ES2316920T3 - Popipeptido truncado e2 de hepatitis c y procedimientos para obtener el mismo. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir un polipéptido del VHC secretado, comprendiendo dicho procedimiento: (a) proporcionar una población de células huésped de mamífero o levaduras, en la que dichas células huésped se transforman con un vector recombinante que comprende: i) un polinucleótido que comprende una secuencia codificante del polipéptido E2 del virus de la hepatitis C (VHC), en el que dicho polipéptido carece de una parte de su extremo C-terminal que comienza en el resto aminoacídico 715, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1 dada en Fig. 4; y ii) elementos de control que están unidos de forma funcional a dicha secuencia codificante por los cuales dicha secuencia codificante puede transcribirse y traducirse en una célula huésped; y (b) cultivar dicha población de células en condiciones por las cuales dicho polipéptido del VHC se expresa y secreta.

Description

Polipéptido truncado E2 de hepatitis C y procedimientos para obtener el mismo.

Antecedentes de la invención Campo técnico

La presente invención se refiere en líneas generales a las proteínas virales. En particular, la invención se refiere a formas truncadas, secretadas de las proteínas E1 y E2 del virus de la hepatitis C y el aislamiento y producción recombinante de las mismas.

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis C (VHC) es la causa principal de hepatitis no A, no B parenteral que se transmite en gran medida a través de transfusión de sangre y contacto sexual. El virus está presente en entre el 0,4 y el 2,0% de los donantes de sangre. Se desarrolla hepatitis crónica en aproximadamente el 50% de las infecciones y de éstas, aproximadamente el 20% de los individuos infectados desarrollan cirrosis hepática que a veces conduce a carcinoma hepatocelular. Por consiguiente, el estudio y control de la enfermedad es de importancia médica.

La secuencia genómica viral del VHC es conocida, ya que hay procedimientos para obtener la secuencia. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nº WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. En particular, el VHC tiene un genoma de ARN monocatenario con sentido positivo de 9,5 y es un miembro de la familia Flaviridae de virus. Actualmente, hay 6 genotipos distintos, pero relacionados del VHC en base a análisis filogenéticos (Simmonds y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). El virus codifica una única poliproteína que tiene más de 3000 restos aminoacídicos (Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Choo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). La poliproteína es procesa de forma co- y post-traduccional en proteínas tanto estructurales como no estructurales (NS).

En particular, hay tres proteínas estructurales putativas, constituidas por la proteína de nucleocápsida N-terminal (llamada "núcleo") y dos glicoproteínas de envuelta, "E1" (también conocida como E) y "E2" (también conocida como E2/NS1). (Véase, Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388, para un análisis de las proteínas del VHC, incluyendo E1 y E2.) E1 se detecta como una especie de 32-35 kDa y se convierte en un única banda sensible a endo H de aproximadamente 18 kDa. Por en contrario, E2 presenta un patrón complejo después de inmunoprecipitación coherente con la generación de múltiples especies (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67: 1385-1395; Tomei y col., J. Virol. (1993) 67:4017-4026.). Las glicoproteínas de envuelta del VHC E1 y E2 forman un complejo estable que se puede co-inmunoprecipitar (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Lanford y col., Virology (1993) 197:225-235; Ralston y col., J. Virol. (1993) 67: 6753-6761). Las glicoproteínas E1 y E2 del VHC son de considerable interés porque han demostrado se protectoras en estudios de primates. (Choo y col., Proc. Nacl. Acad. Sci. USA (1994) 91:1294-1298).

La envuelta del virión VHC sigue sin caracterizar. Por tanto, los estudios de expresión usando moldes de ADNc recombinante son el único medio actualmente disponible para estudiar la biosíntesis de la envuelta. E1 y E2 se retienen dentro de las células y carecen de carbohidratos complejos cuando se expresan de forma estable o en un sistema de virus Vaccinia transitorio (Spaete y col., Virology (1992) 188:819-830; Ralston y col., J. Virol. (1993) 67:6753-6761). Como las proteínas E1 y E2 están normalmente unidas a membrana en estos sistemas de expresión, sería deseable producir formas secretadas para facilitar la purificación de las proteínas para uso adicional.

Se ha descubierto que la retirada del dominio transmembrana de las glicoproteínas de la superficie celular virales del virus de la influenza (Sveda, y col., Cell (1982) 30:649-656; Geting y Sambrook, Nature (1982) 300:598-603) y el virus de la estomatitis vesicular (Rose y Bergmann, Cell (1982) 30:753-762) provoca la secreción de la glicoproteína truncada desde células huésped de mamífero. Véase también la Publicación EPO Nº 139.417. Asimismo, se secreta gH de citomegalovirus truncada cuando se expresa en células de baculovirus (Publicación Internacional Nº WO 92/02628, publicada el 20 de febrero de 1992). Se ha descrito una molécula E2 del VHC truncada de forma C-terminal, capaz de secretarse desde células de mamífero. Spaete y col., Virology (1992) 188: 819-830. Se conoce una molécula E2 truncada de forma C-terminal que carece de una parte desde el resto 717 a partir de Langford y col., Virology (1993) 197: 225-235. Esta proteína no se secreta desde células de insecto Sf 9. Sin embargo, la región de anclaje transmembrana de E1 hasta ahora no se ha dilucidado y por tanto la producción de formas truncadas de E1 del VHC para la secreción no se ha descrito previamente. Además, no se han descrito previamente complejos de polipéptidos E1 y E2 truncados, secretados.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la dilucidación de la secuencia de E2 importante para el anclaje de proteínas al retículo endoplasmático (RE) y para la co-precipitación de E2 con E1. Por tanto, la eliminación de estas secuencias sirve para producir formas truncadas de las glicoproteínas que se secretan en lugar de retenerse en la membrana del RE. Además, el truncamiento facilita la purificación de la proteína E2 sin E1 asociada, y viceversa. La proteína E2 truncada, cuando se expresa junto con E1 o combinada después de la expresión, es capaz de formar un complejo.

Por consiguiente, en este documento se describe para referencia un polipéptido E1 del VHC, que carece de todo o una parte de su dominio de membrana de modo que el polipéptido sea capaz de secreción en medio de cultivo cuando se expresa de forma recombinante en una célula huésped. El polipéptido E1 del VHC carece de al menos una parte de su extremo C-terminal comenzando en o cerca de aproximadamente el aminoácido 370 o aproximadamente el aminoácido 360, numerados con referencia a la secuencia de aminoácidos de E1 del VHC1.

En una realización, la invención se refiere a un polipéptido E2 del VHC que carece de al menos una parte de su dominio de membrana de modo que el polipéptido sea capaz de secreción en medio de cultivo cuando se expresa de forma recombinante en una célula huésped, en la que el polipéptido carece de al menos una parte de su extremo C-terminal comenzando en el resto aminoacídico 715, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1. También se describe en este documento el polipéptido E2 del VHC que carece de al menos una parte de su extremo C-terminal comenzando en aproximadamente el aminoácido 725, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1.

También se describen en este documento polinucleótidos que codifican los anteriores polipéptidos, vectores que comprenden estos polinucleótidos, células huésped transformadas con los vectores y procedimientos para producir de forma recombinante los polipéptidos.

También se describe en este documento un complejo de E1 secretada/E2 secretada que comprende:

(a) un polipéptido E1 del VHC, que carece de todo o una parte de su dominio de membrana de modo que el polipéptido E1 sea capaz de secreción en medio de cultivo cuando se expresa de forma recombinante en una célula huésped; y

(b) un polipéptido E2 del VHC, que carece de todo o una parte de su dominio de membrana de modo que dicho polipéptido E2 sea capaz de secreción en medio de cultivo cuando se expresa de forma recombinante en una célula huésped.

El complejo de E1 secretada/E2 secretada incluye un polipéptido E1 que carece de al menos una parte de su extremo C-terminal comenzando en aproximadamente el aminoácido 360 ó 370, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E1 del VHC1, y dicho polipéptido E2 carece de al menos una parte de su extremo C-terminal comenzando en aproximadamente el aminoácido 725 ó 730, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1.

También se describen en este documento composiciones de vacuna que comprenden los polipéptidos E1 y/o E2 del VHC truncados y/o complejos de los polipéptidos E1 y E2.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un esquema de la región E1 del VHC1.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para E1 del VHC1, incluyendo la secuencia señal N-terminal y el dominio de anclaje a membrana C-terminal.

La Figura 3 es un esquema de la región E2 del VHC1.

Las Figuras 4A-4C muestran la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente para la región E2/NS2 del VHC1, incluyendo la secuencia señal N-terminal de E2 y el dominio de anclaje a membrana C-terminal de E2.

La Figura 5 representa los moldes de ADNc de E1 del VHC usados para transfección en los Ejemplos. La región del núcleo a NS2 se muestra en la parte superior y está dibujada a escala; desde NS3 distal hasta NS5 no está dibujado a escala. La región E1 se ha expandido para representar mejor los moldes usados. Los números a la derecha se refieren al punto final de aminoácido usado en cada molde.

La Figura 6 representa los moldes de ADNc de E2 del VHC usados para transfección en los Ejemplos. La región del núcleo a NS2 se muestra en la parte superior y está dibujada a escala; desde NS3 distal hasta NS5 no está dibujado a escala. La región E2/NS2 se ha expandido para representar mejor los moldes usados. La columna a la izquierda se refiere al punto final de aminoácido usado en cada molde.

La Figura 7 representa el plásmido pMHE2-715, que contiene un gen que codifica una proteína E2 truncada que tiene los aminoácidos 383-715 del VHC1. También presente en el vector está el origen de replicación de SV40, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus de ratón (MCMV ie), un líder tpa, la señal de poliadenilación de SV40 y el ADNc de DH-FR para la selección.

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Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de virología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia habitual de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Fundamental Virology, 2a Edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.)

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias plurales salvo que el contenido indique claramente otra cosa.

I. Definiciones

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que estén definidos como se indica a continuación.

Por un "polipéptido E1" se entiende una molécula derivada de una región E1 del VHC. Dicha molécula puede obtenerse físicamente de la región o producirse de forma recombinante o de forma sintética, en base a la secuencia conocida. La región E1 madura del VHC1 comienza en aproximadamente el aminoácidos 192 de la poliproteína y continúa hasta aproximadamente el aminoácido 383 (véanse las Figuras 1 y 2). Los aminoácidos en aproximadamente 173 a aproximadamente 191 sirven como secuencia señal para E1. Por tanto, por un "polipéptido E1" se entiende una proteína E1 precursora, incluyendo la secuencia señal, o un polipéptido E1 maduro que carece de esta secuencia, o incluso un polipéptido E1 con una secuencia señal heteróloga. Además, como se dilucida en este documento, el polipéptido E1 incluye una secuencia de anclaje a membrana C-terminal que existe en aproximadamente las posiciones de aminoácidos 360-383.

Por un "polipéptido E2" se entiende una molécula derivada de una región E2 del VHC. Dicha molécula puede obtenerse físicamente de la región o producirse de forma recombinante o de forma sintética, en base a la secuencia conocida. Se cree que la región E2 madura del VHC1 comienza en aproximadamente el aminoácido 384-385 (véanse las Figuras 3 y 4A-4C). Un péptido señal comienza en aproximadamente el aminoácido 364 de la poliproteína. Por tanto, por un "polipéptido E2" se entiende una proteína E2 precursora, incluyendo la secuencia señal, o un polipéptido E2 maduro que carece de esta secuencia, o incluso un polipéptido E1 con una secuencia señal heteróloga. Además, como dilucida en este documento, el polipéptido E2 incluye una secuencia de anclaje a membrana C-terminal que existe en aproximadamente las posiciones de aminoácidos 715-730 y puede extenderse tanto como aproximadamente el resto aminoacídico 746 (véase, Lin y col., J. Virol. (1994) 68:5063-5073).

Las regiones E1 y E2 representativas del VHC1 se muestran en las Figuras 2 y 4A-4C, respectivamente. Para propósitos de la presente invención, las regiones E1 y E2 se definen con respecto a los números de aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma del VHC1, estando designada la metionina de inicio como posición 1. Sin embargo, debe apreciarse que el término "polipéptido E1" o "polipéptido E2" como se usa en este documento no se limita a la secuencia del VHC1. A este respecto, las regiones E1 o E2 correspondientes en otro aislado del VHC pueden determinarse fácilmente alineando secuencias de los dos aislados de un modo que ponga las secuencias en alineación máxima. Esto puede realizarse con cualquiera de varios paquetes de software informático, tales como ALIGN 1.0, disponible en la University of Virginia, Department of Biochemistry (Att: Dr. William R. Pearson). Véase, Pearson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85: 2444-2448.

Además, un "polipéptido E1" o un "polipéptido E2" como se define en este documento no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta representada en las Figuras. De hecho, el genoma del VHC está en un estado de flujo constante y contiene varios dominios variables que muestran grados relativamente elevados de variabilidad entre aislados. Como llegará a ser evidente en este documento, todo lo que es importante es que la región que sirve para anclar el polipéptido al retículo endoplasmático se identifique de modo que el polipéptido pueda modificarse para retirar todo o parte de esta secuencia para secreción. Es muy evidente que los términos abarcan polipéptidos E1 y E2 de cualquiera de los diversos aislados del VHC incluyendo aislados que tienen cualquiera de los 6 genotipos del VHC descritos en Simmonds y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Además, el término abarca cualquiera de dichas proteínas E1 o E2 independientemente del procedimiento de producción, incluyendo aquellas proteínas producidas de forma recombinante y de forma sintética.

Además, los términos "polipéptido E1" y "polipéptido E2" abarcan proteínas que incluyen modificaciones adicionales a la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones internas adicionales (generalmente de naturaleza conservativa). Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como a través de acontecimientos mutaciones que suceden de forma natural. Todas estas modificaciones están incluidas en la presente invención siempre que los polipéptidos E1 y E2 funcionen para su propósito pretendido. Por tanto, por ejemplo, si los polipéptidos E1 y/o E2 son para usarlos en composiciones de vacuna, las modificaciones deben ser tales que la actividad inmunológica (es decir, la capacidad de provocar una respuesta de anticuerpos contra el polipéptido) no se pierda. Asimismo, si los polipéptidos son para usarlos para propósitos de diagnóstico, dicha capacidad debe retenerse.

Un polipéptido E1 o E2 "que carece de todo o una parte de su dominio de membrana" es un polipéptido E1 o E2, respectivamente, como se ha definido anteriormente, que está truncado de forma C-terminal para delecionar todo o una parte de la secuencia de anclaje a membrana que funciona para asociar el polipéptido al retículo endoplasmático. Dicho polipéptido es, por lo tanto, capaz de secreción en medio de cultivo en que se cultiva un organismo que expresa la proteína. El polipéptido truncado solamente necesita carecer de toda la secuencia de anclaje a membrana necesaria para realizar la secreción. La secreción en medios de cultivo se determina fácilmente usando varias técnicas de detección, incluyendo, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida y similares y técnicas inmunológicas tales como ensayos de inmunoprecipitación que se describen en los ejemplos. Con E1, generalmente se retendrán polipéptidos que terminan con aproximadamente la posición del aminoácido 370 y superior (en base a la numeración de E1 del VHC1) por el RE y por tanto no se secretarán en los medios de cultivo. Con E2, se retendrán polipéptidos que terminan con aproximadamente la posición del aminoácido 731 y superior (también en base a la numeración de la secuencia de E2 del VHC1) por el RE y no se secretarán. Debe observarse que estas posiciones de aminoácidos no son absolutas y pueden variar en algún grado.

Aunque no se han ejemplificado todos los truncamientos C-terminales posibles, debe entenderse que truncamientos intermedios, tales como por ejemplo, polipéptidos E1 que acaban en los aminoácidos 351, 352, 353 y más, o polipéptidos E2 que acaban en por ejemplo los aminoácidos 716, 717, 718 y más, también se incluyen por la presente invención. Por tanto, se pretende que todos los polipéptidos E1, que terminan en aproximadamente los aminoácidos 369 e inferiores, y todos los polipéptidos E2, que terminan en aproximadamente los aminoácidos 730 e inferiores, que son capaces de secreción en medio de cultivo cuando se expresan de forma recombinante, estén recogidos en este documento.

Además, el truncamiento C-terminal puede extenderse más allá del dominio transmembrana hacia el extremo N-terminal. Por tanto, por ejemplo, truncamientos en E1 que existen en posiciones inferiores a, por ejemplo, 360 y truncamientos en E2 que existen en posiciones inferiores a, por ejemplo, 715, también se incluyen por la presente invención. Todo lo que es necesario es que los polipéptidos E1 y E2 truncados se secreten y sigan siendo funcionales para su propósito pretendido. Sin embargo, las construcciones de E2 particularmente preferidas serán aquellas con truncamientos C-terminales que no se extiendan más allá de la posición del aminoácido 699.

Un "complejo de E1 secretada/E2 secretada" se refiere a un complejo de las proteínas E1 y E2, cada una de las cuales carece de todo o una parte del dominio de membrana, como se ha descrito anteriormente. El modo de asociación de E1 y E2 en dicho complejo es inmaterial. De hecho, dicho complejo puede formarse de forma espontánea simplemente mezclando las proteínas E1 y E2 secretadas que se han producido individualmente. Asimismo, cuando se co-expresan, las proteínas E1 secretada y E2 secretada pueden formar un complejo espontáneamente en el medio. La formación de un "complejo de E1 secretada/E2 secretada" se determina fácilmente usando técnicas de detección de proteínas convencionales tales como electroforesis en gel de poliacrilamida y técnicas inmunológicas tales como inmunoprecipitación.

Dos polinucleótidos o moléculas proteicas son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente el 40-50%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70-80%, y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente el 85-95%, de los nucleótidos o aminoácidos de las moléculas coinciden en una longitud definida de la molécula. Como se usa en este documento, sustancialmente homólogas también se refiere a moléculas que tienen secuencias que muestran identidad con la molécula de ácido nucleico o proteica especificada. Las moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación de Southern en, por ejemplo, condiciones rigurosas, definidas para ese sistema particular. La definición de condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia habitual de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra; DNA Cloning, vol. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Una proteína o polipéptido "asilado" es una proteína que es diferente y concreta de un organismo completo con que la proteína está normalmente asociada en la naturaleza. Por tanto, una proteína contenida en un extracto libre de células constituiría una proteína "aislada", como lo sería una proteína producida de forma sintética o de forma recombinante. Asimismo, un polinucleótido "aislado" es una molécula de ácido nucleico diferente y concreta del organismo completo con que la secuencia se encuentra en la naturaleza; o una secuencia desprovista, por completo o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas (como se define a continuación) en asociación con la
misma.

Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" una proteína seleccionada, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo en control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, aunque sin limitación ADNc de secuencias de nucleótidos virales así como secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción puede localizarse 3' a la secuencia codificante.

Un "polinucleótido" puede incluir, aunque sin limitación, secuencias virales, secuencias procariotas, ARN viral, ARNm eucariota, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN eucariota (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de ADN sintético. El término también recoge secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN tales como, aunque sin limitación 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.

"Elementos de control" se refiere colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores cadena arriba, potenciadores, y similares, que proporcionan colectivamente la transcripción y la traducción de una secuencia codificante en una célula huésped. No todos estos elementos de control siempre tienen que estar presentes en un vector recombinante siempre que el gen deseado sea capaz de transcribirse y traducirse.

Un elemento de control "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora y transcribe la secuencia codificante en ARNm, que después se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia codificante.

"Unido de forma funcional" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes descritos están configurados para realizar su función habitual. Por tanto, los elementos de control unidos de forma funcional a una secuencia codificante son capaces de realizar la expresión de la secuencia codificante cuando la ARN polimerasa está presente. Los elementos de control no tienen que estar contiguos con la secuencia codificante, siempre que funcionen dirigiendo la expresión de la misma. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias transcritas aún no traducidas intermedias entre, por ejemplo, una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora aún puede considerarse "unida de forma funcional" a la secuencia codificante.

"Recombinante" como se usa en este documento para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintetico, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una parte del polinucleótido con que está asociado en la naturaleza; y/o (2) está unido a un polinucleótido diferente de con el que está unido en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. "Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros de dichos términos que indican microorganismos procariotas o líneas celulares eucariotas cultivadas como entidades unicelulares, se usan de forma intercambiable, y se refieren a células que pueden usarse, o se han usado, como destinatarias de vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluyen la descendencia de la célula original que se ha transfectado. Se entiende que la descendencia de una única célula precursora puede no ser necesariamente idéntica completamente en morfología o en el complemento de ADN genómico o total al precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La descendencia de la célula precursora que es suficientemente similar al precursor a caracterizar por la propiedad pertinente, tal como la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido deseado, se incluye en la descendencia pretendida para esta definición, y está cubierta por los anteriores términos.

Un "vector" es un replicón en que está unido un segmento polinucleotídico heterólogo, para provocar la replicación y/o expresión del segmento unido, tal como un plásmido, transposón, fago, etc.

Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro del subfilo cordados, incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos; animales de granja tales como vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como gallinas, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares. El término no indica una edad particular. Por tanto, se pretende que estén cubiertos individuos tanto adultos como recién nacidos. El sistema descrito anteriormente está pretendido para su uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados funcionan de forma similar.

II. Modos de Realizar la Invención - Descritos solamente para referencia

La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos polipéptidos E2 que están truncados de forma C-terminal de modo que sean capaces de secreción en medio de cultivo cuando se producen de forma recombinante en una célula huésped. Los polipéptidos secretados también son sorprendentemente capaces de formar complejos con polipéptidos E1. Esta interacción es inesperada ya que, como se muestra en este documento, la capacidad de E1 y E2 de co-precipitar se pierde después de la eliminación del dominio de membrana.

En particular, el análisis de transfecciones transitorias de moldes prolongados en serie que cubren la región E2/NS2 proporcionó evidencias de tres especies de E2 con distintos extremos C-terminales. Una forma era E2 que terminaba en el aminoácido 729 mientras que las dos especies más grandes representaban fusiones con las proteínas NS2A y NS2A/NS2B cadena abajo que terminan en los aminoácidos 809 y 1026, respectivamente. Usando los mismos moldes de E2, se ha definido una región de E2 importante para la co-inmunoprecipitación de E1 que también evita la secreción de E2. Asimismo, se identificó un dominio de membrana de E1.

Más específicamente, se ha identificado un dominio de membrana que supuestamente sirve para anclar E1 a la membrana del RE, en aproximadamente las posiciones de los aminoácidos 360-383. Se han construido varios polipéptidos E1 truncados de forma C-terminal, que carecen de partes de este dominio de membrana. (Véase la Figura 5). Se ha descubierto que polipéptidos E1, que codifican en las posiciones del aminoácido 370 y superiores, no se secretan en medio de cultivo cuando se expresan de forma recombinante.

Asimismo, se ha expresado de forma recombinante una serie de moléculas E2 que incluyen truncamientos C-terminales como se representa en la Figura 6, y se han ensayado los medios de cultivos de células transformadas para la presencia de los polipéptidos E2 para determinar qué construcciones truncadas son capaces de secreción. Se ha descubierto que moléculas que acaban en las posiciones de aminoácidos superiores a 730, no se secretan en medio de crecimiento y supuestamente se retienen en la membrana del RE. (Debe apreciarse que se observa una pequeña cantidad de secreción con construcciones que terminan en la posición del aminoácido 730). Se ha encontrado una relación inversa entre la secreción de E2 y su asociación con E1. Por tanto, los polipéptidos E2 que se pueden secretar no co-precipitan con E1 de lisados mientras que aquellos que no se secretan, sí.

Sin embargo, sorprendentemente, cuando se co-expresan formas secretadas de polipéptidos E1 y E2, los polipéptidos secretados son capaces de formar un complejo, detectable usando anticuerpos contra E1 o E2. Dicha formación de complejo es significativa ya que se demuestra que las regiones de E1 y E2 que son importantes para su interacción se retienen a pesar de la eliminación de los anclajes a membrana C-terminales.

Estos descubrimientos proporcionan procedimientos eficaces para purificar E1, E2 y complejos de E1/E2 secretados, para su uso futuro. En particular, las proteínas secretadas se purifican más fácilmente que proteínas expresadas de forma intracelular. Asimismo, ya que como se ha descrito anteriormente, se sabe que las proteínas E1 y E2 nativas forman un complejo, la invención descrita en este documento proporciona un procedimiento para obtener E1 o E2 libre de la otra proteína. Además, si se desea un complejo de E1/E2, las proteínas secretadas pueden co-expresarse o mezclarse juntas (en medio de cultivo o en forma purificada o semipurificada), para la formación espontánea del complejo.

Los polipéptidos E1 y E2 truncados pueden producirse usando una diversidad de técnicas. Por ejemplo, los polipéptidos pueden generarse usando técnicas recombinantes, bien conocidas en la técnica. A este respecto, pueden inventarse sondas oligonucleotídicas en base a las secuencias conocidas del genoma del VHC y usarse para sondear bibliotecas genómicas o de ADNc para los genes E1 y E2. Los genes después pueden aislarse adicionalmente usando técnicas convencionales y, por ejemplo, enzimas de restricción empleadas para truncar el gen en posiciones deseadas de la secuencia de longitud completa. Asimismo, los genes E1 y E2 pueden aislarse directamente de células y tejidos que los contienen, usando técnicas conocidas, tales como extracción con fenol y la secuencia se puede manipular adicionalmente para producir los truncamientos deseados. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra, para una descripción de técnicas usadas para obtener y aislar ADN. Finalmente, los genes que codifican los polipéptidos E1 y E2 truncados pueden producirse de forma sintética, en base a las secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos deseada particular. En general, se seleccionarán codines preferidos para el huésped pretendido en que se expresará la secuencia. La secuencia completa generalmente se ensambla a partir de oligonucleótidos solapantes preparados por procedimientos convencionales y se ensamblan en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair y col. (1984) Science 223:1299; Jay y col. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Una vez que se han aislado o sintetizado las secuencias codificantes para las proteínas deseadas, pueden clonarse en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión. Los especialistas en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es un asunto de elección. Los ejemplos de vectores de ADN recombinante para clonación y células huésped que pueden transformar incluyen el bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram-negativas), pGV1106 (bacterias gram-negativas), pLAFR1 (bacterias gram-negativas), pME290 (bacterias gram-negativas no E. coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pU61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIpS (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamífero). Véase, en líneas generales, DNA Cloning: Vol. I y II, supra; Sambrook y col., supra; B. Perbal, supra.

También pueden usarse sistemas de expresión de células de insecto, tales como sistemas de baculovirus, y son conocidos para los especialistas en la técnica y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y procedimientos para sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están disponibles en el mercado en forma de kit en, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac").

Los sistemas virales, tales como un sistema de infección/transfección basado en vaccinia, como se describe en Tomei y col., J. Virol. (1993) 67:4017-4026 y Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113, también encuentran uso con la presente invención. En este sistema, las células primero se transfectan in vitro con un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta polimerasa presenta una especificidad exquisita porque solamente transcribe moldes que contengan promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan con el ADN de interés, dirigido por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus vaccinia recombinante transcribe el ADN introducido por transfección en ARN que después se traduce en la proteína por la maquinaria de traducción del huésped. El procedimiento proporciona una producción citoplasmática, transitoria, de elevado nivel de grandes cantidades de ARN y su(s) producto(s) de traducción.

El gen puede colocarse bajo el control de un promotor, sitio de unión al ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador (colectivamente mencionados en este documento como elementos de "control"), de modo que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido E1 o E2 deseado se transcriba en ARN en la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o secuencia líder. Con la presente invención, pueden usarse tanto péptidos señal de origen natural como secuencias heterólogas. Las secuencias líder pueden retirarse por el huésped en el procesamiento post-traduccional. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.

También pueden ser deseables otras secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias proteicas con relación al crecimiento de la célula huésped. Dichas secuencias reguladoras son conocidas para los especialistas en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellas que causan la expresión de un gen a activarse o desactivarse en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.

Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificante antes de la inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos anteriormente. Como alternativa, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia codificante de modo que pueda unirse a las secuencias de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener la fase de lectura apropiada. También puede ser deseable producir mutantes o análogos de la proteína E1 o E2. Los mutantes o análogos pueden prepararse por deleción de una parte de la secuencia que codifica la proteína, por inserción de una secuencia, y/o por sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos, tales como mutagénesis dirigida al sitio, son bien conocidas para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra; DNA Cloning, Vol. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

El vector de expresión después se usa para transformar una célula huésped apropiada. Se conocen en la técnica varias líneas celulares de mamífero e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), tales como, aunque sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. Asimismo, se encontrará uso de huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp., con las presentes construcciones de expresión. Los huéspedes de levaduras útiles en la presente invención incluyen inter alia, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolitica. Las células de insecto para su uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, inter alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni. Dependiendo del sistema de expresión y el huésped seleccionado, las proteínas de la presente invención se producen cultivando células huésped transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente en condiciones por las cuales se expresa la proteína de interés. La proteína después se aísla de las células huésped y se purifica. Como la presente invención proporciona la secreción de los polipéptidos E1 y E2, las proteínas puede purificarse directamente de los medios. La selección de las condiciones de cultivo apropiadas y los procedimientos de recuperación pertenecen a la experiencia habitual de la
técnica.

Los polipéptidos E1 y E2 de la presente invención también pueden producirse usando procedimientos convencionales de síntesis de proteínas, en base a secuencias de aminoácidos conocidas. En general, estos procedimientos emplean la adición secuencial de uno o more aminoácidos a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido se protege por un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido o derivatizado después puede unirse a un soporte sólido inerte o utilizarse en solución añadiendo el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido, en condiciones que permiten la formación de un enlace amida. El grupo protector después se retira del resto aminoacídico recién añadido y después se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y etc. Después de que se hayan unido los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, cualquier grupo protector restante (y cualquier soporte sólido, si se usan técnicas de síntesis en fase sólida) se retira secuencialmente o al mismo tiempo, para dar el polipéptido final. Por modificación simple de este procedimiento general, es posible añadir más de un aminoácido de una vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo, acoplando (en condiciones que no realicen racemización de los centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido apropiadamente protegido para formar, después de la desprotección, un pentapéptido. Véase, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1980), pág. 3-254, para técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para síntesis en solución clásica.

Como se ha explicado anteriormente, la presente invención también proporciona un procedimiento para producir complejos de E1 secretada/E2 secretada. Dichos complejos se producen fácilmente por, por ejemplo, co-transfección de células huésped con construcciones que codifican las proteínas truncadas E1 y E2. La co-transfección puede realizarse en trans o cis, es decir, usando vectores diferentes o usando un único vector que alberga los dos genes E1 y E2. Si se hace usando un único vector, ambos genes pueden estar dirigidos por un único conjunto de elementos de control o, como alternativa, los genes pueden estar en el vector en casetes de expresión individuales, dirigidos por elementos de control individuales. Después de la expresión, las proteínas E1 y E2 secretadas se asociarán espontáneamente. Como alternativa, los complejos pueden formarse mezclando las proteínas individuales juntas que se han producido por separado, en forma purificada o semi-purificada, o incluso mezclando los medios de cultivo en los que se han cultivado las células huésped que expresan las proteínas.

Los nuevos polipéptidos E1 y E2 secretados de la presente invención, los complejos de los mismos, o los polinucleótidos que los codifican, pueden usarse para varios propósitos de diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, las proteínas y polinucleótidos pueden usarse en una diversidad de ensayos, para determinar la presencia de las proteínas E1 y E2 en una muestra biológica para ayudar al diagnóstico de enfermedad por VHC. Los polipéptidos E1 y E2 y los polinucleótidos que codifican los polipéptidos también pueden usarse en composiciones de vacuna, individualmente o en combinación, en por ejemplo, vacunas profilácticas (es decir, para evitar la infección) o terapéuticas (para tratar el VHC después de la infección). De hecho, dichas glicoproteínas de envuelta secretadas son particularmente útiles en inmunización con ácido nucleico donde las moléculas secretables pueden ser más eficaces que las proteínas intracelulares correspondientes para generar una respuesta inmune. Las vacunas pueden comprender mezclas de una o más de las proteínas E1 y E2 (o secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas), tales como proteínas E1 y E2 derivadas de más de un aislado viral. La vacuna puede también administrarse junto con otros antígenos y agentes inmuno-reguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas, citoquinas, linfoquinas, y quimioquinas, incluyendo, aunque sin limitación, IL-2, IL-2 modificada (cys125\rightarrowser125), GM-CSF, IL-12, interferón \gamma, IP-10, MIP1\beta y RANTES.

Las vacunas generalmente incluirán uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, y similares, en dichos vehículos.

Un vehículo está opcionalmente presente, que es una molécula que por sí misma no induce la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Además, el polipéptido del VHC puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como toxoide de difteria, tétanos, cólera,
etc.

También pueden usarse adyuvantes para potenciar la eficacia de las vacunas. Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin limitación: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como muramil péptidos (véase a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación Internacional Nº WO 90/14837), que contiene Escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5% (opcionalmente que contiene diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación), aunque no se requiere) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene Escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque pluronic al 5% L121, y thr-MDP (véase a continuación) microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado con vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor, y (c) sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo constituido por monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y el esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) que pueden usarse o generar partículas a partir de los mismos tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (4) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (IL-1, IL-2, etc.), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y (6) otras sustancias que funcionan como agentes estimuladores para potenciar la eficacia de la composición. Se prefieren alumbre y MF59.

Los muramil péptidos incluyen, aunque sin limitación, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Típicamente, las composiciones de vacuna se preparan en forma de inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante potenciado, como se ha analizado anteriormente.

Las vacunas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de las proteínas truncadas E1 y/o E2, o complejos de las proteínas, o secuencias de nucleótidos que codifican las mismas, y cualquier otro componente mencionado anteriormente, según sea necesario. Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad de una proteína truncada E1 y/o E2 que inducirá una respuesta inmunológica en el individuo al que se administra. Dicha respuesta generalmente provocará el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmune secretora, celular y/o mediada por anticuerpos contra la vacuna. Habitualmente, dicha respuesta incluye, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos de cualquiera de las clases inmunológicas, tales como inmunoglobulinas A, D, E, G o M; la proliferación de linfocitos B y T; el suministro de señales de activación, crecimiento y diferenciación a las células inmunológicas; la expansión de poblaciones de células T auxiliares, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta.

Preferiblemente, la cantidad eficaz es suficiente para dar lugar al tratamiento o prevención de los síntomas de la enfermedad. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que se esté tratando; la edad y estado general del individuo a tratar; la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseado; la gravedad de la afección que se está tratando; el polipéptido del VHC particular seleccionado y su modo de administración, entre otros factores. Una cantidad eficaz apropiada puede determinarla fácilmente un especialista en la técnica. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" estará en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos rutinarios.

Una vez formuladas, las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, por inyección, de forma subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una única dosis o un programa de múltiples dosis. La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmuno-reguladores.

Como se ha explicado anteriormente, pueden usarse vacunas que contienen polinucleótidos que codifican proteínas truncadas, secretadas para la inmunización con ácido nucleico. Dicho procedimiento comprende la introducción de un polinucleótido que codifica uno o más de los polipéptidos E1 y/o E2 en una célula huésped, para la expresión in vivo de las proteínas. El polinucleótido puede introducirse directamente en el sujeto destinatario, tal como por inyección, inhalación o similares, o puede introducirse ex vivo, en células que se han retirado del huésped. En el último caso, las células transformadas se reintroducen en el sujeto donde puede montarse una respuesta inmune contra la proteína codificada por el polinucleótido. Se conocen en la técnica procedimientos de inmunización con ácido nucleico y se describen en, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº WO 93/14778 (publicada el 5 de agosto de 1993); la Publicación Internacional Nº WO 90/11092 (publicada el 4 de octubre de 1990); Wang y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 4156-4160; Tang y col. Nature (1992) 356: 152-154; y Ulmer y col. Science (1993) 259:
1745-1749.

Generalmente, el polinucleótido se administra en forma de un vector que se ha encapsulado en un liposoma y formulado en una composición de vacuna como se ha descrito anteriormente.

III. Parte Experimental

A continuación se proporcionan ejemplos de realizaciones específicas para realizar la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ningún modo.

Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero debe permitirse, por supuesto, algún error experimental error y desviación.

Materiales y procedimientos Células y expresión transitoria

Se usaron células BSC40 y fibroblastos de chimpancé F503 (Perot y col., J. Gen. Virol. (1992) 73:3281-3284) en experimentos de infección/transfección como se ha descrito previamente (Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113). En resumen, se infectaron monocapas subconfluyentes de células en placas de 60 mm con VV_{T7} (moi = 10) en DME libre de suero. Después de 30-60 minutos, se retiró el inóculo y se remplazó con los moldes de ADNc apropiados clonados en el vector pTM1 (Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747), como se describe a continuación. El ADN del vector se complejó con Lipofectina (BRL) o Lipofectamina (BRL). Después de la transfección durante 2,5-3 horas, se retiró el ADN y las células se privaron durante 30 minutos en DME deficiente de met/cys. Se añadieron aproximadamente 100-200 \muCi de Marcador de Expresión ^{35}S (NEN) a las células durante 3-4 horas. Las células se lisaron en tampón de lisis 1X (NaCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM pH 7,5, EDTA 1 mM, NP40 al 0,5%, desoxicolato al 0,5% y PMSF 100 mM, 0,5 \mug/ml de leupeptina y 2 mg/ml de aprotinina), se almacenaron en hielo durante 10 minutos y se aclararon por centrifugación (15.000 x g durante 5 minutos). Los lisados se inmunoprecipitaron con el anticuerpo designado inmovilizado en Proteína A Sepharose (BioRad).

Moldes del VHC

Todos los moldes de E1 y E2 se generaron por PCR y se confirmaron por secuenciación. Se usó el cebador 5' apropiado que contenía un resto metionina y un sitio Ncol junto con cebadores 3' que tenían un codón de terminación después del punto final de envuelta designado y finalmente, para E1, un sitio BamHI. Ambos oligos tenían secuencias no específicas en los extremos para facilitar digestiones más eficaces con las enzimas NcoI y BamHI. Los fragmentos de PCR digeridos se ligaron en pTM1 digerido con NcoI/BamHI (Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747). El vector pTM1 contiene el promotor T7 y el líder EMC proximal al sitio de clonación NcoI que corresponde con el primer resto met codificado por el ADN designado. Los moldes de E2 se digirieron con NcoI y AscI y se clonaron en NcoI(parcial)/AscI-pTM1-CE2 (Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113) para generar los clones H donde las traducciones comienzan en el aminoácido 1 y codifican el núcleo, E1 y las regiones E2 designadas. Para los polipéptidos E1 truncados, los moldes codificantes comienzan con un resto metionina, seguido de isoleucina y después el aminoácido 172. Para las construcciones de E2 truncadas, se usó la metionina en la posición 364 como el extremo N-terminal en las construcciones. Después de identificar posibles clones y amplificar el ADN, todos se secuenciaron. Se muestras que todos los clones de E1 son correctos por secuenciación. La mayoría de los clones de E2 mostraron la secuencia correcta con la excepción de la pérdida de un único resto leucina dentro de E2. Esta pérdida no influía en las conclusiones ya que no estaba en las cercanías del extremo C-terminal.

Inmunoprecipitaciones

Se realizaron inmunoprecipitaciones en los medios de células transfectadas como se describe en Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113, excepto en que los precipitados se lavaron al menos una vez con tampón de lisis que contenía NaCl 500 mM en lugar de 100 mM. Los precipitados se resuspendieron en tampón de Laemmli, se hirvieron y se analizaron en geles de acrilamida al 12,5% o al 15%. Los geles se potenciaron (Amplify, Amersham), se secaron y se expusieron a la película a -80ºC. Los antisueros usados se describieron previamente en Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113. Se realizaron tratamientos con endo H de los inmunoprecipitados de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Oxford Glycosystems).

Para la inmunoprecipitación de proteínas E1 y E2 secretadas, se microcentrifugaron los medios recogidos de células transfectadas y se inmunoprecipitaron en tubos que contenían anticuerpo monoclonal anti-E1 o anticuerpo policlonal de conejo anti-E2 inmovilizado en proteína G sepharose (Pharmacia) o proteína A sepharose (Sigma), respectivamente. Después de incubación durante una noche a 4ºC, se lavaron los complejos sepharose Ab-Ag con tampón de lisis dos veces, una vez con tampón de lisis que contenía NaCl 500 mM y finalmente con Tris 120 mM, 8,0. Después de que se aspirara todo el líquido, se añadieron aproximadamente 30 \mul de tampón de muestra de Laemmli, las muestras se hirvieron y después se cargaron en un gel de acrilamida al 12,5%. Después de la electroforesis, los geles se fijaron, se amplificaron y se secaron sobre 3MM. Los geles secados se expusieron a la película con una pantalla intensificadora. Se hicieron controles de transfección con un molde para el ADNc de la \beta-galactosidasa (pTM1-\beta-gal).

Secuenciación de NS2B

Se transfectaron células BSC40 con pE2_{1006}, marcado con ^{35}S-met (NEN) y se lisaron con tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasa. Los lisados aclarados se precipitaron con anticuerpo de conejo anti-E2 durante una noche, se lavaron y se analizaron en un gel de acrilamida al 15%. El gel después se transfirió a PVDF en metanol al 20%/tampón de procesamiento 1x durante 2 horas a 50 voltios. Se identificó la región que contenía NS2B por auto-radiografía y se cortó. Se secuenció NS2B mediante degradación de Edmann secuencial en un secuenciador en fase gaseosa Applied Biosystems 470A (Speicher, (1989). Microsequencing with PVDF membranes: Efficient electroblotting, direct protein adsorption and sequencer program modifications. En Techniques in Protein Chemistry. Ed. T.E. Hugli. Academic Press, San Diego, CA. Pág. 24-35.). Se evaporaron las fracciones que contenían cloruro de butilo y se contaron con fluido de centelleo.

Ejemplo 1

Solamente para Referencia

Secreción/Retención de E1

Como se ha explicado anteriormente, se generó una serie de moldes de E1 en pTM1, usando PCR (Figura 5). En particular, se generaron moldes codificantes que comienzan con un resto metionina, seguido de isoleucina y después el aminoácido 172 de la poliproteína del VHC y que continúa hasta el aminoácido 330, y clones de incrementos de 10 aminoácido hasta el aminoácido 380. Los aminoácidos 173 a 191 corresponden al extremo C-terminal del núcleo que aparentemente tiene una tarea como secuencia señal. Se cree que E1 madura comienza en el aminoácido 192 de la poliproteína después de la escisión de la secuencia señal.

Se recuperó material inmuno-reactivo anti-E1 en el medio de células transfectadas con moldes hasta el aminoácido 360. No se detectó E1 en el medio de células transfectadas con clones que terminan en los aminoácidos 370 y 380.

Ejemplo 2 Secreción/Retención de E2

También se generó una serie de moldes de E2 en pTM1, usando PCR (Figura 6). En particular, el primer aminoácido codificante de E2 corresponde a la metionina en la posición 364 y éste se usó como extremo N-terminal en las construcciones. El aminoácido 364 corresponde con el inicio aproximado del péptido señal de E2 (Hijikata y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 5547-5551; Ralston y col., J. Virol. (1993) 67:6753-6761). Se cree que E2 madura comienza con el aminoácido 385. Los extremos C-terminales escalonados variaban del aminoácido 661 al 1006. En particular, los clones terminaban en los aminoácidos 661, 699, 710, 715, 720, 725, 730, 760, 780, 807, 837, 906 y 1006.

Se recuperó material inmuno-reactivo anti-E2 en el medio de células transfectadas con moldes hasta 725. Se detectaron pequeñas cantidades de E2 en el medio transfectado con clones que terminaban en el aminoácido 730. Se detectó poco o nada de E2 en el medio de células transfectadas con clones que terminaban en aminoácidos más allá del 730. La secuencia justo anterior al 730 es bastante hidrófoba, reminiscente de una secuencia de anclaje a membrana. Por tanto, parece que secuencias entre 715 y 730 y que se extienden tanto como aproximadamente el resto aminoacídico 746 (véase, Lin y col., J. Virol. (1994) 68:5063-5073), sirven para anclar E2 al RE, evitando la secreción.

Se hizo una molécula E2 secretada adicional que incluía los aminoácidos 383_{ala} a 715_{lys}. La molécula E2 se expresaba usando un sistema de expresión de células de hámster chino/dihidrofolato reductasa (CHO/DHFR) del siguiente modo. Se generó un fragmento de ADN de E2 del VHC desde el aminoácido 383 hasta el aminoácido 715 del VHC1 por PCR y después se ligó en el vector pMH que incluye el promotor temprano inmediato de citomegalovirus de ratón (MCMV ie) potente y el marcador de selección DH-FR, para dar el plásmido pMHE2-715 (véase la Figura 7). Este plásmido después se introdujo por transfección estable en la línea celular CHO, Dg44, del siguiente modo. Se combinaron 100 \mug de ADN con lipofectina (Gibco-BRL) para la introducción por transfección en 1x10^{7} células en palcas de 10 cm. Las células se transfectaron y se incubaron durante 24 horas en medio no selectivo (mezcla nutriente de Ham F-12, JRH Biosciences serie nº 51, prolina, glutamina y piruvato sódico), después se dejó que se recuperaran durante 24 horas en medio no selectivo suplementado con suero bovino fetal. El medio no selectivo después se remplazó con medio selectivo (mezcla nutriente de Ham F-12, JRH Biosciences serie nº 52, prolina, glutamina, y piruvato sódico) suplementado con suero bovino fetal dializado. El medio se cambió cada 3-4 días hasta que empezaron a formarse colonias.

La línea celular DG44 carece de actividad DHFR endógena. Por tanto, solamente aquellas células transfectadas con el plásmido pMHE2-715 que tiene el gen DHFR pueden crecer y formar colonias en el medio selectivo que carece de hipoxantina, aminopterina y timidina. Se cogieron aproximadamente 2200 colonias y se cultivaron en placas de 96 pocillos. Cuando los clones alcanzaron la confluencia 5 días después, se ensayó el medio para E2 secretada por ELISA usando anticuerpo monoclonal 3E5-1 que se produjo contra un determinante lineal de E2 como anticuerpo de captura y E3 expresado en células CHO y purificado de una columna de afinidad por anticuerpo monoclonal (5E5H7 reactivo para un determinante conformacional de E2) como patrón. Se expandieron los 83 mejores clones de expresión a placas de 24 pocillos. Una vez que se alcanzó la confluencia en las placas de 24 pocillos, se ensayó el medio y después se expandieron los 41 mejores clones a placas de 6 pocillos. Cuando los clones alcanzaron la confluencia, se ensayó el medio y los 21 mejores clones se expandieron a matraces de 75 cm^{2}. En este punto se confirmó la expresión por ELISA y por inmunotinción fluorescente usando el anticuerpo monoclonal 3E5-1. Había 5 clones que tenían un 100% de sus células fluorescentes. En base a ambos ensayos, se eligieron los 3 mejores clones para purificarlos por dilución limitante.

Los 7 mejores clones se combinaron y se sembraron en placas de 10 cm para su cultivo en un intervalo de concentraciones de metotrexato (MTX). El MTX es un inhibidor de DHFR. Entre una población de células cultivadas, los clones variantes que estaban sobre-expresando DHFR eran resistentes al MTX tóxico. Se ha observado que los otros genes del plásmido introducido por transfección en células CHO pueden co-amplificarse con el gen DHFR. Las células que expresaban E2 del VHC se amplificaban en medio selectivo con concentraciones finales de MTX 10, 20, 50, 100, 200 nM. Las colonias crecían solamente en los medios de MTX 10 y 20 nM. Estos 384 clones se cogieron, se expandieron y se comprobaron para la expresión como se hizo anteriormente en la selección inicial. En cultivos adherentes, el mejor clon amplificado tenía un nivel de expresión que era un 31% mayor que el mejor clon no amplificado y era fluorescente al 100%.

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Ejemplo 3

Solamente para Referencia

Co-inmunoprecipitación de E2:E1

E1 inmunoprecipita con E2 usando anticuerpos mono-reactivos contra E2 o E1 (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Lanford y col., Virology (1993) 197: 225-235; Ralston y col., J. Virol. (1993) 67:6753-6761). Esta interacción es muy fuerte ya que resiste la alteración por SDS al 0,5% (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395) o por detergente de elevado contenido salino/no iónico (Ralston y col., J. Virol. (1993) 67:6753-6761; Glazer y Selby, observaciones no publicadas). Para definir la región de E2 importante para esta interacción, se transfectaron células BSC40 con moldes H (núcleo a E2) y se inmunoprecipitaron los lisados radiomarcados con antisuero policlonal de conejo anti-E2. Las especies de E2 codificadas por los moldes que terminaban en el aminoácido 730, 760 y 780 se asociaban con E1. No había diferencia cuantitativa en la co-precipitación de E1 con todos los moldes entre 730 y 1006. En contraste, las especies de E2 codificadas por los moldes 661, 699, 710, 715, 720 y 725 no lograban co-precipitar de forma significativa E1. Como control, se inmunoprecipitaron los mismos lisados con antisuero de paciente LL. Las proteínas E1 de todos los moldes precipitaban claramente con LL; las proteínas E2 precipitaban de forma eficaz con la excepción del molde 661H. Se ha observado de forma coherente una detección relativamente mala de E2_{661}, posiblemente debido a una estructura diferente de esta proteína en comparación con versiones más largas.

Por tanto, las secuencias entre los aminoácidos 715 y 730 son importantes para la asociación eficaz de E1. Parece que la retirada de este anclaje C-terminal impide la asociación que aparece normalmente entre E1 y E2. Sin embargo, cuando se secretan ambas envueltas, parece que existe algo de asociación. Este resultado es opuesto a los datos de secreción con respecto a E2 presentados anteriormente, estableciendo de este modo una relación inversa entre la secreción de E2 y la interacción de E2 con E1.

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Ejemplo 4

Solamente para Referencia

Formación de Complejos de E1 y E2 Truncadas

Para ensayar si las formas truncadas de E1 y E2, producidas anteriormente, eran capaces de asociarse entre sí, se introdujo por co-transfección la construcción que codifica un polipéptido E1, truncado de forma C-terminal en el aminoácido 360, con construcciones que codifican un polipéptido E2, truncado de forma C-terminal en el aminoácido 715 o un polipéptido E2, truncado de forma C-terminal en el aminoácido 725. Las células se transformaron como se ha descrito anteriormente y se recogió el medio. Se observaron claramente complejos de E1/E2 con anticuerpo monoclonal anti-E2 donde se co-precipitaba E1. La precipitación inversa con anticuerpo monoclonal anti-E1 produjo mucha menos E1 en comparación con la precipitación anterior. Se hizo una observación similar en Ralston y col., J. Virol. (1993) 67:6753-6761, con respecto a construcciones no truncadas. Dicha formación de complejo es significativa porque demuestra que las regiones de E1 y E2 importantes para su interacción se retienen, a pesar de la eliminación de todo o parte de los dominios de membrana.

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Ejemplo 5 Múltiples Especies de E2: Estudios con Endo H

Se produjeron tres bandas de E2 por tratamiento con endo F de E2, lo que sugiere que existe más de una especie de E2 aunque los puntos finales sigan estando indefinidos (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395). Además, una banda de elevado peso molecular reactiva antisueros tanto contra E2 como contra NS2 condujo a la especulación de una posible especie E2-NS2 (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei y col., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). Se uso tratamiento con endo H para definir estas tres glicoproteínas E2. La endo H es una desglicosidasa adecuada para estos experimentos ya que se observan glicoproteínas solamente inmaduras, de elevado contenido de manosa en sistemas de expresión transitoria (Spaete et. al., Virology (1992) 188: 819-830; Ralston y col., J. Virol. (1993) 67: 6753-6761). El tratamiento con endo H de proteínas E2 codificadas por moldes E2_{661} a E2_{730} produjo bandas sencillas que aumentaban en tamaño de forma concomitante con los moldes ampliados. Las proteínas E2, tratadas con endo H, codificadas por los moldes E2_{760}, E2_{780} y E2_{807} mostraron una banda adicional que paraba de aumentar de tamaño en el aminoácido 807 en comparación con moldes más largos. Estos datos sugieren que una forma de E2 termina cerca del aminoácido 730. Datos recientes sugieren que E2 puede terminar en aproximadamente el aminoácido 746 (véase, Lin y col., J. Virol. (1994) 68:5063-5073). Parece que una segunda forma de E2 termina cerca de la posición del aminoácido 807. En los moldes E2_{906} y E2_{1006} se observaba una tercera banda que migraba más alta que el doblete previo. Los tamaños de las bandas de estos dos moldes eran coherentes con moléculas E2 que estaban codificadas por los moldes completos. La movilidad de la fusión E2-NS2 en pTM1-HCV estaba ligeramente disminuida con relación a E2_{1006}. Estas observaciones son coherentes con la tercera forma de E2 que acaba de forma co-incidental con la unión NS2/NS3 en el aminoácido 1026 (Grakoui y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:10583-10587).

Se ha identificado que NS2 precede NS3 (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Hijikata y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10773-10777; Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113). Los resultados presentados en este documento y otros informes recientes (Lin y col., J. Virol. (1994) 68: 5063-5073) apoyan el procesamiento diferencial del precursor por el cual extensiones de E2 más allá de los aminoácidos 730-746 representan fusiones de E2 con NS2. Los inventores sugieren tentativamente que la región codificante de la proteína pequeña aproximadamente entre los aminoácidos 730-746 y 807 predicha por los experimentos con endo H corresponde con NS2A mientras que la proteína cadena abajo es NS2B. Esta nomenclatura se basa en la organización similar de proteínas entre los Flaviviridae. Es posible que NS2A no se escinda independientemente de la poliproteína como NS2B y sigue teniendo que determinarse si NS2A es de hecho una proteína no estructural.

Ejemplo 6

Solamente para Referencia

Co-inmunoprecipitación de NS2B:E2 y el extremo N-terminal de NS2B

El suero de paciente LL detectó glicoproteínas E2 y otras dos especies de 14 kDa y 21 kDa a partir de transfecciones con los moldes E2_{906} y E2_{1006}. Esta última especie corresponde con NS2B porque la diferencia en el tamaño se correlaciona perfectamente con la diferencia en las longitudes del molde y se detectó una NS2B de 23 kDa a partir del molde del VHC de longitud completa, pTM1-HCV (Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113). Cuando se usó un anticuerpo anti-E2 para inmunoprecipitar los mismos lisados, NS2B co-precipitó con E2. En estas condiciones E1 también co-inmunoprecipita. Además, también se vieron especies anti-E2 reactivas superiores en precipitaciones con 906, 1006 y pTM1-HCV, que corresponden a fusiones de E2 con NS2A y diferentes longitudes de NS2B.

Usando los diversos moldes de E2, los inventores definieron una región de E2 importante para la co-precipitación de NS2B. Los moldes de E2 que acaban en los aminoácidos 699, 730, 760, 780 y 807 se introdujeron por co-transfección con pTM1-NS25, que codifica los aminoácidos 730 a 3011 (Selby y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113). Se usó pTMI-NS25 ya que se determinó previamente que este molde codificaba NS2 y se requería un molde independiente para la expresión de NS2B para definir secuencias importantes para la interacción E2:NS2B. Anticuerpos anti-E2 inmunoprecipitaban proteínas E2 y también co-precipitaban NS2B (23 kDa) y NS4B probable (27 kDa) de todos los lisados excepto del transfectado con el molde E2_{699}. Como control positivo, se co-precipitó NS2B truncada del molde E2_{1006} con E2. Estos datos demuestran que los aminoácidos 699 a 730 son importantes para la asociación de NS2B y NS4B con E2.

El anticuerpo anti-E2 que co-precipitaba NS2B se creó contra una fusión SOD-E2 que terminaba en el aminoácido 662. Esto excluye la posibilidad de reactividad cruzada con NS2B como una causa para la detección de NS2B. Esta banda de NS2B no estaba glicosilada como se evidencia por su insensibilidad al tratamiento con endo H. Como la co-precipitación de NS2B era con poco fondo y eficaz, esta propiedad de asociación se usó para radio-secuenciar el extremo N-terminal de NS2B. Se analizó el inmunoprecipitado del lisado marcado con ^{35}S-metionina de una transfección con E2_{1006} en un gel de acrilamida al 15% y se transfirió a PVDF para la secuenciación. Usando un resto metionina a 18 aminoácidos del resto 810 como referencia, se identificó el extremo amino de NS2B como el aminoácido 810. Esta asignación está de acuerdo con el extremo C-terminal de E2 predicho en base al patrón de endo H de los moldes de deleción de E2 y confirma los sitios de escisión recientemente presentados por Grakoui y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:10583-10587 y Mizushima y col., J. Virol. (1994) 68:2731-27341994. Se predice que los presuntos extremos de NS2A residen en los aminoácidos 730 y 809 si existe en forma de una proteína independiente.

Claims (3)

1. Un procedimiento para producir un polipéptido del VHC secretado, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una población de células huésped de mamífero o levaduras, en la que dichas células huésped se transforman con un vector recombinante que comprende:

i)

un polinucleótido que comprende una secuencia codificante del polipéptido E2 del virus de la hepatitis C (VHC), en el que dicho polipéptido carece de una parte de su extremo C-terminal que comienza en el resto aminoacídico 715, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1 dada en Fig. 4; y

ii)

elementos de control que están unidos de forma funcional a dicha secuencia codificante por los cuales dicha secuencia codificante puede transcribirse y traducirse en una célula huésped; y

(b) cultivar dicha población de células en condiciones por las cuales dicho polipéptido del VHC se expresa y secreta.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido que comprende una secuencia codificante del polipéptido E2 del virus de la hepatitis C (VHC) codifica un fragmento de E2 del VHC desde el resto aminoacídico 383 hasta el resto aminoacídico 715, numerados con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1 dada en la Fig. 4.

3. El polipéptido del VHC producido de acuerdo con el procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2.