso in vitro e incubado com um painel de lectinas biotiniladas: GNA, SNA, PNA, WGA e ConA. A seguir à incubação, os complexos foram colectados em contas de avidina-acrilico, lavados, eluidos com tampão de amostra Laemmli, e analisados por SDS-PAGE. Os resultados mostraram gue El e E2 se ligam a GNA e ConA, o que indica a presença de manose. A GNA liga-se aos grupos manose terminais, enquanto que a ConA se liga a qualquer manose de ligação a. 0 facto de não existir ligação a SNA, PNA e WGA indica que nenhuma das proteínas contém ácido siálico, galactose-N-acetilgalactosamina ou N-acetil glucosamina.

(C) El e E2 marcadas radioactivamente foram produzidas em células BSC-40 por infecção com rW contendo HCV(S/B) (vv/SCll-HCV), e precipitadas imunologicamente com soro imunológico humano HCV⁺. Metade do material precipitado imunologicamente foi tratado durante a noite com neuraminidase para remover qualquer ácido siálico. A seguir ao tratamento, as proteínas tratadas e não tratadas foram analisadas por SDS-PAGE. Não foram observadas diferenças significativas na mobilidade, indicando a falta de sialilaçâo in vivo.

(D) El e E2 marcadas radioactivamente foram produzidas em células BSC-40 por infecçâo com rW contendo HCV(A/B) (vv/SC59-HCV), e precipitadas imunologicamente com soro humano HCV⁺, ou precipitadas usando lectina biotinilada GNA ligada a contas acrílicas, usando w/SCll livre de sequências HCV como controlo. Os precipitados foram analisados por SDS-PAGE. Os dados demonstraram que El e E2 eram as espécies maioritárias de proteínas terminadas em manose, em células infectadas com vv/SC59-HCV. 0 GNA foi tão eficiente como o antisoro humano na precipitação de El e E2 a partir de meio de cultura de células. Foi observado um componente de 25 kD, mas parece ser especifico para células infectadas com vaccinia.

Exemplo 3 (Purificação usando lectina) (A) Células HeLa S3 foram inoculadas com um stock de virus vv/SC59-HCV purificado, de elevado titulo, com uma multiplicidade de infecçâo de 5 pfu/célula, e a mistura agitada a 37°C durante 30 minutos. As células infectadas foram depois transferidas para um frasco spinner contendo 8 1 de meio spinner e incubadas durante 3 dias a 37°C. As células foram de novo colhidas por centrifugação e ressuspendidas em tampão hipotónico (20 mM HEPES, 10 mM NaCl, lmM MgCl2, 120 ml) em gelo. As células foram depois homogeneizadas num Dounce Homogenizer (50 golpes), e o pellet nucleico foi recolhido por centrifugação (5 minutos, 1600 rpm, 4°C, rotor JA-20). Os pellets foram agrupados, ressuspendidos em 48 ml de tampão hipotónico, rehomogenizados, recentrifugados, agrupados novamente, e congelados a -80°C.

Os sobrenadantes congelados foram depois descongelados, e a fracção microssomal da membrana do lisado pós-nuclear foi isolada por centrifugação durante 20 minutos num rotor JA-20 a 13500 rpm a 4°C. O sobrenadante foi removido por aspiração.

Os pellets foram colocados em 96 ml de tampão detergente (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,5% Triton X-100, pH 7,5) e homogenizado (50 golpes). O produto foi clarificado por centrifugação durante 20 minutos a 13500 rpm, 4°C, e os sobrenadantes recolhidos.

Uma coluna GNA-agarose (1 cm x 3 cm, 3 mg de contas de GNA/ml, 6 ml de volume de suporte, Vector Labs, Burlingame, CA) foi pré-equilibrada com um tampão detergente. A amostra de sobrenadante foi aplicada à coluna com a recirculaçâo, a uma taxa de fluxo de 1 ml/min durante 16 a 20 horas a 4°C. A coluna foi depois lavada com tampão detergente.

As proteínas E1/E2 purificadas foram eluidas com a-Dmanosido (0,9 M em tampão detergente) a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/minuto. A eluição foi interrompida quando apareceu E1/E2 no eluente, e a coluna foi re-equilibrada por 2 a 3 horas. As fracções foram analisadas por Western blot e contrastaçâo em prata. As fracções dos picos foram agrupadas e irradiadas com UV para inactivar qualquer virus vaccinia residual.

(B) As asialoglicoproteinas El e E2, purificadas por GNA-agarose, foram sedimentadas através de gradientes de glicerol 20-60%. Os gradientes foram fraccionados e as proteínas foram analisadas por SDS-PAGE e western blotting. As manchas foram sondadas com GNA para identificação de El e E2. Os resultados indicam a presença do heterodimero E1;E2 que sedimenta à taxa esperada (isto é, na posição caracteristica de uma proteina de 110 kD). Também são evidentes agregados maiores das proteínas do envelope do HCV. Também aparecem homodimeros E2:E2. A E2 parece estar representada em excesso nas espécies maiores relativamente à El, no entanto também foram detectadas espécies distintas El:E2. Os agregados maiores sedimentaram significativamente mais depressa que o marcador de tiroglobulina.

(C) A El e E2 purificadas por GNA-agarose foram sedimentadas através de gradientes de glicerol 20-60% contendo 1 mM de EDTA. As fracçOes foram analisadas por SDS-PAGE com e sem β-mercaptoetanol (βΜΕ). Foi observada uma pequena ou nenhuma diferença na aparente abundância de El e E2 na presença ou ausência de βΜΕ, indicando a ausência de ligaçOes disulfeto entre os heterodimeros.

(D) Os complexos E1/E2 (com uma pureza aproximada de 40%) foram analisados num analisador de submicro partículas Coulter DM-4. Foi detectado material na zona dos 20 a 60 nm.

(E) Os complexos E1/E2 (com uma pureza aproximada de 40%) foram analisados por microscopia electrónica usando contrastação negativa com ácido fosfotungstico. 0 gráfico do microcoscópio electrónico revelou a presença de partículas tendo uma aparência esférica e um diâmetro de cerca de 40 nm. Os complexos E1/E2 foram incubados com soro imunológico humano HCV , e analisados depois por ME de contraste negativo. Foram observados complexos de anticorpos contendo grandes agregados e partículas mais pequenas.

Exemplo 4 (Purificação Cromatográfica) (A) 0 material da GNA-lectina purificado, preparado como no Exemplo 3 (0,5-0,8 ml) foi diluido 10 x com tampão A (20 mM de tampão Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA), e aplicado a uma coluna

1,8 x 1,5 cm de Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibstown, New Jersey, Cat.no 16883), equilibrada em tampão A. A fracçâo proteica contendo E1/E2 foi eluida com o mesmo tampão a uma taxa de fluxo de 0,2 ml/minuto, e foram colhidas fracções de 1 ml. As fracções contendo El e E2 (determinadas por SDS-PAGE) foram agrupadas e armazenadas a -80°C.

(B) 0 material purificado na parte (A) tinha uma grau de pureza de 60 a 80%, como calculado pelo SDS-PAGE. A identificação das supostas bandas El e E2 foi confirmada pela análise da sequência N-terminal depois de se usar uma técnica de transferência. Para o propósito, o material E1/E2 purificado pela Fractogel-DEAE foi reduzido pela adição de tampão Laemmli (pH

6,8, 0,06 M Tris-Cl, 2,3 % SDS, 10% glicerol, 0,72 Μ βmercaptoetanol) e fervido durante 3 minutos. A amostra foi depois colocada no gel de 10% poliacrilamida. Após o SDS-PAGE, a proteina foi transferida para uma membrana de 0,2 gm de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). As supostas bandas proteicas El e E2, respectivarnente, foram retiradas da mancha e sujeitas a uma análise do aminoácido N-terminal, contudo não foi tomado nenhum cuidado especial para evitar um bloqueio do terminal amina, durante a preparação do material. Os primeiros 15 ciclos revelaram que a amostra El tinha a sequência Tyr-Gln-Val-Arg-XSer-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Asp, enquanto que a sequência E2 era Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe. Este sobre a sequência de aminoácidos está de acordo com a esperada das correspondentes sequências de DNA.

Crê-se que o produto E1/E2, purificado acima por cromatografia fractogel-DEAE, esteja agregado como evidenciado pelo facto de que uma grande quantidae de El e E2 coelui na região vazia de volume numa coluna de cromatografia de permeação em gel Bio-Sil TSK-4000 SW. Isto indica que em condições nativas uma quantidade significativa do complexo E1/E2 tem um peso molecular de, pelo menos, 800 kD. Foi também observado material E1/E2 tendo um peso molecular de cerca de 650 kD.

Claims (9)

1- Um método de produção de asialoglicoproteinas de HCV adequadas para uso em vacinas ou imunoensaios, caracterizado pelo facto de compreender:

o crescimento de um eucariota inferior transformado com um gene estrutural codificando para uma asialoglicoproteina de HCV, seleccionada do grupo consistindo em El e E2, num meio de cultura adequado;

provocar a expressão do referido gene estrutural; e a recuperação da referida asialoglicoproteina de HCV a partir da referida cultura celular.

2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido eucariota inferior ser a levedura.

3- Um método para a produção de asialoglicoproteinas de HCV adequadas para uso numa vacina ou imunoensaio, caracterizado pelo facto de compreender:

o crescimento de uma célula hospedeira de mamifero, transformada com um gene estrutural, codificando uma asialoglicoproteina de HCV seleccionada do grupo consistindo de El e E2 num meio de cultura adequado;

provocar a expressão do referido gene estrutural sob condições que inibem a sialilação; e recuperação da asialoglicoproteina de HCV a partir da referida cultura celular.

4- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto da referida situação de inibição da sialilaçâo compreender a expressão de El ou E2, a uma taxa suficiente para inibir o transporte das glicoproteinas a partir do retículo endoplasmático para o golgi.

5- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto das referidas condições de inibição da sialilaçâo compreenderem:

a presença de uma quantidade suficiente de um modulador de cálcio para causar a libertação de proteinas no interior do reticulo endoplasmático da célula hospedeira.

6- Um método para purificar asialoglicoproteinas de HCV, caracterizado pelo facto de compreender:

o contacto de uma composição contendo asialogliproteinas de HCV com uma proteina de ligação à manose; e o isolamento da porção da composição que se liga à referida proteina de ligação à manose.

7- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto da referida proteina de ligação à manose ser uma lectina seleccionada do grupo consistindo em ConA e GNA.

8- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de:

o referido contacto compreender a incubação da referida composição contendo asialoglicoproteinas de HCV numa coluna compreendendo uma lectina de ligação à manose, imobilizada num suporte, durante um periodo de, pelo menos, uma hora; e o referido isolamento compreender a eluição das referidas asialoglicoproteinas de HCV com a manose.

9- Um kit de ensaio para detectar a presença de asialoglicoproteinas de HCV, caracterizado pelo facto de compreender:

) um suporte sólido;

uma proteína de ligação à manose; e um anticorpo especifico para a referida asialoglicoproteina de HCV;

em que um dos referidos anticorpo e lectina é ligado ao referido suporte sólido.

PELO A3EÍTE OFICIAL DA Ρ^ΟΡ5.ΈΟΑΓΕ