ES2316920T3 - Popipeptido truncado e2 de hepatitis c y procedimientos para obtener el mismo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir un polipéptido del VHC secretado, comprendiendo dicho procedimiento: (a) proporcionar una población de células huésped de mamífero o levaduras, en la que dichas células huésped se transforman con un vector recombinante que comprende: i) un polinucleótido que comprende una secuencia codificante del polipéptido E2 del virus de la hepatitis C (VHC), en el que dicho polipéptido carece de una parte de su extremo C-terminal que comienza en el resto aminoacídico 715, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1 dada en Fig. 4; y ii) elementos de control que están unidos de forma funcional a dicha secuencia codificante por los cuales dicha secuencia codificante puede transcribirse y traducirse en una célula huésped; y (b) cultivar dicha población de células en condiciones por las cuales dicho polipéptido del VHC se expresa y secreta.
Description
Polipéptido truncado E2 de hepatitis C y
procedimientos para obtener el mismo.
La presente invención se refiere en líneas
generales a las proteínas virales. En particular, la invención se
refiere a formas truncadas, secretadas de las proteínas E1 y E2 del
virus de la hepatitis C y el aislamiento y producción recombinante
de las mismas.
El virus de la hepatitis C (VHC) es la causa
principal de hepatitis no A, no B parenteral que se transmite en
gran medida a través de transfusión de sangre y contacto sexual. El
virus está presente en entre el 0,4 y el 2,0% de los donantes de
sangre. Se desarrolla hepatitis crónica en aproximadamente el 50% de
las infecciones y de éstas, aproximadamente el 20% de los
individuos infectados desarrollan cirrosis hepática que a veces
conduce a carcinoma hepatocelular. Por consiguiente, el estudio y
control de la enfermedad es de importancia médica.
La secuencia genómica viral del VHC es conocida,
ya que hay procedimientos para obtener la secuencia. Véanse, por
ejemplo, las Publicaciones Internacionales Nº WO 89/04669; WO
90/11089; y WO 90/14436. En particular, el VHC tiene un genoma de
ARN monocatenario con sentido positivo de 9,5 y es un miembro de la
familia Flaviridae de virus. Actualmente, hay 6 genotipos
distintos, pero relacionados del VHC en base a análisis
filogenéticos (Simmonds y col., J. Gen. Virol. (1993)
74:2391-2399). El virus codifica una única
poliproteína que tiene más de 3000 restos aminoacídicos (Choo y
col., Science (1989) 244:359-362; Choo y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)
88:1711-1715). La poliproteína es procesa de forma
co- y post-traduccional en proteínas tanto
estructurales como no estructurales (NS).
En particular, hay tres proteínas estructurales
putativas, constituidas por la proteína de nucleocápsida
N-terminal (llamada "núcleo") y dos
glicoproteínas de envuelta, "E1" (también conocida como E) y
"E2" (también conocida como E2/NS1). (Véase, Houghton y col.,
Hepatology (1991) 14:381-388, para un análisis de
las proteínas del VHC, incluyendo E1 y E2.) E1 se detecta como una
especie de 32-35 kDa y se convierte en un única
banda sensible a endo H de aproximadamente 18 kDa. Por en
contrario, E2 presenta un patrón complejo después de
inmunoprecipitación coherente con la generación de múltiples
especies (Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:
1385-1395; Tomei y col., J. Virol. (1993)
67:4017-4026.). Las glicoproteínas de envuelta del
VHC E1 y E2 forman un complejo estable que se puede
co-inmunoprecipitar (Grakoui y col., J. Virol.
(1993) 67:1385-1395; Lanford y col., Virology
(1993) 197:225-235; Ralston y col., J. Virol. (1993)
67: 6753-6761). Las glicoproteínas E1 y E2 del VHC
son de considerable interés porque han demostrado se protectoras en
estudios de primates. (Choo y col., Proc. Nacl. Acad. Sci. USA
(1994) 91:1294-1298).
La envuelta del virión VHC sigue sin
caracterizar. Por tanto, los estudios de expresión usando moldes de
ADNc recombinante son el único medio actualmente disponible para
estudiar la biosíntesis de la envuelta. E1 y E2 se retienen dentro
de las células y carecen de carbohidratos complejos cuando se
expresan de forma estable o en un sistema de virus Vaccinia
transitorio (Spaete y col., Virology (1992)
188:819-830; Ralston y col., J. Virol. (1993)
67:6753-6761). Como las proteínas E1 y E2 están
normalmente unidas a membrana en estos sistemas de expresión, sería
deseable producir formas secretadas para facilitar la purificación
de las proteínas para uso adicional.
Se ha descubierto que la retirada del dominio
transmembrana de las glicoproteínas de la superficie celular
virales del virus de la influenza (Sveda, y col., Cell (1982)
30:649-656; Geting y Sambrook, Nature (1982)
300:598-603) y el virus de la estomatitis vesicular
(Rose y Bergmann, Cell (1982) 30:753-762) provoca la
secreción de la glicoproteína truncada desde células huésped de
mamífero. Véase también la Publicación EPO Nº 139.417. Asimismo, se
secreta gH de citomegalovirus truncada cuando se expresa en células
de baculovirus (Publicación Internacional Nº WO 92/02628, publicada
el 20 de febrero de 1992). Se ha descrito una molécula E2 del VHC
truncada de forma C-terminal, capaz de secretarse
desde células de mamífero. Spaete y col., Virology (1992) 188:
819-830. Se conoce una molécula E2 truncada de forma
C-terminal que carece de una parte desde el resto
717 a partir de Langford y col., Virology (1993) 197:
225-235. Esta proteína no se secreta desde células
de insecto Sf 9. Sin embargo, la región de anclaje transmembrana de
E1 hasta ahora no se ha dilucidado y por tanto la producción de
formas truncadas de E1 del VHC para la secreción no se ha descrito
previamente. Además, no se han descrito previamente complejos de
polipéptidos E1 y E2 truncados, secretados.
La presente invención se basa en la dilucidación
de la secuencia de E2 importante para el anclaje de proteínas al
retículo endoplasmático (RE) y para la
co-precipitación de E2 con E1. Por tanto, la
eliminación de estas secuencias sirve para producir formas
truncadas de las glicoproteínas que se secretan en lugar de
retenerse en la membrana del RE. Además, el truncamiento facilita
la purificación de la proteína E2 sin E1 asociada, y viceversa. La
proteína E2 truncada, cuando se expresa junto con E1 o combinada
después de la expresión, es capaz de formar un complejo.
Por consiguiente, en este documento se describe
para referencia un polipéptido E1 del VHC, que carece de todo o una
parte de su dominio de membrana de modo que el polipéptido sea capaz
de secreción en medio de cultivo cuando se expresa de forma
recombinante en una célula huésped. El polipéptido E1 del VHC carece
de al menos una parte de su extremo C-terminal
comenzando en o cerca de aproximadamente el aminoácido 370 o
aproximadamente el aminoácido 360, numerados con referencia a la
secuencia de aminoácidos de E1 del VHC1.
En una realización, la invención se refiere a un
polipéptido E2 del VHC que carece de al menos una parte de su
dominio de membrana de modo que el polipéptido sea capaz de
secreción en medio de cultivo cuando se expresa de forma
recombinante en una célula huésped, en la que el polipéptido carece
de al menos una parte de su extremo C-terminal
comenzando en el resto aminoacídico 715, numerado con referencia a
la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1. También se describe en
este documento el polipéptido E2 del VHC que carece de al menos una
parte de su extremo C-terminal comenzando en
aproximadamente el aminoácido 725, numerado con referencia a la
secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1.
También se describen en este documento
polinucleótidos que codifican los anteriores polipéptidos, vectores
que comprenden estos polinucleótidos, células huésped transformadas
con los vectores y procedimientos para producir de forma
recombinante los polipéptidos.
También se describe en este documento un
complejo de E1 secretada/E2 secretada que comprende:
(a) un polipéptido E1 del VHC, que carece de
todo o una parte de su dominio de membrana de modo que el
polipéptido E1 sea capaz de secreción en medio de cultivo cuando se
expresa de forma recombinante en una célula huésped; y
(b) un polipéptido E2 del VHC, que carece de
todo o una parte de su dominio de membrana de modo que dicho
polipéptido E2 sea capaz de secreción en medio de cultivo cuando se
expresa de forma recombinante en una célula huésped.
El complejo de E1 secretada/E2 secretada incluye
un polipéptido E1 que carece de al menos una parte de su extremo
C-terminal comenzando en aproximadamente el
aminoácido 360 ó 370, numerado con referencia a la secuencia de
aminoácidos de E1 del VHC1, y dicho polipéptido E2 carece de al
menos una parte de su extremo C-terminal comenzando
en aproximadamente el aminoácido 725 ó 730, numerado con referencia
a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1.
También se describen en este documento
composiciones de vacuna que comprenden los polipéptidos E1 y/o E2
del VHC truncados y/o complejos de los polipéptidos E1 y E2.
La Figura 1 es un esquema de la región E1 del
VHC1.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
y la secuencia de aminoácidos correspondiente para E1 del VHC1,
incluyendo la secuencia señal N-terminal y el
dominio de anclaje a membrana C-terminal.
La Figura 3 es un esquema de la región E2 del
VHC1.
Las Figuras 4A-4C muestran la
secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos
correspondiente para la región E2/NS2 del VHC1, incluyendo la
secuencia señal N-terminal de E2 y el dominio de
anclaje a membrana C-terminal de E2.
La Figura 5 representa los moldes de ADNc de E1
del VHC usados para transfección en los Ejemplos. La región del
núcleo a NS2 se muestra en la parte superior y está dibujada a
escala; desde NS3 distal hasta NS5 no está dibujado a escala. La
región E1 se ha expandido para representar mejor los moldes usados.
Los números a la derecha se refieren al punto final de aminoácido
usado en cada molde.
La Figura 6 representa los moldes de ADNc de E2
del VHC usados para transfección en los Ejemplos. La región del
núcleo a NS2 se muestra en la parte superior y está dibujada a
escala; desde NS3 distal hasta NS5 no está dibujado a escala. La
región E2/NS2 se ha expandido para representar mejor los moldes
usados. La columna a la izquierda se refiere al punto final de
aminoácido usado en cada molde.
La Figura 7 representa el plásmido
pMHE2-715, que contiene un gen que codifica una
proteína E2 truncada que tiene los aminoácidos
383-715 del VHC1. También presente en el vector está
el origen de replicación de SV40, el promotor temprano inmediato de
citomegalovirus de ratón (MCMV ie), un líder tpa, la señal de
poliadenilación de SV40 y el ADNc de DH-FR para la
selección.
\newpage
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de
virología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN
recombinante dentro de la experiencia habitual de la técnica.
Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase,
por ejemplo, Sambrook, y col. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2a Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol.
I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed.,
1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds.,
1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds.,
1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A
Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Fundamental Virology,
2a Edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.)
Como se usa en esta memoria descriptiva y las
reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un",
"una" y "el", "la" incluyen referencias plurales
salvo que el contenido indique claramente otra cosa.
Al describir la presente invención, se emplearán
los siguientes términos, y se pretende que estén definidos como se
indica a continuación.
Por un "polipéptido E1" se entiende una
molécula derivada de una región E1 del VHC. Dicha molécula puede
obtenerse físicamente de la región o producirse de forma
recombinante o de forma sintética, en base a la secuencia conocida.
La región E1 madura del VHC1 comienza en aproximadamente el
aminoácidos 192 de la poliproteína y continúa hasta aproximadamente
el aminoácido 383 (véanse las Figuras 1 y 2). Los aminoácidos en
aproximadamente 173 a aproximadamente 191 sirven como secuencia
señal para E1. Por tanto, por un "polipéptido E1" se entiende
una proteína E1 precursora, incluyendo la secuencia señal, o un
polipéptido E1 maduro que carece de esta secuencia, o incluso un
polipéptido E1 con una secuencia señal heteróloga. Además, como se
dilucida en este documento, el polipéptido E1 incluye una secuencia
de anclaje a membrana C-terminal que existe en
aproximadamente las posiciones de aminoácidos
360-383.
Por un "polipéptido E2" se entiende una
molécula derivada de una región E2 del VHC. Dicha molécula puede
obtenerse físicamente de la región o producirse de forma
recombinante o de forma sintética, en base a la secuencia conocida.
Se cree que la región E2 madura del VHC1 comienza en aproximadamente
el aminoácido 384-385 (véanse las Figuras 3 y
4A-4C). Un péptido señal comienza en aproximadamente
el aminoácido 364 de la poliproteína. Por tanto, por un
"polipéptido E2" se entiende una proteína E2 precursora,
incluyendo la secuencia señal, o un polipéptido E2 maduro que
carece de esta secuencia, o incluso un polipéptido E1 con una
secuencia señal heteróloga. Además, como dilucida en este
documento, el polipéptido E2 incluye una secuencia de anclaje a
membrana C-terminal que existe en aproximadamente
las posiciones de aminoácidos 715-730 y puede
extenderse tanto como aproximadamente el resto aminoacídico 746
(véase, Lin y col., J. Virol. (1994)
68:5063-5073).
Las regiones E1 y E2 representativas del VHC1 se
muestran en las Figuras 2 y 4A-4C,
respectivamente. Para propósitos de la presente invención, las
regiones E1 y E2 se definen con respecto a los números de
aminoácidos de la poliproteína codificada por el genoma del VHC1,
estando designada la metionina de inicio como posición 1. Sin
embargo, debe apreciarse que el término "polipéptido E1" o
"polipéptido E2" como se usa en este documento no se limita a
la secuencia del VHC1. A este respecto, las regiones E1 o E2
correspondientes en otro aislado del VHC pueden determinarse
fácilmente alineando secuencias de los dos aislados de un modo que
ponga las secuencias en alineación máxima. Esto puede realizarse
con cualquiera de varios paquetes de software informático, tales
como ALIGN 1.0, disponible en la University of Virginia, Department
of Biochemistry (Att: Dr. William R. Pearson). Véase, Pearson y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:
2444-2448.
Además, un "polipéptido E1" o un
"polipéptido E2" como se define en este documento no se limita
a un polipéptido que tiene la secuencia exacta representada en las
Figuras. De hecho, el genoma del VHC está en un estado de flujo
constante y contiene varios dominios variables que muestran grados
relativamente elevados de variabilidad entre aislados. Como llegará
a ser evidente en este documento, todo lo que es importante es que
la región que sirve para anclar el polipéptido al retículo
endoplasmático se identifique de modo que el polipéptido pueda
modificarse para retirar todo o parte de esta secuencia para
secreción. Es muy evidente que los términos abarcan polipéptidos E1
y E2 de cualquiera de los diversos aislados del VHC incluyendo
aislados que tienen cualquiera de los 6 genotipos del VHC descritos
en Simmonds y col., J. Gen. Virol. (1993)
74:2391-2399). Además, el término abarca cualquiera
de dichas proteínas E1 o E2 independientemente del procedimiento de
producción, incluyendo aquellas proteínas producidas de forma
recombinante y de forma sintética.
Además, los términos "polipéptido E1" y
"polipéptido E2" abarcan proteínas que incluyen modificaciones
adicionales a la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones
y sustituciones internas adicionales (generalmente de naturaleza
conservativa). Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a
través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales,
tales como a través de acontecimientos mutaciones que suceden de
forma natural. Todas estas modificaciones están incluidas en la
presente invención siempre que los polipéptidos E1 y E2 funcionen
para su propósito pretendido. Por tanto, por ejemplo, si los
polipéptidos E1 y/o E2 son para usarlos en composiciones de vacuna,
las modificaciones deben ser tales que la actividad inmunológica
(es decir, la capacidad de provocar una respuesta de anticuerpos
contra el polipéptido) no se pierda. Asimismo, si los polipéptidos
son para usarlos para propósitos de diagnóstico, dicha capacidad
debe retenerse.
Un polipéptido E1 o E2 "que carece de todo o
una parte de su dominio de membrana" es un polipéptido E1 o E2,
respectivamente, como se ha definido anteriormente, que está
truncado de forma C-terminal para delecionar todo
o una parte de la secuencia de anclaje a membrana que funciona para
asociar el polipéptido al retículo endoplasmático. Dicho
polipéptido es, por lo tanto, capaz de secreción en medio de cultivo
en que se cultiva un organismo que expresa la proteína. El
polipéptido truncado solamente necesita carecer de toda la secuencia
de anclaje a membrana necesaria para realizar la secreción. La
secreción en medios de cultivo se determina fácilmente usando
varias técnicas de detección, incluyendo, por ejemplo,
electroforesis en gel de poliacrilamida y similares y técnicas
inmunológicas tales como ensayos de inmunoprecipitación que se
describen en los ejemplos. Con E1, generalmente se retendrán
polipéptidos que terminan con aproximadamente la posición del
aminoácido 370 y superior (en base a la numeración de E1 del VHC1)
por el RE y por tanto no se secretarán en los medios de cultivo.
Con E2, se retendrán polipéptidos que terminan con aproximadamente
la posición del aminoácido 731 y superior (también en base a la
numeración de la secuencia de E2 del VHC1) por el RE y no se
secretarán. Debe observarse que estas posiciones de aminoácidos no
son absolutas y pueden variar en algún grado.
Aunque no se han ejemplificado todos los
truncamientos C-terminales posibles, debe entenderse
que truncamientos intermedios, tales como por ejemplo, polipéptidos
E1 que acaban en los aminoácidos 351, 352, 353 y más, o
polipéptidos E2 que acaban en por ejemplo los aminoácidos 716, 717,
718 y más, también se incluyen por la presente invención. Por
tanto, se pretende que todos los polipéptidos E1, que terminan en
aproximadamente los aminoácidos 369 e inferiores, y todos los
polipéptidos E2, que terminan en aproximadamente los aminoácidos
730 e inferiores, que son capaces de secreción en medio de cultivo
cuando se expresan de forma recombinante, estén recogidos en este
documento.
Además, el truncamiento
C-terminal puede extenderse más allá del dominio
transmembrana hacia el extremo N-terminal. Por
tanto, por ejemplo, truncamientos en E1 que existen en posiciones
inferiores a, por ejemplo, 360 y truncamientos en E2 que existen en
posiciones inferiores a, por ejemplo, 715, también se incluyen por
la presente invención. Todo lo que es necesario es que los
polipéptidos E1 y E2 truncados se secreten y sigan siendo
funcionales para su propósito pretendido. Sin embargo, las
construcciones de E2 particularmente preferidas serán aquellas con
truncamientos C-terminales que no se extiendan más
allá de la posición del aminoácido 699.
Un "complejo de E1 secretada/E2 secretada"
se refiere a un complejo de las proteínas E1 y E2, cada una de las
cuales carece de todo o una parte del dominio de membrana, como se
ha descrito anteriormente. El modo de asociación de E1 y E2 en
dicho complejo es inmaterial. De hecho, dicho complejo puede
formarse de forma espontánea simplemente mezclando las proteínas E1
y E2 secretadas que se han producido individualmente. Asimismo,
cuando se co-expresan, las proteínas E1 secretada y
E2 secretada pueden formar un complejo espontáneamente en el medio.
La formación de un "complejo de E1 secretada/E2 secretada" se
determina fácilmente usando técnicas de detección de proteínas
convencionales tales como electroforesis en gel de poliacrilamida y
técnicas inmunológicas tales como inmunoprecipitación.
Dos polinucleótidos o moléculas proteicas son
"sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente el
40-50%, preferiblemente al menos aproximadamente el
70-80%, y mucho más preferiblemente al menos
aproximadamente el 85-95%, de los nucleótidos o
aminoácidos de las moléculas coinciden en una longitud definida de
la molécula. Como se usa en este documento, sustancialmente
homólogas también se refiere a moléculas que tienen secuencias que
muestran identidad con la molécula de ácido nucleico o proteica
especificada. Las moléculas de ácido nucleico que son
sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de
hibridación de Southern en, por ejemplo, condiciones rigurosas,
definidas para ese sistema particular. La definición de condiciones
de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia habitual de
la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., supra; DNA
Cloning, vol. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization,
supra.
Una proteína o polipéptido "asilado" es una
proteína que es diferente y concreta de un organismo completo con
que la proteína está normalmente asociada en la naturaleza. Por
tanto, una proteína contenida en un extracto libre de células
constituiría una proteína "aislada", como lo sería una proteína
producida de forma sintética o de forma recombinante. Asimismo, un
polinucleótido "aislado" es una molécula de ácido nucleico
diferente y concreta del organismo completo con que la secuencia se
encuentra en la naturaleza; o una secuencia desprovista, por
completo o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en
la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero
que tiene secuencias heterólogas (como se define a continuación) en
asociación con la
misma.
misma.
Una "secuencia codificante" o una secuencia
que "codifica" una proteína seleccionada, es una secuencia de
ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce
(en el caso de ARNm) en un polipéptido in vitro o in
vivo cuando se coloca bajo en control de secuencias reguladoras
apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan
por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada
de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia
codificante puede incluir, aunque sin limitación ADNc de secuencias
de nucleótidos virales así como secuencias de ADN sintético. Una
secuencia de terminación de la transcripción puede localizarse 3' a
la secuencia codificante.
Un "polinucleótido" puede incluir, aunque
sin limitación, secuencias virales, secuencias procariotas, ARN
viral, ARNm eucariota, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN
genómico de ADN eucariota (por ejemplo, de mamífero), e incluso
secuencias de ADN sintético. El término también recoge secuencias
que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y
ARN tales como, aunque sin limitación
4-acetilcitosina,
8-hidroxi-N6-metiladenosina,
aziridinilcitosina, pseudoisocitosina,
5-(carboxihidroxilmetil)uracilo,
5-fluorouracilo, 5-bromouracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo,
5-carboximetil-aminometiluracilo,
dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina,
1-metiladenina,
1-metilpseudouracilo,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina,
3-metilcitosina, 5-metilcitosina,
N6-metiladenina, 7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarbonilmetiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
N-uracil-5-oxiacético,
ácido uracil-5-oxiacético,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y
2,6-diaminopurina.
"Elementos de control" se refiere
colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma,
señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la
transcripción, dominios reguladores cadena arriba, potenciadores, y
similares, que proporcionan colectivamente la transcripción y la
traducción de una secuencia codificante en una célula huésped. No
todos estos elementos de control siempre tienen que estar presentes
en un vector recombinante siempre que el gen deseado sea capaz de
transcribirse y traducirse.
Un elemento de control "dirige la
transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando
la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora y transcribe la
secuencia codificante en ARNm, que después se traduce en el
polipéptido codificado por la secuencia codificante.
"Unido de forma funcional" se refiere a una
disposición de elementos en la que los componentes descritos están
configurados para realizar su función habitual. Por tanto, los
elementos de control unidos de forma funcional a una secuencia
codificante son capaces de realizar la expresión de la secuencia
codificante cuando la ARN polimerasa está presente. Los elementos
de control no tienen que estar contiguos con la secuencia
codificante, siempre que funcionen dirigiendo la expresión de la
misma. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias
transcritas aún no traducidas intermedias entre, por ejemplo, una
secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia
promotora aún puede considerarse "unida de forma funcional" a
la secuencia codificante.
"Recombinante" como se usa en este
documento para describir una molécula de ácido nucleico significa un
polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintetico, o sintético
que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado
con todo o una parte del polinucleótido con que está asociado en la
naturaleza; y/o (2) está unido a un polinucleótido diferente de con
el que está unido en la naturaleza. El término "recombinante"
como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un
polipéptido producido por expresión de un polinucleótido
recombinante. "Células huésped recombinantes", "células
huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos
celulares", y otros de dichos términos que indican
microorganismos procariotas o líneas celulares eucariotas
cultivadas como entidades unicelulares, se usan de forma
intercambiable, y se refieren a células que pueden usarse, o se han
usado, como destinatarias de vectores recombinantes u otro ADN de
transferencia, e incluyen la descendencia de la célula original que
se ha transfectado. Se entiende que la descendencia de una única
célula precursora puede no ser necesariamente idéntica completamente
en morfología o en el complemento de ADN genómico o total al
precursor original, debido a mutación accidental o deliberada. La
descendencia de la célula precursora que es suficientemente similar
al precursor a caracterizar por la propiedad pertinente, tal como
la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido
deseado, se incluye en la descendencia pretendida para esta
definición, y está cubierta por los anteriores términos.
Un "vector" es un replicón en que está
unido un segmento polinucleotídico heterólogo, para provocar la
replicación y/o expresión del segmento unido, tal como un plásmido,
transposón, fago, etc.
Por "sujeto vertebrado" se entiende
cualquier miembro del subfilo cordados, incluyendo, sin limitación,
seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos
tales como chimpancés y otros simios y especies de monos; animales
de granja tales como vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos;
mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de
laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas;
aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como
gallinas, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y
similares. El término no indica una edad particular. Por tanto, se
pretende que estén cubiertos individuos tanto adultos como recién
nacidos. El sistema descrito anteriormente está pretendido para su
uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores, ya que
los sistemas inmunes de todos estos vertebrados funcionan de forma
similar.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de nuevos polipéptidos E2 que están truncados de
forma C-terminal de modo que sean capaces de
secreción en medio de cultivo cuando se producen de forma
recombinante en una célula huésped. Los polipéptidos secretados
también son sorprendentemente capaces de formar complejos con
polipéptidos E1. Esta interacción es inesperada ya que, como se
muestra en este documento, la capacidad de E1 y E2 de
co-precipitar se pierde después de la eliminación
del dominio de membrana.
En particular, el análisis de transfecciones
transitorias de moldes prolongados en serie que cubren la región
E2/NS2 proporcionó evidencias de tres especies de E2 con distintos
extremos C-terminales. Una forma era E2
que terminaba en el aminoácido 729 mientras que las dos especies más
grandes representaban fusiones con las proteínas NS2A y NS2A/NS2B
cadena abajo que terminan en los aminoácidos 809 y 1026,
respectivamente. Usando los mismos moldes de E2, se ha definido una
región de E2 importante para la
co-inmunoprecipitación de E1 que también evita la
secreción de E2. Asimismo, se identificó un dominio de membrana de
E1.
Más específicamente, se ha identificado un
dominio de membrana que supuestamente sirve para anclar E1 a la
membrana del RE, en aproximadamente las posiciones de los
aminoácidos 360-383. Se han construido varios
polipéptidos E1 truncados de forma C-terminal, que
carecen de partes de este dominio de membrana. (Véase la Figura 5).
Se ha descubierto que polipéptidos E1, que codifican en las
posiciones del aminoácido 370 y superiores, no se secretan en medio
de cultivo cuando se expresan de forma recombinante.
Asimismo, se ha expresado de forma recombinante
una serie de moléculas E2 que incluyen truncamientos
C-terminales como se representa en la Figura 6, y
se han ensayado los medios de cultivos de células transformadas para
la presencia de los polipéptidos E2 para determinar qué
construcciones truncadas son capaces de secreción. Se ha
descubierto que moléculas que acaban en las posiciones de
aminoácidos superiores a 730, no se secretan en medio de
crecimiento y supuestamente se retienen en la membrana del RE. (Debe
apreciarse que se observa una pequeña cantidad de secreción con
construcciones que terminan en la posición del aminoácido 730). Se
ha encontrado una relación inversa entre la secreción de E2 y su
asociación con E1. Por tanto, los polipéptidos E2 que se pueden
secretar no co-precipitan con E1 de lisados mientras
que aquellos que no se secretan, sí.
Sin embargo, sorprendentemente, cuando se
co-expresan formas secretadas de polipéptidos E1 y
E2, los polipéptidos secretados son capaces de formar un complejo,
detectable usando anticuerpos contra E1 o E2. Dicha formación de
complejo es significativa ya que se demuestra que las regiones de E1
y E2 que son importantes para su interacción se retienen a pesar de
la eliminación de los anclajes a membrana
C-terminales.
Estos descubrimientos proporcionan
procedimientos eficaces para purificar E1, E2 y complejos de E1/E2
secretados, para su uso futuro. En particular, las proteínas
secretadas se purifican más fácilmente que proteínas expresadas de
forma intracelular. Asimismo, ya que como se ha descrito
anteriormente, se sabe que las proteínas E1 y E2 nativas forman un
complejo, la invención descrita en este documento proporciona un
procedimiento para obtener E1 o E2 libre de la otra proteína.
Además, si se desea un complejo de E1/E2, las proteínas secretadas
pueden co-expresarse o mezclarse juntas (en medio
de cultivo o en forma purificada o semipurificada), para la
formación espontánea del complejo.
Los polipéptidos E1 y E2 truncados pueden
producirse usando una diversidad de técnicas. Por ejemplo, los
polipéptidos pueden generarse usando técnicas recombinantes, bien
conocidas en la técnica. A este respecto, pueden inventarse sondas
oligonucleotídicas en base a las secuencias conocidas del genoma del
VHC y usarse para sondear bibliotecas genómicas o de ADNc para los
genes E1 y E2. Los genes después pueden aislarse adicionalmente
usando técnicas convencionales y, por ejemplo, enzimas de
restricción empleadas para truncar el gen en posiciones deseadas de
la secuencia de longitud completa. Asimismo, los genes E1 y E2
pueden aislarse directamente de células y tejidos que los
contienen, usando técnicas conocidas, tales como extracción con
fenol y la secuencia se puede manipular adicionalmente para
producir los truncamientos deseados. Véase, por ejemplo, Sambrook y
col., supra, para una descripción de técnicas usadas para
obtener y aislar ADN. Finalmente, los genes que codifican los
polipéptidos E1 y E2 truncados pueden producirse de forma sintética,
en base a las secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos
puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de
aminoácidos deseada particular. En general, se seleccionarán
codines preferidos para el huésped pretendido en que se expresará
la secuencia. La secuencia completa generalmente se ensambla a
partir de oligonucleótidos solapantes preparados por procedimientos
convencionales y se ensamblan en una secuencia codificante completa.
Véase, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair y col.
(1984) Science 223:1299; Jay y col. (1984) J. Biol. Chem.
259:6311.
Una vez que se han aislado o sintetizado las
secuencias codificantes para las proteínas deseadas, pueden clonarse
en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión. Los
especialistas en la técnica conocen numerosos vectores de
clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es un
asunto de elección. Los ejemplos de vectores de ADN recombinante
para clonación y células huésped que pueden transformar incluyen el
bacteriófago \lambda (E. coli), pBR322 (E. coli),
pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias
gram-negativas), pGV1106 (bacterias
gram-negativas), pLAFR1 (bacterias
gram-negativas), pME290 (bacterias
gram-negativas no E. coli), pHV14 (E.
coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pU61
(Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIpS
(Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del
papiloma bovino (células de mamífero). Véase, en líneas generales,
DNA Cloning: Vol. I y II, supra; Sambrook y col.,
supra; B. Perbal, supra.
También pueden usarse sistemas de expresión de
células de insecto, tales como sistemas de baculovirus, y son
conocidos para los especialistas en la técnica y se describen en,
por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment
Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y
procedimientos para sistemas de expresión de baculovirus/células de
insecto están disponibles en el mercado en forma de kit en, inter
alia, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac").
Los sistemas virales, tales como un sistema de
infección/transfección basado en vaccinia, como se describe en
Tomei y col., J. Virol. (1993) 67:4017-4026 y Selby
y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113, también
encuentran uso con la presente invención. En este sistema, las
células primero se transfectan in vitro con un virus
vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa del
bacteriófago T7. Esta polimerasa presenta una especificidad
exquisita porque solamente transcribe moldes que contengan
promotores T7. Después de la infección, las células se transfectan
con el ADN de interés, dirigido por un promotor T7. La polimerasa
expresada en el citoplasma del virus vaccinia recombinante
transcribe el ADN introducido por transfección en ARN que después
se traduce en la proteína por la maquinaria de traducción del
huésped. El procedimiento proporciona una producción
citoplasmática, transitoria, de elevado nivel de grandes cantidades
de ARN y su(s) producto(s) de traducción.
El gen puede colocarse bajo el control de un
promotor, sitio de unión al ribosoma (para expresión bacteriana) y,
opcionalmente, un operador (colectivamente mencionados en este
documento como elementos de "control"), de modo que la
secuencia de ADN que codifica el polipéptido E1 o E2 deseado se
transcriba en ARN en la célula huésped transformada por un vector
que contiene esta construcción de expresión. La secuencia
codificante puede contener o no un péptido señal o secuencia líder.
Con la presente invención, pueden usarse tanto péptidos señal de
origen natural como secuencias heterólogas. Las secuencias líder
pueden retirarse por el huésped en el procesamiento
post-traduccional. Véanse, por ejemplo, las Patentes
de Estados Unidos Nº 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.
También pueden ser deseables otras secuencias
reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las
secuencias proteicas con relación al crecimiento de la célula
huésped. Dichas secuencias reguladoras son conocidas para los
especialistas en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellas que
causan la expresión de un gen a activarse o desactivarse en
respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de
un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos
de elementos reguladores en el vector, por ejemplo, secuencias
potenciadoras.
Las secuencias de control y otras secuencias
reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificante antes de la
inserción en un vector, tal como los vectores de clonación descritos
anteriormente. Como alternativa, la secuencia codificante puede
clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las
secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.
En algunos casos puede ser necesario modificar
la secuencia codificante de modo que pueda unirse a las secuencias
de control con la orientación apropiada; es decir, para mantener la
fase de lectura apropiada. También puede ser deseable producir
mutantes o análogos de la proteína E1 o E2. Los mutantes o análogos
pueden prepararse por deleción de una parte de la secuencia que
codifica la proteína, por inserción de una secuencia, y/o por
sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las
técnicas para modificar secuencias de nucleótidos, tales como
mutagénesis dirigida al sitio, son bien conocidas para los
especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col.,
supra; DNA Cloning, Vol. I y II, supra; Nucleic Acid
Hybridization, supra.
El vector de expresión después se usa para
transformar una célula huésped apropiada. Se conocen en la técnica
varias líneas celulares de mamífero e incluyen líneas celulares
inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection
(ATCC), tales como, aunque sin limitación, células de ovario de
hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de
hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma
hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovino
Madin-Darby ("MDBK"), así como otras.
Asimismo, se encontrará uso de huéspedes bacterianos tales como
E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp., con
las presentes construcciones de expresión. Los huéspedes de
levaduras útiles en la presente invención incluyen inter alia,
Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa,
Hansenula polimorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis,
Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces
pombe y Yarrowia lipolitica. Las células de insecto para
su uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, inter
alia, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila
melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni.
Dependiendo del sistema de expresión y el huésped seleccionado, las
proteínas de la presente invención se producen cultivando células
huésped transformadas por un vector de expresión descrito
anteriormente en condiciones por las cuales se expresa la proteína
de interés. La proteína después se aísla de las células huésped y
se purifica. Como la presente invención proporciona la secreción de
los polipéptidos E1 y E2, las proteínas puede purificarse
directamente de los medios. La selección de las condiciones de
cultivo apropiadas y los procedimientos de recuperación pertenecen
a la experiencia habitual de la
técnica.
técnica.
Los polipéptidos E1 y E2 de la presente
invención también pueden producirse usando procedimientos
convencionales de síntesis de proteínas, en base a secuencias de
aminoácidos conocidas. En general, estos procedimientos emplean la
adición secuencial de uno o more aminoácidos a una cadena peptídica
en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer
aminoácido se protege por un grupo protector adecuado. El aminoácido
protegido o derivatizado después puede unirse a un soporte sólido
inerte o utilizarse en solución añadiendo el siguiente aminoácido
en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o
carboxilo) adecuadamente protegido, en condiciones que permiten la
formación de un enlace amida. El grupo protector después se retira
del resto aminoacídico recién añadido y después se añade el
siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y etc. Después de
que se hayan unido los aminoácidos deseados en la secuencia
apropiada, cualquier grupo protector restante (y cualquier soporte
sólido, si se usan técnicas de síntesis en fase sólida) se retira
secuencialmente o al mismo tiempo, para dar el polipéptido final.
Por modificación simple de este procedimiento general, es posible
añadir más de un aminoácido de una vez a una cadena en crecimiento,
por ejemplo, acoplando (en condiciones que no realicen racemización
de los centros quirales) un tripéptido protegido con un dipéptido
apropiadamente protegido para formar, después de la desprotección,
un pentapéptido. Véase, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young,
Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides:
Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Vol.
2, Academic Press, Nueva York, (1980), pág. 3-254,
para técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y M. Bodansky,
Principles of Peptide Synthesis,
Springer-Verlag, Berlín (1984) y E. Gross y J.
Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology,
supra, Vol. 1, para síntesis en solución clásica.
Como se ha explicado anteriormente, la presente
invención también proporciona un procedimiento para producir
complejos de E1 secretada/E2 secretada. Dichos complejos se producen
fácilmente por, por ejemplo, co-transfección de
células huésped con construcciones que codifican las proteínas
truncadas E1 y E2. La co-transfección puede
realizarse en trans o cis, es decir, usando vectores
diferentes o usando un único vector que alberga los dos genes E1 y
E2. Si se hace usando un único vector, ambos genes pueden estar
dirigidos por un único conjunto de elementos de control o, como
alternativa, los genes pueden estar en el vector en casetes de
expresión individuales, dirigidos por elementos de control
individuales. Después de la expresión, las proteínas E1 y E2
secretadas se asociarán espontáneamente. Como alternativa, los
complejos pueden formarse mezclando las proteínas individuales
juntas que se han producido por separado, en forma purificada o
semi-purificada, o incluso mezclando los medios de
cultivo en los que se han cultivado las células huésped que expresan
las proteínas.
Los nuevos polipéptidos E1 y E2 secretados de la
presente invención, los complejos de los mismos, o los
polinucleótidos que los codifican, pueden usarse para varios
propósitos de diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, las proteínas
y polinucleótidos pueden usarse en una diversidad de ensayos, para
determinar la presencia de las proteínas E1 y E2 en una muestra
biológica para ayudar al diagnóstico de enfermedad por VHC. Los
polipéptidos E1 y E2 y los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos también pueden usarse en composiciones de vacuna,
individualmente o en combinación, en por ejemplo, vacunas
profilácticas (es decir, para evitar la infección) o terapéuticas
(para tratar el VHC después de la infección). De hecho, dichas
glicoproteínas de envuelta secretadas son particularmente útiles en
inmunización con ácido nucleico donde las moléculas secretables
pueden ser más eficaces que las proteínas intracelulares
correspondientes para generar una respuesta inmune. Las vacunas
pueden comprender mezclas de una o más de las proteínas E1 y E2 (o
secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas), tales como
proteínas E1 y E2 derivadas de más de un aislado viral. La vacuna
puede también administrarse junto con otros antígenos y agentes
inmuno-reguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas,
citoquinas, linfoquinas, y quimioquinas, incluyendo, aunque sin
limitación, IL-2, IL-2 modificada
(cys125\rightarrowser125), GM-CSF,
IL-12, interferón \gamma, IP-10,
MIP1\beta y RANTES.
Las vacunas generalmente incluirán uno o más
"excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" tales
como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden
estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes
humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, y
similares, en dichos vehículos.
Un vehículo está opcionalmente presente, que es
una molécula que por sí misma no induce la producción de anticuerpos
dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos
adecuados son típicamente macromoléculas grandes, metabolizadas
lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos,
ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de
aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o
liposomas), y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son
bien conocidos para los especialistas en la técnica. Además, el
polipéptido del VHC puede conjugarse con un toxoide bacteriano, tal
como toxoide de difteria, tétanos, cólera,
etc.
etc.
También pueden usarse adyuvantes para potenciar
la eficacia de las vacunas. Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin
limitación: (1) sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2)
formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes
inmunoestimuladores específicos tales como muramil péptidos (véase
a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana),
tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación Internacional Nº WO
90/14837), que contiene Escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span
85 al 0,5% (opcionalmente que contiene diversas cantidades de
MTP-PE (véase a continuación), aunque no se
requiere) formulado en partículas submicrométricas usando un
microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y
(Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene Escualeno al 10%,
Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque pluronic al 5% L121, y
thr-MDP (véase a continuación) microfluidizado en
una emulsión submicrométrica o agitado con vórtice para generar una
emulsión de tamaño de partícula mayor, y (c) sistema adyuvante
Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene
Escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared
celular bacteriana del grupo constituido por monofosforil lípido A
(MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y el esqueleto de la pared
celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3)
adyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge
Bioscience, Worcester, MA) que pueden usarse o generar partículas a
partir de los mismos tales como ISCOM (complejos
inmunoestimuladores); (4) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y
Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citoquinas, tales como
interleuquinas (IL-1, IL-2, etc.),
factor estimulador de colonias de macrófagos
(M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; y
(6) otras sustancias que funcionan como agentes estimuladores para
potenciar la eficacia de la composición. Se prefieren alumbre y
MF59.
Los muramil péptidos incluyen, aunque sin
limitación,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina
(nor-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Típicamente, las composiciones de vacuna se
preparan en forma de inyectables, como soluciones o suspensiones
líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para
solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su
inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse
en liposomas para un efecto adyuvante potenciado, como se ha
analizado anteriormente.
Las vacunas comprenderán una cantidad
terapéuticamente eficaz de las proteínas truncadas E1 y/o E2, o
complejos de las proteínas, o secuencias de nucleótidos que
codifican las mismas, y cualquier otro componente mencionado
anteriormente, según sea necesario. Por "cantidad terapéuticamente
eficaz" se entiende una cantidad de una proteína truncada E1 y/o
E2 que inducirá una respuesta inmunológica en el individuo al que se
administra. Dicha respuesta generalmente provocará el desarrollo en
el sujeto de una respuesta inmune secretora, celular y/o mediada
por anticuerpos contra la vacuna. Habitualmente, dicha respuesta
incluye, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes
efectos: la producción de anticuerpos de cualquiera de las clases
inmunológicas, tales como inmunoglobulinas A, D, E, G o M; la
proliferación de linfocitos B y T; el suministro de señales de
activación, crecimiento y diferenciación a las células
inmunológicas; la expansión de poblaciones de células T auxiliares,
células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T
\gamma\delta.
Preferiblemente, la cantidad eficaz es
suficiente para dar lugar al tratamiento o prevención de los
síntomas de la enfermedad. La cantidad exacta necesaria variará
dependiendo del sujeto que se esté tratando; la edad y estado
general del individuo a tratar; la capacidad del sistema inmune del
individuo para sintetizar anticuerpos; el grado de protección
deseado; la gravedad de la afección que se está tratando; el
polipéptido del VHC particular seleccionado y su modo de
administración, entre otros factores. Una cantidad eficaz apropiada
puede determinarla fácilmente un especialista en la técnica. Una
"cantidad terapéuticamente eficaz" estará en un intervalo
relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos
rutinarios.
Una vez formuladas, las vacunas se administran
convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, por inyección,
de forma subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales
adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones
orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas. El
tratamiento de dosificación puede ser un programa de una única
dosis o un programa de múltiples dosis. La vacuna puede
administrarse junto con otros agentes
inmuno-reguladores.
Como se ha explicado anteriormente, pueden
usarse vacunas que contienen polinucleótidos que codifican proteínas
truncadas, secretadas para la inmunización con ácido nucleico.
Dicho procedimiento comprende la introducción de un polinucleótido
que codifica uno o más de los polipéptidos E1 y/o E2 en una célula
huésped, para la expresión in vivo de las proteínas. El
polinucleótido puede introducirse directamente en el sujeto
destinatario, tal como por inyección, inhalación o similares, o
puede introducirse ex vivo, en células que se han retirado
del huésped. En el último caso, las células transformadas se
reintroducen en el sujeto donde puede montarse una respuesta inmune
contra la proteína codificada por el polinucleótido. Se conocen en
la técnica procedimientos de inmunización con ácido nucleico y se
describen en, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº WO
93/14778 (publicada el 5 de agosto de 1993); la Publicación
Internacional Nº WO 90/11092 (publicada el 4 de octubre de 1990);
Wang y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:
4156-4160; Tang y col. Nature (1992) 356:
152-154; y Ulmer y col. Science (1993) 259:
1745-1749.
1745-1749.
Generalmente, el polinucleótido se administra en
forma de un vector que se ha encapsulado en un liposoma y formulado
en una composición de vacuna como se ha descrito anteriormente.
A continuación se proporcionan ejemplos de
realizaciones específicas para realizar la presente invención. Los
ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se
pretende que limiten el alcance de la presente invención de ningún
modo.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la
precisión con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades,
temperaturas, etc.), pero debe permitirse, por supuesto, algún
error experimental error y desviación.
Se usaron células BSC40 y fibroblastos de
chimpancé F503 (Perot y col., J. Gen. Virol. (1992)
73:3281-3284) en experimentos de
infección/transfección como se ha descrito previamente (Selby y
col., J. Gen. Virol. (1993) 74: 1103-1113). En
resumen, se infectaron monocapas subconfluyentes de células en
placas de 60 mm con VV_{T7} (moi = 10) en DME libre de suero.
Después de 30-60 minutos, se retiró el inóculo y se
remplazó con los moldes de ADNc apropiados clonados en el vector
pTM1 (Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1990) 87:6743-6747), como se describe a
continuación. El ADN del vector se complejó con Lipofectina (BRL) o
Lipofectamina (BRL). Después de la transfección durante
2,5-3 horas, se retiró el ADN y las células se
privaron durante 30 minutos en DME deficiente de met/cys. Se
añadieron aproximadamente 100-200 \muCi de
Marcador de Expresión ^{35}S (NEN) a las células durante
3-4 horas. Las células se lisaron en tampón de lisis
1X (NaCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM pH 7,5, EDTA 1 mM,
NP40 al 0,5%, desoxicolato al 0,5% y PMSF 100 mM, 0,5 \mug/ml de
leupeptina y 2 mg/ml de aprotinina), se almacenaron en hielo
durante 10 minutos y se aclararon por centrifugación (15.000 x g
durante 5 minutos). Los lisados se inmunoprecipitaron con el
anticuerpo designado inmovilizado en Proteína A Sepharose
(BioRad).
Todos los moldes de E1 y E2 se generaron por PCR
y se confirmaron por secuenciación. Se usó el cebador 5' apropiado
que contenía un resto metionina y un sitio Ncol junto con
cebadores 3' que tenían un codón de terminación después del punto
final de envuelta designado y finalmente, para E1, un sitio
BamHI. Ambos oligos tenían secuencias no específicas en los
extremos para facilitar digestiones más eficaces con las enzimas
NcoI y BamHI. Los fragmentos de PCR digeridos se ligaron en
pTM1 digerido con NcoI/BamHI
(Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1990) 87:6743-6747). El vector pTM1 contiene el
promotor T7 y el líder EMC proximal al sitio de clonación
NcoI que corresponde con el primer resto met codificado por
el ADN designado. Los moldes de E2 se digirieron con NcoI y
AscI y se clonaron en
NcoI(parcial)/AscI-pTM1-CE2 (Selby y
col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113) para
generar los clones H donde las traducciones comienzan en el
aminoácido 1 y codifican el núcleo, E1 y las regiones E2 designadas.
Para los polipéptidos E1 truncados, los moldes codificantes
comienzan con un resto metionina, seguido de isoleucina y después el
aminoácido 172. Para las construcciones de E2 truncadas, se usó la
metionina en la posición 364 como el extremo
N-terminal en las construcciones. Después de
identificar posibles clones y amplificar el ADN, todos se
secuenciaron. Se muestras que todos los clones de E1 son correctos
por secuenciación. La mayoría de los clones de E2 mostraron la
secuencia correcta con la excepción de la pérdida de un único resto
leucina dentro de E2. Esta pérdida no influía en las conclusiones
ya que no estaba en las cercanías del extremo
C-terminal.
Se realizaron inmunoprecipitaciones en los
medios de células transfectadas como se describe en Selby y col.,
J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113, excepto en que
los precipitados se lavaron al menos una vez con tampón de lisis
que contenía NaCl 500 mM en lugar de 100 mM. Los precipitados se
resuspendieron en tampón de Laemmli, se hirvieron y se analizaron
en geles de acrilamida al 12,5% o al 15%. Los geles se potenciaron
(Amplify, Amersham), se secaron y se expusieron a la película a
-80ºC. Los antisueros usados se describieron previamente en Selby y
col., J. Gen. Virol. (1993) 74:1103-1113. Se
realizaron tratamientos con endo H de los inmunoprecipitados de
acuerdo con las especificaciones del fabricante (Oxford
Glycosystems).
Para la inmunoprecipitación de proteínas E1 y E2
secretadas, se microcentrifugaron los medios recogidos de células
transfectadas y se inmunoprecipitaron en tubos que contenían
anticuerpo monoclonal anti-E1 o anticuerpo
policlonal de conejo anti-E2 inmovilizado en
proteína G sepharose (Pharmacia) o proteína A sepharose (Sigma),
respectivamente. Después de incubación durante una noche a 4ºC, se
lavaron los complejos sepharose Ab-Ag con tampón de
lisis dos veces, una vez con tampón de lisis que contenía NaCl 500
mM y finalmente con Tris 120 mM, 8,0. Después de que se aspirara
todo el líquido, se añadieron aproximadamente 30 \mul de tampón de
muestra de Laemmli, las muestras se hirvieron y después se cargaron
en un gel de acrilamida al 12,5%. Después de la electroforesis, los
geles se fijaron, se amplificaron y se secaron sobre 3MM. Los geles
secados se expusieron a la película con una pantalla
intensificadora. Se hicieron controles de transfección con un molde
para el ADNc de la \beta-galactosidasa
(pTM1-\beta-gal).
Se transfectaron células BSC40 con pE2_{1006},
marcado con ^{35}S-met (NEN) y se lisaron con
tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasa. Los lisados
aclarados se precipitaron con anticuerpo de conejo
anti-E2 durante una noche, se lavaron y se
analizaron en un gel de acrilamida al 15%. El gel después se
transfirió a PVDF en metanol al 20%/tampón de procesamiento 1x
durante 2 horas a 50 voltios. Se identificó la región que contenía
NS2B por auto-radiografía y se cortó. Se secuenció
NS2B mediante degradación de Edmann secuencial en un secuenciador
en fase gaseosa Applied Biosystems 470A (Speicher, (1989).
Microsequencing with PVDF membranes: Efficient electroblotting,
direct protein adsorption and sequencer program modifications. En
Techniques in Protein Chemistry. Ed. T.E. Hugli. Academic Press,
San Diego, CA. Pág. 24-35.). Se evaporaron las
fracciones que contenían cloruro de butilo y se contaron con fluido
de centelleo.
Solamente para
Referencia
Como se ha explicado anteriormente, se generó
una serie de moldes de E1 en pTM1, usando PCR (Figura 5). En
particular, se generaron moldes codificantes que comienzan con un
resto metionina, seguido de isoleucina y después el aminoácido 172
de la poliproteína del VHC y que continúa hasta el aminoácido 330, y
clones de incrementos de 10 aminoácido hasta el aminoácido 380. Los
aminoácidos 173 a 191 corresponden al extremo
C-terminal del núcleo que aparentemente tiene una
tarea como secuencia señal. Se cree que E1 madura comienza en el
aminoácido 192 de la poliproteína después de la escisión de la
secuencia señal.
Se recuperó material
inmuno-reactivo anti-E1 en el medio
de células transfectadas con moldes hasta el aminoácido 360. No se
detectó E1 en el medio de células transfectadas con clones que
terminan en los aminoácidos 370 y 380.
También se generó una serie de moldes de E2 en
pTM1, usando PCR (Figura 6). En particular, el primer aminoácido
codificante de E2 corresponde a la metionina en la posición 364 y
éste se usó como extremo N-terminal en las
construcciones. El aminoácido 364 corresponde con el inicio
aproximado del péptido señal de E2 (Hijikata y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1991) 88: 5547-5551; Ralston y col.,
J. Virol. (1993) 67:6753-6761). Se cree que E2
madura comienza con el aminoácido 385. Los extremos
C-terminales escalonados variaban del aminoácido
661 al 1006. En particular, los clones terminaban en los aminoácidos
661, 699, 710, 715, 720, 725, 730, 760, 780, 807, 837, 906 y
1006.
Se recuperó material
inmuno-reactivo anti-E2 en el medio
de células transfectadas con moldes hasta 725. Se detectaron
pequeñas cantidades de E2 en el medio transfectado con clones que
terminaban en el aminoácido 730. Se detectó poco o nada de E2 en el
medio de células transfectadas con clones que terminaban en
aminoácidos más allá del 730. La secuencia justo anterior al 730 es
bastante hidrófoba, reminiscente de una secuencia de anclaje a
membrana. Por tanto, parece que secuencias entre 715 y 730 y que se
extienden tanto como aproximadamente el resto aminoacídico 746
(véase, Lin y col., J. Virol. (1994) 68:5063-5073),
sirven para anclar E2 al RE, evitando la secreción.
Se hizo una molécula E2 secretada adicional que
incluía los aminoácidos 383_{ala} a 715_{lys}. La
molécula E2 se expresaba usando un sistema de expresión de células
de hámster chino/dihidrofolato reductasa (CHO/DHFR) del siguiente
modo. Se generó un fragmento de ADN de E2 del VHC desde el
aminoácido 383 hasta el aminoácido 715 del VHC1 por PCR y después
se ligó en el vector pMH que incluye el promotor temprano inmediato
de citomegalovirus de ratón (MCMV ie) potente y el marcador de
selección DH-FR, para dar el plásmido
pMHE2-715 (véase la Figura 7). Este plásmido
después se introdujo por transfección estable en la línea celular
CHO, Dg44, del siguiente modo. Se combinaron 100 \mug de ADN con
lipofectina (Gibco-BRL) para la introducción por
transfección en 1x10^{7} células en palcas de 10 cm. Las células
se transfectaron y se incubaron durante 24 horas en medio no
selectivo (mezcla nutriente de Ham F-12, JRH
Biosciences serie nº 51, prolina, glutamina y piruvato sódico),
después se dejó que se recuperaran durante 24 horas en medio no
selectivo suplementado con suero bovino fetal. El medio no
selectivo después se remplazó con medio selectivo (mezcla nutriente
de Ham F-12, JRH Biosciences serie nº 52, prolina,
glutamina, y piruvato sódico) suplementado con suero bovino fetal
dializado. El medio se cambió cada 3-4 días hasta
que empezaron a formarse colonias.
La línea celular DG44 carece de actividad DHFR
endógena. Por tanto, solamente aquellas células transfectadas con
el plásmido pMHE2-715 que tiene el gen DHFR pueden
crecer y formar colonias en el medio selectivo que carece de
hipoxantina, aminopterina y timidina. Se cogieron aproximadamente
2200 colonias y se cultivaron en placas de 96 pocillos. Cuando los
clones alcanzaron la confluencia 5 días después, se ensayó el medio
para E2 secretada por ELISA usando anticuerpo monoclonal
3E5-1 que se produjo contra un determinante lineal
de E2 como anticuerpo de captura y E3 expresado en células CHO y
purificado de una columna de afinidad por anticuerpo monoclonal
(5E5H7 reactivo para un determinante conformacional de E2) como
patrón. Se expandieron los 83 mejores clones de expresión a placas
de 24 pocillos. Una vez que se alcanzó la confluencia en las placas
de 24 pocillos, se ensayó el medio y después se expandieron los 41
mejores clones a placas de 6 pocillos. Cuando los clones alcanzaron
la confluencia, se ensayó el medio y los 21 mejores clones se
expandieron a matraces de 75 cm^{2}. En este punto se confirmó la
expresión por ELISA y por inmunotinción fluorescente usando el
anticuerpo monoclonal 3E5-1. Había 5 clones que
tenían un 100% de sus células fluorescentes. En base a ambos
ensayos, se eligieron los 3 mejores clones para purificarlos por
dilución limitante.
Los 7 mejores clones se combinaron y se
sembraron en placas de 10 cm para su cultivo en un intervalo de
concentraciones de metotrexato (MTX). El MTX es un inhibidor de
DHFR. Entre una población de células cultivadas, los clones
variantes que estaban sobre-expresando DHFR eran
resistentes al MTX tóxico. Se ha observado que los otros genes del
plásmido introducido por transfección en células CHO pueden
co-amplificarse con el gen DHFR. Las células
que expresaban E2 del VHC se amplificaban en medio selectivo con
concentraciones finales de MTX 10, 20, 50, 100, 200 nM. Las
colonias crecían solamente en los medios de MTX 10 y 20 nM. Estos
384 clones se cogieron, se expandieron y se comprobaron para la
expresión como se hizo anteriormente en la selección inicial. En
cultivos adherentes, el mejor clon amplificado tenía un nivel de
expresión que era un 31% mayor que el mejor clon no amplificado y
era fluorescente al 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Solamente para
Referencia
E1 inmunoprecipita con E2 usando anticuerpos
mono-reactivos contra E2 o E1 (Grakoui y col., J.
Virol. (1993) 67:1385-1395; Lanford y col.,
Virology (1993) 197: 225-235; Ralston y col., J.
Virol. (1993) 67:6753-6761). Esta interacción es
muy fuerte ya que resiste la alteración por SDS al 0,5% (Grakoui y
col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395) o por
detergente de elevado contenido salino/no iónico (Ralston y col., J.
Virol. (1993) 67:6753-6761; Glazer y Selby,
observaciones no publicadas). Para definir la región de E2
importante para esta interacción, se transfectaron células BSC40
con moldes H (núcleo a E2) y se inmunoprecipitaron los lisados
radiomarcados con antisuero policlonal de conejo
anti-E2. Las especies de E2 codificadas por los
moldes que terminaban en el aminoácido 730, 760 y 780 se asociaban
con E1. No había diferencia cuantitativa en la
co-precipitación de E1 con todos los moldes entre
730 y 1006. En contraste, las especies de E2 codificadas por los
moldes 661, 699, 710, 715, 720 y 725 no lograban
co-precipitar de forma significativa E1. Como
control, se inmunoprecipitaron los mismos lisados con antisuero de
paciente LL. Las proteínas E1 de todos los moldes precipitaban
claramente con LL; las proteínas E2 precipitaban de forma eficaz
con la excepción del molde 661H. Se ha observado de forma coherente
una detección relativamente mala de E2_{661}, posiblemente debido
a una estructura diferente de esta proteína en comparación con
versiones más largas.
Por tanto, las secuencias entre los aminoácidos
715 y 730 son importantes para la asociación eficaz de E1. Parece
que la retirada de este anclaje C-terminal impide la
asociación que aparece normalmente entre E1 y E2. Sin embargo,
cuando se secretan ambas envueltas, parece que existe algo de
asociación. Este resultado es opuesto a los datos de secreción con
respecto a E2 presentados anteriormente, estableciendo de este modo
una relación inversa entre la secreción de E2 y la interacción de E2
con E1.
\vskip1.000000\baselineskip
Solamente para
Referencia
Para ensayar si las formas truncadas de E1 y E2,
producidas anteriormente, eran capaces de asociarse entre sí, se
introdujo por co-transfección la construcción que
codifica un polipéptido E1, truncado de forma
C-terminal en el aminoácido 360, con construcciones
que codifican un polipéptido E2, truncado de forma
C-terminal en el aminoácido 715 o un polipéptido
E2, truncado de forma C-terminal en el aminoácido
725. Las células se transformaron como se ha descrito anteriormente
y se recogió el medio. Se observaron claramente complejos de E1/E2
con anticuerpo monoclonal anti-E2 donde se
co-precipitaba E1. La precipitación inversa con
anticuerpo monoclonal anti-E1 produjo mucha menos
E1 en comparación con la precipitación anterior. Se hizo una
observación similar en Ralston y col., J. Virol. (1993)
67:6753-6761, con respecto a construcciones no
truncadas. Dicha formación de complejo es significativa porque
demuestra que las regiones de E1 y E2 importantes para su
interacción se retienen, a pesar de la eliminación de todo o parte
de los dominios de membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjeron tres bandas de E2 por tratamiento
con endo F de E2, lo que sugiere que existe más de una especie de
E2 aunque los puntos finales sigan estando indefinidos (Grakoui y
col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395). Además, una
banda de elevado peso molecular reactiva antisueros tanto contra E2
como contra NS2 condujo a la especulación de una posible especie
E2-NS2 (Grakoui y col., J. Virol. (1993)
67:1385-1395; Tomei y col., J. Virol. (1993)
67:4017-4026). Se uso tratamiento con endo H para
definir estas tres glicoproteínas E2. La endo H es una
desglicosidasa adecuada para estos experimentos ya que se observan
glicoproteínas solamente inmaduras, de elevado contenido de manosa
en sistemas de expresión transitoria (Spaete et. al., Virology
(1992) 188: 819-830; Ralston y col., J. Virol.
(1993) 67: 6753-6761). El tratamiento con endo H de
proteínas E2 codificadas por moldes E2_{661} a E2_{730} produjo
bandas sencillas que aumentaban en tamaño de forma concomitante con
los moldes ampliados. Las proteínas E2, tratadas con endo H,
codificadas por los moldes E2_{760}, E2_{780} y E2_{807}
mostraron una banda adicional que paraba de aumentar de tamaño en el
aminoácido 807 en comparación con moldes más largos. Estos datos
sugieren que una forma de E2 termina cerca del aminoácido 730. Datos
recientes sugieren que E2 puede terminar en aproximadamente el
aminoácido 746 (véase, Lin y col., J. Virol. (1994)
68:5063-5073). Parece que una segunda forma de E2
termina cerca de la posición del aminoácido 807. En los moldes
E2_{906} y E2_{1006} se observaba una tercera banda que migraba
más alta que el doblete previo. Los tamaños de las bandas de estos
dos moldes eran coherentes con moléculas E2 que estaban codificadas
por los moldes completos. La movilidad de la fusión
E2-NS2 en pTM1-HCV estaba
ligeramente disminuida con relación a E2_{1006}. Estas
observaciones son coherentes con la tercera forma de E2 que acaba de
forma co-incidental con la unión NS2/NS3
en el aminoácido 1026 (Grakoui y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1993) 90:10583-10587).
Se ha identificado que NS2 precede NS3 (Grakoui
y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Hijikata y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:
10773-10777; Selby y col., J. Gen. Virol. (1993)
74:1103-1113). Los resultados presentados en este
documento y otros informes recientes (Lin y col., J. Virol. (1994)
68: 5063-5073) apoyan el procesamiento diferencial
del precursor por el cual extensiones de E2 más allá de los
aminoácidos 730-746 representan fusiones de E2 con
NS2. Los inventores sugieren tentativamente que la región
codificante de la proteína pequeña aproximadamente entre los
aminoácidos 730-746 y 807 predicha por los
experimentos con endo H corresponde con NS2A mientras que la
proteína cadena abajo es NS2B. Esta nomenclatura se basa en la
organización similar de proteínas entre los Flaviviridae. Es
posible que NS2A no se escinda independientemente de la poliproteína
como NS2B y sigue teniendo que determinarse si NS2A es de hecho una
proteína no estructural.
Solamente para
Referencia
El suero de paciente LL detectó glicoproteínas
E2 y otras dos especies de 14 kDa y 21 kDa a partir de
transfecciones con los moldes E2_{906} y E2_{1006}. Esta última
especie corresponde con NS2B porque la diferencia en el tamaño se
correlaciona perfectamente con la diferencia en las longitudes del
molde y se detectó una NS2B de 23 kDa a partir del molde del VHC de
longitud completa, pTM1-HCV (Selby y col., J. Gen.
Virol. (1993) 74:1103-1113). Cuando se usó un
anticuerpo anti-E2 para inmunoprecipitar los mismos
lisados, NS2B co-precipitó con E2. En estas
condiciones E1 también co-inmunoprecipita. Además,
también se vieron especies anti-E2 reactivas
superiores en precipitaciones con 906, 1006 y
pTM1-HCV, que corresponden a fusiones de E2 con NS2A
y diferentes longitudes de NS2B.
Usando los diversos moldes de E2, los inventores
definieron una región de E2 importante para la
co-precipitación de NS2B. Los moldes de E2 que
acaban en los aminoácidos 699, 730, 760, 780 y 807 se introdujeron
por co-transfección con pTM1-NS25,
que codifica los aminoácidos 730 a 3011 (Selby y col., J. Gen.
Virol. (1993) 74:1103-1113). Se usó
pTMI-NS25 ya que se determinó previamente que este
molde codificaba NS2 y se requería un molde independiente para la
expresión de NS2B para definir secuencias importantes para la
interacción E2:NS2B. Anticuerpos anti-E2
inmunoprecipitaban proteínas E2 y también
co-precipitaban NS2B (23 kDa) y NS4B probable (27
kDa) de todos los lisados excepto del transfectado con el molde
E2_{699}. Como control positivo, se co-precipitó
NS2B truncada del molde E2_{1006} con E2. Estos datos demuestran
que los aminoácidos 699 a 730 son importantes para la asociación de
NS2B y NS4B con E2.
El anticuerpo anti-E2 que
co-precipitaba NS2B se creó contra una fusión
SOD-E2 que terminaba en el aminoácido 662. Esto
excluye la posibilidad de reactividad cruzada con NS2B como una
causa para la detección de NS2B. Esta banda de NS2B no estaba
glicosilada como se evidencia por su insensibilidad al tratamiento
con endo H. Como la co-precipitación de NS2B era
con poco fondo y eficaz, esta propiedad de asociación se usó para
radio-secuenciar el extremo
N-terminal de NS2B. Se analizó el inmunoprecipitado
del lisado marcado con ^{35}S-metionina de una
transfección con E2_{1006} en un gel de acrilamida al 15% y se
transfirió a PVDF para la secuenciación. Usando un resto metionina
a 18 aminoácidos del resto 810 como referencia, se identificó el
extremo amino de NS2B como el aminoácido 810. Esta asignación está
de acuerdo con el extremo C-terminal de
E2 predicho en base al patrón de endo H de los moldes de deleción
de E2 y confirma los sitios de escisión recientemente presentados
por Grakoui y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)
90:10583-10587 y Mizushima y col., J. Virol. (1994)
68:2731-27341994. Se predice que los presuntos
extremos de NS2A residen en los aminoácidos 730 y 809 si existe en
forma de una proteína independiente.
Claims (3)
1. Un procedimiento para producir un polipéptido
del VHC secretado, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) proporcionar una población de células
huésped de mamífero o levaduras, en la que dichas células huésped
se transforman con un vector recombinante que comprende:
- i)
- un polinucleótido que comprende una secuencia codificante del polipéptido E2 del virus de la hepatitis C (VHC), en el que dicho polipéptido carece de una parte de su extremo C-terminal que comienza en el resto aminoacídico 715, numerado con referencia a la secuencia de aminoácidos de E2 del VHC1 dada en Fig. 4; y
- ii)
- elementos de control que están unidos de forma funcional a dicha secuencia codificante por los cuales dicha secuencia codificante puede transcribirse y traducirse en una célula huésped; y
(b) cultivar dicha población de células en
condiciones por las cuales dicho polipéptido del VHC se expresa y
secreta.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polinucleótido que comprende una secuencia codificante
del polipéptido E2 del virus de la hepatitis C (VHC) codifica un
fragmento de E2 del VHC desde el resto aminoacídico 383 hasta el
resto aminoacídico 715, numerados con referencia a la secuencia de
aminoácidos de E2 del VHC1 dada en la Fig. 4.
3. El polipéptido del VHC producido de acuerdo
con el procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2.
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