JP4585314B2 - Ｈｃｖアッセイ - Google Patents

Description

本発明は、一般にウイルスの診断に属する。特に本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスポリタンパク質の領域に由来する最初に単離された抗原およびＨＣＶポリタンパク質からの複数のエピトープを含有する複数エピトープ融合抗原を利用する抗原／抗体／抗原サンドウイッチアッセイに関連し、本複合エピトープは、Ｃ型肝炎ウイルス感染を正確に診断するために、複合タンパク質の同領域からの最初の抗原として１以上のエピトープを含有する。

（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主に輸血および性的接触を通じて伝染する非経口感染の非Ａ、非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主要原因である。本ウイルスは、血液提供者中の０．４〜２．０％に存在する。感染の約５０％については慢性肝炎を発症し、そのうちの感染個体の約２０％については時々肝細胞癌をもたらす肝硬変を発症する。したがって、本疾患の研究および管理は、医学的に重要である。

ＨＣＶは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎらによって初めてＮＡＮＢＨの原因として同定され、特徴づけられた。ＨＣＶのウイルスゲノム配列は公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照。ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブ−センス一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ウイルスのＦｌａｖｉｒｉｄａｅ科の一員である。系統発生論解析に基づき、少なくとも６つの、異なるが関連する遺伝子型の、ＨＣＶが同定された（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９）。本ウイルスは、３０００を超えるアミノ酸残基を有する一つのポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５；Ｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１−１７１５）。ポリタンパク質は、転写に伴ってかあるいは転写後に、構造タンパク質および非構造タンパク質（ＮＳ）の両方にプロセスされる。

特に、図１で示されるように、いくつかのタンパク質が、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断生成物の順序および命名は以下の通りである：ＮＨ_２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ポリタンパク質の最初の切断は、Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）および２つのエンベロープ糖タンパク質であるＡＥ１”（Ｅとしてもまた公知である）およびＡＥ２”（Ｅ２／ＮＳ１としてもまた公知である）の３つの構造タンパク質、ならびにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離する、宿主のプロテアーゼにより触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と名づけられている。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、そして、ＮＳ３と結合して、ＮＳ２−ＮＳ３ ｓｉｓｓｌｅ結合を切断し（言い換えると、ＮＳ３のＮ末端を生じ）、さらにセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を遊離する。ＮＳ３プロテアーゼは、残存するポリタンパク質をプロセスするために役立つ。これらの反応において、ＮＳ３はＮＳ３補助因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離する。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３−ＮＳ４ａ接合点において自動触媒的に切断されることにより開始され、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒される。

ＨＣＶポリタンパク質に由来する、ＨＣＶのための免疫学的および診断的な試薬として有用な多くの一般的なポリペプチドおよび特異的なポリペプチドが記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，欧州特許公報第３１８，２１６号および同第３８８，２３２号；Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８を参照。これらの公報および公開は、一般的にＨＣＶについて、ならびにＨＣＶポリペプチドの免疫学的な試薬の製造および使用について、広範な背景を提供する。

ＨＣＶ保有者およびＨＣＶ汚染血液あるいはＨＣＶ汚染血液産物をスクリーニングおよび同定するための感度の良く特異性の高い方法は、医薬品に対して重要な進歩を提供する。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、約１０％の輸血された患者で発症し、そしてＨＣＶは、これらの症例の９０％にのぼる原因である。患者のケアならびに血液および血液産物によるＨＣＶの伝播、または近密な個人的接触によるＨＣＶの伝播予防にとって、信頼度の高い診断および予後診断のツールが必要である。従って、いくつかのアッセイがＨＣＶ感染の血清診断のために開発されている。例えば、Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４；Ｃｈｏｏら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．（１９９０）４６：４２３−４４１；Ｅｂｅｌｉｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：９８２−９８３；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｅｌら，Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：５５８−５６０；ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｅｌら，Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３７：３１７−３１９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９；およびＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら，米国特許第５，８７１，９０４号を参照。

血清ベースのいくつかのアッセイで遭遇する重大な問題は、本ウイルスの感染と検出との間に、しばしば８０日を越える顕著な間隙があることである。このアッセイ間隙は、輸血レシピエントに対して多大な危険を引き起こし得る。この問題を克服するために、ウイルスＲＮＡを直接的に検出する核酸ベースの検査（ＮＡＴ）、および抗体反応の代わりにウイルスの抗原をアッセイするＨＣＶコア抗原検査が開発されている。例えば、Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａら，米国特許第５，８７１，９０４号；Ｂｅｌｄら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（２０００）４０：５７５−５７９を参照。

しかしながら、適切な患者のケアを提供するためならびに血液および血液産物によるＨＣＶの伝播、あるいは近密な個人的接触によるＨＣＶの伝播予防にとって、感度の良い正確な診断ツールおよび予後診断ツールの必要性が残されている。

（発明の要旨）
本発明は、ＨＣＶポリタンパク質に由来する最初の抗原の、ＨＣＶポリタンパク質の同じ領域からのエピトープを最初の抗原として含む複数エピトープ融合抗原と組み合わせた使用が、ＨＣＶの検出にとって感度が高くかつ信頼度の高い方法を提供するという所見に、部分的に基づく。本明細書中に記載される本アッセイは、ＨＣＶの６つの公知の遺伝子型のいずれかにより引き起こされるＨＣＶ感染を検出し得る。本発明の代表的な実施形態の１つにおいて、第１の抗原は、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープを含み、そして第２の抗原は、ＮＳ３／４ａ領域からの１つ以上のエピトープを含む複数エピトープ融合抗原である。複合エピトープ融合タンパク質の使用は、基質の単位領域上の非常に多数のエピトープの提供および選択性の改善により、マスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）の問題を減少させ、感度を改善し、抗体を検出する。さらに、本明細書中に記載されるアッセイは迅速に行われ得、かつ、より多くのサンプル容量がバックグラウンド効果なしに使用され得る。

したがって、１つの実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法に関連する。本方法は、以下：
（ａ）イムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、この固体支持体は、この固体支持体に結合するＨＣＶ抗原を含み、ここでこのＨＣＶ抗原は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の領域からの１つ以上の単離された抗原からなる、工程；
（ｂ）生物学的サンプル中に存在する場合、ＨＣＶ抗体を１つ以上のＨＣＶ抗原に結合させる条件下で、生物学的サンプルと上記固体支持体を結合させる工程；
（ｃ）複合体形成条件下において、検出可能に標識化されたＨＣＶの複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）を、工程（ｂ）からの上記固体支持体に加える工程であって、ここで、この標識されたＭＥＦＡは、１つ以上の単離された抗原として、ＨＣＶポリタンパク質の同じ領域からの少なくとも１つのエピトープを含み、ここで、このＭＥＦＡは、結合ＨＣＶ抗体に結合する、工程；
（ｄ）ＨＣＶ抗体と、ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域からの１つ以上の抗原および上記ＭＥＦＡとの間で形成される複合体が存在する場合、これを、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染の指標として検出する工程；
を包含する。

別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染を検出する方法に属する。本方法は、以下：
（ａ）イムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、この固体支持体は、この固体支持体に結合するＨＣＶ抗原を含み、このＨＣＶ抗原は、１つ以上の複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）からなる、工程；
（ｂ）生物学的サンプル中に存在する場合、ＨＣＶ抗体を１つ以上のＭＥＦＡに結合させる条件下で、生物学的サンプルを上記固体支持体と結合させる工程；
（ｃ）複合体形成条件下において、１つ以上のＭＥＦＡに存在するＨＣＶポリタンパク質の領域からの検出可能に標識化された単離されたＨＣＶ抗原を、工程（ｂ）からの上記固体支持体に加える工程であって、ここで、この単離された抗原は、結合ＨＣＶ抗体に結合する、工程；
（ｄ）ＨＣＶ抗体と、単離されたＨＣＶ抗原および上記ＭＥＦＡとの間で形成される複合体が存在する場合、これを、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染の指標として検出する工程；
を包含する。

なおさらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染を検出する方法に属する。本方法は、以下：
（ａ）イムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、この固体支持体は、この固体支持体に結合するＨＣＶ抗原を含み、このＨＣＶ抗原は、１つ以上の単離されたＨＣＶ ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープからなる工程；
（ｂ）生物学的サンプル中に存在する場合、ＨＣＶ抗体が１つ以上のＮＳ３／４ａエピトープに結合することが可能である条件下で、生物学的サンプルを上記固体支持体と結合させる工程；
（ｃ）複合体形成条件下において、検出可能に標識化されたＨＣＶ複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）を、工程（ｂ）からの上記固体支持体に加える工程であって、ここで、この標識されたＭＥＦＡは、ＨＣＶ ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含み、ここで、このＭＥＦＡは、結合ＨＣＶ抗体に結合する、工程；
（ｄ）ＨＣＶ抗体と、上記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープおよび上記ＭＥＦＡとの間で形成される複合体が存在する場合、これを、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染の指標として検出する工程；
を包含する。

別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染を検出する方法に属する。本方法は、以下：
（ａ）イムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、この固体支持体は、この固体支持体に結合するＨＣＶ抗原を含み、ここで、このＨＣＶ抗原は、１つ以上の複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）からなり、ここで、１つ以上のＭＥＦＡは、ＨＣＶ ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、工程；
（ｂ）生物学的サンプル中に存在する場合、ＨＣＶ抗体が１つ以上のＭＥＦＡに結合することが可能である条件下で、生物学的サンプルを上記固体支持と結合させる工程；
（ｃ）複合体形成条件下において、検出可能に標識化されたＨＣＶ ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープを、工程（ｂ）からの上記固体支持体に加える工程であって、ここで、このＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープは、結合ＨＣＶ抗体に結合する、工程；
（ｄ）ＨＣＶ抗体および上記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープおよび上記ＭＥＦＡとの間で形成される複合体が存在する場合、これを、生物学的サンプル中でＨＣＶ感染の指標として検出する工程；
を包含する。

上述の方法において、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープおよび／またはＭＥＦＡは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からの１つのエピトープ、および／またはＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からの１つのエピトープを含む。特定の実施形態において、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープは、図３Ａ〜図３Ｄ（配列番号１および配列番号２）に示されるアミノ酸配列を含む。

さらなる実施形態において、ＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１の配列に対して番号付けされたアミノ酸１１９３〜１６５７を含む。なお、さらなる実施形態において、ＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされたアミノ酸１２１１〜１４５７および／またはアミノ酸１１９２〜１４５７のような、ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域からの１つのエピトープを含む。

さらなる実施形態において、ＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされたアミノ酸１６８９〜１７３５のようなＨＣＶポリタンパク質の５−１−１領域からの１つのエピトープを含む。

特定の実施形態において、ＭＥＦＡは、図６Ａ〜図６Ｆ（配列番号３および配列番号４）に示されたアミノ酸配列または図８Ａ〜図８Ｆ（配列番号５および配列番号６）に示されたアミノ酸配列を含む。

これらのおよび他の本発明の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。加えて、より詳細な特定の手順または組成で記載する種々の参考文献を、ここに示す。

（発明の詳細な説明）
他で示さない限り、本発明の実施は、当該技術分野の範囲内の、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来方法を使用する。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。

本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明らかに他を述べていない限り、単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の対象を含むことを留意しなければならない。従って、例えば、「１つの抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」の言及は、２以上の抗原などの混合物を含む。

以下のアミノ酸の略語は本明細書を通じて用いられる。
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明の記述において、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義されることを意図される。

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを言い、そして、生成物の最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、２量体、多量体などが、定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントは、共に定義に含まれる。この用語は、また、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブの配列に対する欠失、付加および（天然で一般に保存的な）置換のような修飾を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的突然変異を介するように意図的であっても、または、タンパク質を生成する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅による誤りを介するように偶発的であってもよい。

ＨＣＶポリペプチドは、上記で定義されたように、ＨＣＶポリタンパク質に由来するポリペプチドである。ポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はなく、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、ポリペプチドは、様々なＨＣＶ株および単離株（例えば、ＨＣＶの１株、２株、３株、４株、５株または６株からのいずれかの単離株であるが、これらに限定されない）のいずれかに由来し得る。多くの保存領域および可変領域はこれらの株の間で既知であり、そして、一般的に、２つの配列が並べられた場合、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、高度の配列相同性、例えば、３０％、好ましくは４０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ３／４ａ」ポリペプチドは、さらに以下に定義されるように、種々のＨＣＶ株、ならびに、ＮＳ３／４ａアナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントのいずれかに由来するネイティブＮＳ３／４ａをいう。これらの株の多くの完全な遺伝子型は公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００号およびＡＪ２３８７９９号を参照。

用語「アナログ」および「ムテイン」は、関連分子の生物学的に活性な誘導体、または、所望の活性（例えば、本明細書中で記載されるアッセイにおける免疫反応性）を保持するような誘導体のフラグメントを言う。一般に、用語「アナログ」は、ネイティブのポリペプチド配列を有する化合物、および、修飾が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブ分子に関連して１つ以上のアミノ酸の付加、（天然で一般に保存的な）置換および／または欠失を有する構造を有する化合物を言う。用語「ムテイン」は、国際公開番号ＷＯ９１／０４２８２で記載されたような１つ以上のペプチド模倣体（「ペプトイド」）を有するペプチドを言う。好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくともネイティブ分子と同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製する方法は、当該分野で公知であり、さらに、以下に記載される。

特に好ましいアナログは、天然で保存的な置換、すなわち、関連した側鎖のアミノ酸のファミリー内において行われる置換を含む。具体的に、アミノ酸は一般的に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非電荷極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時々芳香族アミノ酸として分類される。例えば、イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの単独置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の単独置換、セリンによるスレオニンの単独置換、または、構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似した保存的置換が、生物学的活性に対して大きな影響を有さないことは、理論的に予測可能である。例えば、分子の所望の機能がインタクトのままである限り、目的のポリペプチドは、約５〜１０までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または、約１５〜２５まで、または、５〜２５の間の任意の整数の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換をすら含む可能性がある。当業者は、当該分野で周知であるＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットに関連し、変化に耐え得る、目的の分子の領域を容易に決定し得る。

「フラグメント」により、インタクトの全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドが意図される。フラグメントは、ネイティブポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。目的のフラグメントが明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持する場合、特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般に、全長分子の少なくとも約５〜１０の連続したアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続したアミノ酸残基、そして、最も好ましくは、全長分子の少なくとも約２０〜５０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基（これはエピトープを規定する）、または５アミノ酸と全長配列との間の任意の整数を含む。例えば、ＭＥＦＡでの使用のための好ましい免疫原性フラグメントとしては、例えば、ポリタンパク質のアミノ酸１０〜４５、１０〜５３、６７〜８８および１２０〜１３０、エピトープ５−１−１（ウイルスゲノムのＮＳ３領域中）、ならびに、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域、Ｅ２領域、ｃ３３ｃ（ＮＳ３）領域、ｃ１００（ＮＳ４）領域、ＮＳ３／４ａ領域およびＮＳ５領域に由来する規定のエピトープ、ならびに、ＨＣＶポリタンパク質から同定された他の種々のエピトープのいずれかを含む、ＨＣＶコアのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；米国特許第６，１５０，０８７号および同第６，１２１，０２０号を参照。

本明細書中で用いられる場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、好ましくは、約５から１０または１５、および約１，０００を超えない（またはその間の全ての整数）のアミノ酸であって、それ自身またはより大きい配列の一部として、そのような配列に関連して産生された抗体に結合する配列を定義する配列をいう。フラグメントの長さに対する重要な上限はなく、フラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含み得るか、または、ＨＣＶポリタンパク質からの２以上のエピトープを含む融合プロテインさえ含む。本発明で使用されるエピトープは、由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは一定のフラックスの状態であり、そして、単離物間で比較的高度の可変性を示すいくつかの可変ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブ配列に対して同一の配列、ならびに、欠失、付加および（天然で一般に保存的な）置換のようなネイティブ配列に対する修飾を含む。

エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術の使用により同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照。例えば、直線状のエピトープは、例えば、固体支持体上の多数のペプチド（タンパク質分子の一部に対応するペプチド）を同時に合成し、ペプチドがまだ支持体に結合している間に、ペプチドを抗体と反応させることにより、決定され得る。このような技術は当該分野で公知であり、そして、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載されている。このような技術を使用することにより、ＨＣＶの多数のエピトープが同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）ｐｐ．３２０−３２４、そしてさらに以下に記載されている。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、Ｘ線結晶回折および２次元核磁気共鳴によるような、アミノ酸の空間的なコンフォメーションを決定することにより容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前出を参照。タンパク質の抗原領域は、また、抗原性標準および例えばＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから利用可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたようなハイドロパシープロットを使用することにより同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性のプロフィールを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８）を使用し、そして、ハイドロパシープロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）を使用する。

種々のＨＣＶエピトープの記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；および米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号を参照。

本明細書中で使用される場合、用語「コンフォメーショナルエピトープ」は、全長天然タンパク質内のエピトープをコードしているアミノ酸配列に対してネイティブ構造的特徴を有する全長タンパク質の一部分、または、そのアナログもしくはムテインをいう。ネイティブ構造特徴としては、グリコシル化および３次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、広範なバリエーションに供され得る。それは、これらのエピトープが抗原の３次元形状（例えば折りたたみ）により形成されると考えられるからである。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少数であり得るが、分子の長さに沿って（または２量体などの場合、異なる分子上でさえ）幅広く分散され得、折りたたみを経て正確なエピトープコンフォメーションをもたらし得る。エピトープを規定する残基間の抗原の一部分は、エピトープのコンフォメーション構造に対して重要でなくてもよい。例えば、エピトープコンフォメーションにとって重要な配列が維持される（例えば、ジスルフィド結合に関わるシステイン、グリコシル化部位など）場合、これらの干渉配列の欠失または置換は、コンフォメーショナルエピトープに影響を与えなくてもよい。

例えばＮＳ３／４ａ領域中に存在するコンフォメーショナルエピトープは、上記で議論された方法を使用して容易に同定される。さらに、所定のポリペプチド中のコンフォメーショナルエピトープの存在または非存在は、抗体（ポリクローナル血清またはコンフォメーショナルエピトープに対するモノクローナル血清）を用いた目的の抗原のスクリーニング、および直線的なエピトープのみを保有する抗原の変性バージョンの反応性と反応性を比較することを通じて、容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用したこのようなスクリーニングにおいて、変性抗原を用いて最初にポリクローナル抗体血清を吸収すること、および、それが、目的の抗原に対する抗体を保持しているか否かを見ることは、有利であり得る。加えて、ＮＳ３／４ａの場合、ネイティブコンフォメーションを保存する分子もまた、プロテアーゼ酵素アッセイを有し、さらに、必要に応じて、ヘリカーゼ酵素活性を有する。このような活性は、以下にさらに記載されるように、酵素アッセイを使用して検出され得る。

好ましくは、コンフォメーショナルエピトープは組換え的に産生され、そして、所望の構造特徴を保存する（例えば、エピトープの変性なしの）条件で抽出可能な細胞内で発現される。このような細胞としては、バクテリア、酵母、昆虫および哺乳類の細胞が挙げられる。発現およびＨＣＶポリタンパク質からの組換え型コンフォメーショナルエピトープの単離は、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４で記載される。あるいは、抗原を発現することおよび、さらに回収後タンパク質を復元することが可能である。また、化学合成が、「ネイティブ」抗原のコンフォメーショナルエピトープと交差反応するコンフォメーション抗原ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）を提供し得ることもまた理解される。

本明細書中で使用されるような用語「複数エピトープ融合抗原」または「ＭＥＦＡ」は、多数のＨＣＶ抗原が、自然に存在しない１つの連続したアミノ酸鎖の一部であるポリペプチドを意図する。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合により互いに直接的に結合し得るか、または干渉するアミノ酸配列により分離され得る。融合抗原はまた、ＨＣＶポリタンパク質に対して外因性の配列を含み得る。さらに、ＨＣＶ配列は、多数の遺伝子型および／またはＨＣＶの単離株由来で存在し得る。本発明のイムノアッセイでの使用のための特別なＭＥＦＡの例は、例えば、国際公開番号ＷＯ０１／９６８７５、同ＷＯ０１／０９６０９、同ＷＯ９７／４４４６９ならびに米国特許第６，５１４，７３１号および同第６，４２８，７９２号で詳述されている。

「抗体」は、化学的または生理学的手段を通じて、特異的に目的のポリペプチドに結合する分子を意図する。従って、ＨＣＶ ＮＳ３／４ａ抗体は、ＨＣＶ ＮＳ３／４ａタンパク質のエピトープに特異的に結合する分子である。本明細書中で使用される用語「抗体」は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに、以下：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９および米国特許第４，８１６，５６７を参照）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合性ヘテロ２量体、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６を参照）；１本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）；２量体および３量体抗体フラグメント構造物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；および英国特許第ＧＢ ２，２７６，１６９号，１９９４年９月２１日発行を参照）および、このような分子から得られるすべての機能性フラグメントを含み、このようなフラグメントは、親抗体分子の免疫学的な結合特性を保持する。

「組換え」タンパク質は、所望の活性を保持するタンパク質および本明細書中で記載されているような組換えＤＮＡ技術により調製されたタンパク質である。一般に、以下でさらに記載されるように、目的の遺伝子はクローン化され、そしてその後形質転換した生物体中で発現される。宿主生物体は、発現条件下で、タンパク質を産生する外来遺伝子を発現する。

ポリペプチドをいう場合、「単離された」により、示した分子が、この分子が天然で見出される生物体全体から分離しており、独立しているか、または、同じタイプの他の生物学的巨大分子の実質的非存在下で存在することが、意味される。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、全体的もしくは部分的に、通常天然で関連する配列を有さない核酸分子、もしくは天然に存在するが、それらと関連する異種配列を有する配列、または染色体から分離される分子である。

「等価抗原決定因子」により、ＨＣＶの株１、株２、株３などに由来するようなＨＣＶの異なる亜種または株からの抗原決定因子が、意味される。より具体的には、５−１−１のようなエピトープは、公知であり、そして、このようなエピトープは、株１、株２および株３の間で変動する。従って、３つの異なる株からの５−１−１エピトープは、等価抗原決定因子であり、そして、従って、それらの配列が同一でなくても、「コピー」である。一般的に、２つの配列が並べられた場合、等価抗原決定因子のアミノ酸配列は、高度の配列相同性（例えば３０％を超えるアミノ酸配列相同性、好ましくは、４０％を超えるアミノ酸配列相同性）を有する。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間の、または２つのポリペプチド部分間の、百分率類似性をいう。配列が、分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして、最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列類似性を示す場合、２つのＤＮＡ配列、または２つのポリペプチド配列は、互いに「実質的に相同」である。また、本明細書中で使用される場合、実質的に相同は、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列についてもいう。

一般に、「同一性」は、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの一致またはアミノ酸−アミノ酸の一致について言及する。百分率同一性は、配列を並べること、２つの並べられた配列間のマッチの正確な数を計数すること、より短い配列の長さで割ること、そしてその結果に１００を掛けることによって、２つの分子間の配列情報の直接的な比較により決定され得る。

ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適用するＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣのような容易に利用できるコンピュータプログラムをペプチド解析のために使用して、類似性および同一性の解析を補助し得る。ヌクレオチド配列類似性および同一性を決定するためのプログラムが、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから利用可能である）（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムによるＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム）で利用可能である。これらのプログラムは、製造者によって推奨されるデフォルトパラメータを用いて容易に利用され、そして、上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の百分率類似性は、デフォルトのスコア表および６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いたＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。

本発明に関連して百分率類似性を確立するもう一つの方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが版権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、さらに、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配布されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一揃いのパッケージから、デフォルトパラメータがスコア表について使用される（例えば、ギャップオープンペナルティーが１２、ギャップ拡張ペナルティーが１、そしてギャップが６）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用され得る。得られたデータからの「マッチ」の値は、「配列類似性」を反映する。配列間の百分率同一性または類似性を計算するための他の好適なプログラムは本分野で一般に公知であり、例えば、別の配列プログラムはＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメータを用いて使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。

あるいは、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く、一本鎖特異的なヌクレアーゼを用いた消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定により、相同性が決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、厳しい条件下（その特定のシステムのために規定される）でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、本分野の技術内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照。

「一般の固体支持体」は、本発明のイムノアッセイで使用されるＨＣＶポリペプチドが、疎水性吸着のような共有結合するかまたは非共有結合的な手段により結合する、１つの固体支持体を意図する。

「免疫学的に反応性」は、問題の抗原がＨＣＶ感染個体からの生物学的なサンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを意味する。

抗体が抗原上のエピトープに結合する場合、「免疫複合体」は、形成される組み合わせを意図する。

本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織または体液のサンプルをいい、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆液、脊髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、腸管および尿生殖器の外分泌液、涙、唾液、乳、血球、器官、生検材料、ならびにインビトロ細胞培養物構成成分のサンプル（培養培地中の細胞および組織の増殖により生じた調整培地（例えば、組換え細胞および細胞構成成分）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」は、検出可能な分子をいい、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素インヒビター、発色団、染料、金属イオン、金属コロイド溶液、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）またはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」は、検出範囲で蛍光を示し得る基質またはその一部分をいう。本発明の下で使用され得る標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

（ＩＩ．発明を実行する方法）
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の処方またはプロセスパラメータ（無論変動し得る）に制限されないということが理解される。本明細書中で使用される用語が本発明の特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、そして、限定を意図されないこともまた、理解される。

本明細書中で記載された組成物および方法と類似または等価の多くの組成物および方法が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中以下に記載される。

上述のように、本発明は、ＨＣＶ感染を正確に検出するための新規の抗原／抗体／抗原サンドウィッチ診断方法の発見に基づく。本方法は、迅速かつ効率的に実施され得、そして、大容量のサンプルの使用から生じ得るバックグラウンド効果を除去し得る。本方法は、好ましくは、ＨＣＶ血清変換の初期段階の間に存在する高い免疫原性ＨＣＶ抗原を利用し、それにより、検出の正確性を向上させ、そして誤った結果の発生を減少させる。

特に、本明細書中で記載されるイムノアッセイは、２つの基本的なＨＣＶ抗原（１つは固相中に存在し、１つは液相中に存在する）を利用する。両抗原が、感染個体からの生物学的サンプル中に存在するＨＣＶ抗体に結合し得る。本発明のアッセイで使用される１つの抗原は、ＨＣＶポリタンパク質の領域から単離された抗原である。使用される２番目の抗原は、同一または異なるＨＣＶ遺伝子型および単離物のいずれか由来の種々のＨＣＶポリペプチドを含む複数エピトープ融合抗原（「ＭＥＦＡ」）である。ＭＥＦＡは、単離されたＨＣＶ抗原としてＨＣＶポリタンパク質の同領域に由来する少なくとも１またはそれ以上のエピトープを含む。

特に好ましい実施形態において、本発明のアッセイで使用される抗原の１つは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域に由来する高度に免疫原性のコンフォメーショナルエピトープである。これらの実施形態において、さらに以下で記載されるように、使用される２番目の抗原は、ＮＳ３／４ａ領域（直線的または立体構造的のいずれか）由来の１以上のエピトープを含むＭＥＦＡである。従って、ＭＥＦＡは、１以上のＨＣＶ単離物からのＮＳ３／４ａ領域に由来する複数の免疫優性エピトープを含み得る。多数のＮＳ３／４ａエピトープが多数のエピトープ融合で使用される場合、それらは、同一または異なるエピトープであり得る。あるいは、融合抗原は、ＮＳ３／４ａ領域に由来する１以上のエピトープ、ならびに、他のＨＣＶ領域（例えば、非限定で、ＨＣＶコア配列、Ｅ１配列、Ｅ２配列、Ｐ７配列、ＮＳ４ｂ配列、ＮＳ５ａ配列およびＮＳ５ｂ配列）からの主要な直線的エピトープを含み得る。

本方法は、単数のアッセイで、以下に記載される幾つかのアッセイ様式のいずれかを用いて都合良く実施され得、これらのアッセイ様式としては、例えば、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープのような単離されたＨＣＶ抗原またはＭＥＦＡのどちらかが結合した固体支持体を利用するアッセイ様式であるが、これらに限定されない。従って、ＭＥＦＡは溶液相または固相のいずれかで提供され得る。溶液で提供される場合、単離されたＨＣＶ抗原は、固相上に存在する。

例えば、本発明の１つの代表的な方法において、アッセイは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域に由来する１以上のコンフォメーショナルエピトープを含む１以上のポリペプチドが結合している固体支持体上で行われる。この実施形態において、ＭＥＦＡは溶液相中に提供される。代替の実施形態において、アッセイは１以上のＭＥＦＡが結合した固体支持体上で行われる。この実施形態において、コンフォメーションＮＳ３／４ａエピトープを含むポリペプチドが、溶液相中に提供される。従って、コンフォメーションＮＳ３／４ａエピトープが固相上に存在する場合、ＭＥＦＡは溶液相中に存在し、そして逆もまた然りである。

本発明のさらなる理解のために、本発明の方法における使用のための種々のＨＣＶポリペプチド抗原およびＭＥＦＡ、ならびに、タンパク質の産生およびタンパク質を使用する方法に関して、より詳細な考察が以下に提供される。

（ＨＣＶ抗原およびＭＥＦＡ）
ＨＣＶ株のゲノムは、約９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの１つのオープンリーディングフレーム（ポリタンパク質に転写される）を含む。図１および表１で示されているように、切断の際、ＨＣＶポリタンパク質は、ＮＨ_２−Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、少なくとも１０の異なる産物を生成する。コアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に関連して番号付けされた１位〜１９１位で生じる（ＨＣＶ−１ゲノムに対しては、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照）。このポリペプチドは、さらにプロセスされて、およそアミノ酸１〜１７３を有するＨＣＶポリペプチドを産生する。エンベロープポリペプチドＥ１およびＥ２は、それぞれ約１９２位〜３８３位および３８４位〜７４６位で生じる。Ｐ７ドメインは、約７４７位〜８０９位で見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、ポリタンパク質の約８１０位〜１０２６位で見出される。ＮＳ２は、ＮＳ３（約１０２７位〜１６５７位で見出される）と組み合わせて、ＮＳ２−ＮＳ３ ｓｉｓｓｌｅ結合を切断し（言い換えるとこれはＮＳ３のＮ末端を生じ）、そしてセリンプロテアーゼ活性とＲＮＡヘリカーゼ活性との両方を含む大きなポリタンパク質を遊離する。約１０２７位〜１２０７位で見出されるＮＳ３プロテアーゼは、残存するポリタンパク質をプロセスすることに役立つ。ヘリカーゼ活性は、約１１９３位〜１６５７位で見出される。ＮＳ３は、ＮＳ３補助因子（ＮＳ４ａ、約１６５８位〜１７１１位で見出される）、２つのタンパク質（約１７１２位〜１９７２位で見出されるＮＳ４ｂ、および約１９７３位〜２４２０位で見出されるＮＳ５ａ）、そしてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約２４２１位〜３０１１位で見出されるＮＳ５ｂ）を遊離する。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３−Ｎｓ４ａ接合点での自動触媒的切断により開始され、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒される。

＊ＨＣＶ−１に関連して番号付けされた。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照。

本方法の１つの構成要素は、上で記載されるようなＨＣＶポリタンパク質の種々の領域のいずれか由来の単離された抗原である。多くのＨＣＶ株および単離株の核酸配列およびアミノ酸配列（上述された種々の領域の核酸配列およびアミノ酸配列を含む）が決定されている。例えば、単離株ＨＣＶ Ｊ１．１が、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載される。２つの独立した単離株ＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全なコード配列が、Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３によりそれぞれ記載される。

ＨＣＶ−１単離株を記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離株ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４が、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７中で記載される。ＨＣＶ単離株ＨＣＴ１８、ＨＣＴ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０は、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８中で記載される。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２が、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５中で記載される。ＨＣＶ単離株Ａ、Ｃ、ＤおよびＥは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ５：２４３−２５４中で記載される。

従って、例えば、単離されたＨＣＶ抗原は、これらのＨＣＶ単離株のいずれかのコア領域に由来し得る。この領域は、ＨＣＶ−１に対して番号を付されたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１位−１９１位に存在する。全長タンパク質のフラグメント、例えば、アミノ酸１−１５０、例えばアミノ酸１−１３０、１−１２０、例えば、アミノ酸１−１２１、１−１２２、１−１２３など、または、全長タンパク質のエピトープを含むより小さいフラグメントのいずれか、例えば、アミノ酸１０−５３、アミノ酸１０−４５、アミノ酸６７−８８、アミノ酸１２０−１３０の間で見出されるエピトープ、または、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８および米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号で同定されたコアエピトープのうちのいずれかが、本方法で使用され得る。さらに、国際公開番号ＷＯ９９／６３９４１で記載されるようなポリタンパク質のコア領域中のフレームシフトから生じるタンパク質が使用され得る。

同様に、ＨＣＶ Ｅ１領域および／またはＥ２領域からのポリペプチドが、単離されたＨＣＶ抗原として本発明の方法で使用され得る。Ｅ２は、多数の種（Ｓｐａｅｔｅら，Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）として存在し、そしてクリッピングおよびタンパク質分解は、Ｅ２ポリペプチドのＮＢおよびＥ２ポリペプチドのＣ末端で起こり得る。従って、本明細書中での使用のためのＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号を付されたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸４０５−６６１、例えば、４００、４０１、４０２．．．から６６１まで、例えば、３８３または３８４−６６１、３８３または３８４−７１５、３８３または３８４−７４６、３８３または３８４−７４９あるいは３８３または３８４−８０９、あるいは３８３または３８４から６６１−８０９の間の任意のＣ末端までを含み得る。同様に、本明細書中で使用するためのＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質の、アミノ酸１９２−３２６、１９２−３３０、１９２−３３３、１９２−３６０、１９２−３６３、１９２−３８３、または１９２から３２６−３８３の間の任意のＣ末端までを含み得る。

エピトープを含むＥ１および／またはＥ２の免疫原性フラグメントが、本方法で使用され得る。例えば、Ｅ１ポリペプチドのフラグメントは、その分子の約５個からほぼ全長、例えば、Ｅ１ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１８５個以上のアミノ酸、または記載した数字の間の任意の整数個を含み得る。同様に、Ｅ２ポリペプチドのフラグメントは、Ｅ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、もしくは３５０アミノ酸、または記載した数字の間の任意の整数個を含み得る。

例えば、アミノ酸３８４−４１０または３９０−４１０にわたる領域のような、例えばＥ２の超可変領域に由来するエピトープが、融合物中に含まれ得る。Ｅ２ポリペプチド配列に組み込むために特に有効なＥ２エピトープは、ＨＣＶ１型ゲノムのアミノ酸３９０−４１０のためのコンセンサス配列を表すコンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号７）のような、この領域に由来するコンセンサス配列を含むものである。Ｅ１およびＥ２のさらなるエピトープは公知であり、例えば、Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５に記載される。

さらに、Ｅ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインのすべてまたは部分を欠き得る。Ｅ１で、一般的に、ほぼアミノ酸３７０位およびより大きいアミノ酸位置（ＨＣＶ−１ Ｅ１の番号付けに基づく）で終わるポリペプチドは、ＥＲにより保持され、よって増殖培地中に分泌されない。Ｅ２で、ほぼアミノ酸７３１位およびより大きいアミノ酸位置（これもまたＨＣＶ−１ Ｅ２配列の番号付けに基づく）で終わるポリペプチドは、ＥＲによって保持され、そして分泌されない（例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１，１９９６年２月１５日公開を参照）。これらのアミノ酸位置は絶対的ではなく、そして、ある程度変動し得ることが留意されるべきである。従って、本発明は、膜貫通結合ドメインを保持するＥ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチド、ならびに、膜貫通結合ドメインの全部または一部を欠くポリペプチド（ほぼアミノ酸３６９以下で終わるＥ１ポリペプチド、およびほぼアミノ酸７３０以下で終わるＥ２ポリペプチドを含む）の使用を企図する。さらに、Ｃ末端切断物は、膜貫通ドメインを越えてＮ末端の方へと広がり得る。従って、例えば３６０位以下で起こるＥ１切断、および例えば７１５位以下で起こるＥ２切断もまた、本発明により包含される。必要であるすべてのことは、切断されたＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドが、意図された目的にとって機能的なままであるということである。しかしながら、特に好ましい切断されたＥ１構造物は、ほぼアミノ酸３００を越えて広がらないものである。最も好ましいものは、３６０位で終わるものである。好ましい切断されたＥ２構造物は、ほぼアミノ酸７１５位を越えて広がらないＣ末端切断を含むものである。特に好ましいＥ２切断は、アミノ酸７１５−７３０のうちのいずれか（例えば、７２５）の後で切断された分子である。

さらに、ＮＳ３領域、ＮＳ４領域、ＮＳ５ａ領域またはＮＳ５ｂ領域からのエピトープが、単離されたＨＣＶ抗原として使用され得る。特に好ましいのは、ＮＳ３／４ａ領域からのエピトープの使用である。ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域が記載され、そしてアミノ酸配列およびタンパク質の全体構造が、例えば、Ｙａｏら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９９年１１月）７：１３５３−１３６３；Ｓａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７：３３９２−３４０１およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．（１９９９）６：１６５−１８１で開示される。また、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号を参照。本イムノアッセイは、天然に存在するＨＣＶ粒子またはその感染産物で見出されるようなコンフォメーションで存在するＮＳ３／４ａ領域に由来する少なくとも１つのコンフォメーショナルエピトープを利用し得、このコンフォメーションは、ＮＳ３／４ａ遺伝子産物および／またはＨＣＶ感染被験体由来の生物学的サンプル中の抗体との抗原の免疫反応性、そして抗原の変性によるエピトープの免疫反応性の損失により通常示されるプロテアーゼ酵素活性の保存、および必要に応じてヘリカーゼ酵素活性の保存により明らかにされる。例えば、コンフォメーショナルエピトープは、加熱、極度な酸性もしくは塩基性へとｐＨを変化することにより、または、公知の有機変性剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））もしくは適当な界面活性剤の添加により破壊され得る。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）および上記のように処理されない産物と比較される変性した産物を参照のこと。

プロテアーゼ活性およびヘリカーゼ活性は、当該分野で周知の標準的酵素アッセイを使用して決定され得る。例えば、プロテアーゼ活性は、当該分野で周知のアッセイを使用して決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５３−１５８およびＫｉｍら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照。プロテアーゼ活性を試験するための特に便利なアッセイが、以下の実施例で示される。

同様に、ヘリカーゼ活性アッセイが当該分野で周知であり、そしてＮＳ３／４ａエピトープのヘリカーゼ活性が、例えばＨｓｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２５３：５９４−５９９で記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイ、Ｋｙｏｎｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５７：１２０−１２６で記載されるようなシンチレーション近接アッセイ系、例えばＨｉｃｈａｍら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．（２０００）４６：１８１−１９３およびＫｗｏｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０００）２４：９７−１１６で記載されるようなハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、ならびに当該分野で公知の他のアッセイ方法によって決定され得る。例えば、Ｋｈｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５：２０５−２１４；Ｕｔａｍａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）２７３：３１６−３２４；Ｐａｏｌｉｎｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）８１：１３３５−１３４５；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：５１７４−５１８３；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９８）１９：３５３−３６４およびＨｅｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：２６１９−２６２５を参照のこと。

コンフォメーションＮＳ３／４ａエピトープが使用される場合、抗原の長さは、免疫反応性コンフォメーショナルエピトープを維持するために十分である。しばしば使用される抗原を含むポリペプチドは、ほとんど全長であるが、このポリペプチドは、また、例えば溶解性を向上させるために、または分泌を改善させるために、切断され得る。一般的に、ＮＳ３／４ａで見出されるコンフォメーショナルエピトープは、細胞中の組み換え型ポリペプチドとして発現され、そして、このポリペプチドは、以下で詳細に記載されるように、望ましい形態で上記エピトープを提供する。

ＮＳ３／４ａポリペプチドについての代表的なアミノ酸配列が図３Ａから図３Ｄ（配列番号１および配列番号２）で示される。図３Ａから図３Ｄの２位〜６８６位に示されるアミノ酸配列は、ＨＣＶ−１のアミノ酸１０２７位〜１７１１位に対応する。Ｍｅｔをコードする開始コドン（ＡＴＧ）が１位として示される。さらに、ＨＣＶ−１の１４２８位（図３のアミノ酸４０３位）に通常存在するＴｈｒは、Ｐｒｏに変異されており、そして、ＨＣＶ−１の１４２９位（図３のアミノ酸４０４位）に通常存在するＳｅｒは、Ｉｌｅに変異されている。しかしながら、Ｎ末端Ｍｅｔを持つもしくは持たないネイティブ配列、Ｎ末端Ｍｅｔを持つもしくは持たない記載されたアナログ、または、他のアナログおよびフラグメントのいずれかが、当該アッセイで使用され得、それは、上記エピトープが、プロテアーゼ活性、および必要に応じてヘリカーゼ活性が保持されるようなネイティブコンフォメーションを保持、または、回復させる方法を使用して産生される限り使用され得る。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら，米国特許第５，９９０，２７６号は、ともにＮＳ３／４ａのアナログを記載する。

ＮＳ３／４ａのＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶ−１に対して番号を付されたほぼ１０２７位〜１２０７位、図３の２位〜１８２位で見出される。ＮＳ３プロテアーゼの構造および活性部位の構造は公知である。例えば、Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０を参照のこと。通常許容されるネイティブ配列への変化は、この分子の活性部位の外側での変化である。特に、保存的置換をほとんど含まないかまたは保存的置換しか含まない、図３のアミノ酸１位〜１５５位または２位〜１５５位を維持することが望ましい。１５５位を越えて存在するアミノ酸は、より大きな変化を許容する。さらに、ＮＳ３／４ａ配列のフラグメントが使用される場合、これらのフラグメントは、一般的に、Ｎ末端Ｍｅｔありまたは無しで、少なくともアミノ酸１位〜１５５位または２位〜１５５位、好ましくはアミノ酸１位〜１７５位または２位〜１７５位、そして最も好ましくはアミノ酸１位〜１８２位または２位〜１８２位を含む。ヘリカーゼドメインは、ＨＣＶ−１のほぼ１１９３位〜１６５７位（図３の２０７位〜６３２位）で見出される。従って、ヘリカーゼ活性が望まれる場合、上記分子のこの部分は、保存的な変化をほとんど含まずにか、または保存的変化しか含まずに、維持される。当業者は、ＮＳ３／４ａの公知構造に基づく変化を許容する他の領域を容易に決定し得る。

ＮＳ３／４ａに由来するエピトープを含む多くの抗原（ｃ３３ｃ領域、ｃ２００領域、ｃ１００領域および５−１−１領域に由来する抗原、ならびにＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質（例えば、ｃ２５）が挙げられるが、これらに限定されない）が公知である。

他のＨＣＶ領域からのこれらのＨＣＶエピトープおよび種々の他のＨＣＶエピトープの記載については、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８および米国特許第６，２８０，９２７号および同第６，１５０，０８７号を参照のこと。

本明細書で記載されるイムノアッセイもまた、エピトープ融合抗原（「ＭＥＦＡ」と呼ばれる）を利用し、例えば、国際公開番号ＷＯ０１／９６８７５および同ＷＯ０１／０９６０９および同ＷＯ９７／４４４６９および米国特許第６，５１４，７３１号および同第６，４２８，７９２号で記載される。当該アッセイでの使用のためのＭＥＦＡは、図１および表１で示される種々のウイルス領域および上記のような種々のウイルス領域のいずれかに由来する複数のエピトープを含む。

複数のＨＣＶ抗原は、天然には存在しない単一のアミノ酸連続鎖の一部である。従って、上記エピトープの直線順序は、それらが存在するゲノム中の直線順序とは異なる。本明細書中での使用のためのＭＥＦＡの配列の直線順序は、最適な抗原性のために好ましく整列される。好ましくは、上記エピトープは、１つより多くのＨＣＶ株由来であり、従って、単一のアッセイにおいてＨＣＶの複数の株を検出する追加能力を提供する。従って、本明細書中での使用のためのＭＥＦＡは、上記のポリタンパク質に由来する種々の免疫原性領域を含み得る。

上述のように、特に好ましい実施形態では、ＮＳ３／４ａエピトープは単離されたＨＣＶ抗原として使用される。この実施形態では、上記ＭＥＦＡは、ＮＳ３／４ａ領域に由来する少なくとも１つ以上のエピトープ（直線的またはコンフォメーションのいずれか）を含む。それゆえ、上記ＭＥＦＡは、１つ以上のＨＣＶ単離株からのＮＳ３／４ａ領域に由来する複数の免疫優性エピトープを含み得る。複数のＮＳ３／４ａエピトープが、複数のエピトープ融合で使用される場合、それらは、同じエピトープであっても異なるエピトープであってもよい。あるいは、融合抗原は、ＮＳ３／４ａ領域に由来する１つ以上のエピトープ、ならびに、他のＨＣＶ領域からの主要な直線的エピトープ（例えば、ＨＣＶコア配列、Ｅ１配列、Ｅ２配列、Ｐ７配列、ＮＳ４ｂ配列、ＮＳ５ａ配列およびＮＳ５ｂ配列であるが、これらに限定されない）を含み得る。

ＮＳ３／４ａ領域に由来するエピトープを含むポリペプチドは、ＮＳ３領域、ＮＳ４ａ領域およびＮＳ３／４ａ領域の全部または一部を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。これらの領域由来の多くのエピトープが公知であり、ｃ３３ｃ領域、ｃ２００領域およびｃ１００領域に由来する抗原、ならびに、ＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質（例えば、ｃ２５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＮＳ３エピトープおよび他のＮＳ３エピトープは当該アッセイで有用であり、そして、当該分野で公知であり、そして、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８および米国特許第６，３４６，３７５号および同第６，１５０，０８７号で記載される。

さらに、５−１−１として公知である抗原決定基は、部分的にＮＳ４ａ領域（図１参照）内にあり、そして、当該アッセイでの使用のためのＭＥＦＡで特に有用である。この抗原決定基は、ＨＣＶの３つの異なるウイルス株上において３つの異なる形態で存在する。従って、本発明の好ましい実施形態では、５−１−１の３つすべての形態は、当該イムノアッセイで使用されるマルチエピトープ融合抗原上に存在する。

ＭＥＦＡでの使用のためのさらなるＨＣＶエピトープとしては、上記された種々のエピトープのいずれか（例えば、Ｅ２の超可変領域（例えば、アミノ酸３８４−４１０もしくは３９０−４１０にわたる領域）に由来するエピトープ、または、上記のようなこの領域由来のコンセンサス配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ）（配列番号７）（ＨＣＶ１型ゲノムのアミノ酸３９０−４１０のコンセンサス配列を表す））が挙げられる。本発明のＭＥＦＡに存在する代表的なＥ２エピトープは、アミノ酸３９０−４４４にわたるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、ＨＣＶ Ｅ２のアミノ酸４１１−４４４のためのネイティブアミノ酸配列に融合しているアミノ酸３９０〜４１０を表すコンセンサス配列を包含し得る。

上述のように、上記抗原は、種々のＨＣＶ株に由来し得る。ＨＣＶの複数のウイルス株が公知であり、そしてこれらの株のいずれかに由来するエピトープが、融合タンパク質で使用され得る。任意の所定の種の生物が、１つの個別の生物と別の生物とで変動することは周知であり、そしてさらに、ウイルスのような所定の生物が、多くの異なる株を持ち得ることも周知である。例えば、上述のように、ＨＣＶは、少なくとも６つの遺伝子型を包含する。これらの遺伝子型の各々は、等価な抗原決定基を含む。さらに具体的には、各々の株は、上記ウイルスのすべての株上に存在するがあるウイルスの株と別のウイルスの株とでわずかに異なる、多くの抗原決定基を含む。同様に、異なるＨＣＶ株のコア領域からの等価な抗原決定基もまた存在し得る。一般的に、等価な抗原決定基は、アミノ酸配列に関して高い程度の相同性を有し、整列された場合にその相同性の程度は一般的に３０％以上、好ましくは４０％以上である。本発明の多コピーエピトープもまた、同じエピトープの正確なコピーである複数のコピーを含む。

当該アッセイとともに使用するための代表的なＭＥＦＡが、図５、図７および図９Ａ〜図９Ｃにおいて示され、そして、国際公開番号ＷＯ０１／９６８７５，ＷＯ０１／０９６０９，ＷＯ９７／４４４６９および米国特許第６，５１４，７３１号および同第６，４２８，７９２号において記載される。本明細書中での使用のための代表的なＭＥＦＡとしては、ＭＥＦＡ３，ＭＥＦＡ５，ＭＥＦＡ６，ＭＥＦＡ７．１，ＭＥＦＡ１２，ＭＥＦＡ１３およびＭＥＦＡ１３．１と呼ばれるＭＥＦＡが挙げられる。これらのＭＥＦＡは単に代表的なものに過ぎず、そして、ＨＣＶゲノムに由来する他のエピトープもまた当該アッセイとの使用が見出され、そしてこれらのＭＥＦＡまたは別のＭＥＦＡに組み込まれ得るということが理解されるべきである。

ＭＥＦＡ１２のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列が図６Ａから図６Ｆ（配列番号３および配列番号４）において示される。ＭＥＦＡ１２に関する一般的な構造式が図５で示され、それは以下の通りである：ｈＳＯＤ−Ｅ１（１型）−Ｅ２ ＨＶＲコンセンサス（１ａ型）−Ｅ２ ＨＶＲコンセンサス（１型および２型）−ｃ３３ｃショート（１型）−５−１−１（１型）−５−１−ｌ（３型）−５−１−１（２型）−ｃ１００（１型）−ＮＳ５（１型）−ＮＳ５（１型）−コア（１型＋２型）−コア（１型＋２型）。この多コピーエピトープとしては、ＨＣＶ−１に対して番号を付された以下のアミノ酸配列（以下で示されるアミノ酸の番号付けは、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５で提供される番号付け指定に従い、ここで、アミノ酸番号１が、コア領域のコード配列によりコードされている最初のメチオニンである）が挙げられる。スーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸１位−６９位（タンパク質の組換え発現を高めるために使われる、切断されたＳＯＤ）；Ｅ１領域からのポリタンパク質アミノ酸３０３位から３２０位；ＨＣＶ−１ａ Ｅ２の超可変領域のコンセンサス配列を表す、上記ポリタンパク質のアミノ酸３９０位−４１０位；ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２のＥ２超可変領域のコンセンサス配列を表す、領域Ｅ２からのポリタンパク質のアミノ酸３８４位から４１４位；ヘリカーゼを規定する、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸１２１１位−１４５７位；５−１−１からのエピトープのアミノ酸１６８９位−１７３５位の３つのコピー（ＨＣＶ−１からのコピー、ＨＣＶ−３からのコピー、そしてＨＣＶ−２からのコピーであり、これらのコピーは、ＨＣＶの３つの異なるウイルス株からの等価な抗原決定基である）；ＨＣＶ−１のＨＣＶポリペプチドｃ１００、ポリタンパク質のアミノ酸１９０１位−１９３６位；ＨＣＶ−１のＮＳ５領域からのエピトープの２つの正確なコピー（各々は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８位から２３１３位を有する）；そして、コア領域からの３つのエピトープの２つのコピー（ＨＣＶ−１からの２つのコピーおよびＨＣＶ−２からの１つのコピーであり、これらのコピーは、ＨＣＶ−１のアミノ酸９位から５３位およびのアミノ酸６４位−８８位およびＨＣＶ−２のアミノ酸６７位−８４位により表される等価な抗原決定基である）。

表２は、本明細書中の図６Ａから図６Ｆ（配列番号３および配列番号４）に関してＭＥＦＡ１２中の種々のエピトープのアミノ酸位置を示す。表中の番号付けは、ＨＣＶ−１に関連する。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照。ＭＥＦＡ１３およびＭＥＦＡ１３．１もまた、それぞれ、表３および表４で指示されたような改変を含んで、ＭＥＦＡ１２について上で特定された一般式を共有する。

＊５−１−１エピトープは、ＮＳ３／４ａ組み換えタンパク質により標的とされる、可能な切断部位（ＣＳまたはＣＡ）を除去することにより改変される。ＣＳまたはＣＡの代わりに、この配列はＰＩに変えられている。

＊５−１−１エピトープは、ＮＳ３／４ａ組み換えタンパク質により標的とされる、可能な切断部位（ＣＳまたはＣＡ）を除去することにより改変される。ＣＳまたはＣＡの代わりに、配列はＰＩに変えられている。

別の代表的な多エピトープ融合抗原である、ＭＥＦＡ７．１のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列が、図８Ａから図８Ｆ（配列番号５および配列番号６）において示されている。ＭＥＦＡ７．１についての一般的な構造式が図７で示され、そしてそれは、以下の通りである：ｈＳＯＤ−Ｅ１（１型）−Ｅ２ ＨＶＲコンセンサス（１ａ型）−Ｅ２ ＨＶＲコンセンサス（１型および２型）−ヘリカーゼ（１型）−５−１−１（１型）−５−１−１（３型）−５−１−１（２型）−ｃ１００（１型）−ＮＳ５（１型）−ＮＳ５（１型）−コア（１型＋２型）−コア（１型＋２型）。この多コピーエピトープは、ＨＣＶ−１に関連して番号を付された、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５で提供されている番号付け指定に従い、以下に示されるアミノ酸の番号付けは、アミノ酸番号１が、コア領域のコード配列によりコードされている最初のメチオニンである、以下のアミノ酸配列を含む：スーパーオキシドジスムターゼ（上記タンパク質の組み換え体発現を高めるために使われる、ＳＯＤ）のアミノ酸１−１５６；Ｅ１領域からのポリタンパク質のアミノ酸３０３から３２０；ＨＣＶ−１ａ Ｅ２の超可変領域のコンセンサス配列を表す、ポリタンパク質のアミノ酸３９０−４１０；ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２のＥ２の超可変領域のコンセンサス配列を表す領域Ｅ２からのポリタンパク質のアミノ酸３８４から４１４；ヘリカーゼを規定する、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸１１９３−１６５８；５−１−１のアミノ酸１６８９−１７３５からのエピトープの３つのコピー（ＨＣＶ−１からのもの、ＨＣＶ−３からのもの、そしてＨＣＶ−２からのものであり、それらのコピーはＨＣＶの３つの異なるウイルス株からの等価な抗原決定基である）；ＨＣＶ−１のＨＣＶポリペプチドＣ１００、ポリタンパク質のアミノ酸１９０１−１９３６；ＨＣＶ−１のＮＳ５領域からのエピトープの２つの正確なコピー（各々がＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８から２３１３を有する）；ならびに、コア領域からのエピトープの２つのコピー（ＨＣＶ−１からの１つおよびＨＣＶ−２からの１つ）、それらのコピーはＨＣＶ−１のアミノ酸９−３２、３９−４２およびアミノ酸６４−８８およびＨＣＶ−２のアミノ酸６７−８４により表される等価な抗原決定基である。

表５は、本明細書中図８Ａから図８Ｆ（配列番号５および配列番号６）に関する種々のエピトープのアミノ酸位置を示す。

あるアッセイ形式において、上記サンプルは、以下でさらに記載されるように、固体支持体と合わされる。この固体支持体は、単離されたＨＣＶ抗原（例えば、１以上のＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープ）、または、上記のようなＭＥＦＡ（このＭＥＦＡは、ＨＣＶ抗原と同じ上記ポリタンパク質の領域に由来する（例えば、ＮＳ３／４ａ領域由来）１以上のエピトープを含む）のいずれかを含む。上述のように、このようなエピトープを含む多くの抗原が公知であり、この抗原としては、ｃ３３ｃ領域に由来する抗原およびｃ１００領域に由来する抗原、ならびに、ＮＳ３エピトープ（例えば、ｃ２５）、およびＮＳ４領域内に部分的に存在する５−１−１として公知である抗原決定基を含む融合タンパク質（図１を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＮＳ３／４ａエピトープおよび他のＮＳ３／４ａエピトープは、本アッセイで有用であり、そして、当該分野で公知であり、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８ならびに米国特許第６，３４６，３７５号および同第６，１５０，０８７号において記載される。

サンプルがＨＣＶに感染している場合、固体支持体上に存在するエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体支持体構成部分に結合する。生物学的サンプルに由来する捕捉されたＨＣＶ抗体とも反応する検出可能に標識された抗原もまた、液相中に添加される。例えば、固体支持体に結合している抗原が、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープである場合、液相中で使用される検出可能に標識された抗原は、ＮＳ３／４ａエピトープを含むＭＥＦＡである。固体支持体に結合している抗原が、ＮＳ３／４ａエピトープを含むＭＥＦＡである場合、液相中で使用される検出可能に標識された抗原は、コンフォメーションＮＳ３／４ａエピトープを含む。

本発明下での代表的なアッセイが、図２において示される。この図で示されるように、上記固体支持体は、コンフォメーションＮＳ３／４ａエピトープを含む。上記生物学的サンプルは、固体支持体に添加される。サンプル中に存在する上記ＮＳ３／４ａエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体支持体上のＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープに結合する。その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化ＭＥＦＡ１２（サンプル抗体が結合するエピトープを含む）が、添加される。ＭＥＦＡ１２は、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープによっても結合される抗体に結合する。未結合の成分は洗い流され、そして上記標識の検出は、ＨＣＶ感染の存在を示す。

上述の抗原／抗体／抗原サンドウィッチアッセイは、サンプル抗体に結合する２つの抗原の使用が大量のサンプルの使用を可能にするので有利である。さらに、当該アッセイは迅速に完了され得る。

（ＨＣＶイムノアッセイでの使用のための抗原の産生）
上述のように、本発明の分子は、一般的に組み換えにより産生される。従って、本発明との使用のためのＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準技術を使用して生成され得る。例えば、上記分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例えば、遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、または、上記を含むことが公知であるベクターから遺伝子を得ることにより）得られ得る。さらに、望ましい遺伝子は、、当該分野で記載される技術（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号）を使用してウイルス核酸分子から直接単離され得る。目的の遺伝子はまた、クローニングよりもむしろ合成により産生され得る。当該分子は、特定の配列についての適切なコドンを用いて設計され得る。その後、完全な配列が、標準的な方法により調製されたオーバーラップしているオリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。

従って、特定のヌクレオチド配列が、望ましい配列を保有するベクターから得られ得るか、または、当該分野で公知である種々のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合は、部位特異的変異およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を完全、または部分的に使用して合成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照。特に、望ましい配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、通常の自動化されたポリヌクレオチド合成装置で産生されるオーバーラップした合成オリゴヌクレオチドの相補対をアニーリングし、その後、適切なＤＮＡリガーゼを用いる連結、および、（ＰＶＲ）を介する連結されたヌクレオチド配列の増幅を行うことにより、得られる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４０８４−４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド特異的合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ５４：７５−８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）およびＴ_４ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップを有するオリゴヌクレオチドの酵素的充填（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３）が、本発明下で使用されて、改変した抗原結合能力もしくは増強した抗原結合能力、および／または減少した免疫原性を有する分子が提供され得る。

一旦、コード配列が調製または単離されれば、このような配列は、適切な任意のベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。多数のクローニングベクターが、当業者に公知であり、そして、適切なクローニングベクターの選択は、選択事項である。適切なベクターとしては、適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能である、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、またはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

次にコード配列は、発現のために使用される系に依存して、適当な制御エレメントの制御下に、配列される。従って、コード配列は、目的のＤＮＡ配列が適当な形質転換体によりＲＮＡに転写されるように、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のため）および、必要に応じて、オペレーターの制御下に、配列され得る。コード配列は、翻訳後のプロセシングで宿主により後ほど除去され得る、シグナルペプチドもしくはリーダー配列を含んでも含まなくてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照。

制御配列に加え、宿主細胞の成長に関連して配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望ましいかもしれない。調節配列は、当業者に公知であり、そして、例としては、調節化合物の存在を含む化学的刺激もしくは生理学的刺激に反応してオンもしくはオフになる遺伝子の発現を引き起こす配列が挙げられる。他のタイプの調節エレメントもまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、本明細書では、構築物の発現レベルを増加させるために使用され得る。例としては、ＳＶ４０早期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７）、そして、ＣＭＶイントロンＡ配列中に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８号）のようなヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）が挙げられる。発現カセットは、さらに、適当な宿主細胞中での自律的な複製のための複製起点、１またはそれ以上の選択マーカー、１またはそれ以上の制限部位、高コピー数のための能力および強いプロモーターを含み得る。

発現ベクターは、特定のコード配列が、適当な調節配列とともにベクター中に配置され、そしてコード配列が制御配列の「制御」下で転写されるように（すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写する）、コード配列が制御配列に対して位置決めおよび配向されるように構築される。目的の分子をコードする配列の修飾は、この目的を達成するために望ましいかもしれない。例えば、いくつかのケースでは、適当な配向で制御配列に結合し得るような配列を修飾すること；すなわち、リーディングフレームを維持することが必要になり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、すでに制御配列および適当な制御部位を含む発現ベクター内に直接的にクローン化され得る。

上述のように、目的の抗原の変異体またはアナログを産生することもまた望ましいかもしれない。これは、特にＮＳ３／４ａの場合に当てはまる。そのようにする方法が、例えば、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら，米国特許第５，９９０，２７６号に記載される。本アッセイでの使用のためのこのＨＣＶタンパク質および他のＨＣＶタンパク質の変異体またはアナログが、目的のポリペプチドをコードする配列の一部の欠失により、および配列の挿入により、および／または配列内の１以上のヌクレオチドの置換により調製され得る。ヌクレオチド配列を修飾する技術（例えば、部位特異的な突然変異導入など）が、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ７９：６４０９を参照のこと。

その分子は、昆虫、哺乳類、細菌、ウイルスおよび酵母発現系を含む広範囲の系で発現され得、すべて当該分野で周知である。

例えば、バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系が、当業者に公知であり、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）で記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」ｋｉｔ）からのキット形態で市販されている。同様に、細菌および哺乳類細胞発現系が当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）で記載されている。酵母発現系もまた、当該分野で公知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編集，１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載される。

上記の系での使用のための多くの適当な宿主細胞もまた、公知である。例えば、哺乳類細胞株が当該分野で公知であり、そして、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である不死化細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚性腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、ならびにその他の細胞であるが、これらに限定されない）が挙げられる。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．のような細菌宿主が、本発現構築物で使用され得る。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ，Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターでの使用のための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ，Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ，Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ，Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。

目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれ得るか、または本分野で周知の種々の遺伝子送達技術を使用する適当な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上で維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照。

発現系および選択される宿主に依存して、本分子は、タンパク質が発現される条件下、上記の発現ベクターにより変換される宿主細胞の成長により産生される。発現したタンパク質はその後宿主細胞から単離および精製される。もし、発現系が、増殖培地液中にタンパク質を分泌するならば、産生物は培地液から直接精製され得る。もし、分泌されないならば、産生物は、細胞溶解物から単離され得る。適当な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の技術内である。

様々なＨＣＶ抗原の組み換え型生産が記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８を参照。

（免疫診断アッセイ）
ひとたび産生されれば、上記ＨＣＶ抗原は、本イムノアッセイで使用される適当な固体支持体上に配置される。この発明のために、固体支持体は不溶性マトリックスである任意の材料であり得、そして、剛体表面または半剛体表面を持ち得る。例示的な固体支持体としては、ニトロセルロース（例えば、メンブレンまたはマイクロタイターウェルの形態において）；ポリビニルクロライド（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）；ジアゾ化された紙；ナイロンメンブレン；活性化されたビーズ、磁気反応性ビーズなどのような基材が挙げられるが、これらには限定されない。特定の支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空ファイバー、針、ピン、固体ファイバー、セルロースビーズ、孔の開いたガラスビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンと架橋されたポリスチレンビーズ、移植された共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンと架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングされたガラス粒子が挙げられる。

望まれる場合、固体支持体に添加され得る分子は、スチレンまたはアクリレート部分を生成するために容易に官能性を持つことができ、従って、ポリスチレン、ポリアクリレート、または、ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、ポリサッカライド、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸、ハイドロゲル、アガロース、セルロースなどのような他のポリマーへの分子の取り込みを可能にする。

１つの文脈において、固体支持体は、分子が十分に支持体に固定されるような適当な結合条件化、単離されるＨＣＶ抗原もしくはＭＥＦＡ（ここでは「固相構成要素」と呼ばれる）のいずれかと、最初に反応する。時々、支持体に対する固定は、より良い固相結合特性で最初にタンパク質に抗原をカップリングさせることにより増強され得る。適当なカップリングタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、および当業者にとって周知である他のタンパク質のような巨大分子が挙げられるが、これらに限定されない。分子を支持体に結合させるために使用され得る他の試薬は、ポリサッカライド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。このような分子およびこれらの分子を抗原にカップリングさせるこのような方法は、当業者にとって周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照。

固体支持体を固相構成要素と反応させた後、固定化されない任意の固相構成要素は、洗浄により支持体から除去され、そして、支持体に結合した構成要素は、その後、適当な結合条件下、ＨＣＶ抗体（本明細書において「リガンド分子」と呼ばれる）を含むと疑われる生物学的サンプルと接触する。任意の非結合リガンド分子を除去するために洗浄した後、２番目のＨＣＶ抗原（固体支持体に結合する抗原に依存して、単離されたＨＣＶ抗原またはＭＥＦＡのいずれか）が適当な結合条件下で添加される。この２番目の抗原は、本明細書では「液相構成要素」と呼ばれる。添加される抗原は、上述のように検出可能なラベルを含み、そして、支持体に結合する抗原と反応したリガンド分子と結合する。従って、リガンド分子は、両方の固相構成要素、ならびに液相構成要素に結合する。非結合のリガンド分子および液相構成要素は、洗浄により除去される。ラベルの存在は、それゆえに、生物学的サンプル中のＨＣＶ抗体の存在を示す。

より具体的には、マイクロタイタープレートのウェルが固相構成要素でコーティングされるＥＬＩＳＡ法が、使用され得る。リガンド分子を含むまたは含むことが疑わしい生物学的サンプルは、その後コーティングされたウェルに添加される。リガンド−分子が固定された固相構成要素に結合することを可能にするのに十分なインキュベーションの期間の後、プレートは、非結合部分を除去するために洗浄され得、そして、検出可能なラベル化された液相構成要素が添加される。これらの分子は、捕捉されるサンプル抗体のいずれかと反応することを可能にされ、プレートは洗浄され、そしてラベルの存在が当該分野において周知の方法を使用することで検出される。

上述のようなイムノアッセイを行うために、結合した抗原を有するイムノアッセイ固体支持体を含む上述のアッセイ試薬、ならびに捕捉されたサンプルと反応する抗原が、適当な使用説明書および他の必要な試薬を備えるキットにおいて提供され得る。本キットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、適当なラベルおよび他の包装された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。上述のような標準的なイムノアッセイは、これらのキットを使用することで実施され得る。

（ＩＩＩ．実験）
以下が、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は、例示の目的のためだけに提供され、そして、どの点においても、本発明の範囲を制限することを意図しない。

使用される数字（例えば、量、温度など）に関して、正確さを確実にするために努力がなされているが、もちろん、いくつかの実験誤差および偏差は認められるべきである。

（実施例１）
（ＴｈｒのＰｒｏへの置換およびＳｅｒのＩｌｅへの置換を用いたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープの産生）
ＮＳ３／４ａのコンフォメーショナルエピトープは、以下のようにして得られた。このエピトープは図３Ａから図３Ｄ（配列番号１および配列番号２）で特定される配列を持ち、そして、４０３位（ＨＣＶ−１全長配列のアミノ酸１４２８）および４０４位（ＨＣＶ−１全長配列のアミノ酸１４２９）で、天然型配列と異なる。具体的には、天然型配列の１４２８位で通常生じるＴｈｒは、Ｐｒｏに突然変異し、そして、天然型配列の１４２９位で生じるＳｅｒは、Ｉｌｅに突然変異する。

具体的には、使用される酵母発現ベクターは、ｐＢＳ２４．１であった。この酵母発現ベクターは、酵母内での自律複製のための２μ配列およびインバーテッドリピート（ＩＲ）、転写終結を確実にするα因子ターミネーター、および選択のための酵母ｌｅｕ２−ｄおよびＵＲＡ３を含む。ＣｏｌＥ１複製起点およびβ−ラクタマーゼ遺伝子もまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中での増殖および選択のために存在する（Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓら（１９９６）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎ Ｙｅａｓｔ」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ５．Ｊ．Ｌ．ＣｌｅｌａｎｄおよびＣ．Ｃｒａｉｋ編集，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．ｐｐ．１２９−１６１）。

本イムノアッセイで使用される代表的なＮＳ３／４ａエピトープをコードするプラスミドｐｄ．ｈｃｖ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩは、以下のように産生された。２工程の手順が使用された。最初に、以下のＤＮＡ片が一緒に連結された：（ａ）５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、引き続いて配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ（配列番号８）、イニシエーターＡＴＧ、およびアミノ酸１０２７で始まり、そしてアミノ酸１０４６でＢｇｌＩ部位に続くＨＣＶ１ａのためのコドンを提供する合成オリゴヌクレオチド；（ｂ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩからの６８３ｂｐＢｇｌＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（アミノ酸１０４６−１２７４をコードする）；および（ｃ）脱リン酸化され、そしてゲル精製されたＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化されたｐＳＰ７２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッションナンバーＸ６５３３２）。プラスミドｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩは、ｐＡｃＨＬＴという、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているバキュロウイルス発現ベクターに由来する。具体的には、ｐＡｃＨＬＴ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクター、ならびに以下のフラグメントが調製された：ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１０２７−１３３６に対応するＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩ，９３５ｂｐ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１３３６−１４１９に対応するＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩ，２４７ｂｐ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸配列１４４９−１５０９に対応するＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩ，１７５ｂｐ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１５１０−１７１１に対応するＢｇｌＩ−ＰｓｔＩ，６１９ｂｐ、および転写終結コドン。ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４２０−１４４８に対応し、そして、ＰＩ突然変異（Ｐｒｏに突然変異したＴｈｒ−１４２８、Ｉｌｅに突然変異したＳｅｒ−１４２９）を含む９１ｂｐのフラグメントを合成的に生じるＳａｃＩＩ−ＨｉｎｆＩは、１７５ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩフラグメントおよび上述の６１９ｂｐのＢｇｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントと連結され、そして、ＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩで消化されるｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）ベクター中にサブクローニングされた。ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）は、市販のＥ．ｃｏｌｉベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッションナンバーＸ６５３０８）である。コンピテントＨＢ１０１細胞の形質転換、個々のクローンのミニスクリーンアッセイおよび配列検証の後、ｐＧＥＭ５．ＰＩクローン２からの８８５ｂｐのＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントは、ゲル精製された。このフラグメントは、上述のＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩの９３５ｂｐフラグメント、ＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩの２４７ｂｐフラグメントおよびｐＡｃＨＬＴ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターと連結された。結果としての構造物は、ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと命名された。

上記の連結混合物は、ＨＢ−１０１コンピテント細胞中に形質転換され、そして１００μ／ｍｌアンピシリンを含むルリア寒天プレート上で培養された。個々のクローンのＭｉｎｉｐｒｅｐ解析は、陽性であると推定され、それらの２つが増幅された。ｐＳＰ７２ １ａＨＣ、クローン＃１およびクローン＃２のためのプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて調製され、そして配列が決定された。

次に、以下のフラグメントが、ともに連結された：（ａ）ｐＳＰ７２１ａＨＣ＃１からの７６１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメント（ｐＳＰ７２．１ａＨＣは以下のと共に連結されることにより生成された：ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化されたｐＳＰ７２、５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、引き続いて配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ（配列番号８）、開始コドンＡＴＧ、そして、アミノ酸１０２７で始まり、アミノ酸１０４６でＢｇｌＩ部位が続くＨＣＶ１ａのためのコドン、そしてｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩからの６８３ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（アミノ酸１０４６−１２７４をコードする）を与える合成オリゴヌクレオチド）；（ｂ）酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨのための１３５３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；（ｃ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩからの１３２０ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメント（Ｐｒｏに突然変異したＴｈｒ１４２８およびＩｌｅに突然変異したＳｅｒ１４２９をもつＨＣＶ１ａアミノ酸１０４６−１７１１をコードする）；ならびに（ｄ）ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化され、脱リン酸化され、そしてゲル精製されたｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター。連結混合物は、コンピテントなＨＢ１０１中に形質転換され、そして１００μ／ｍｌアンピシリンを含むルリア寒天プレート上で培養された。個々のコロニーのＭｉｎｉｐｒｅｐ解析によって、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、開始コドンＡＴＧ、およびＰｒｏに変異したＴｈｒ１４２８（図３Ａ−図３Ｄのアミノ酸４０３位）およびＩｌｅに突然変異したＳｅｒ１４２９（図３Ａ−図３Ｄのアミノ酸４０４位）を持つアミノ酸１０２７−１７１１（図３Ａ−図３Ｄのアミノ酸１−６８６として示される）からのＨＣＶ１ａ ＮＳ３／４ａが含まれた、予想される３４４６ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入を持つクローンを同定した。構築物は、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと命名された（図４を参照）。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３は、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩを用いて形質転換され、そして１つの形質転換体は、培地中のグルコースの枯渇の後、発現のために確認された。クマシーブルーにより検出され、そしてＮＳ３のヘリカーゼドメインに対するポリクローナル抗体を使用するイムノブロット解析により確認されるように、組み換え型タンパク質は、酵母中で高レベルで発現された。

（実施例２）
（ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープの精製）
ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープは以下のように精製された。ＮＳ３／４ａエピトープを発現する上記からのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、上述のように採取された。その細胞は、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，０．１μＭペプスタチン，１μＭ ロイペプチン）中で懸濁され、そして、細胞：緩衝液：０．５ｍｍガラスビーズが１：１：１の割合で、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはガラスビーズを使用する等価な装置で溶解された。

溶解物は、４℃で３０分間３０１００×ｇで遠心分離され、そして不溶性タンパク質画分を含むペレットが、緩衝液を洗浄するために添加され（６ｍｌ／ｇ 細胞ペレットの開始重量）、そして室温で１５分間揺すり動かされた。洗浄緩衝液は、５０ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ８．０，０．３Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ β−メルカプトエタノール，１０％ グリセロール，０．０５％ オクチルグルコシド，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，０．１μＭ ペプスタチン，１μＭ ロイペプチンからなる。細胞破片は、４℃で３０分間３０１００×ｇで遠心分離することにより除去された。上清は捨てられ、そしてペレットは確保された。

タンパク質は、以下のようにペレットから抽出された。６ｍｌ／ｇ抽出緩衝液が添加され、そして室温で１５分間揺すり動かされた。抽出緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，０．１Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ β−メルカプトエタノール，１０％ グリセロール，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，０．１μＭ ペプスタチン，１μＭ ロイペプチンからなる。これは、４℃で３０分間３０１００ｘｇで遠心分離された。上清が保持され、そして、硫酸アンモニウムが、以下の式を使用して、１７．５％にまで添加された：上清の容量（ｍｌ）掛けるｘ％硫酸アンモニウム（１−ｘ％硫酸アンモニウム）＝上清に添加する４．１Ｍ飽和硫酸アンモニウムのｍｌ。氷上で攪拌しながら、硫酸アンモニウムを添加し、そして、溶液を、１０分間氷上で攪拌した。溶液は、４℃で３０分間１７７００ｘｇで遠心分離され、そして、ペレットが確保され、４８時間まで２℃から８℃で保存された。

ペレットは、以下のように４℃で再懸濁され、そしてＰｏｌｙＵカラム（ＰｏｌｙＵ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通された。ペレットは、ペレット重量１グラムにつき６ｍｌのＰｏｌｙＵ平衡バッファーで再懸濁された。平衡バッファーは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０，２００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＤＴＴ（新たに添加される），１０％ グリセロール，１．２ オクチルグルコシドからなる。溶液は、１５分間４℃で揺すり動かされ、そして、４℃で３０分間３１０００ｘｇで遠心分離された。

ＰｏｌｙＵカラム（ペレットの開始重量１グラムにつき１ｍｌの樹脂）が調製された。直線的流量速度は、６０ｃｍ／ｈｒであり、そして、パッキング流量速度は、６０ｃｍ／ｈｒの１３３％であった。カラムは、平衡緩衝液で平衡化され、そして再懸濁された硫酸アンモニウムペレットの上清が平衡カラム上にロードされた。カラムは、平衡緩衝液でベースラインまで洗浄され、そしてタンパク質は以下のＰｏｌｙＵ溶離緩衝液で、段階的溶出により溶出された：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０，１Ｍ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＤＴＴ（新たに添加される），１０％グリセロール，１．２ オクチルグルコシド。カラム溶出液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに通され（クマシー染色され）、そして、アリコートを−８０℃で凍結し、保管した。ＮＳ３／４ａエピトープの存在は、ＮＳ３プロテアーゼドメインに対して指向されたポリクローナル抗体および５−１−１エピトープ（ＨＣＶ４ａ）に対するモノクローナル抗体を使用することで、ウェスタンブロットにより確認された。

さらに、プロテアーゼ酵素活性は、以下のように精製の間、モニタリングされた。ＮＳ４Ａペプチド（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ）（配列番号９）、および、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープを含むサンプルは、９０μの反応緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，０．０５ ｎ−ドデシル Ｂ−Ｄ−マルトシド，５ｍＭ ＤＴＴ）で希釈され、そして室温で３０分間混合された。９０μｌの混合物が、マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に添加され、そして１０μｌのＨＣＶ基質（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）が添加された。そのプレートは、混合され、そしてＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダー上で読まれた。結果は、１分毎の相対的蛍光発光単位（ＲＦＵ）として表示された。

これらの方法を使用することで、１Ｍ ＮａＣｌ抽出の産物は、３．７ＲＦＵ／分の活性を含み、硫酸アンモニウム沈殿は、７．５ＲＦＵ／分の活性を有し、そしてＰｏｌｙＵ精製の産物は、１８．５ＲＦＵ／分の活性を有した。

（実施例３）
（ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープ 対 変性ＮＳ３／４ａの免疫反応性）
上述のように産生されるＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープの免疫反応性は、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープ調整液に２％の最終濃度になるようにＳＤＳを添加することにより変性されるＮＳ３／４ａと比較された。変性したＮＳ３／４ａおよびコンフォメーショナルＮＳ３／４ａは、上述のようにマイクロタイタープレート上に、コーティングされた。ｃ２００抗原（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）１５：１９−２５，ＯＲＴＨＯ ＨＣＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙで入手可能）もまた、マイクロタイタープレート上にコーティングされた。ｃ２００抗原は、処方物中の還元剤（ＤＴＴ）および界面活性剤（ＳＤＳ）の存在のため、非コンフォメーションであることが推定される比較として使用された。

免疫反応性は、２つの初期ＨＣＶセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０４およびＰＨＶ９１４（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡから市販のヒト血液サンプル）に対して試験された。結果が表６に示される。データは、ＮＳ３／４ａ（ならびにｃ２００）の変性した形態または直鎖状の形態が、ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープほど早く初期セロコンバージョンパネルを検出しないということを示唆する。

コンフォメーショナルエピトープの免疫反応性もまた、標準的な手順を使用して作製されるＮＳ３／４ａに対するモノクローナル抗体を使用することで試験された。これらのモノクローナル抗体は、その後、ＮＳ３／４ａおよび変性したＮＳ３／４ａおよびｃ２００抗原に対してＥＬＩＳＡ形式で試験された。データは、抗ＮＳ３／４ａモノクローナル抗体が、表７で示されるセロコンバージョンパネルに類似する様式で、ＮＳ３／４ａおよび変性したＮＳ３／４ａに反応することを示す。反応性において初期ｃ３３ｃセロコンバージョンパネルに類似するモノクローナル抗体が作製され得るので、この結果もまた、ＮＳ３／４ａが天然でコンフォメーショナルであるというさらなる証拠を提供する。

（実施例４）
（ＨＣＶ抗原を用いた固体支持体のコーティング）
ＨＣＶ ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープまたはＭＥＦＡ抗原は、以下のようにプレート上にコーティングされる。ＨＣＶコーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ７．０，２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％クロロアセトアミド）は、０．２２μ濾過ユニットを通じて濾過される。以下の試薬は、その後逐次的にＨＣＶコーティング緩衝液に添加され、そして、各々の添加後、攪拌される：１０ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．Ｐｅｎｔｅｘ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からの２μｇ／ｍｌ ＢＳＡ−スルフヒドリル修飾；１Ｍ 溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からの５ｍＭ ＤＴＴ；０．４５μｇ／ｍｌ ＮＳ３／４ａ（０．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）；または０．３７５μｇ／ｍｌ ＭＥＦＡ ７．１（１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）。最終溶液は、室温で１５分間撹拌される。

２００μｌの上記溶液は、Ｃｏｓｔａｒ高結合、平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の各々のウェルに添加され、そして、プレートは、高湿室で一晩インキュベートされる。プレートは、その後、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ ＴＷＥＥＮ−２０）で洗浄され、軽くたたかれ、乾燥され、そして２８５μｌのＯｒｔｈｏ Ｐｏｓｔ−Ｃｏａｔ Ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４，１％ＢＳＡ，３％スクロース）が添加される。プレートは少なくとも１時間インキュベートされ、軽くたたかれ、そして２８℃で一晩乾燥される。プレートは、少なくとも１時間インキュベートされ、軽く叩かれ、そして、２〜８℃で一晩乾燥される。

（実施例５）
（イムノアッセイ）
ＨＣＶ感染を検出するための本発明のイムノアッセイの能力を試験するために、市販のＨＣＶ感染したヒト血液サンプルのパネルが使用される。このようなパネルは、Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡ（ＢＢＩ）；Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ（ＢＣＰ）およびＮｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃｏＲａｔａｎ，ＦＬ（ＮＡＢＩ）から市販される。

アッセイは、以下のように実施される。２００μ検体希釈緩衝液（１ｇ／ｌ カゼイン，１００ｍｇ／ｌ 組み換えヒトＳＯＤ，１ｇ／ｌ クロロアセトアミド，１０ｇ／ｌ ＢＳＡ，５００ｍｇ／ｌ 酵母抽出物，０．３６６ｇ／１ ＥＤＴＡ，１．１６２ｇ／１ ＫＰＯ_４，５ｍｌ／ｌ Ｔｗｅｅｎ−２０，２９．２２ｇ／ｌ ＮａＣｌ，１．６２７ｇ／ｌ ＮａＰＯ_４，１％ ＳＤＳ）がコーティングされたプレートに添加される。次に、２０μｌのサンプルを添加する。これは、３７℃で、３０〜６０分間インキュベーションされる。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄する。２００μｌの標識液相構成要素（固相支持体に結合する抗原に依存して、ＨＲＰ標識ＭＥＦＡまたはＨＲＰ標識ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープ）。

Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＳＡＶｅ ｂｕｌｋ結合体希釈液（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いるＯＲＴＨＯ ＨＣＶ３．０ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ中で１：２２，０００に希釈される２００μｌのラベル化される液相構成要素（固体支持体に結合する抗原に依存する、ＨＲＰで標識されるＭＥＦＡまたはＨＲＰで標識されるＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープのいずれか）が添加され、そして３７℃で３０〜６０分間インキュベートされる。

これは、上のように洗浄され、そして２００μｌ基質溶液（１ ＯＰＤ錠／１０ｍｌ）が添加される。ＯＰＤ錠は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ反応色顕色のために、ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩および過酸化水素を含む。これは、暗がり中室温で３０分間インキュベートされる。反応は、５０μｌの４Ｎ硫酸の添加により止められ、そして対照としての６９０ｎｍでの吸収と比較するため、プレートは４９２ｎｍで読まれる。

従って、新規ＨＣＶ検出アッセイが開示された。上述の記載から、本発明の特定の実施形態が例示の目的のために本明細書において記載されたが、種々の修飾が、本明細書における開示の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

図１は、本発明のアッセイ試薬（タンパク質および抗体）に由来するポリタンパク質の種々の領域を示す、ＨＣＶゲノムの図解表現である。 図２は、本発明に基づく、ＭＥＦＡ１２を用いた代表的な抗原／抗体／抗原サンドウイッチアッセイの概略図である。 図３Ａ〜３Ｄ（配列番号１および配列番号２）は、本アッセイで使用するための代表的なＮＳ３／４ａコンフォメーション抗原のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を図示する。図３Ａから図３Ｄの４０３位および４０４位におけるアミノ酸は、ＨＣＶ−１のネイティブアミノ酸配列のＰｒｏのＴｈｒへの置換およびＩｌｅのＳｅｒへの置換を表す。 図４は、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩの構造の図表である。 図５は、ＭＥＦＡ１２の概略図である。 図６Ａ〜図６Ｆ（配列番号３および配列番号４）は、ＭＥＦＡ１２のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を図示する。 図７は、ＭＥＦＡ７．１の概略図である。 図８Ａ〜図８Ｆ（配列番号５および配列番号６）は、ＭＥＦＡ７．１のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を図示する。 図９Ａ〜図９Ｃは、本発明のイムノアッセイを用いた使用のための代表的なＭＥＦＡを示す。図９Ａは、ＭＥＦＡ３の概略図である。図９Ｂは、ＭＥＦＡ５の概略図である。図９Ｃは、ＭＥＦＡ６の概略図である。

Claims (58)

1. 生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）：
   （ａ）結合したＨＣＶ抗原を備えるイムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、ここで、該ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原からなる、イムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
   （ｂ）生物学的サンプルを、（該生物学的サンプル中に存在する場合に）ＨＣＶ抗体が該１以上のＨＣＶ抗原に結合することを可能にする条件下で該固体支持体と組み合わせる工程；
   （ｃ）検出可能であるように標識されたＨＣＶ複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）を、複合体形成条件下で、工程（ｂ）の固体支持体へと添加する工程であって、ここで、該標識されたＭＥＦＡが、該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離された１以上の抗原と同じ少なくとも１つのエピトープを含み、ここで、該ＭＥＦＡが該結合したＨＣＶ抗体に結合する、工程；
   （ｄ）該生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として、該ＨＣＶ抗体と、該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域からの１以上の抗原と、該ＭＥＦＡとの間で形成された複合体が存在する場合に、該複合体を検出する工程
   を包含し、
   該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原は、１以上の単離されたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープであり、かつ、該ＭＥＦＡは、該ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、
   方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに記載のアミノ酸配列（配列番号２）を含む、方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
7. 請求項６に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１の配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９３〜１６５７を含む、方法。
8. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域からのエピトープを含む、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１２１１〜１４５７を含む、方法。
10. 請求項８に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９２〜１４５７を含む、方法。
11. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質の５−１−１領域からのエピトープを含む、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１６８９〜１７３５を含む、方法。
13. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、図６Ａ〜６Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号４）を含む、方法。
14. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記図８Ａ〜８Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号６）を含む、方法。
15. 生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下の（ａ）〜（ｄ）：
    （ａ）結合したＨＣＶ抗原を備えるイムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、ここで、該ＨＣＶ抗原は、１以上の複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）からなる、イムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
    （ｂ）生物学的サンプルを、（該生物学的サンプル中に存在する場合に）ＨＣＶ抗体が該１以上のＭＥＦＡに結合することを可能する条件下で、該固体支持体に組み合わせる工程；
    （ｃ）前記１以上のＭＥＦＡに存在するＨＣＶポリタンパク質の領域から単離した検出可能に標識されたＨＣＶ抗原を、複合体形成条件下で、工程（ｂ）の固体支持体へと添加する工程であって、ここで、該単離した抗原は、該結合したＨＣＶ抗体に結合する、工程；
    （ｄ）該生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として、存在する場合に、該ＨＣＶ抗体と該単離したＨＣＶ抗原と該ＭＥＦＡとの間で形成された複合体を検出する工程
    を包含し、
    該単離されたＨＣＶ抗原は、単離されたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープであり、かつ、該ＭＥＦＡは、該ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
17. 請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
18. 請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号２）を含む、方法。
19. 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
20. 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、方法。
21. 請求項２０に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶ−１の配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９３〜１６５７を含む、方法。
22. 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域からのエピトープを含む、方法。
23. 請求項２２に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１２１１〜１４５７を含む、方法。
24. 請求項２２に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９２〜１４５７を含む、方法。
25. 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質の５−１−１領域からのエピトープを含む、方法。
26. 請求項２５に記載の方法であって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１６８９〜１７３５を含む、方法。
27. 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＭＥＦＡが、図６Ａ〜６Ｆに示されたアミノ酸配列（配列番号４）を含む、方法。
28. 請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＭＥＦＡが、図８Ａ〜８Ｆにおいて示されるアミノ酸配列（配列番号６）を含む、方法。
29. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を検出する方法における、結合したＨＣＶ抗原を備えるイムノアッセイ固体支持体および検出可能であるように標識されたＨＣＶ複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）の使用であって、
    ここで、該ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原からなり、そして、該標識されたＭＥＦＡは、該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原と同じ少なくとも１つのエピトープを含み、
    該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原は、１以上の単離されたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープであり、かつ、該ＭＥＦＡは、該ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、使用。
30. 請求項１５〜２８のいずれか１項に記載の生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を検出する方法における、結合したＨＣＶ抗原を備えるイムノアッセイ固体支持体および検出可能に標識された単離されたＨＣＶ抗原の使用であって、
    ここで、該ＨＣＶ抗原は、１以上の複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）からなり、そして、該標識され単離されたＨＣＶ抗原は、該１以上のＭＥＦＡにおいて存在するＨＣＶポリタンパク質の領域に由来し、
    該単離されたＨＣＶ抗原は、単離されたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープであり、かつ、該ＭＥＦＡは、該ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、使用。
31. 生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を検出する方法において使用するための、結合したＨＣＶ抗原を備えるイムノアッセイ支持体および検出可能であるように標識されたＨＣＶ複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）の組合せであって、
    ここで、該ＨＣＶ抗原は、ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原からなり、そして、該標識されたＭＥＦＡは、該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原と同じ少なくとも１つのエピトープを含み、
    該ＨＣＶポリタンパク質の第１の領域から単離した１以上の抗原は、１以上の単離されたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープであり、かつ、該ＭＥＦＡは、該ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、組合せ。
32. 請求項３１に記載の組合せであって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
33. 請求項３１に記載の組合せであって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
34. 請求項３１に記載の組合せであって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに記載のアミノ酸配列（配列番号２）を含む、組合せ。
35. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
36. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
37. 請求項３６に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶ−１の配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９３〜１６５７を含む、組合せ。
38. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域からのエピトープを含む、組合せ。
39. 請求項３８に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１２１１〜１４５７を含む、組合せ。
40. 請求項３８に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９２〜１４５７を含む、組合せ。
41. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の組合せであって、ここで、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質の５−１−１領域からのエピトープを含む、組合せ。
42. 請求項４１に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１６８９〜１７３５を含む、組合せ。
43. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、図６Ａ〜６Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号４）を含む、組合せ。
44. 請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記図８Ａ〜８Ｆに示されるアミノ酸配列（配列番号６）を含む、組合せ。
45. 生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を検出する方法において使用するための、結合したＨＣＶ抗原を備えるイムノアッセイ固体支持体および検出可能に標識された単離されたＨＣＶ抗原の組合せであって、
    ここで、該ＨＣＶ抗原は、１以上の複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）からなり、そして、該標識され単離されたＨＣＶ抗原は、該１以上のＭＥＦＡにおいて存在するＨＣＶポリタンパク質の領域に由来し、
    該単離されたＨＣＶ抗原は、単離されたＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープであり、かつ、該ＭＥＦＡは、該ＮＳ３／４ａ領域からの少なくとも１つのエピトープを含む、組合せ。
46. 請求項４５に記載の組合せであって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
47. 請求項４５に記載の組合せであって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
48. 請求項４５に記載の組合せであって、前記ＮＳ３／４ａコンフォメーショナルエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列（配列番号２）を含む、組合せ。
49. 請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａプロテアーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
50. 請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａヘリカーゼ領域からのエピトープを含む、組合せ。
51. 請求項５０に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶ−１の配列と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９３〜１６５７を含む、組合せ。
52. 請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域からのエピトープを含む、組合せ。
53. 請求項５２に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１２１１〜１４５７を含む、組合せ。
54. 請求項５２に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１１９２〜１４５７を含む、組合せ。
55. 請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、前記ＨＣＶポリタンパク質の５−１−１領域からのエピトープを含む、組合せ。
56. 請求項５５に記載の組合せであって、前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ−１と比較して番号付けされた、アミノ酸１６８９〜１７３５を含む、組合せ。
57. 請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の組合せであって、ここで、前記ＭＥＦＡが、図６Ａ〜６Ｆに示されたアミノ酸配列（配列番号４）を含む、組合せ。
58. 請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の組合せであって、ここで、前記ＭＥＦＡが、図８Ａ〜８Ｆにおいて示されるアミノ酸配列（配列番号６）を含む、組合せ。