DE69333269T2

DE69333269T2 - Expressionssystem in säugetieren für hcv-proteine

Info

Publication number: DE69333269T2
Application number: DE69333269T
Authority: DE
Inventors: M. James CASEY; L. Suzanne BODE; J. Billy ZECK; Julie Yamaguchi; E. Donald FRAIL; M. Suresh DESAI; G. Sushil DEVARE
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1992-01-31
Filing date: 1993-01-29
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2013-01-30
Also published as: EP0627000A1; US5854001A; EP0627000B1; CA2129733A1; CA2129733C; ES2210235T3; AU666176B2; TW239147B; EP0627000A4; JP3439209B2; DE69333269D1; AU3604993A; US5667992A; JPH07503614A; WO1993015193A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen das Hepatitis C Virus (HCV) und insbesondere betrifft sie Expressionssysteme für Säugetiere, die die Fähigkeit haben, HCV-Proteine herzustellen, und die Benutzungen dieser Proteine.
Beschreibungen von Hepatitis-Krankheiten, die Gelbsucht und Ikterus verursachen, waren schon in der Antike bekannt. Heute weiß man, das eine virale Hepatitis eine Gruppe an viralen Agenzien umfasst, mit charakteristischer Proteinstruktur des viralen Aufbaus und Art der Reproduktion, die eine Hepatitis verursachen mit einem verschiedenen Graden an Ernsthaftigkeit des hepatischen Schadens durch verschiedene Wege der Übertragung. Akute. virale Hepatitis ist klinisch diagnostiziert durch gut festgelegte Symptome beim Patienten einschließlich Gelbsucht, hepatische Weichheit und einen erhöhten Gehalt an Lebertransaminasen, wie Aspartat-Transaminase und Alanin-Transaminase.
Serologische Assays werden allgemein benutzt, um weiter zu unterscheiden zwischen Hepatitis-A und Hepatitis-B. Non-A Non-B Hepatitis (NANBH) ist ein Begriff, der zum ersten Mal 1975 benutzt wurde, der Post-Transfusion-Fälle der Hepatitis beschreibt, die nicht von Hepatitis A Virus und nicht von Hepatitis B Virus verursacht wurden. Feinstone et al., New Engl., J. Med. 292: 454–457 (1975). Die Diagnose von NANBH wurde in erster Linie mittels Ausschluss gemacht, auf der Basis von serologischen Analysen, für die Anwesenheit von Hepatitis A und Hepatitis B. NANBH ist für circa 90% der Fälle von Post-Transfusion-Hepatitis verantwortlich. Hollinger et al., in N. R. Rose et al., eds., Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 558–572 (1986).
Versuche, das NANBH-Virus zu identifizieren auf Grund von genomischen Ähnlichkeiten zu einem der bekannten Hepatitis-Viren sind bis jetzt fehlgeschlagen, was zur Vermutung führt, dass das NANBH eine charakteristische genomische Organisation und Struktur hat. Fowler et al., J. Med. Virol, 12: 205–213 (1983) und Weiner et al., J. Med. Virol, 21: 239–247 (1987). Fortschritte in der Entwicklung von Assays, um spezifische Antikörper für das NANBH zu entdecken, wurden durch Schwierigkeiten in der Identifizierung der Antigene behindert, die mit dem Virus verbunden sind. Wards et al., U. S. Patent Nr. 4,870,076; Wards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6608–6612 (1986); Ohori et l., J. Med. Virol, 12: 161–178 (1983); Bradly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 6277–6281 (1987); Akatsuka et al., J. Med. Virol, 20: 43– 56 (1986).
Im Mai 1988 endete eine gemeinsame Arbeit von Chiron Corporation mit dem Centers for Disease Control, die zu der Identifizierung eines vermeintlichen NANB-Agens, Hepatitis C Virus (HCV), führte. M. Houghton et al., klonte und exprimierte in E. coli ein NANB-Agens, das er aus dem infizierten Plasma eines Schimpansen erhielt. Cuo et al., Science 244: 359–361 (1989); Chou et al., Science 244: 362–364 (1989). Es wurden CDNA-Sequenzen von HCV identifiziert, die Antigene kodieren, die mit Antikörpern immunologisch reagieren, die in einer Mahrzahl der Patienten vorhanden waren, wie klinisch mit NANBH diagnostiziert wurden. Beruhend auf den erhältlichen Informationen und auf der Molekülstruktur des HCV, besteht die genetische Aufmachung des Virus aus einer Einzelstrang-linearen RNA (positiver Strang) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 9,5 kb und welches ein kontinuierliches offenes Translations-Lese-Raster besitzt. J. A. Cuthbert, Amer, J. Med. Sci, 299: 346–355 (1990). Es ist ein kleines kodiertes Virus, das den Flaviviren gleicht. Forscher haben Versuche gemacht, das NANB-Agens durch strukturelle Änderungen der Hepatocyten in infizierten Individuen zu identifizieren. H. Gupta, Liver 8: 111–115 (1988); D. W. Bradly J. Virol. Methods 10: 307–319 (1985). Ähnliche ultrastrukturelle Änderungen in Hepatocyten, sowie HCV-RNA-Sequenzen, die durch PCR verstärkt wurden, wurden in NANBH-Patienten sowie in Schimpansen entdeckt, die experimentell mit infizierten HCV-Plasma infiziert wurden. T. Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 87: 6441–6444 (1990).
Ein bedeutendes serologisches Ergebnis zeigte, dass das HCV als etiologisches Agens für Post-Transfusion-NANBH verwickelt ist. H. Alter et al., N. Eng. J. Med. 321: 1494–1500 (1989); Estaben et al., The Lancet: Aug. 5: 294–296 (7989); C. Van Der Poel et al., The Lancet: Aug. 5: 297–298 (1989); G. Sbolli, J. Med. Virol, 30: 230–232 (1990); M. Makris et al., The Lancet 335: 1117–1119 (1990). Obwohl die Ermittlung der HCV-Antikörper 70 bis 80% des mit NANBH infizierten Blutes aus den Blutversorgungssystem entfernt, werden offensichtlich die Antikörper ohne weiteres während dem chronischen Zustand der Krankheit ermittelt, während nur 60% der Proben aus dem akuten NANBH-Stadium HCV-Antikörper positiv sind. H. Alter et al., New Eng. J. Med. 321: 1994–1500 (1989). Der verlängerte Zeitraum zwischen Aussetzung an HCV und Antikörper-Ermittlung und der Mangel an geeigneter Information, die das Profil der Immunreaktion an verschiedene strukturelle und nicht-strukturelle Proteine betrifft, erhebt Fragen über den infizierten Zustand des Patienten in der latenten und Antikörper-negativen Phase, während der NANBH-Infektion.
Seit der Entdeckung des vermeintlich HCV-etiologischen Agens, wie oben besprochen, haben Forscher versucht, die vermeintlichen HCV-Proteine in menschlichen Expressionssystemen zu exprimieren und auch das Virus zu isolieren. Bis heute wurden keine Berichte publiziert, in denen HCV-wirksam in Expressionssysteme der Säugetiere exprimiert wurde und das Virus wurde nicht in Gewebekultursysteme fortgepflanzt.
Deshalb besteht der Bedarf für die Entwicklung von Assay-Reagenzien und Assay-Systemen, um eine akute Infektion und eine Virämie, die vorhanden sein können, zu identifizieren und die nicht durch allgemein kommerziell erhältliche Assays ermittelt worden sind. Man braucht diese Instrumente, um unterscheiden zu können zwischen akuter und resistenter, andauernder und/oder chronischer Infektion und denen, die wahrscheinlich gelöst werden können, und um den prognostischen Kurs der NANBH-Infektion zu definieren, um so vorbeugende und/oder therapeutische Strategien zu entwickeln. Auch die Expressionssysteme, die die Sekretion dieser glycosylierten Antigene erlauben, würden für die Reinigung und Herstellung von diagnostischen und therapeutischen Reagenzien hilfreich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung liefert neue Expressionssysteme für Säugetiere, die die Fähigkeit haben, hohe Pegel an exprimierte Proteine des HCVs zu generieren. Insbesondere werden strukturelle Fragmente des HCVs in voller Länge werden als eine Verschmelzung mit den Amyloid-Precursor-Protein (APP) oder dem menschlichen Wachstumshormon (HGH)-Sekretionssignal exprimiert. Diese einzigartigen Expressionssysteme werden für die Produktion von hohen Pegeln an HCV-Proteinen in Betracht gezogen, wobei sie bei der eigentlichen Verarbeitung, Glycosylierung und Einschließung des viralen Proteins (der viralen Proteine) in das System mitwirken. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung die Plasmide pHCV-162, pHCV-167, pHCV-168, pHCV-169 und pHCV-170. Die APP-HCV-E2-Fusionsproteine, die von Säugetieren durch die Expressionsvektoren pHCV-162 und pHCV-167 exprimiert werden, werden auch eigeschlossen. Zusätzlich werden die HGH-HCV-E2-Fusionsproteine geliefert, die exprimiert werden, durch Expressionsvektoren, pHCV-168, pHCV-169 und pHCV-170 der Säugetiere.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Ermittlung von HCV-Antigen oder Antikörper in einer Testprobe, in der vermutet wird, dass das HCV-Antigen oder der Antikörper enthalten ist, wobei die Verbesserung das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem glycosylierten HCV-Antigen umfasst, welches in einem Expressionssystem eines Säugetieres produziert wird. Es wird ebenfalls ein Verfahren zur Ermittlung eines HCV-Antigen oder Antikörpers in einer Testprobe zur Verfügung gestellt, in der vermutet wird, dass das HCV-Antigen oder der Antikörper enthalten ist, wobei die Verbesserung das In-Kontakt-Bringen Kontakt der Testprobe mit einem Antikörper umfasst, der beim Gebrauch eines glycosylierten HCV-Antigens produziert wird, das in einem Expressionssystem eines Säugetieres produziert wird. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein.
Die vorliegende Erfindung liefert zusätzlich ein Testkit für die Ermittlung eines HCV-Antigen oder HCV-Antigen in einer Testprobe, in der vermutet wird, dass das HCV-Antigen oder der Antikörper enthalten ist, welches einen Behälter umfasst, in dem glycosylierten HCV-Antigen enthalten ist, welches in einem Expressionssystem eines Säugetieres produziert wird. Das Testkit kann auch einen Antikörper umfassen, welches produziert wird, durch Gebrauch eines glycosylierten HCV-Antigen, welches in ein Expressionssystem eines Säugetieres produziert wird. Ein anderes Testkit, das die vorliegende Erfindung liefert, umfasst einen Behälter, der einen Antikörper enthält, welcher produziert wird, durch Gebrauch eines glycosylierten HCV-Antigen, das in einem Expressionssystem eines Säugetieres produziert wird. Der Antikörper, der durch die Testkits geliefert wird, kann monoklonal oder polyklonal sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung der Strategie, die benutzt wurde, um HCV-genomische Klone herzustellen und zusammenzusetzen.
2 zeigt eine schematische Darstellung der Stelle und die Aminosäuren-Zusammensetzung der APP-HCV-E2-Fusionsproteine, die durch die Expressionsvektoren pHCV-162 und pHCV-167 bei Säugetieren exprimiert werden.
3 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsvektors APP-HCV-E2 der Säugetiere.
4 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die für das Fusionsprotein APP-HCV-E2 erhalten wurden, welches durch pHCV-162 in HEK-293-Zellen durch die Benutzung von HCV-Antikörper von positiven menschlichen Sera exprimiert wurden.
5 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die für das APP-HCV-E2-Fusionsprotein erhalten wurden, exprimiert durch pHCV-162 in HEK-293-Zellen, durch den Gebrauch von polyklonalem Sera von Hasen, die gegen synthetische Peptide gerichtet sind.
6 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten wurden für das APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-167 in HEK-293-Zellen, durch den Gebrauch von HCV-Antikörper von positiven menschlichen Sera.
7 zeigt die Endoglycosidase-H Verdauung der immunogefällten APP-HCV-E2-Fusionsproteine, exprimiert durch pHCV-162 und pHCV-167 in HEK-293-Zellen.
8 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn amerikanisches-HCV-Antikörper positive Sera gegen das APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch das pHCV-162 in HEK-293-Zellen, gescreent wurden.
9 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Sera von freiwiligen japanischen Blutspendern gegen das APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch das pHCV-162 in HEK-293-Zellen, gescreent wurde.
10 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Sera von freiwiligen japanischen Blutspendern gegen das APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-162 in HEK-293-Zellen gescreent wurde.
11 zeigt eine schematische Darstellung des Expressionsvektors pCDNA-I der Säugetiere.
12 zeigt eine schematische Darstellung der Stelle und der Zusammensetzung der Aminosäure der HGH-HCV-E1-Fusionsproteine, exprimiert durch die Expressionsvektoren von Säugetieren pHCV-168.
13 zeigt eine schematische Darstellung der Stelle und der Zusammensetzung der Aminosäure der HGH-HCV-E2-Fusionsproteine, exprimiert durch die Expressionsvektoren von Säugetieren pHCV-169 und pHCV-170.
14 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn HCV-E2-Antikörper positive Sera gegen die HGH-HCV-E1-Fusionsproteine, exprimiert durch pHCV-168 in HEK-293-Zellen, gescreent wurden.
15 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn HCV-E2-Antikörper positives Sera gegen die HGH-HCV-E2-Fusionsproteine, exprimiert durch pHCV-169 und pHCV-170 in HEK-293-Zellen, gescreent wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert genomische Klone in ganzer Länge, die in verschiedenen Hinsichten nützlich sein können. Solche genomische Klone in ganzer Länge ermöglichen HCV-Viruskulturen, die wiederum für eine Vielfalt an Zwecken nützlich sein können. Eine erfolgreiche Kultur des HCV-Virus ermöglicht die Entwicklung von Hemmern der viralen Replikation, von viralen Proteinen für diagnostische Anwendungen, von viralen Proteinen für Therapeutika und von viralen Antigenen mit einer spezifischen Struktur, umfassend, zum Beispiel vermeintliche HCV-Hüllen, vermeintliche HCV-E1 und vermeintliche HCV-E2 Fragmente.
Es gibt zahlreiche Zellinien, die für virale Reproduktion benutzt werden können und umfassen (sind aber nicht beschränkt auf), zum Beispiel primäre Hepatocyten, permanente oder semipermanente Hepatocyten, transfizierte Kulturen mit umwandelnden Viren oder umwandelnden Genen. Besonders nützliche Zellinien können zum Beispiel permanente Hepatocyt-Kulturen umfassen, die kontinuierlich irgendeine von mehreren Heterologen RNA-Polymerase-Gene exprimieren, um HCV-RNA-Sequenzen zu verstärken, unter der Kontrolle dieser spezifischen RNA-Polymerase-Sequenzen.
Quellen von HCV-viralen Sequenzen, die strukturelle Antigene kodieren, umfassen einen vermeintlichen Kern, vermeintliche E1- und vermeintliche E2-Fragmente. Man kann Expressionen in prokaryotischen und eukaryotischen Systemen erhalten. Die Expressionen der HCV-Proteine in Expressionssystemen der Säugetiere werden in Betracht gezogen für die Herstellung von glycosylierten Proteinen, wie die E1- und E2-Proteine. Diese glycosylierten Proteine haben einen diagnostischen Nutzen in verschiedenen Hinsichten, umfassend, zum Beispiel Assay-Systeme für die Screening-Verfahren und prognostische Anwendungen. Die Säugetier-Expressions von HCV-viralen Proteinen wird in Betracht gezogen für Studien über Hemmer, umfassend die Erklärung von besonderen viralen Anlagestellen oder Sequenzen und/oder viralen Rezeptoren auf empfindlichen Zelltypen, zum Beispiel Leberzellen und ähnliche.
Die Beschaffung von spezifischen Expressionsklonen, die wie hier beschrieben, entwickelt wurden in Expressionssysteme der Säugetiere, liefert Antigene für diagnostische Assays, die das Stadium der HCV-Infektion feststellen können, wie zum Beispiel, akute vs. fortdauernde oder persistente Infektionen und/oder frische Infektion gegenüber älterer Exposition. Diese spezifischen Expressionsklone liefern auch prognostische Maker zur Lösung der Krankheit, wie um die Lösung der Krankheit von der chronischen Hepatitis, die durch HCV verursacht ist, zu unterscheiden. Es wurde in Betracht gezogen, dass eine früher Serokonversion zu glycosylierten strukturellen Antigenen möglicherweise durch den Gebrauch von Proteinen ermittelt werden können, die in diesen Expressionssystemen der Säugetiere produziert werden. Antikörper, sowohl die monoklonalen als auch die polyklonalen, können auch aus Proteinen produziert werden, die von solchen Expressionssystemen der Säugetiere entstehen, die dann wieder für diagnostische, prognostische und therapeutische Anwendungen benutzt werden können. Auch Reagenzien, die aus diesen neuen Expressionssystemen, die hier beschrieben wurden sind, produziert werden, können zur Charakterisierung und/oder Isolierung von anderen infektiösen Agenten nützlich sein.
Proteine, die aus diesen Expressionssystemen der Säugetiere produziert wurden, sowie Reagenzien, die aus diesen Proteinen produziert wurden, können in geeignete Behälter untergebracht werden und als Testkits verpackt werden zur Bequemlichkeit in der Durchführung von Assays. Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen ein Polypeptid, das ein HCV-Epitop umfasst, das an eine festen Phase gebunden ist und ein Antikörper für das HCV-Epitop, der an die feste Phase gebunden ist. Auch eingeschlossen sind Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides, das ein HCV-Epitop enthält, das ausbrütende Gastzellen umfasst, die mit einem Expressionsvektor des Säugetieres transformiert sind, der eine Sequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, welches ein HCV-Epitop enthält, und zwar unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptides erlauben, und ein Polypeptid, das ein HCV-Epitop enthält, welches durch dieses Verfahren produziert wurde.
Die vorliegende Erfindung liefert Assays, die rekombinante oder synthetische Polypeptide benutzt, die durch die Erfindung geliefert werden, sowie die Antikörper, die hier in verschiedenen Assays beschrieben wurden, von denen manche eine Signal generierende Verbindung in dem Assay verwenden können. Assays, die nicht Signal-generierende Verbindungen benutzen, um Nachweismittel zu liefern, werden auch zur Verfügung gestellt. Alle beschriebenen Assays weisen generell entweder Entigene oder Antikörper oder beides nach und schließen das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit mindestens einem hier gelieferten Reagenz ein, um mindestens einen Antigen-/Antikörper-Komplex zu bilden und die Anwesenheit des Komplexes zu ermitteln. Diese Assays sind hier im Detail beschrieben.
In der Erfindung sind auch Impfungen zur Behandlung von HCV-Infektion umfassend ein immunogenes Peptid, das aus einem Expressionssystem der Säugetiere erhalten wurde, welches ein HCV-Epitop enthält oder eine inaktivierte Herstellung von HCV oder eine verdünnte Herstellung des HCV eingeschlossen. Auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern des HCV, umfassend die Verabreichungen an einem Individuum eines isolierten immunogenen Polypeptides, das ein HCV-Epitop in einer genügenden Menge enthält, um eine Immunantwort in einem geimpften Individuum zu erzeugen.
In der vorliegenden Erfindung wird auch eine Gewebezelle, die in einer Kultur gewachsen ist, die mit HCV infiziert ist, geliefert.
Der Ausdruck "Antikörper, der eine Körperkomponente enthält" (oder Testprobe) betrifft eine Komponente eines Körpers eines Individuums, die die Quelle ist für die Antikörper, die von Interesse sind. Diese Komponenten sind im Fachgebiet bekannt. Diese Proben schließen biologische Proben ein, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung getestet werden können, die hier beschrieben wurden und schließen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein, wie Vollblut, Serum, Plasma, zerebrospinale Flüssigkeit, Urin, Lymphenflüssigkeit und verschiedene externe Teile des Atmungs-, Intestinal- und Genitaltraktes, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutkörperchen, Myelomen und ähnlichen, biologischen Flüssigkeiten, wie überstehende Flüssigkeiten von Zellkulturen, Proben von festem Gewebe und Proben von festen Zellen.
Nach der Herstellung der rekombinanten Proteine, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, können die rekombinanten Proteine benutzt werden, um einzigartige Assays zu entwickeln, wie hier beschrieben und so die Anwesenheit eines Antigens als auch eines Antikörpers des HCV zu ermitteln. Diese Zusammensetzungen können auch benutzt werden, um monoklonale und/oder polyklonale Antikörper mit einem besonderen rekombinanten Protein zu entwickeln, das spezifisch an einem immunologischen Epitop des HCV bindet, wie es vom Fachmann erwünscht ist. Es wird auch betrachtet, dass mindestens eines der rekombinanten Proteine der Erfindung benutzt werden kann, um Impfungen durch Folgen von Verfahren zu entwickeln, die im Fachgebiet bekannt sind.
Es wird betrachtet, dass das benutzte Reagenz für den Assay in Form eines Kits mit einem oder mehreren Behältern, wie Fläschchen oder Flaschen geliefert werden kann, wobei jeder Behälter ein getrenntes Reagenz enthält, wie einen monoklonalen Antikörper oder ein Gemisch an monoklonalen Antikörpern oder ein Polypeptid (entweder rekombinant oder synthetisch), der in den Assays benutzt wurde.
"Feste Phasen" ("feste Träger") sind für den Fachmann bekannt und schließem die Schachtwände eines Reaktionsschachtes, Reagenzgläser, Polystyrolkügelchen, magnetische Kugeln, Nitrozellulosestreifen, Membranen, Mikropartikel, wie Latexpartikel und andere ein. Die "feste Phase" ist nicht kritisch und kann von einem Fachmann ausgesucht werden. Folgendermaßen sind Latexpartikel, Mikropartikel, magnetische oder nicht-magnetische Kugeln, Membranen, Plastikröhre, Mikrotiterschachtwände, Glas-oder Siliziumchips und rote Blutkörperchen von Schafen alle geeignete Beispiele. Geeignete Verfahren zur Immobilisierung der Peptide auf feste Phasen schließen ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und ähnliche ein. Eine "feste Phase", wie hier benutzt, verweist auf jedes Material, das unlöslich ist oder das durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann wegen ihrer intrisischen Fähigkeit das Abfangreagenz an sich zu ziehen und zu immobilisieren, ausgesucht werden. Ersatzweise kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor zurückhalten, der die Fähigkeit hat, das Abfangreagenz an sich zu ziehen und zu immobilisieren. Dieser Zusatzrezeptor kann eine geladene Substanz umfassen, die entgegengesetzt geladen ist, gegenüber dem Abfangreagenz oder gegenüber einer geladenen Substanz, die mit dem Abfangreagenz konjugiert ist. Als weitere Möglichkeit kann das Rezeptormolekül jedes spezifisch bindende Glied sein, das auf der festen Phase immobilisiert ist (gebunden ist) und das die Fähigkeit hat, das Abfangreagenz durch eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül ermöglicht das indirekte Binden des Abfangreagenz an festen Phasenmaterialien vor der Durchführung des Asasys oder während des Assays. Die feste Phase kann solchermaßen ein Kunststoff sein, ein derivatisierter Kunststoff, ein magnetisches oder nicht-magnetisches Metall, eine Glas- oder Siliziumoberfläche eines Reagenzglases, ein Mikrotiterschacht, ein Blatt, ein Kügelchen, ein Mikropartikel, ein Chip und andere Gestaltungen, die vom Fachmann bekannt sind.
Es wird betrachtet und im Schutzumfang der Erfindung ein geschlossen, dass die feste Phase auch jedes geeignete poröse Material umfassen kann, mit genügender Porosität, um den Zugang durch die Ermittlungs-Antikörper zu ermöglichen und eine geeignete Oberflächenaffinität, um Antigene zu binden. mikroporöse Strukturen werden generell bevorzugt, aber Materiealien mit Gelstruktur im hydratisierten Zustand können auch benutzt werden. Solche nützlichen festen Träger schließen folgendes ein:
natürliche polymere Kohlenhydrate und ihre synthetisch modifizierte, quervernetzte oder substituierte Derivate, wie Agar, Agarose, quervernetzte Algensäure, substituierte und quervernetzte Guargummis, Zellulose-Ester, besonders mit Salpetersäure und Karbonsäure, gemischte Zellulose-Ester und Zellulose-Ester; natürliche Polymere, die Stickstoff enthalten, wie Proteine und Derivate, umfassend quervernetzte oder modifizierte Gelatine; natürliche polymere Kohlenwasserstoffe, wie Latex und Gummi; synthetische Polymere, die mit geeigneten porösen Strukturen hergestellt werden können, wie Vinylpolymere, umfassend, Polyethylene, Polypropylene, Polystyrene, Polyvinylchloride, Polyvinylacetate und ihre teilweise hydrolysierten Derivate, Polyacrylamide, Polymethacrylate, Copolymere und Terpolymere der oben genannten Polykondensate, wie Polyester, Polyamide und andere Polymere, Polyurethane oder Polyepoxide; poröse anorganische Materiealien, wie Sulfate oder Karbonate der Alkali-Erd-Metalle und Magnesium, umfassend Bariumsulfat, Kalziumsulfat, Kalziumcarbonat, Silikate der Alkali- und Erdalkalimetalle, Aluminium und Magnesium; und Aluminium- oder Siliziumoxide oder Hydrate, wie Tone, Aluminiumoxid, Talk, Kaolin, Zeolit, Silikagel oder Glass (diese Materiealien können als Filter mit den oben beschrieben polymeren Materialien benutzt werden); und Mischungen oder Copolymere der oben beschriebenen Klassen, wie Pfropf-Copolymere, die erhalten wurden, durch initialisierte Polymerisation eines synthetischen Polymers auf einem vorher existierenden natürlichen Polymer. All diese Materialien können in geeigneten Formen benutzt werden, wie Filme, Folien oder Platten oder sie können beschichtet werden auf oder gebunden werden an oder angeklebt werden an geeignete inerte Trägerstoffe, wie Papier, Glas, Kunststoffilme oder Stoffe.
Die poröse Struktur der Nitrozellulose hat exzellente Absorptions- und Adsorptionseigenschaften für ein breites Band an Reagenzien, umfassend monoklonale Antikörper. Nylon besitzt auch ähnliche Eigenschaften und ist auch geeignet. Es wurde betrachtet, dass solche porösen festen Träger, die hier oben beschrieben wurden, vorzugsweise in Form von Folien der Dicke von circa 0,01 bis 0,5 mm, vorzugsweise circa 0,1 mm sind. Die Porengröße kann variieren in einem großen Bereich und ist bevorzugt von circa 0,025 bis 15 Mikrons, besonders von circa 0,15 bis 15 Mikrons. Die Oberflächen solcher Träger können aktiviert werden durch chemische Prozesse, wie eine kovalente Bindung des Antigens oder Antikörper mit dem Träger verursachen. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörper wird erhalten, schließlich generell durch Absorption an porösem Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte. Geeignete feste Träger werden auch in der US Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 227,272 beschrieben.
Das "Indikator-Reagenz" umfasst eine "Signal-generierende Verbindung" (Markierung), die die Fähigkeit hat, ein messbares Signal zu generieren, das durch externe Mittel ermittelbar ist, die konjugiert (gebunden) sind an einem spezifischen Bindeglied für HCV. "Spezifisches Bindeglied", wie es hier benutzt wird, bedeutet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares. Das bedeutet, zwei verschiedene Moleküle, wo eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Außer einem Antikörperglied eines spezifischen Bindungspaares für HCV zu sein, kann das Indikator-Reagenz auch ein Glied von irgend einem des spezifischen Bindungspaares sein, umfassend Hapten-Anti-Hapten-Systeme, sowie Biotin oder Anti-Biotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lektin, eine komplementäre Nukleotidsequenz, ein Effektor- oder ein Rezeptormolekül, ein Enzymkofaktor und ein Enzym, ein Enzymhemmer oder ein Enzym. Ein immunoreaktives spezifisches Bindeglied kann ein Antikörper sein, ein Antigen oder ein Antikörper-/ Antigen-Komplex, der die Fähigkeit hat, zu binden, entweder an HCV, wie in einer Sandwich-Probe, an das Abfangreagenz, wie in einer Konkurrenzprobe oder an ein spezifisches Hilfsbindeglied, wie in einer indirekten Probe.
Die verschiedenen betrachteten "Signal-generierenden Verbindunge" (Markierungen) schließen Chromogene, Katalysatoren, wie Enzyme, lumineszente Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemiluminescente Verbindungen, radioaktive Elemente und direkt sichtbare Markierungen ein. Beispiele der Enzyme schließen Alkaliphosphatase, Meeretisch-Peroxidate, Beta-Galaktosidase und ähnliche ein. Das Aussuchen einer besonderen Markierung ist nicht kritisch, aber sie wird die Fähigkeit haben, das Signal entweder selbst oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen zu produzieren.
Die verschiedenen betrachteten "Signal-generierenden Verbindungen" (Markierungen) schließen Chromogene, Katalysatoren, wie Enzyme, lumineszente Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente Verbindungen, wie Acridinium, Phenanthridinium und Dioxetan-Verbindungen, radioaktive Elemente und direkt sichtbare Markierungen ein. Beispiele der Enzyme schließen Alkaliphosphatase, Meeretisch-Peroxidate, Beta-Galaktosidase und ähnliche ein. Das Aussuchen einer besonderen Markierung ist nicht kritisch, aber sie wird die Fähigkeit haben, das Signal entweder selbst oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen zu produzieren.
Auch andere Ausführungsformen, die verschiedene andere feste Phasen benutzen, werden in Betracht gezogen und sind im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen. Zum Beispiel Ionen-Abfang-Methoden zur Immobilisierung und Mobilisierungsreaktionskomplex mit einem negativ geladenen Polymer, beschrieben in der mit-anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 150,278 entsprechend der EP-Veröffentlichung 0 326 100 und in der US Patentanmeldung mit der Seriennummer 375,029 (EP-Veröffentlichung 0 406 473), die beide der Inhaberin der vorliegenden Anmeldung gehören, können benutzt werden, gemäß der vorliegenden Erfindung, um eine schnelle Lösungsphase immunochemische Reaktion zu ergeben. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird von dem Rest der Reaktionsmischung durch ionische Wechselwirkungen zwischen den negativ geladenen Poly-Anion/Immunkomplex und die vorher behandelte positiv geladenen poröse Matrix getrennt, und ermittelt durch vorher beschriebene verschiedene Signal-generierenden Systeme, umfassend die, die in chemilumineszenten Signalmessungen beschrieben wurden, wie in der mitanhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 921,979 entsprechend der EPO-Veröffentlichung Nr. 0 273 115, beschrieben, die der Inhaberin der vorliegenden Anmeldung gehört und die hier dem Inhalt nach durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch für den Gebrauch in Systemen angepasst werden, die Mikropartikel-Technologie benutzen, einschließlich in automatischen und semiautomatischen Systemen, in denen die feste Phase einen Mikropartikel umfasst. Solche Systeme schließen jene ein, die in der mit-anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 425,651 und 425,643, die den veröffentlichten EPO-Anmeldungen Nr. EP 0 425 633 und EP 0 424 634 entsprechen, beschrieben wurden.
Der Gebrauch der Rasterkraft-Mikroskopie (RKM) für Immuno-Assays ist auch eine Technologie auf die die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung leicht anwendbar sind. In der Rasterkraft-Mikroskopie, besonders in der atomaren Kraft-Mikroskopie, ist die Abfangphase, zum Beispiel mindestens eine der monoklonalen Antikörper der Erfindung, an einer festen Phase angehaftet und eine Rasterkraft-Mikroskopie wird benutzt, um Antigen-/Antikörper-Komplexe zu ermitteln, die auf der Oberfläche der festen Phase anwesend sein können. Der Gebrauch der Raster-Tunnel-Mikroskopie beseitigt den Bedarf an Markierungen, die normalerweise benutzt werden müssen in vielen Immuno-Assay-Systemen, um Antigen-/Antikörper-Komplexe zu ermitteln. So ein System wird in der mit-anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer Nr. 662,147 beschrieben, die der Inhaberin der vorliegenden Anmeldung gehört.
Der Gebrauch der Rasterkraft-Mikroskopie zur Überwachung von spezifischen Bindungsreaktionen kann in verschiedenen Weisen stattfinden. In einer Ausführungsform wird ein Glied eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische Substanz, die der monoklonale Antikörper der Erfindung ist) an einer Oberfläche gebunden werden, die für das Rastern geeignet ist. Die Bindung der Analyt-spezifischen Substanz kann durch Adsorption an einem Testteil geschehen, der eine feste Phase einer Kunststoff- oder Metalloberfläche umfasst, gefolgt von Verfahren, die vom Fachmann bekannt sind. Oder es kann eine kovalente Bindung eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische Substanz) benutzt werden an einem Testteil, der eine feste Phase aus derivatisiertem Kunststoff, Metall, Silizium oder Glas umfasst. Kovalente Bindungsmethoden sind dem Fachmann bekannt und schließen eine Vielfalt an Mitteln zur irreversiblen Bindung zwischen den spezifischen Bindungspartnern und den Testteilen. Wenn das Testteil Silizium oder Glas ist, muss vor dem Binden des spezifischen Bindungspartners die Oberfläche aktiviert werden. Aktivierte Silanverbindungen, wie Triethoxyaminopropylsilan (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Luuis, MO), Triethoxyvinylsilan (Aldrich Chemical Co., St. Luois, MO) und (3-Mercapto-propyl)-trimethoxysilan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) können benutzt werden, um reaktive Gruppen, wie Amino-, Vinyl und Thiol jeweils einzubringen. Solche aktivierten Oberflächen können benutzt werden, um Bindungspartner direkt zu binden (im Falle der Amino und Thiol) oder die aktivierte Oberfläche kann weiter reagieren mit Bindungspartnern, wie Glutaraldehyd, bis(Succinimidyl)suberat, SPPD 9 Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionat), SMCC (succinimidyl-4-[4-maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat), SIAB (Succinimidyl [4-iodoacetyl]aminobenzoat) und SMPB (Succinimidyl 4-[1-maleimidophenyl]butyrat), um den Bindungspartner von der Oberfläche zu trennen. Die Vinylgruppe kann oxidiert werden, um Mittel zu liefern für eine kovalente Bindung. Sie wird auch als Anker für die Polymerisation von verschiedenen Polymeren, wie Polyacrylsäure, benutzt werden, die mehrere Bindungsstellen für spezifische Bindungspartner liefern kann. Die Amino-Oberfläche kann mit oxidierten Dextranen mit verschiedenen Molekulargewicht reagieren, um hydrophile Bindeglieder mit verschiedener Größe und Fähigkeit zu liefern. Beispiele von oxidierbaren Dextranen umfassen Dextran T-40 (Molekulargewicht 40.000 Daltons), Dextran T-110 (Molekulargewicht 110.000 Daltons), Dextran T-500 (Molekulargewicht 500.000 Daltons), Dextran T-2M (Molekulargewicht 2.000.000 Daltons) (die alle erhältlich sind von Pharmacia, LOCATION) oder Ficoll (Molekulargewicht 70.000 Daltons erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Es können auch Polyelektrolyt-Wechselwirkungen benutzt werden, um einen spezifischen Bindungspartner auf der Oberfläche eines Testteils zu immobilisieren, durch die Techniken und die Chemie, die in der mit-anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 150,278, eingereicht am 29. Januar 1988 und 375,029, eingereicht am 7. July 1989, beschrieben sind, von denen beide der Inhaberin der vorliegenden Anmeldung gehören. Das bevorzugte Verfahren zur Bindung ist durch kovalente Mittel. Nach der Bindung eines spezifischen Bindungsglieds, kann die Oberfläche weiter behandelt werden mit Materialien, wie Serum, Proteinen oder anderen Blockern, um die nicht-spezifischen Bindungen zu minimieren. Die Oberfläche kann auch gerastert werden, entweder bei der Herstellung oder am Zeitpunkt des Gebrauchs, um seine Eignung für die Assay-Zwecke zu prüfen. Es wird nicht erwartet, dass der Raster-Prozess die spezifischen Bindungseigenschaften des Testteils ändert.
Es können verschiedene andere Assay-Formate benutzt werden, umfassend die "Sandwich"-Immunoassays und die Konkurrenz-Proben- Assays. Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper, die aus den Proteinen der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, in verschiedenen Assay-Systemen benutzt werden, um die Anwesenheit, wenn überhaupt, von HCV-Proteinen in einer Testprobe zu ermitteln. Fragmente dieses gelieferten monoklonalen Antikörpers können auch benutzt werden. Zum Beispiel, in einem ersten Assay-Format, wird ein polyklonalen oder monoklonalen Anti-HCV-Antikörper oder ein Fragment davon oder ein Gemisch dieser Antikörper, das auf der festen Phase aufgeschichtet worden ist, in Kontakt gebracht mit einer Testprobe, die HCV-Proteine enthalten kann, um ein Gemisch zu bilden. Dieses Gemisch wird ausgebrütet für eine Zeit und unter Bedingungen die genügend sind, um Antigen-/Antikörper-Komplexe zu bilden. Dann wird ein Indikator-Reagenz umfassend einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, das spezifisch an dem HCV-Fragment bindet, oder ein Gemisch dieser Antikörper, an denen eine Signal-generierende Verbindung gebunden wurde, mit den Antigen-/Antikörper-Komplexen in Kontakt gebracht, um ein zweites Gemisch zu bilden. Dieses zweite Gemisch wird dann für eine Zeit und unter Bedingungen ausgebrütet, die genügen, um Antikörper-/Antigen-/Antikörper-Komplexe zu bilden. Die Anwesenheit des HCV-Antigen, das in der Testprobe anwesend ist und auf der festen Phase eingefangen ist, wenn überhaupt, wird festgestellt durch die Ermittlungen der messbaren Signale, die von der Signal-generierenden Verbindung generiert werden. Die in der Testprobe anwesende Menge des HCV-Antigens ist proportional zu dem generierten Signal.
Ersatzweise wird ein polyklonaler oder monoklonaler Anti-HCV-Antikörper oder ein Fragment davon oder ein Gemisch dieser Antikörper, das an einen festen Träger gebunden ist, die Testprobe und ein Indikator-Reagenz umfassend einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder Fragmente davon, der bzw. die spezifisch an einem HCV-Antigen binden oder ein Gemisch dieser Antikörper, an denen eine Signal-generierende Verbindung gebunden ist, in Kontakt gebracht, um ein Gemisch zu bilden. Dieses Gemisch wird ausgebrütet für eine Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um ein Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden. Die Anwesenheit, wenn überhaupt, der HCV-Proteine, die in der Testprobe anwesend sind und die in der festen Phase eingefangen sind, wird festgestellt durch Ermittlungen der messbaren Signale, die durch die Signal-generierende Verbindung generiert wurden. Die in der Testprobe anwesende Menge an HCV-Proteinen ist proportional zum generierten Signal.
In einem anderen Assay-Format, können ein oder ein Gemisch aus einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern der Erfindung benutzt werden als Konkurrenzprobe zur Ermittlung der Antikörper für das HCV-Protein. Zum Beispiel können HCV-Proteine, entweder allein oder im Gemisch auf einer festen Phase beschichtet werden. Eine Testprobe, von der vermutet wird, sie umfasse Antikörper zum HCV-Antigen, wird dann ausgebrütet mit einem Indikator-Reagenz, umfassend eine Signal-generierende Verbindung und mindestens einen monoklonalen Antikörper der Erfindung für eine Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um Antigen/ Antikörper-Komplexe zu bilden von entweder der Testprobe und dem Indikator-Reagenz auf der festen Phase oder von Indikator-Reagenz auf der festen Phase. Die Reduktion bei der Bindung des monoklonalen Antikörpers auf der festen Phase kann quantitativ gemessen werden. Eine messbare Reduktion des Signals verglichen mit dem Signal, das generiert wird aus einer bestätigten negativen NANB-Hepatitis-Testprobe, zeigt die Anwesenheit von Anti-HCV-Antikörper in der Testprobe.
In einem weiteren Ermittlungverfahren, kann jedes der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung benutzt werden, zur Ermittlung der HCV-Antigene in festen Gewebeabschnitte, wie auf festen Zellen durch immuno-histochemische Analyse.
Zusätzlich können diese monoklonalen Antikörper an Matrizen gebunden werden, die ähnlich sind zur CNBr-aktivierte Sepharose, und können für die Affinitätsreinigung von spezifischen HCV-Proteinen aus Zellkulturen oder biologische Gewebe, wie Blut und Leber, benutzt werden.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch für die Bildung von chimerischen Antikörpern für therapeutischen Gebrauch oder andere ähnliche Anwendungen benutzt werden.
Die monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon können einzeln geliefert werden, um HCV-Antigene zu ermitteln. Gemische aus monoklonalen Antikörper (und Fragmente davon), wie sie hier geliefert werden, können auch zusammen benutzt werden, als Komponenten in einem Gemisch oder "Cocktail" aus mindestens einen Anti-HCV-Antikörper der Erfindung mit Antikörper für andere HCV-Regionen, wobei jedes verschiedene Bindungsspezifitäten hat. Folgendermaßen kann dieser "Cocktail" die monoklonalen Antikörper der Erfindung umfassen, die auf HCV-Proteine gerichtet sind und andere monoklonale Antikörper, die auf andere antigene Determinanten des HCV-Genoms gerichtet sind.
Der polyklonale Antikörper oder Fragmente davon, die in den Assay-Formaten benutzt werden, sollten spezifisch binden an eine spezifische HCV-Stelle oder an anderen in dem Assay benutzten HCV-Proteine. Der benutzte polyklonale Antikörper stammt vorzugsweise aus Säugetieren; es können menschliche, Ziegen-, Hasen- oder Schaf-Anti-HCV-polyklonale Antikörper benutzt werden. Vorzugsweise ist der polyklonale Antikörper ein Hasenpolyklonaler Anti-HCV-Antikörper. Die polyklonalen Antikörper, die in den Assays benutzt wurden, können entweder allein oder als ein Cocktail an polyklonalen Antikörpern benutzt werden. Da die in den Assay-Formaten benutzten Cocktails entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper umfassen, die eine verschiedene HCV-Spezifität haben, sind sie nützlich für Diagnose, Auswertung und Prognose von HCV-Infektionen, sowie für Studien über die Differenzierung und Spezifität des HCV-Proteins.
In einem anderen Assay-Format kann die Anwesenheit von Antikörper und/oder Antigen des HCVs ermittelt werden in einer gleichzeitigen Untersuchung, wie folgt. Eine Testprobe wird gleichzeitig in Kontakt mit einem Abfangreagenz des ersten Analyts in Kontakt gebracht, indem das Abfangreagenz ein erstes Bindeglied umfasst, das spezifisch für einen ersten Analyt ist, der an einer festen Phase gebunden ist und ein Abfangreagenz für einen zweiten Analyten, indem das Abfangreagenz ein erstes Bindeglied umfasst für einen zweiten Analyten, der an einer zweiten festen Phase gebunden ist, um dadurch ein Gemisch zu bilden. Dieses Gemisch wird ausgebrütet für eine Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um Abfangreagenz/erster Analyt – und Abfangreagenz/zweiter Analyt – Komplexe zu bilden. Diese so gebildeten Komplexe werden dann in Kontakt gebracht mit einem Indikator-Reagenz umfassend ein Glied eines Bindungspaares, der spezifisch für den ersten Analyt ist, der markiert wird mit einer Signal-generierenden Verbindung und ein Indikator-Reagenz umfassend ein Glied eines Bindungspaares, der spezifisch für einen zweiten Analyten ist, der markiert wird mit einer Signalgenerierenden Verbindung, um eine zweite Mischung zu bilden. Dieses zweite Gemisch wird ausgebrütet für eine Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um Abfangreagenz/erster Analyt/Indikator-Reagenz-Komplexe und Abfangreagenz/zweiter Analyt/Indikator-Reagenz-Komplexe zu bilden. Die Anwesenheit von einen oder mehreren Analyten wird festgestellt durch Ermittlung eines Signals, das generiert wird, im Zusammenhang mit den Komplexen, die entweder auf jeder oder auf beiden festen Phasen gebildet wurden, als Anzeige der Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten in der Testprobe. In diesem Assay-Format, können Proteine, die aus menschlichen Expressions-Systemen stammen, benutzt werden, sowie monoklonale Antikörper, die aus Proteinen hergestellt wurden, die aus Expressionssystemen der Säugetiere stammen, wie hier offenbart. Solche Assay-Systeme werden detaillierter Beschrieben in der mit-anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/574,821, mit dem Titel gleichzeitiger Assay zur Ermittlung von einem oder mehreren Analyten, eingereicht am 29. August 1990, die der Inhaberin der vorliegenden Anmeldung gehört.
In anderen Assay-Formaten können rekombinante Proteine benutzt werden, um die Anwesenheit von Anti-HCV in Testproben zu ermitteln. Zum Beispiel wird eine Testprobe ausgebrütet mit einer festen Phase, an der mindestens ein rekombinantes Protein gebunden wurde. Diese ließ man reagieren für eine Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden. Nach dem Ausbrüten wird der Antigen/Antikörper-Komplex ermittelt. Indikator-Reagenzien können benutzt werden, um die Ermittlung zu erleichtern. In Abhängigkeit von den ausgewählten Untersuchungs-Systemen. In einem anderen Assay-Format wird eine Testprobe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, an der ein rekombinantes Protein, hergestellt wie hier beschrieben, gebunden ist, und auch wird sie mit einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der für das Protein spezifisch ist, welches vorzugsweise mit einem Indikator-Reagenz markiert wurde. Nach der Ausbrütung für eine Zeit und unter den Bedingungen, die genügen, um Antikörper/Antigen-Komplexe zu bilden, wird die feste Phase von der freien Phase getrennt und die Markierung wird ermittelt in entweder der festen oder der freien Phase, als Anzeige der Anwesenheit des HCV-Antikörpers. Es werden andere Assay-Formate, die die Proteine der vorliegenden Erfindung benutzen, in Betracht gezogen. Diese umfassen das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einer festen Phase an der mindestens ein rekombinantes Protein gebunden wurde, das im Expressionssystem der Säugetiere hergestellt wurde, das Ausbrüten der festen Phase un der Testprobe für eine Zeit und Unter Bedingungen die genügen, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden, und dann das In-Kontakt-Bringen der festen Phase mit einem markierten rekombinanten Antigen. Assays wie diese und andere werden beschrieben in der mit-anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/787,710, die der Inhaberin der vorliegenden Anmeldung gehört.
Während die vorliegende Erfindung die Vorzüge offenbart für den Gebrauch von festen Phasen, wird betrachtet, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung auch in nicht-festen Phasen-Assay-Systemen benutzt werden können. Diese Assay-Systeme sind vom Fachmann bekannt und werden als im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegend, betrachtet.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch Beispiel erklärt, die als Darstellung verstanden werden und nicht als Einschränkung des Geistes und des Schutzumfangs der Erfindung.
BEISPIELE
Beispiel 1: Generierung von HCV-genomischen Klonen
RNA, das isoliert wurde aus dem Serum oder Plasma eines Schimpansen (bezeichnet als "CO"), der experimentell mit HCV infiziert wurde oder eines HCV-seropositiven menschlichen Patienten (bezeichnet als "LG"), wurde zu cDNA überschrieben, durch die reverse Transkriptase, und zwar durch die Verwendung von entweder Zufalls-Hexamer-Primere oder spezifische Anti-Sense-Primere, die aus dem Prototyp HCV-1 Sequenz stammen. Die Sequenz wurde von Choo et al. berichtet (Choo et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455 [1991] und ist durch die GenBank Datenbank, Zugangsnummer M62321 erhältlich). Diese cDNA wurde dann amplifiziert mit PCR und AmpliTaq^® DNA-Polymerase (erhältlich in Gene Amp Kit^® von Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conneticut 06859), in dem man entweder einen zweiten Sense-Primer, der ca. 100–2000 Nukleotide stromabwärts gegenüber den spezifischen Anti-Sense-Primer befindlich ist, oder ein paar Sense- und Anti-Sense-Primer, die einen 1000–2000 Nukleotid-Fragment des HCVs angrenzen. Nach 25 bis 35 Amplifikations-Zyklen, gefolgt durch Standardmethoden, die im Fachgebiet bekannt sind, wird ein Teil dieses Reaktionsgemisches einem Satz PCR (oder "PCR-2") ausgesetzt, in dem ein paar von Sense- und Anti-Sense-Primer, das sich intern gegenüber dem Ausgangspaar der PCR Primer befindet, benutzt wurde, um weiterhin HCV-Gen-Segmente zu amplifizieren, in Mengen, die genügen für Analyse und Subklone, in dem man endonuklease Erkennungs-Regionen benutzt, die im zweiten Satz der PCR Primer anwesend sind. Auf diese Art und Weise konnten sieben benachbarte HCV-DNA-Fragmente gebildet werden, die dann zusammengesetzt werden können, durch die allgemeine Klon-Strategie, die in der 1 dargestellt und beschrieben ist. Die Stelle der spezifischen Primer, die in dieser Art und Weise benutzt werden, wird in der Tabelle 1 vorgestellt und sie werden nummeriert gemäß der HCV-1-Sequenz, die von Choo et al. (GenBank Datenbank, Zugangsnummer M62321) berichtet wird. Vor der Zusammensetzung, wurde die DNA-Sequenz von jedem der individuellen Fragmente ermittelt und in die genomischen Aminosäure-Sequenzen übersetzt, die in den Sequenz-ID-Nr. 1 und 2 für jeweils CO und LG dargestellt sind. Ein Vergleich des genomischen Polypeptides von CO mit den von HCV-1, zeigte 98 Aminosäuren-Unterschiede. Ein Vergleich des genomischen Polypeptides von CO mit dem von LG zeigte 150 Aminosäuren-Unterschiede. Ein Vergleich des genomischen Polypeptides von LG mit dem von HCV-1 zeigte 134 Aminosäuren-Unterschiede.
Beispiel 2: Expression des HCV-E2-Protein als Verschmelzung mit den Amyloid Precursor Protein (APP)
Das HCV-E2-Protein, das aus dem CO, wie in Beispiel 1 beschrieben entwickelt wurde, wurde exprimiert als eine Verschmelzung mit dem Amyloid Precursor Protein (APP). APP wurde beschrieben von Kang et al., Nature 325: 733–736 (1987). Kurz gesagt, wurden die HCV-Aminosäuren 384–749 des isolierten CO benutzt, um die Mehrheit der APP kodierenden Sequenz, wie in der 2 gezeigt, auszutauschen. Ein HindIII-Styl DNA Fragment, das das terminale Amin der 66 Aminosäure darstellt und ein BgIII-Xbal Fragment, das das terminale Carboxyl der 105 Aminosäure des APP darstellt, wurden an einen PCR gebunden, das aus einen HCV Fragment des CO stammt, das HCV Aminosäuren 384–749 darstellt, die Styl und BgIII Restriktionsstellten an ihren jeweiligen 5'- und 3'-Enden umfassen. Diese APP-HCV-E2 Verschmelzungs-Gen-Kassette wurde dann in kommerziell erhältlichen Expressionsvektoren der Säugetiere pRC/CMV geklont, wie in der 3 gezeigt, (erhältlich von Invitrogen, San Diego, CA) nur an den HindIII und Xbal-Stellen. Nach der Transformation in E. coli DH5a, wurde ein Klon, der als pHCV-162 bezeichnet wurde, isoliert, was die Expression der APP-HCV-E2 Verschmelzungs-Gen-Kassette unter der Kontrolle des starken CMV-Promoters brachte. Die komplette Nukleotid-Sequenz des Expressionsvektors des Säugetieres pHCV-162 wird in der Sequenz-ID-Nr. 3 vorgestellt. Translation der Nukleotide 922 bis 2535 ergibt sich in der kompletten Aminosäure-Sequenz des APP-HCV-E2 Fusionsproteins, das durch pHCV-162 exprimiert wird, wie in der Sequenz-ID-Nr. 4 dargestellt.
Eine mit menschlichen Adenovirus Typ 5 transformierte primäre Zellinie einer menschlichen embrionischen Niere (HEK = Human Embryonic Kidney), bezeichnet als HEK-293, wurde für alle Transfektions- und Expressionsanalysen benutzt. HEK-293-Zellenwurden in einen Minimum-Essential-Medium (MEM) erhalten, das mit 10% Serum eines fötalen Kalb-Serums (FCS = Fetal Calf Serum), Penizillin und Streptomycin ergänzt wurde.
Circa 20 μg gereinigte DNA von pHCV-162 wurden in HEK-293-Zellen transfiziert, indem man das modifizierte Kalziumphosphat- Protokoll benutzte, wie durch Chen et al., Molecular and Cellular Biology 7(8): 2745–2752 (1987) berichtet. Die Kalziumphosphat-DNA-Lösung wurde ausgebrütet in den HEK-293-Zellen für circa 15 bis 24 Stunden. Die Lösung wurde entfernt, die Zellen wurden zweimal gewaschen mit MEM-Media und dann wurden die Zellen in MEM-Media ausgebrütet für zusätzliche 24 bis 48 Stunden. Um die Proteinexpression zu analysieren, wurden die transfizierten Zellen metabolisch markiert mit 100 μCi/ml S–35 Methionin und Cystein für 12 bis 18 Stunden. Die Kultur-Medien wurden entfernt und gelagert und die Zellen wurden gewaschen in MEM-Media und dann in Phosphatpuffersalz in (PBS) lysiert, welches 1% Triton X-100^® (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,1% Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und 0,5% Deoxychlorat, bezeichnet als PBS-TDS, enthält. Dieses Zell-Lysat wurde dann bei –70°C für 2 bis 24 Stunden eingefroren, auf Eis aufgetaut und dann gereinigt durch Zentrifugierung bei 50000 x g-Kraft für eine Stunde bei 4°C. Es wurden dann Standard-Radio-Immuno-Präzipitate-Assays (RIPAs) an den markierten Zell-Lysaten und/oder Kulturmedien durchgeführt. In wenigen Worten, wurden markierte Zell-Lysate und/oder Kulturmedien ausgebrütet mit 2 bis 5 μl eines spezifischen Serums bei 4°C für eine Stunde. Protein-A-Sepharose wurde dann hinzugefügt und die Proben wurden weiter ausgebrütet für eine Stunde bei 4°C mit schütteln. Die droben wurden dann zentrifugiert und die Pellets mehrmals mit PBS-TDS-Puffern gewaschen. Proteine, die durch Immuno-Präzipitate aufgearbeitet wurden, wurden gelöst durch Aufheizen in einem Elektrophorese-Probe-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM Dithiothreitol [DTT], 2% SDS, 0,1% Bromphenol, blau und 10% Glycerol) für 5 Minuten bei 95°C. Die gelösten Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gele getrennt, die danach mit einem fluorographischen Reagenz behandelt, wie Enlightening^® (erhältlich NEN [DuPont], Boston, MA), unter Vakuum getrocknet und an einen Röntgenstrahlen-Film bei –70°C mit verstärkenden Aufnahmen ausgesetzt. 4 zeigt eine RIPA-Analyse des pHCV-162 transfizierten HEK-Zell-Lysates, das mit normalen menschlichem Serum (NHS) ausgefällt wurde, einen monoklonalen Antikörper, der gegen APP-Sequenzen gerichtet ist, die (MAB) ersetzt wurden und einen HCV-Antikörper positiven menschlichem Serum (#25). In der 4 werden auch die Kulturmedien (überstehende Flüssigkeit) dargestellt, die ausgefällt wurden mit dem gleichen HCV-Antikörper positiven menschlichen Sera (#25). Aus der 4 kann man erkennen, dass nur die niedrigen Pegel eines HCV-spezifischen Proteins von ungefähr 75 K Daltons in den Kulturmedien der mit pHCV-162 transfizierten HEK-293-Zellen ermittelt werden, wobei hohe Pegel an interzellularer Proteinexpression des APP-HCV-E2-Fusionsprotein von ungefähr 70 K Daltons ersichtlich sind.
Um dieses APP-HCV-E2-Fusionsprotein weiter zu charakterisieren, wurden polyklonale Antikörper von Hasen, die gegen synthetische Peptide gezüchtet wurden, in einem ähnlichen RIPA benutzt, von dem die Ergebnisse in der 5 dargestellt sind. Wie man aus dieser Figur erkennen kann, fällt das normale Hasenserum (NRS) nicht das 70 K Dalton-Protein aus, während die Hasensera, die gegen die HCV-Aminosäuren 509–551 (6512), HCV-Aminosäuren 380–436 (6521) und APP-Aminosäuren 45–62 (Anti-N-Terminus) gezüchtet wurden, sehr spezifisch für das 70 K Dalton APP-HCV-E2-Fusionsprotein sind.
Um die Sekretion dieses APP-HCV-E2-Fusionsproteins zu erhöhen, wurde ein anderer Klon generiert, der nur die terminalen Amin 66 Aminosäuren des APP verschmelzte, die die putative Sekretion der Signal-Sequenzen zu dem HCV-E2-Sequenzen enthalten. Zusätzlich wurde eine stark hydrophobe Sequenz gelöscht, beim terminalen Carboxyl-Ende der HCV-E2-Sequenz, das als potenzielle Transmembran-Überspannende Region erkannt wurde. Der erhaltende Klon wurde bezeichnet als pHCV-167 und ist schematisch in der 2 dargestellt. Die komplette Nukleotid-Sequenz pHCV-167 des Expressionsvektors der Säugetiere ist dargestellt in der Sequenz-ID-Nr. 5. Die Translation der Nukleotide 922 bis 2025 ergibt sich in der kompletten Aminosäure-Sequenz des APP-HCV-E2-Fusionsproteins, exprimiert durch pHCV-167, wie in der Sequenz-ID-Nr. 6 dargestellt. Gereinigtes DNA des pHCV-167 wurde transfiziert in HEK-293-Zellen und durch RIPA und Polyacrylamid-SNS-Gelen, wie hier vorher beschrieben, analysiert. 6 stellt die Ergebnisse dar, in denen eine Probe des normalen menschlichen Serums (NHS) versagte bei der Erkennung des APP- HCV-E2-Fusionsproteins anwesend, entweder im Zell-Lysat oder in der überstehenden Flüssigkeit der Zellen der HEK-293-Zellen, die mit pHCV-167 transfiziert wurden. Die positive Kontroll-Probe des HCV-Serum (#25), jedoch fällte eine ungefähr 65 K Dalton APP-HCV-E2-Fusionsprotein aus, das in dem Zell-Lysat der HEK-293-Zellen anwesend war, die mit pHCV-167 transfiziert wurden. Zusätzlich wurden wesentliche Mengen des abgeschiedenen APP-HCV-E2-Proteins von ungefähr 70 K Daltons aus den Kulturmedien durch das Serum #25 ausgefällt.
Es wurde eine Verdauung mit Endoglycosidase-H (Endo-H) durchgeführt, um das Ausmaß und die Zusammensetzung der N-gebundenen Glycosylierung festzustellen in den APP-HCV-E2-Fusionsproteins, exprimiert durch pHCV-167 und pHCV-162 in HEK-293-Zellen. In wenigen Worten, wurden mehrere Mengen an markierten Zell-Lysaten von pHCV-162 und pHCV-167 transfizierten HEK-293-Zellen mit menschlichem Serum #50 ausgefällt, welches einen Antikörper für das HCV-E2, wie vorher beschrieben, enthielt. Das Protein-A-Sepharose-Pellet, das einen immuno-ausgefällten Protein-Antikörper-Komplex enthielt, wurde dann wieder in Puffer (75 mM Natriumacetat, 0,05% SDS) suspendiert, der 0,05 Einheiten pro ml Endo-H (Sigma) enthielt oder nicht. Verdauungen wurden bei 37°C durchgeführt für 12 bis 18 Stunden und alle Proben wurden analysiert durch Polyacrylamid-SDS-Gele, wie vorher beschrieben. 7 zeigt die Ergebnisse der Endo-H-Verdauung. Kohlenstoff-14 markierte Molekulargewichts-Standards (MW) (erhalten von Amersham, Arlington Heights, IL) sind in allen Gelen gemeinsam und stellen jeweils 200 K, 92,5 K, 69 K, 46 K, 30 K und 14,3 K Daltons dar. Normales menschliches Serum (NHS) immuno-präzipitatiert das APP-HCV-E2-Fusionsprotein nicht, das durch entweder pHCV-162 oder pHCV-167 exprimiert wird, während das menschliche Serum, das für das HCV-E2-Antikörper (#50) positiv ist, ermittelt ohne weiteres das 72 K Dalton APP-HCV-E2-Fusionsprotein in pHCV-162 und das 65 K Dalton APP-HCV-E2-Fusionsprotein in pHCV-167. Verdauung dieser immuno-ausgefällten Proteine in Abwesenheit von Endo-H (#50 –Endo-H) wirkt sich nicht bedeutend auf die Menge oder die Beweglichkeit von entweder pHCV-162 oder pHCV-167 exprimierte Proteine aus. Ver dauung in Anwesenheit von Endo-H (#50 +Endo-H), jedoch, verringert drastisch die Beweglichkeit der Proteine, die durch pHCV-162 und pHCV-167 exprimiert werden, indem eine heterogene Größenverteilung erzeugt wird. Das vorausgesagte Molekulargewicht der nicht-glykosylierten Polypeptid-Kette des pHCV-162 ist ungefähr 59 K Daltons. Behandlung des pHCV-162 mit Endo-H verringert die Mobilität auf ein Minimum von ungefähr 44 K Dalton, was darauf hinweist, dass das APP-HCV-E2-Fusionsprotein, hergestellt durch pHCV-162, proteolitisch an das terminale Carboxyl-Ende gespalten ist. Eine Größe von ungefähr 44 K Dalton stimmt überein mit einer Spaltung bei oder in der Nähe der HCV-Aminosäure 720. Ähnlicher weise verringert die Behandlung des pHCV-167 mit Ende-H Immobilität auf ein Minimum von ungefähr 41 K Dalton, was vorteilhaft ist, verglichen mit dem vorausgesagten Molekulargewicht von ungefähr 40 K Dalton für das intakte APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-167.
Beispiel 3: Vermittlung der HCV-E2-Antikörper
Radio-Immuno-Präzipitat-Assays (RIPA) und Polyacrylamid-SDS-Gel-Analysen, die vorher beschrieben wurden, wurden benutzt, um zahlreiche Serum-Proben für die Anwesenheit von Antikörpern zu screenen, die gegen HCV-E2-Epitope gerichtet sind. Mit pHCV-162 transfizierte HEK-293-Zellen wurden metabolisch markiert und Zell-Lysate vorbereitet, wie vorher beschrieben. Zusätzlich zu den RIPA-Analysen wurden alle Serum-Proben für die Anwesenheit der Antikörper gescreent, die gegen spezifische HCV rekombinante Antigene gerichtet waren, die bestimmte Zonen des HCV-Genoms darstellen, indem man das Abbott-Matrix^® System benutzte (erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL 60064, U. S. No. Patent 5,075,077). In den in Tabellen 2 bis 7 dargestellten Matrix-Daten, bezeichnet C100 Hefe die NS4 Region, die HCV-Aminosäuren 1569–1930 enthält, C100 E. coli bezeichnet die HCV-Aminosäuren 1676–1930, NS3 bezeichnet die HCV-Aminosäuren 1192– 1457 und LORE bezeichnet HCV-Aminosäuren 1–150.
8 zeigt ein typisches RIPA-Ergebnis, das man erhalten wurde, durch Gebrauch von pHCV-162 Zell-Lysat, um amerikanische HCV-Antikörper-positive Blutspender und Transfusions-Empfänger zu screenen. Tabelle 2 fasst das Antikörper-Profil zusammen, dieser verschiedenen amerikanischen Blutproben, mit sieben aus siebzehn (41%) der Proben, die HCV-E2-Antikörper aufweisen. Genomische Variabilität in der E2-Region wurde nachgewiesen zwischen verschiedenen HCV-Isolaten, besonders in geographisch verschiedenen Isolaten, die zu Unterschieden in den Antikörper-Reaktionen führen können. Wir haben deshalb 26 japanische freiwillige Blutspender und 20 spanische Hemodialyse-Patienten, bei denen vorher gezeigt war, dass sie HCV-Antikörper enthalten, für die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern zum APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-162, gescreent. Die 9 und 10 zeigen die RIPA-Analysen der 26 japanischen freiwilligen Blutspender. Positive menschliche Kontroll-Sera (#50) und Molekulargewichts-Standards (MW) erscheinen in beiden Figuren, in denen spezifische Immuno-Präzipitate des ungefähr 72 K Dalton APP-HCV-E2-Fusionsproteins für verschiedene der getesteten Serum-Proben nachgewiesen ist. Die Tabelle 3 zeigt sowohl die APP-HCV-E2-RIPA- als auch die Abbott-Matrix-Ergebnisse, zusammenfassend die Antikörper-Profile von jedem der 26 getesteten japanischen Proben. Tabelle 4 zeigt ähnliche Daten für die 20 getesteten spanischen Hemodialyse-Patienten. Tabelle 5 fasst die RIPA-Ergebnisse zusammen, die man bei Benutzung von pHCV-162 erhält, um in diesen verschiedenen Proben HCV-E2 spezifische Antikörper zu ermitteln. 18 der 26 (69%) japanischen freiwilligen Blutspender, 14 von 20 (70%) spanischer Hemodialyse-Patienten und 7 der 17 (41%) amerikanische Blutspender oder Transfusions-Empfänger zeigten eine spezifischen Antikörper-Reaktion gegen das HCV-E2-Fusionsprotein. Die breite Immuno-Reaktivität, die von dem APP-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-162, bewiesen wurde, deutet auf die Erkennung von konservierten Epitopen innerhalb des HCV-E2 hin.
Serielle Blutproben aus 5 Transfussions-Empfängern, die zum HCV-Antikörper serokonvertiert wurden, wurden auch durch die Benutzung des APP-HCV-E2-Fusionsproteins, exprimiert durch pHCV-162, gescreent. Diese Analyse wurde durchgeführt, um den Zeit-Intervall festzustellen, an dem E2 spezifische Antikörper ermittelt werden können, nach der Aussetzung an HCV. Tabelle 6 zeigt einen solchen Patienten (AN), der zu NS3 bei 154 Tagen nach der Transfusion (DPT) serokonvertiert wurde. Es wurden keine Antikörper zum HCV-E2 durch RIPA bis zu 271 DPT ermittelt. Tabelle 7 zeigt einen anderen solchen Patienten (WA), der zu LORE serokonvertiert wurde, und zwar irgendwann vor dem 76 DPT, und er war positiv auf HCV-E2-Antikörper an dem nächsten erhältlichen Blutproben (103 DPT). Tabelle 8 fasst die serologischen Ergebnisse zusammen, die von diesen 5 Transfussions-Empfängern erhalten wurden und zeigt (a) manche generelle Antikörper-Profile bei Serokonversion (AB-Status); (b) die Tage nach der Transfusion, bei denen ein ELISA-Test mit größter Wahrscheinlichkeit HCV-Antikörper ermitteln konnte (2,0 GEN); (c) die Proben, in denen HCV-E2-Antikörper durch RIPA (E2 AB-Status) ermittelt wurden; und (d) die Zeit-Intervalle zwischen den getesteten Blutproben (getestete Proben). Die Ergebnisse zeigen, dass ein Antikörper für HCV-E2, wie ermittelt in den RIPA-Verfahren, wie hier beschrieben wurde, nach Serokonversion zu mindestens einem anderen HCV-Marker (CORE, NS3, C100 etc.) erscheint und er ist anhaltend, wenn es einmal erscheint. Zusätzlich scheint die Abwesenheit von. Antikörpern zu dem strukturellen Gen CORE mit der Abwesenheit von ermittelbaren Antikörpern zu E2, einen anderen vermeintlich strukturellem Gen, stark korreliert zu sein. Weitere Arbeiten gehen weiter, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von HCV-Gen-spezifischen Antikörpern mit der Weiterentwicklung der Krankheit und/oder dem Zeit-Intervall nach der Aussetzung an HCV-viralen Antigenen in Korrelation zu bringen.
Beispiel 4: Expression der HCV-E1 und E2 durch Benutzung von Sekretionssignal des menschlichen Wachstumshormons
HCV DNA Fragmente, die HCV-E1 (HCV-Aminosäuren 192–384) und HCV-E2 (HCV-Aminosäuren 384–750 und 384–684) darstellen, wurden aus dem CO-Isolat gebildet, durch Benutzung von PCR, wie im Beispiel 2 beschrieben. Eine Eco RI-Restriktionsstelle wurde benutzt, um ein synthetisches Oligonukleotid, das mit dem Sekretionssignal des menschlichen Wachstumshormons (HGH) (Blak et al., Oncogene, 3 129–136, 1988) kodiert, am 5'-Ende dieser HCV-Sequenz zu binden. Das entstandene Fragment wurde dann geklont in kommerziell erhältlichen Expressionsvektoren der Säugetiere pCDNA-I, (erhältlich von Invitrogen, San Diego, California) dargestellt in der 11. Nach der Umwandlung in E. coli MC1061/P3, bringen die resultierenden Klone die Expression der geklonten Sequenz unter Kontrolle des starken CMV Promoters. Nach den oben dargestellten Verfahren, wurde ein Klon isoliert, der die Fähigkeit hat, HCV-E1 (HCV-Aminosäure 192–384) durch die Benutzung des HGH Sekretionssignals an dem extremen Amino-Terminal-Ende zu exprimieren. Der Klon wurde als pHCV-168 bezeichnet und er ist schematisch dargestellt in der 12. Ähnlicher weise wurden Klone isoliert, die die Fähigkeit haben, HCV-E2 (HCV-Aminosäuren 384–750 oder 384–684) durch die Benutzung des HGH Sekretionssignals, bezeichnet jeweils als pHCV-169 und pHCV-170 und dargestellt in der 13, zu exprimieren. Die komplette Nukleotid-Sequenz der Expressionsvektoren der Säugetiere pHCV-168, pHCV-169 und pHCV-170, wird jeweils in der Sequenz-ID-Nr. 7, 9 und 11 dargestellt. Die Translation der Nukleotide 2227 bis 2913 ergibt sich in der kompletten Aminosäure-Sequenz des HGH-HCV-E1-Fusionsproteins, exprimiert durch pHCV-168, wie in der Sequenz-ID-Nr. 8 dargestellt. Die Translation der Nukleotide 2227 bis 3426 ergibt sich in der kompletten Aminosäure-Sequenz des HGH-HCV-E2-Fusionsproteins, exprimiert durch pHCV-169, wie in der Sequenz-ID-Nr. 10 dargestellt. Die Translation der Nukleotide 2227 bis 3228 ergibt sich in der kompletten Aminosäure-Sequenz des HGH-HCV-E2-Fusionsproteins, exprimiert durch pHCV-170, wie in der Sequenz-ID-Nr. 12 dargestellt. Gereinigte DNA von pHCV-168, pHCV-169 und pHCV-170 wurde transfiziert in HEK-293-Zellen, die metabolisch markiert wurden, in Zell-Lysaten präpariert und davon wurden RIPA-Analysen durchgeführt, wie vorher hier beschrieben. Sieben Sera-Proben, für die vorher gezeigt wurde, dass sie Antikörper für das APP-HCV-E2-Fusionsprotein enthielten, das durch pHCV-162 exprimiert ist, wurden in den markierten Zell-Lysaten von pHCV-168, pHCV-169 und pHCV-170 gescreent. 14 zeigt die RIPA-Analysen für pHCV-168 und beweist, dass 5 Sera, die HCV-E2-Antikörper enthalten, auch HCV-E1-Antikörper enthalten, die gegen ein ungefähr 33 K Dalton HGH-HCV-E1-Fusionsprotein (#25, #50, 121, 503 und 728) gerichtet sind, während zwei andere Sera nicht diese Antikörper (476 und 505) enthalten. 15 zeigt die RIPA-Ergebnisse, die erhalten werden, wenn man die selben oben angebrachten Sera gegen die markierten Zell-Lysate von entweder pHCV-169 oder pHCV-170 gescreent wurden. Alle sieben HCV-E1-Antikörper positiver Sera ermittelten zwei Protein-Spezies von circa 70 K und 75 K Daltons in mit pHCV-168 transfizierten Zellen. Diese zwei unterschiedlichen HGH-HCV-E2-Protein-Spezies könnten aus der nicht vollständigen proteolitischen Spaltung der HCV-E2-Sequenz am terminalen Carboxyl-Ende (bei oder in der Nähe der HCV-Aminosäure 720) resultieren oder aus Unterschieden in der Carbohydrat-Verarbeitung zwischen den zwei Spezies. Alle sieben HCV-E2-Antikörper positiver Sera ermittelten eine einzige Protein-Spezies von ungefähr 62 K Daltions für das HGH-HCV-E2-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-170. Die Tabelle 9 fasst das serologische Profil von 6 der 7 HCV-E2-Antikörper positiver Sera zusammen, die gegen das HGH-HCV-E1-Fusionsprotein, exprimiert durch pHCV-170, gescreent wurden. Es wird weiter gearbeitet, um die Anwesenheit oder die Abwesenheit der HCV-Gen-spezifischen Antikörper mit dem Verlauf der Krankheit und/oder den Zeit-Intervall. zwischen der Aussetzung an den HCV-viralen Antigenen zu korrelieren.
Die Klone pHCV-167 und pHCV-162 wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, am 17. Januar 1992 unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt und ihnen wurden folgende ATCC-Bezeichnungs-Nummern gewährt: dem Klon pHCV-167 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 68893 gewährt und dem Klon pHCV-162 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 68894 gewährt. Die Klone pHCV-168, pHCV-169 und pHCV-170 wurden dem American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, am 26. Januar 1993 unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt und ihnen wurden die folgenden ATCC-Bezeichnungs-Nummern gewährt: dem Klon pHCV-168 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 69228 gewährt, dem Klon pHCV-169 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 69229 gewährt und dem Klon pHCV-170 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 6-9230 gewährt. Die genannten Hinterlegungen werden für eine Zeit von dreißig (30) Jahren ab dem Hinterlegungsdatum oder für fünf (5) Jahren nach dem letzten Hinterlegungsantrag gehalten; oder für das durchsetzbare Leben des U. S. Patents, welches länger ist. Diese Hinterlegungen und andere hinterlegten Materialien, die hier genannt wurden, sind nur als Bequemlichkeit beabsichtigt und sind nicht erforderlich, um die Erfindung auszuüben, im Hinblick auf die Beschreibungen hierin. Die HCV cDNA Sequenzen in all den hinterlegten Materialien werden hierin durch den Verweis eingeschlossen.
Andere Veränderungen der Anwendungen des Gebrauchs der Proteine und der Expressionssysteme der Säugetiere, die hierin zur Verfügung gestellt wurden, werden dem Fachmann ersichtlich sein. Folglich ist es beabsichtigt, dass die Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüchen eingeschränkt ist.
Tabelle 1
Tabelle 2 Amerikanische HCV positive Sera
Tabelle 3 Japanische HCV positive Blutspender
Tabelle 4 Spanische Hemodialyse-Patienten
Tabelle 5 Antikörper-Reaktion auf HCV-Proteine
Tabelle 6 Menschliche Transfusions-Empfänger (AN)
Tabelle 7 Menschliche Transfusions-Empfänger (WA)
Tabelle 8 Menschliche Transfusions-Empfänger
Tabelle 9 Ausgewählte HCV-E2-Antikörper positive Proben
SEQUENZLISTE

Claims

Plasmid gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 68894.
Plasmid gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 68893.
Plasmid gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 69228.
Plasmid gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 69229.
Plasmid gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 69230.
APP-HCV-E2 (Amyloid Vorläufer Protein-Hepatitis C Virus-E2) Fusionsprotein, das durch das Plasmid, gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 68894, exprimiert werden kann.
APP-HCV-E2 Fusionsprotein, das durch das Plasmid, gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 68893, exprimiert werden kann.
HGH-HCV-E2 (humanes Wachstumshormon-Hepatitis C Virus-E2) Fusionsprotein, das durch das Plasmid, gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 69228, exprimiert werden kann.
HGH-HCV-E2 Fusionsprotein, das exprimiert werden kann durch das Plasmid, gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 69229.
HGH-CV-E2 Fusionsprotein, das durch das Plasmid, gekennzeichnet durch A. T. C. C. Nr. 69230, exprimiert werden kann.
Ein Verfahren zum Detektieren von HCV Antigen oder Antikörper in einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie HCV Antigen oder Antikörper enthält; das das in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Fusionsprotein von irgendeinem der Ansprüche 6–10 umfasst.
Ein Testkit zum Detektieren von HCV Antigen oder Antikörper in einer Testprobe, von der vermutet wird, daß sie HCV Antigen oder Antikörper enthält, das folgendes umfassen: einen Behälter, der ein Fusionsprotein von irgendeinem der Ansprüche 6–10 enthält.
Das Testkit von Anspruch 12, das weiterhin einen Antikörper umfasst, der durch Verwenden eines Fusionsproteins von irgendeinem der Ansprüche 6–10 hergestellt werden kann.