ES2377978T3 - Mutantes de proteínas no estructurales de VHC y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un polipeptido aislado que comprende la secuencia deaminoacidos de la SEC ID Nº 2, 4 o 6, en el que el polipeptido comprende un epitopo conformacional de NS3.

Description

Mutantes de proteinas no estructurales del VHC y usos de los mismos

Campo de la técnica

La presente revelacion se refiere a, en general, construcciones del virus de la hepatitis C (VHC) y a procedimientos

5 de uso de los mismos. Mas particularmente, la invencion se refiere a proteinas inmunogenicas e inmunorreactivas del VHC con dominios modificados de la NS3 proteasa, de modo que se inhibe la actividad proteolitica de la molecula NS3. Las proteinas modificadas conservan los epitopos conformaciones y, por tanto, son utiles en inmunoensayos para el diagnostico de la infeccion por VHC, asi como para estimular la respuesta inmunitaria frente al VHC.

10 Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis C (VHC) es la causa principal de la hepatitis parenteral (NANBH), que se transmite, principalmente, mediante transfusiones de sangre y e intercambio de fluidos corporales. El virus esta presente en el 0,4-2,0% de la poblacion general de EE.UU. La hepatitis cronica se desarrolla en aproximadamente un 50% de las infecciones y, de estas, aproximadamente el 20% de los individuos infectados desarrolla cirrosis hepatica que, en

15 ocasiones, conduce a carcinoma hepatocelular. En consecuencia, el estudio y control de la enfermedad es de importancia medica.

Houghton y col. Identificaron y caracterizaron por primera vez el VHC, como cassa de NANBH. Se conoce la secuencia genomica viral del VHC, como lo son los procedimientos para obtener la secuencia. Vease, por ejemplo, las publicaciones internacionales n° W0 89/04669 W0 90/11089 y W0 90/14436. El VHC tiene genoma de ARN

20 monocatenario de 9,5 kb de sentido positivo y es miembro de la familia Flaviridae de virus. Sobre la base del analisis filogenetico se han identificado al menos seis genotipos distintos aunque relacionados del VHC (Simmonds y col., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). El virus codifica una unica poliproteina que tiene mas de 3000 residuos de aminoacidos (Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Choo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1 991) 88:24512455; Han y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). La poliproteina se procesa al mismo tiempo y

25 despues de la traduccion en proteinas tanto estructurales como no estructurales (NE).

En particular, como se muestra en la Figura 1, en el genoma del VHC se codifican varias proteinas. El orden y la nomenclatura de los productos de la escision de la poliproteina del VHC es el siguiente: NH2-C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-C00H. La escision inicial de la poliproteina esta catalizada por las proteasas del huesped, que liberan tres pos ibles proteinas estructurales compuestas por la proteina N-terminal de la nucl eocapside

30 (denominada "del nucleo" y dos glicoproteinas de la cubierta, "E1" (tambien conocida como E) y "E2" (tambien conocida como E2/NS1), asi como proteinas no estructurales (NS) que contienen las enzimas virales. Las regiones NS se denominan NS2, NS3, NS4, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b. NS2 es una proteina integral de la membrana que posee actividad proteolitica. NS2, sola o en combinacion con NS3, escinde el enlace scissile NS2-NS3 que, a su vez, genera el extremo NS3 N y libera una poliproteina grande que incluye las actividades serina proteasa y ARN

35 helicasa. La proteasa NS3 sirve para procesar el resto de la poliproteina. En concreto, la proteina NS3 del VHC es una proteina de 630 aminoacidos que contiene tres dominios funcionales. El dominio de tipo serin a proteasa se localiza en el extremo amino, mientras que la actividad helicasa y NTPasa estan en el extremo carboxi. La serina proteasa de NS3 es responsable de la escision en la union de NS3/4a, NS4a/b, NS4b/5a y NS5a/b.

Se ha descrito una serie de polipeptidos generales y especificos utiles como reactivos inmunologicos y diagnosticos 40 para el VHC, derivado de la poliproteina del VHC. Vease, por ejemplo, Houghton y col., publicacion europea n°

318.216 y 388.232; Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Kno y col., Science (1989) 244:362-364; Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien y col., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:533-39; Chien y col., publicacion internacional N° W0 93/00365; Chien, D.Y., publicacion internacional N° W0 94/01778. Estas publicaciones proporcionan una extensa informacion basica sobre

45 el VHC en general, asi como sobre la fabricacion y usos de los reactivos inmunologicos del polipeptido del VHC.

Procedimientos sensibles y especificos para la deteccion selectiva y la identificacion de portadores de VHC y de sangre o productos sanguineos contaminados por el VHC proporcionarian un importante avance en medicina. La hepatitis postransfusional (HPT) se produce en aproximadamente el 10 % de los pacientes transfundidos y el VHC ha sido responsable de hasta el 90 % de estos casos. Los cuidados del paciente, asi como la prevencion y la

50 transmision del VHC por sangr e y productos sanguineos o mediante contacto personal intimo requieren herramientas diagnosticas y pronosticas. De acuerdo con esto, se han desarrollado varios ensayos para el serodiagnostico de la infeccion por VHC. Vease, por ejemplo, Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Kuo y col., Science (1989) 244:362-364; Choo y col., Br. Med. Bull. ( 1990) 46: Vease, Ebeling y col., Lancet (1990) 335:982983; van der Poel y col., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel y col., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y.,

55 publicacion internacional N° W0 94/01778; Valenzuela y col., publicacion internacional N° W 0 97/44469; y Kashiwakuma y col., patente de EE.UU. n° 5.871.904.

La patente de EE.UU. n° 6.632.601 describe inmunoensayos usando epitopos c onformacionales NS3/4a en combinacion con antigenos de fusion de multiples epitopos (MEFA). Los ensayos proporcionan procedimientos

2 sensibles y fiables para detectar la seroconversion temprana del VHC. NS3/4a, expresada en levaduras y purificada en condiciones no desnaturalizantes, tal como se describe en la patente de EE.UU. n° 6.632.601, contiene las funciones de proteasa y helicasa. Dado que la NS3/4a purificada de este modo conserva la conformacion nativa, se ha d escubierto qu e es ma s sensib le q ue los a ntigenos c20 0 o c 33c e n la d eteccion de a nticuerpos de seroconversion temprana. En los ensayos de anticuerpos con NS3/4a yMEFA 7.1 como antigenos, se detectaron anticuerpos de seroconversion 2-14 dias antes que los ensayos para VHC comercializados en la actualidad. No obstante, la proteina NS3/4 sufre autohidrolisis y escinde el MEFA 7.1 debido a la actividad de NS3 proteasa.

Las publicaciones internacionales n° W0 04/00547 yW0 01/38360 describen proteinas del VHC que incluyen dominios mutados de NS3 proteasa con menor actividad proteolitica. No obstante, sigue existiendo la necesidad de herramientas diagnosticas y pronosticas sensibles y precisas con el fin de proporcionar una adecuada atencion al paciente, ademas de para prevenir la transmision del VHC mediante sangre y productos hemoderivados o mediante contacto personal estrec ho. Los documentos W 0 01/ 38360 y W 0 200 4/005473 divu lgan p olipeptidos que comprenden un dominio de proteasa NS3 de VHC, en el que la actividad proteasa del dominio esta inhibida, asi como soportes de inmunoensayo que comprenden los polipeptidos. El documento W0 2004/005473 tambien divulga sustituciones de aminoacidos correspondientes a His-1083, Asp-1105 y/o Ser-1165, incluida la sustitucion de Ala por el aminoacido correspondiente a Ser-1165. El documento W0 01/96870 divulga un epitopo conformacional de NS3/4a que difiere de la secuencia nativa en las posiciones de aminoacidos 1428 y 1429 de la secuencia de longitud completa delVHC-1 en que la Thr que normalmente esta en la posicion 1428 ha mutado a Proy la Ser que normalmente esta en la posicion 1429 ha mutado a Ile. Este epitopo se usa en inmunoensayos para el diagnostico del VHC.

Sumario de la invención

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que el uso de los polipeptidos NS3 del VHC con dominios proteasa modificados proporciona reactivos mejores los para detectar infeccion por VHC. Los polipeptidos NS3 modificados conservan los epitopos conformacionalesy, por tanto, inmunorreactividad, al tiempo que eliminan la actividad proteasa. Dado que los polipeptidos NS3 estan modificados para eliminar la actividad proteasa, son especialmente utiles con otros polipeptidos del VHC que conservan sitios de escision proteolitica de NS· que, de otro modo, se escindirian proteoliticameente mediante una proteasa NS3 funcional. Por tanto, los polipeptidos de NS3 modificados el pueden usarse solos o en combinacion con otros reactivos del VHC y, en particular, con antigenos de fusion de multiples epitopos (MEFA) para detectar de forma eficaz y precisa la presencia de infeccion por VHC. El uso de MEFA proporciona las ventajas anadidas de disminucion de problemas de enmascaramiento, mejora de la selectividad y mejora de la sensibilidad para detectar anticuerpos permitiendo un mayor numero de epitopos en una unidad de area de sustrato. Los ensayos descritos en el presente documento se pueden usar para detectar infeccion por VHC producida por cualquiera de los seis genotipos conocidos del VHC.

La invencion esta dirigida a un polipeptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° 2, 4 o 6, en la que el polipeptido comprende un epitopo conformacional de NS3. En realizaciones adicionales, la invencion esta dirigida a un soporte solido de inmunoensayo que comprende un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEC ID 2, 4 o 6, que reaccionaespecificamente con anticuerpos anti-VHCpresentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC.

En otras realizaciones adicionales, el soporte solido de inmunoensayo comprende ademas un antigeno de fusion de multiples epitopos unido al soporte, en el que el antigeno de fusion de multiples epitopos reacciona especificamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC.

En ciertas rea lizaciones, el antigen o de fusio n de mu ltiples epito pos comprende l a secuenci a de aminoac idos representada en la SEC ID N° 10, o una secuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de al menos el 80 %, tal como al menos 90 % o al menos una identidad de secuenciadel 98 %, y que reacciona especificamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC. En realizaciones adicionales, el antigeno de fusion de multiples epitopos consta de la secuencia de aminoacidos representados en la SEC ID N° 10.

En realizaciones adicionales, la invencion esta dirigida a un procedimiento de deteccion de la infeccion del VHC en una muestra biologica. El procedimiento comprende:

(a)

proporcionar un soporte solido de inmunoensayo como se ha descrito anteriormente;

(b)

combinar una muestra biologica con el soporte solido en condiciones que permitan que los anticuerpos anti-VHC, cuando estan presentes en la muestra biologica, se unan al polipeptido y/o el antigeno de fusion de multiples epitopos para formar un primer complejo inmunitario;

(c)

anadir al soporte solido de la etapa (b) en condiciones formadoras de complejo un anticuerpo marcado de forma que se pueda detectar, en el que el anticuerpo marcado reacciona con el complejo inmunitario; y

(d)

detectar un segundo complejo inmunitario formado entre el anticuerpo marcado de forma que se pueda detectar y el primer complejo inmunitario, si existe, como indicacion de infeccion por VHC en la muestra biologica.

En otras re alizaciones a dicionales mas, l a inv encion e sta dirig ida a un kit d e pru eba inmunodiagnostica q ue comprende un soporte solido de inmunoensayo tal como se ha descrito anteriormente, e instrucciones para realizar la prueba inmunodiagnostica.

En otras realizaciones adicionales mas, la invencion esta dirigida a un polinucleotido que comprende una secuencia codificadora p ara un o cual quiera de los polipeptidos a nteriores y u n vector recombin ante q ue c omprende e l polinucleotido y elementos control unidos de forma o perable al polinucleotido, a trav es de l o cual la secuencia codificadora se puede transcribir y traducir en una celula huesped. En realizaciones adicionales, la invencion esta dirigida a un a celul a hu esped transforma da con e l vec tor recombi nante. En realiz aciones a dicionales mas, la invencion esta dirigida a un procedimiento para producir un polipeptido recombinante, que comprende:

(a)

proporcionar una poblacion de celulas huesped descrita anteriormente; y

(b)

cultivar la poblacion de celulas en condiciones mediante las cuales se expresa el polipeptido codificado por la secuencia codificadora presente en el vector recombinante.

En realizaciones adicionales mas, la invencion esta dirigida a un procedimiento para producir un soporte solido de inmunoensayo, que comprende:

(a)

proporcionar un soporte solido; y

(b)

unir al soporte solido al menos un polipeptido tal como se ha descrito anteriormente.

En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende ademas unir al soporte solido en una posicion pequena un antigeno de fusion de multiples epitopos.

Estos y otros aspectos de la presente invencion se pondran de manifiesto mediante referencia a las siguientes Figuras y Descripcion detallada. Ademas, en el presente documento se exponen varias referencias que describen con mas detalle procedimientos o composiciones.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 es una representacion en diagrama del genoma del VHC, que representa las diversas regiones de la poliproteina de la cual derivan los presentes reactivos del ensayo (proteinas y anticuerpos).

La Figura 2 es un dibujo esquematico de un inmunoensayo representativo que usa polipeptidos modificados de NS3 de acuerdo con la invencion, en el que los antigenos del VHC estan inmovilizados sobre un soporte solido.

La Figura 3 (SEC ID N° 7 y 8) representan el ADN y la correspondiente secuencia de aminoacidos de un dominio de proteasa NS3 nativo, sin modificar, representativo.

Las Figuras 4A-4C son representaciones en diagrama de proteinas NS3 mutantes de acuerdo con la invencion. En las Figuras 4A-4C, la Ser normalmente presente en la posicion 1165 esta sustituida por Ala. Adicionalmente, todos los mutantes representados en las Figuras 4A-4C incluyen una sustitucion de Pro por Thr normalmente presente en la posicion 1428 e Ile por la Ser normalmente presente en la posicion 1429. En la Figura 4A, la proteina incluye en direccion N-terminal a C-terminal, una Met en N-terminal, los aminoacidos 1027-1657 de NS3 ylos aminoacidos 1658-1711 de NS4a y, por tanto, incluye los dominios NS3 y NS4a de longitud completa de la poliproteina del VHC. En la Figura 4B, la proteina incluye en direccion N-terminal a C-terminal, una Met en N-terminal ylos aminoacidos 1027-1657 de NS3 y, por tanto, incluye los dominios NS3 de longitud completa de la poliproteina del VHC. En la Figura 4C, la proteina incluye en direccion N-terminal a C-terminal, una Met en N-terminal y los aminoacidos 16781690 de de NS4a, seguida de la secuencia de aminoacidos Ser-Gly-Ser, despues los aminoacidos 1029 a 1657 de NS3.

Las Figuras 5A-5C (SEC ID N° 1 y 2) representan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos correspondiente de la proteina de la Figura 4A, denominada "NS34aPI.1165."

Las Figuras 6A-6C (SEC ID N° 3 y 4) representan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos correspondiente de la proteina de la Figura 4B, denominada "NS3PI.1165."

Las Figuras 7A-7C (SEC ID N° 5 y 6) representan la secuencia de nucleotidos y la secuencia de aminoacidos correspondiente de la proteina de la Figura 4C, denominada "d.4a.t.NS3PI.1165."

La Figura 8 es una representacion en diagrama del MEFA 7.1.

Las Figuras 9A-9F (SEC ID N° 9 y 10) representan el ADN y la correspondiente secuencia de aminoacidos del MEFA 7,1.

La Figura 10 es un diagrama a fotografia de la construccion de pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

Las Figuras 11A-11C muestran MEFA representativos para usar con l os inmunoensayos objeto. La Figura 11A es una representacion endiagrama de MEFA 3. La Figura 11B es una representacion en diagrama de MEFA 5. La

Figura 11C es una representacion en diagrama de MEFA 6.

La Figura 12 es un dibujo esquematico de un formato de inmunoensayo representativo que usa polipeptidos de NS3 modificados con un soporte solido revestido con estreptavidina.

La Figura 13 es una representacion de un gel de SDS-PAGE tenido con azul de Coomassie, que demuestra que las

5 proteinas mut antes NS· no sufren autoh idrolisis y no escinden el MEFA 7.1. C arril 1: NS34 aPI; Carril 2: NS34aPI.1165; carril 3: NS3PI.1165; carril 4: NS34aPI + MEFA 7.1, t=0; Carril 5: NS34aPI + MEFA 7.1, t=40 min; Carril 6: NS34aPI + MEFA 7.1, t=2 h; Carril 7: NS34aPI. 1165 + MEFA 7.1, t=0; Carril 8: NS34aPI.1165 + MEFA 7.1, t=40 min; Carril 9: NS34aPI. 116 5 + ME FA 7.1, t= 2 h ; Carril 1 0: N S34aPI.1165 + MEF A 7.1, t=0; Carril 11: NS3PI.1165 + MEFA 7.1, t=40 min; Carril 12: NS3PI.1165 + MEFA 7.1, t=2 h; Carril 13: MEFA 7.1.

10 La Figura 14 es una representacion de una transferencia Western usando anti-S0D como anticuerpo primario contra MEFA 7.1 yHRP anti-raton como anticuerpo secundario,lo que demuestra que las proteinas mutantes NS3 no sufren autohidrolisisyno escinden el MEFA 7.1. Carril 1: NS34aPI; Carril 2: NS34aPI.1165; carril 3: NS3PI.1165; carril 4: NS34aPI + MEFA 7.1, t=0; Carril 5: NS34aPI + MEFA 7.1, t=40 min; Carril 6: NS34aPI + MEFA 7.1, t=2 h; Carril 7: NS34aPI.1165 + MEFA 7.1, t=0; Carril 8: NS34aPI 1165+ MEFA 7.1, t=40 min; Carril 9: NS34aPI.1165 +

15 MEFA 7.1, t=2 h; Carril 10: NS3PI. 1165 + MEFA 7.1, t=0; Carril 11: NS3PI.1165 + MEFA 7.1, t=40 min; Carril 12: NS3PL 1165 + MEFA 7.1, t=2 h; Carril 13: MEFA 7.1.

Descripción detallada de la invención

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de quimica, bioquimica, tecnicas de ADN recombinante e inmunologia, dentro de la experiencia en la tecnica. Dichas 20 tecnicas se explican por completo en la literatura. Vease, por ejemplo, Fundamental Virology, 2a Edicion, vol. I y II

(B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman y Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edicion actual); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edicion, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic

25 Press, Inc.).

Tambien cabe indicar que, como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "uno", "una" y "el/la" comprenden las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un antigeno" incluye una mezcla de dos o mas antigenos y similares.

30 A lo largo del texto se usan las siguientes abreviaturas de aminoacidos:

Alanita: Ala (A) Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N) Acido aspartico: Asp (D)

Cisteina: Cys (C) Glutamina: Gln (0)

Acido glutamico: Glu (E) Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)

I. Definiciones

Al describir la presente invencion se emplearan los terminos siguientesy se pretende definirlos como se indica a continuacion.

35 Los terminos "polipeptido" y "proteina" se refieren a un polimero de residuos de aminoacido y no estan limitados a una longitud minima del producto. Por tanto, peptidos, oligopeptidos, dimeros, multimeros y similares estan incluidos dentro de la definicion. Tanto las proteinas de longitud completa como fragmentos de las mimas estan dentro de la definicion. Los terminos tambien incluyen las modificaciones postexpresion del polipeptido, por ejemplo glicosilacion, acetilacion, fosforilacion y similares. De forma adicional, para los fines de la presente invencion un "polipeptido" se

refiere a una proteina que incluye "modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservadora), en la secuencia nativa, siempre que la proteina mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como las realizadas mediante mutagenesis dirigida al sitio, o puede ser accidental, tal como mutaciones de huespedes que producen las proteinas o errores debido a la amplificacion por PCR.

Un polipeptido del VHC es un polipeptido, como se ha definido anteriormente, derivado de la poliproteina del VHC. El polipeptido no tiene que derivar fisicamente del VHC, pero puede producirse de forma sintetica o recombinante. Ademas, el polipeptido puede derivar de cualquier de las diversas cepas y aislamientos del VHC, tales como, entre otros, cualquiera de los aislamientos de las cepas 1, 2, 3, 4, 5 o 6 del VHC. Se conocen numerosas regiones conservadas y variables entre estas cepas y, en general, las secuencias de aminoacidos de los epitopos derivados de estas regiones tendran un grado alto de homologia de secuencia, por ejemplo una homologia de secuencia de aminoacidos superior al 30 %, preferentemente superior al 40 %, cua ndo las dos secuencias estan alineadas. Por tanto, por ejemplo, el termino polipeptido "NS3/4a" se refiere a NS3/4a nativa de cualquiera de las diversas cepas del VHC, asi como analogos, muteinas y fragmentos inmunogenicos de "NS3/4a, tal como se define adicionalmente mas adelante. Los genotipos completos de muchas de estas cepas se conocen. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 6.150.087 y los numeros de registro en GenBank AJ238800 y AJ238799.

Con un polipeptido "derivado de" una poliproteina del VHC se quiere decir un polipeptido que comprende una secuencia de una o mas regiones o porciones de regiones de la poliproteina del VHC de referencia. Normalmente, el polipeptido esta compuesto por regiones o porciones de regiones que incluyen epitopos y, en general, tienen una secuencia de aminoacidos s ustancialmente homo loga a la de l p olipeptido d e refer encia, como s e define ma s adelante. Por tanto, la expresion "derivado de" se usa para identificar la fuente original de una molecula, pero no se pretende limitar el procedimiento mediante el cual se produce la molecula que puede ser, por ejemplo, mediante sintesis quimica o medios recombinantes.

Los terminos "analogo" y "muteina" hace referencia a derivados biologicamente activos de la molecula de referencia,

o fragmentos de dichos derivados, que conservan la actividad deseada, tal como inmunorreactividad en los ensayos que se describen en el presente documento. En general, el termino "analogo" hace referencia a compuestos que tienen una secuencia yestructura de polipeptidos nativa con una o mas adici ones, sustituciones (en general de naturaleza conservadora o, en el caso deNS3 modificada, de naturaleza no conservadora en el sitio proteolitico activo) y/o deleciones de aminoacidos, respecto a la molecula nativa, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad inmunogenica. El termino "muteina" se refiere a polipeptidos que tienen una o mas moleculas similares a aminoacidos, que incluyen, entre otros, compuestos que comprenden solo moleculas amino y/o imino, polipeptidos que contienen uno o mas a nalogos de un aminoacido (incluidos, por ejemplo, aminoacidos no naturales etc.), polipeptidos con enlaces sustituidos, asi como otras modif icaciones conocidas en la tecnica, molec ulas naturales y no naturales (p. ej., sinteticas), en forma de ciclos, ramificadas y similares. El termino tambien incluye moleculas que comprenden uno o mas r esiduos de glicina N-sustituidos (un "peptoide") y otros aminoacidos o peptidos sinteticos. (Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 5.831.005; 5.877.278; y 5.977.301; Nguyen y col., Chem Biol. (2000) 7:463-473; y Simon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:9367-9371 para descripciones de peptoides). Preferentemente, el analogo o muteina tie ne al menos la misma inmunoactividad que la molecula nativa. En la tecnica se c onocen pr ocedimientos p ara fabricar analogos y m uteinas d e pol ipeptidos, y s e descri ben adicionalmente mas adelante.

Como se ha explicado anteriormente, los analogos incluyen, en general, sustituciones de naturaleza conservadora, es decir sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoacidos que estan relacionados por sus cadenas laterales. Especificamente, en general, los aminoacidos se dividen en cuatro familias: (1) acidos - aspartato y glutamato; (2) basicos - l isina, arginina, histidina; (3) no polares -- alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. En ocasiones, los aminoacidos fenilalanina, triptofano y tirosina se clasifican como aminoacidos aromaticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitucion a islada de leucina con isoleucina o valina, u n aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o una sustitucion conservadora similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado, no tendra un efecto importante sobre la actividad biologica. Por ejemplo, el p olipeptido de interes puede incluir hasta apr oximadamente 5-10 su stituciones d e amin oacidos conservadoras o n o co nservadoras, o incluso hasta aproximadamente 15-25 s ustituciones de aminoacidos conservadoras o no c onservadoras, o cualquier numero entero entre 5-25 siempre que la funcion deseada de la molecula permanezca intacta. Un experto en la tecnica puede determinar con facilidad regiones de la molecula de interes que pueden tolerar cambios con referencia a los graficos de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, bien conocidos en la tecnica.

Por "NS3 modificada" se quiere decir un polipeptido NS3 con una mo dificacion tal que la actividad proteasa del polipeptido NS3 esta alterada. Por tanto, los polipeptidos de NS3 modificados exhiben menos actividad proteasa en comparacion con el polipeptido de NS3 parental sin modificar. La modificacion puede incluir una o mas adiciones, sustituciones (en general, de naturaleza no conservadora) y/o deleciones de aminoacidos respecto a la molecula nativa, en la que la susceptibilidad a la escision proteolitica de NS3 se reduce o elimina. Mas adelante se tratan procedimientos para medir la actividad proteasa.

Por "fragmento" se q uiere decir un polipeptido que consiste en s olo una parte de la secuencia polipeptidica de longitud completa y de la estructura intactas. El fragmento puede incluir una delecion en C-terminal y/o una delecion en N-terminal del polipeptido nativo. Un "fragmento inmunogenico" de una proteina concreta del VHC incluira, en general, al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoacidos contiguos de la molecula de longitud completa, preferentemente al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoacidos contiguos de la molec ula de longitud completa y, mas preferentemente, al menos aproximadamente 20-50 o mas residuos de aminoacidos contiguos de la molecula de longitud completa, que definen un epitopo, o cualquier numero entero entre 5 a minoacidos y la secuencia de longitud completa, siempre que el fragmento en cuestion conserve inmunorreactividad en los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, los fragmentos inmunogenicos preferidos, incluyen, entre otros, fragmentos del nucleo del VHC que comprenden, por ejemplo, los aminoacidos 10-45, 10-53, 67-88 y 120-130 de la poliproteina, el epitopo 5-1-1 (en la region NS4a/NS4b del genoma viral), asi como epitopos definidos derivados de cualquiera de las regiones de la poliproteina mostrada en la Figura 1, tal como, entre otros, E1, E2, NS3 (p. ej., un polipeptido c33c de la region NS3), NS4 (p. ej., el polipeptido c100 de las regiones NS3/NS4), las regiones NS3/4a y NS5 de la poliproteina del VHC, asi como cualquiera de los demas epitopos identificados de la poliproteina del VHC. Vease, por ejemplo, Chienycol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992)89:10011-10015; Chien y col., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chie n y co l., publicacion i nternacional n ° W 0 93/00 365; C hien, D. Y., publ icacion internacional n° W0 94/01778; patentes de EE.UU. n° 6.150.087 y 6.121.020.

El termino "epitopo", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de al menos 3 a 5, preferentemente de aproximadamente 5 a 10 o 15, y no mas de aproximadamente 1.000 aminoacidos (o cualquier numero entero entre ellos), que definen una secuencia que, por si misma o como p arte de una secuencia mas grande, se une a un anticuerpo generado como respuesta a dicha secuencia. No hay un limite superior critico de la longitud del fragmento, que puede comprender casi toda la longitud de la secuencia proteica, o incluso una proteina de fusion que comprende dos o mas epitopos de la poliproteina del VHC. Un epitopo para usar en la invencion objeto no esta limitado a un polipeptido que tenga la secuencia exacta de la porc ion de la protein a parental de la cual deriva. De hecho, los genomas virales estan en un estado de flujo constante ycontienen varios dominios variables q ue exhiben gr ados rel ativamente a ltos de va riabilidad e ntre l os aislamientos. Por tant o, el termi no "epitopo" abarca secuencias identicas a la secuencia nativa, asi como modificaciones de la secuencia nativa tales como deleciones, adiciones y sustituciones internas adicionales (normalmente de naturaleza conservadora).

Las regiones de un polipeptido dado que incluyen unepitopo se pueden identificar usando cualquier numero de tecnicas de mapeo de epitopos bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn

E. Morris, Ed., 199 6) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar epitopos lineales mediante, por ejemplo, sintesis concurrente de numeros elevados de peptidos sobre soportes solidos, en los que los peptidos corresponden a porciones de la molecula proteica y haciendo reaccionar los peptidos con anticuerpos mientras los peptidos siguen unidos a los soportes. Dichas tecnicas se conocen en la tecnica y se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 4.08.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :178-182; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Usando dichas tecnicas, se han identificado diversos epitopos del VHC. Vease, por ejemplo, Chien y col., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pag. 320, -324 y m as a delante. De f orma similar, los epitopos co nformacionales se ide ntifican co n facil idad determinando l a conformacion espacial de los aminoacidos, tal como, por ej emplo, mediante cristalografia de rayos X y resonancia magnetica n uclear b idimensional. Veas e, por ej emplo, Epitop e Map ping Prot ocols, anteri ormente. Las regi ones antigenicas d e proteinas t ambien se p ueden id entificar usan do graficos d e antig eneicidad e hidro patia convencionales, tales como los ca lculados usan do, p or ejemplo, el p rograma de s oftware 0mig a versio n 1.0 disponible en 0xford Molecular Group. Este programa informatico emplea el procedimiento de Hopp/Woods Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar los perfiles de antigeneicidad, yla tecnica de Kyte-Doolittle, Kyte y col., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para graficos de hidropatia.

Como se usa en el presente documento, la expresion "epitopo conformacional" se refiere a una porcion de una proteina de longitud completa o un analogo o muteina de la misma, que tiene caracteristicas estructurales nativas de la secuencia de aminoacidos que codifica el epitopo en la proteina natural de longitud completa. Las caracteristicas estructurales nativas incluyen, entre otras, glicosilacion y estructura tridimensional. La longitud de la secuencia que define el epitopo puede estar sujeta a amplias variaciones, ya que se cree que estos epitopos estan formados por la forma tridimensional del antigeno (p. ej., pl egamiento). Por tanto, los a minoacidos que definen el epitopo 'pueden ser relativamente pocos en numero pero ampliamente dispersados a lo largo de la longitud de la molecula, llegando a la correcta conformacion del epitopo a traves del plegamiento. Las porciones del antigeno entre los residuos que definen el epitopo pueden no ser cruciales para la estructura conformacional del epitopo. Por ejemplo, la delecion o sustitucion de estas secu encias i ntermedias pueden no afectar al epitopo c onformacional si empre que las secuencias cruciales para la conformacion del epitopo se mantengan (p. ej. las cisternas implicadas en los puentes disulfuro, los sitios de glicosilacion etc.).

Los epitopos conformacionales presentes en la r egion NS3/4a, se i dentifican facilmente usando procedimientos tratados anteriormente. Ademas, la presencia o ausencia de un epitopo conformacional en un polipeptido dado se puede determinar con facilidad mediante deteccion selectiva del antigeno de interes con un anticuerpo (suero

policlonal o m onoclonal fre nte al e pitopo c onformacional) y com parando su re actividad co n la de una v ersion desnaturalizada del antigeno que solo conserva epitopos lineales (en su caso). En dicha deteccion selectiva usando anticuerpos policlonales, puede ser ventajoso absorber el suero policlonal primero con el antigeno desnaturalizado y ver si conserva anticuerpos frente al antigeno de interes.

Preferentemente, un epitopo conformacional se produce de forma recombinante y se expresa en una celula a partir de la cual se puede extraer en condiciones que conserven sus caracteristicas estructurales deseadas, por ejemplo sin desnaturalizacion del epitopo. Dichas celulas incluyen celulas de bacterias, levaduras, insectos y de mamifero. La expresion y el aislamiento de epitopos conformacionales recombinantes de la proteina del VHC se describen en, por ejemplo, las publicaciones internacionales n° W0 96/04301, W0 94/01778, W0 95/33053, W0 92/08734. Como alternativa, es posible expresar los antigenos y renaturalizar despues la proteina tras la recuperacion. Tambien se entiende q ue la sintesis q uimica puede tambi en pro porcionar mim itopos a ntigenicos c onformacionales q ue reaccionan de forma cruzada con el epitopo conformacional del antigeno "nativo".

La expresion "antigeno de fusion de multiples epitopos" o "MEFA", como se usa en el presente documento quiere decir un polipeptido en el que multiples antigenos virales estan dispuestos como una cadena sencilla y continua de aminoacidos, cadena que no se produce en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, los MEFA estan limitados a a ntigenos del VHC. Los antige nos del VH C pueden estar c onectados directamente entre si mediante enlaces peptidicos o pueden estar separados por secuencias de aminoacidos intermedios. Los antigenos de fusion pueden tamb ien c ontener s ecuencias e xogenas a l a poliproteina d el VHC. A demas, las s ecuencias del VH C presentes pueden proceder de multiples genotipos y/o aislamientos del VHC. Ejemplos de MEFA concretos para usar en los presentes inmunoensayos se detallan en, por ejemplo, la publicacion internacional n° W0 97/44469; las patentes de EE.UU. n° 6.514.731, 6.428.792 y 6.632.601.

Un "anticuerpo" quiere decir una molecula que se une especificamente a un e pitopo de interes presente en un antigeno. Por "se une especificamente" se quiere decir que el anticuerpo reconocee interacciona con el epitopo mediante una interaccion de tipo "llave y cerradura" para formar un complejo entre el antigeno y el anticuerpo, frente a la union inespecifica que se podria producir entre el anticuerpo y, por ejemplo, el sustrato de prueba. Por tanto, por ejemplo, un anticuerpo del nucleo del VHC es una molecula que se une especificamente a la proteina del nucleo del VHC. El termi no "a nticuerpo", como se u sa en el presente d ocumento, inclu ye l os anticu erpos obtenidos d e preparaciones tanto policlonales como monoclonales, asi como de los siguientes: moleculas de anticuerpos hibridos (quimericos (vease, por ejemplo, Winter y col. (1991) Nature 349:293-299; y la patente de EE.UU. n° 4.816.567); los fragmentos F(ab')2 yF(ab); las moleculas Fv (heterodimeros no covalentes, vease, por ejemplo, Inbar y col. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:265 9-2662; y Ehrlich ycol. (1980) Biochem 19:4091-4096); moleculas Fv de cadena sencilla (sFv) (vease, por ejemplo, Huston y col. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); construcciones de fragmentos de anticuerpos dimericos y trimericos; minicuerpos (vease, por ejemplo, Pack ycol. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber y col. (1992) J Immunology 149B:120-126); moleculas de anticuerpos humanizados (vease, por ejemplo, Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan y col. 1988; 239; 1534; -1536; y

Publicacion de patente U.K. n° GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y, cualquier fragmento funcional obtenido de d ichas molecu las, en el q ue dichos fragme ntos conserva n l as prop iedades de uni on inmunologicas de la molecula del anticuerpo parental.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composicion de anticuerpo que tiene un a poblacion h omogenea de a nticuerpos. E l term ino no esta limitado por las esp ecies o la fue nte d el anticuerpo, ni tampoco se pretende que este limitado por el modo en el que se fabrica. Por tanto, el termino abarca anticuerpos obtenidos de hibridomas murinos, asi como de anticuerpos monoclonales humanos obtenidos usando hibridomas humanos en lugar de murinos. Vease, por ejemplo, Cotey col. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, pag. 77.

Por "aislado" se quiere decir, al hacer referencia a un polipeptido, que la molecula indicada es distinta y pequena del organismo entero con el cual la moleculase encuentra en la naturaleza o esta presente en ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas del mismo tipo. El termino "aislado" con respecto a un polinucleotido es una molecula de acido nucleico desprovista, todo o en parte, de secuencias asociadas normalmente con ella en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterologas asociadas en ella;

o una molecula disociada del cromosoma.

Por "determinante antigenico equivalente" se quiere decir un determinante antigenico de diferentes subespecies o cepas de VHC, tal como las cepas 1, 2 o 3 del VHC. Masespecificamente, se conocen epitopos, como el "5-1-1", que se producen aproximadamente en las posiciones 1694-1735, numeradas respecto a la secuencia poliproteina del VHC-1 (vease la Figura 1) ydichos epitopos varian entre las cepas 1, 2 y3. Por tanto, el epitopo 5-1-1 de las tres cepas diferentes son determinantes antigenicos equivalentes y, por tanto, son "copias" aunque sus secuencias no sean identicas. En general, las secuencias de aminoacidos de determinantes antigenicos equivalentes tendran un grado alto de homologia de secuencia, por ejemplo una homologia de secuencia de aminoacidos superior al 30 %, preferentemente superior al 40 %, cuando las dos secuencias estan alineadas.

"Homologia" se refiere al p orcentaje de similitu d entre dos r estos polinucleotidicos o d os polipeptidicos. Dos secuencias de ADN, o d os secue ncias polipeptidicas, son "susta ncialmente homologas" entre si cuan do l as secuencias exhiben al menos aproximadamente 50 %, preferentemente al menos aproximadamente 75 %, mas preferentemente al menos aproximadamente 80-85 %, preferentemente al menos aproximadamente 90 % y mas preferentemente al menos aproximadamente 95 %-98 % de similitud de secuencia sobre una longitud definida de las moleculas. Como se usa en el prese nte documento, sustancialmente homologo tambien se refiere a moleculas que muestran identidad completa con el ADN o la secuencia polipeptidica especificados.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleotido-nucleotido o aminoacido-aminoacido de d os sec uencias de polinucleotidos o polipeptidos, re spectivamente. El p orcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparacion directa de la informacion de la secuencia entre dos moleculas (la secuencia de referencia y una secuencia con % de identidad desconocido con respecto a la secuencia de referencia) alineando las secuencias, contando el numero exacto de apareamientos entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia de referencia y multiplicando el resultado por 100.

Se pu eden usar pro gramas informatic os disponibles fa cilmente p ara a yudar a l a nalisis de la h omologia y la identidad, tal como ALIGN, Dayhoff, M.0. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.0. Dayhoff ed., 5 Supp l. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489,1981, 1981 para el analisis peptidico. Programas para determinar la homologia de la secuencia nucleotidica estan disponibles en el paquete Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que tambien dependen del algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se usan facilmente con los parametros predeterminados recomendados por el fabricante y descritos en el paquete Wisconsin Sequence Analysis Package al que se ha hecho referencia anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de homologia de una secuencia nucleotidica concreta con una secuencia de referencia se puede determinar usando el algoritmo de homologia de Smith y Waterman con una tabla de puntuaciones predeterminadas y una penalizacion por hueco de seis posiciones de nucleotidos.

0tro procedimientos de establecer un porcentaje de homologia en el contexto de la presente invencion es usar el paquete MPSRCH de programas de cuyos derechos es propietaria la University of Edinburgh, desarrollados por John F. Collins y Shane S. Sturrok, ydistribuidos por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) De este grupo de paquetes se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman en el que se usan los parametros predeterminados para la tabla de puntuacion (por ejemplo, penalizacion por hueco abierto de 12, penalizacion por extension de hueco de uno y un huecodeseis). De los datos generados, el valor "Correspondencia" refleja "homologiade secuencia". 0tros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias generalmente se conocen en la tecnic a, p or ejem plo otro progr ama de alineacion es el B LAST, que se usa co n par ametros predeterminados. Por eje mplo, BLAST N y BLAST P pueden u sarse usa ndo los sigui entes param etros predeterminados: Codi go g enetico= es tandar; filtro= ning uno; he bra= a mbas; corte= 60; previsto= 10; Matriz= BL0SUM62; Descripciones = 50 secu encias; clasific adas por = PU NTUACION ALT A; bases de datos = n o redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas estan disponibles facilmente.

Como alternativa, la homo logia se pued e determinar mediante hibridacion de po linucleotidos en condiciones que forman duplex estables entre regiones homologas, seguido de digestion con nucleasa(s) especificas de una cadena y determinacion del tama no d e l os fra gmentos digeridos. L as s ecuencias d e A DN q ue s on s ustancialmente homologas se pueden identificar en un experimento de hibridacion de tipo southern en, por ejemplo, condiciones estrictas tal y como se define para ese sistema concreto. La definicion de las condiciones de hibridacion adecuadas esta dentro de la experiencia en la te cnica. Vease, por ejempl o, Sambrook y col., ant.; DNA Cloning, ant.; Nucleic Acid Hybridization, ant.

Una "secuencia codificadora" o una secuencia que "codifica" un polipeptido seleccionado es una molecula de acido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y traduce (en el caso del ARNm) en un polipeptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los limites de la secuencia codificadora estan determinados por un codon de iniciacion en el extremo 5' (amino) y un codon de finalizacion de la traduccion en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia de terminacion de la transcripcion puede localizarse en 3' de la secuencia de codificacion.

"0perablemente unido" se refiere a una organizacion de elementos en la que los componentes asi descritos estan configurados de modo que realizan su funcion deseada.Por tanto, un promotor dado operablemente unido a una secuencia codificadora es capaz de efectuar la expresion de la secuencia codificadora cuando estan presentes los factores de transcripcion adecuados. El promotor no necesita estar contiguo a la secuencia codificadora, mientras que funcione dirigiendo su expresion. Por tanto, por ejemplo, las secuencias intermedias sin traducir pero transcritas pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuenciacodificadora, como tambien puede haber intrones transcritos, y la secuencia promotora puede seguir considerandose "unida operablemente" a la secuencia codificadora.

"Recombinante", como se usa en el presente documento para describir una molecula de acido nucleico significa un

polinucleotido de origen genomico, ADNc, viral, semisintetico o sintetico que, en virtud de su origen o manipulacion, no esta asociada con nada o una porcion del polinucleotido con el que esta asociada en la naturaleza. El termino "recombinante", como se usa con respecto a una proteina o polipeptido quiere decir un polipeptido producido mediante la expresion de un polinucleotido recombinante. En general, el gen de i nteres se colona y despues se expresa en or ganismos transformados, como se describ e mas adelante. El organ ismo huesped expresa e l gen extrano para producir la proteina en condiciones de expresion.

Un "elemento control" se refiere a una secuencia de polinucleotidos que ayuda en la expresion de una secuencia codificadora a la que esta u nido. �l termino incluye promotores, secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores en 5', senales de poliadenilacion, regiones no traducidas, incluidas 5'-UTR and 3'-UTR, y, cuando s ea a decuado, sec uencias lid er y p otenciadores, que, e n conjunto, pr oporcionan la tr anscripcion y traduccion de una secuencia codificadora en una celula huesped.

Un "promotor", como se usa en el presente documento, es una region reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una celula huesped e iniciar la transcripcion de una secuencia codificadora (direccion 3') posterior unida operablemente al mismo. Para los fines de la presente invencion, una secuencia promotora incluye el numero minimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion de un gen de interes a niveles detectables por encima del basal. Dentro de la secuencia promotora hay un sitio de inicio de la transcripcion, asi como dominios de union a proteina (secuencias consenso) responsables de la union de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, aunque no siempre, contienen cajas "TATA" y cajas "CAT".

Una secuencia de control "dirige la transcripcion" de una secuencia de codificacion en una celula cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia promotora y transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que a su vez se traduce en el polipeptido codificado por la secuencia codificadora.

"Casete de expresion" o "construccion deexpresion" se refiere a un ensamblajeque puede dirigir la expresion de la(s) secuencia(s) o gen(es) de interes. El casete de e xpresion incluye elementos de control, como se ha descrito anteriormente, tal como un promotor que esta operablemente unido a la(s) secuencia(s) o gen(es) de interes (para dirigir su tran scripcion dir ecta) y a men udo tambi en i ncluye una secue ncia de poliadenilacion. En ciertas realizaciones de la invencion, el casete de expresion descrito en el presente documento puede estar contenido dentro de una construccion plasmidica. Ademas de los componentes del casete de expresion, la construccion plasmidica puede tambien incluir uno o mas marcadores seleccionables, una senal que permite que la construccion plasmidica exista como ADN monocatenario (p. ej., un origen de replicacion de M13), al menos un sitio de clonacion multiple y un origen de replicacion de "mamifero" (p. ej., un origen de replicacion de SV40 o de adenovirus).

"Transformacion", como se usa en el presente documento, se refiere a la insercion de un polinucleotido exogeno en una celula huesped, al m argen del procedimiento usado para la insercion: por e jemplo, transformacion mediante captacion directa, transfeccion, infeccion y similares. Para procedimientos concretos de transfeccion, vease mas adelante. El polinucleotido exogeno puede mantenerse como vector no integrado, por ejemplo, un episoma, o, como alternativa, puede integrarse en el genoma del huesped.

Una "celula huesped" es una celula que se ha transformado, o es capaz de transformarse, con una secuencia de ADN exogeno.

Como se usa en el presente documento, una "muestra biologica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un sujeto que normalmente incluye anticuerpos producidos por el sujeto. Las m uestras tipicas que incluyen dichos anticuerpos se conocen en la tecnica e incluyen, entre otras, sangre, plasma, suero, material fecal, orina, medula osea, bilis, liquido cefalorraquideo, liquido linfatico, muestras de la piel, secreciones externas de la piel, los tractos respir atorio, intesti nal y g enitourinario, muestr as deriv adas de l epitelio gastr ico y la mucosa gastrica, lagrimas, saliva, leche, celulas sanguineas, organos, biopsias, asi como muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro, incluidos, entre otros, medios acondicionados resultantes del crecimiento de celulas y tejidos en medio de cultivo, por ejemplo celulas recombinantes y componentes celulares.

"Soporte solido comun" quiere decir una matriz solida sencilla a la que los polipeptidos del VHC usados en los inmunoensayos objeto estan unidos covalentemente o por medios no covalentes, tales como adsorcion hidrofoba.

"Inmunologicamente re activo" o "i nmunorreactivo" qu iere decir que el antigeno en c uestion reacc iona especificamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC.

"Inmunogenico" quiere decir que el antigeno en cuestion producira una reaccion inmunitaria cuando se administre a un individuo.

"Complejo inmunitario" quiere decir la combinacion formada cuando un anticuerpo se une a un epitopo sobre un antigeno.

Como se usa en el presente documento, los terminos "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una molecula capaz de rea lizar d eteccion, inclu idas, e ntre otras, isotopos r adioactivos, flu orescentes, qu imioluminiscentes, enzimas, sustr atos e nzimaticos, cofactores de enz imas, inhibidores d e enzim as, cro moforos, co lorantes, i ones

metalicos, sol es metalic os, ligandos (p. ej ., biotina, av idina, estre ptavidina o h aptenos) y s imilares. El termino "fluorescente" se refiere a una sustancia o porcion de la sustancia que es capaz de exhibir fluorescencia en la gama detectable. Ej emplos co ncretos d e marc adores q ue s e pueden usar con l a i nvencion i ncluyen, entre otro s, peroxidasa de rabano (HRP), fluoresceina, FITC, rodamina, dansilo, umbeliferona, ester de dimetilacridinio (DMAE), rojo Texas, NADPH, a-1-galactosidasa.

II. Modos de llevar a cabo la invención

Antes de describir con detalle la presente invencion debe entenderse que la presente invencion no se limita a formulaciones concretas o parametros de procedimientos concretos, ya que todos pueden, por supuesto, variar. Se entendera tambien que la terminologia usada en el presente documento es para el proposito de describir solo realizaciones particulares de la invencion y no se desea que sea limitante.

Aunque en l a practica de la pres ente invencion se pu eden us ar nu merosas c omposiciones y procedimientos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuacion se describen los procedimientos y materiales preferidos.

Como se ha indicado anteriormente, la presente invencion se basa en el descubrimiento de que los mutantes de polipeptidos del VHC con dominios de NS3 modificados, de modo que este inhibida la actividad proteolitica de la proteasa NS3, puede conservar los epitopos conformacionales y, por tanto, son utiles en inmunoensayos para detectar la presencia de infeccion por VHC. Los mutantes de NS3 son especialmente utiles en procedimientos diagnosticos para deteccion precisa y precoz de la inf eccion por VHC. Los proce dimientos se pueden usar para detectar infeccion por VHC durante las primeras etapas de la seroconversion del VHC, incrementando de este modo la precision de la deteccion y reduciendo la incidencia de resultados falsos.

En particular, los inmunoensayos descritos en el pr esente documento usan epitoposaltamente inmunorreactivos derivados de la region NS3/4a de la poliproteina del VHC con mutaciones que alteran la actividad proteolitica pero conservan l os epitopos co nformacionales. Los pol ipeptidos d e NS3 modifica dos se pue den u sar solos e n inmunoensayos o en c ombinacion c on otr os a ntigenos del VHC, ta les como antig enos de f usion de multi ples epitopos que comprenden varios polipeptidos del VHC, bien de los mismos o de diferentes genotipos y aislamientos del VHC, tal como multi ples epitopos inmunodominantes, por ejemplo epitopos lineales principales del nucleo del VHC, SECUENCIAS E1, E2, NS3, NS4, 5-1-1, c100-3 y NS5. Los procedimientosse pueden poner en practicade forma conveniente en un ensayo sencillo usando cualquiera de los d iversos formatos de ensayo que se describen mas adelante, tales como, entre otros, formatos de ensayos que usan un soporte solido al que se unen los antigenos del VHC.

Con el fin de entender adicionalmente la invencion se proporciona una discusion mas detallada con respecto a polipeptidos de NS3 modificados y fusiones del VHC (es decir, MEFA), asi como produccion de las proteinas y procedimientos de usar las proteinas.

Proteinas del VHC

Los genomas de las cepas del VHC contienen un unico marco de lectura abierto de aproximadamente 9.000 a

12.000 nucleotidos que setranscriben en una poliproteina. Como se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1, una poliproteina del VHC, tras escision, produce al menos diez productos distintos, en el orden siguiente:

NH2-Nucleo-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-C00H. El polip eptido del nucl eo se p roduce e n la s posiciones 1-191, numerados en relaci on con el VHC-1 (vease, Choo y col. (19 91) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, para el genoma del VHC-1). Este polipeptido se procesa despues para producir un polipeptido del VHC co n a proximadamente 1-17 3 aminoacidos, Los polipeptidos d e la cub ierta, E1 y E 2, s e pro ducen aproximadamente en las posici ones 192-383 y 384-746, res pectivamente. El dominio P7 s e enc uentra aproximadamente en las p osiciones 747-809. NS 2 es una proteina integr al d e l a membra na con activ idad proteolitica y se encuentra aproximadamente en las pos iciones 810-1026 de la p oliproteina. NS2, en combinacion con NS3, (encontrada aproximadamente en las posiciones 1027-1657), escinde el enlace Scissile NS2-NS3 que, a su vez, genera el extremo NS3 N y libera una poliproteina grande que incluye las actividades serina proteasa y ARN helicasa. La proteasa NS3, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1027-1207, sirve para procesar el resto de la poliproteina. La actividad helicasa se encuentra alrededor de las posiciones 1193-1657. NS3 libera un cofactor de NS3 (NS4a, que se encuentra aproximadamente en las p osiciones 1658-1711), dos proteinas (NS4b, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1712-1972, y NS5a que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1973-2420), y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5b, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 2 421-3011). La termin acion d e la m aduracion de l a poli proteina s e inic ia me diante escisi on autocatalitica en la union NS3-NS4a, catalizada por la NS3 serina proteasa.

Tabla 1

Dominio

Limites aproximados�

C (nucleo)

1-191

E1

192-383

E2

384-746

P7

747-809

NS2

810-1026

NS3

1027-1657

NS4a

1658-1711

NS4b

1712-1972

NS5a

1973-2420

NS5b

2421-3011

�Numerado con respecto al VHC-1. Vease Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455.

Los polipeptidos de NS3 modificados de la invencion estan mutados para inhibir la actividad proteasa, de modo que

5 la escision adicional un polipeptido que incluye el dominio NS3 modificado, tal como un polipeptido NS3/4a, asi como la escision catalitica de proteinas del VHC adicionales usadas en combinacion con el polipeptido de NS3 modificado, esta inhibida. El polipeptido NS3 se puede modificar mediante delecion de todo o una porcion del dominio d e proteasa NS 3. Como alter nativa, la activ idad pr oteolitica se p uede inhibir m ediante s ustitucion de aminoacidos dentro de las regiones activas del dominio proteasa. Por ultimo, las adiciones de aminoacidos a las

10 regiones activas del dominio, de modo que se modifica el sitio catalitico, tambien serviran para inhibir la actividad proteolitica. Preferentemente, las modificaciones realizadas para reducir o eliminar la actividad proteasa no alteran los epitopos conformacionales en las proteinas NS3 o NS3/4a nativas.

Como se ha explicado anteriormente, la actividad proteasa se encuentra en aproximadamente las posiciones 10271207, numeradas con respecto a la poliproteina del VHC-1 de longitud completa (vease, Choo ycol., Proc. Natl.

15 Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455), las posiciones 2-182 de la Figura 3. Se conocen la estructura de la proteasa NS3 y un siti o activ o. Vea se, por ej emplo, D e F rancesco y col., Antivir. Ther. (1998) 3:99-1 09; Koch y col., Biochemistry (2001) 40:631-640. Por tanto, las deleciones o modificaciones de la secuencia nativa normalmente se produciran en o cerca del sitio activo de la molecula. Particularmente, es deseable modificar o realizar deleciones de uno o mas aminoacidos que se producen en las posiciones 1 o 2-182, preferentemente 1 o 2-172 o 1 o 2-155 de la

20 figura 3. Las modificaciones preferidas se realizan en la triada catalitica en el sitio activo de la proteasa, es decir los residuos H, D y/o S, con el fin de inactivar la proteasa. Estos residuos se producen en las posiciones 1083, 1105 and 1165, respectivamente, numeradas respecto a la poliproteina de longitud completa del VHC (posiciones 58, 80 y 140, 1083, 1105 and 1165, respectivamente, de la F igura 3. Dichas modificaciones suprimiran la actividad de escision pr oteolitica d e l a proteas a N S3 al ti empo que m antienen la i nmunorreactividad. Sustitucio nes

25 particularmente preferidas son de naturaleza no conservadora, tal como una sustitucion de Ala para uno o mas de los residuos de aminoacidos que normalmente se encuentran en las posiciones 1083, 1105 y 1165 del dominio proteasa. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente las porciones de la proteasa NS3 que se van a eliminar con el fin de alterar la actividad.

Ademas, un experto en la tecnica puede determinar facilmente otras modificaciones de aminoacidos adecuadas en

30 estos sitios en base a la estructura y funcion conocidas de la proteasaNS3delVHCcomose describe en, por ejemplo, De Franceco ycol., Antivir. Ther. (1998) (Supl. 3): 99-109; y Schechter y Berger, Biochim. Biophys. Res. Commun. (1967) 27:157-162.En particular, se sabe que la proteasa NS2 es una serina proteasa y el mecanismo proteolitico se basa en el ataque nucleofilico del enlace peptidico objetivo mediante una serina. En muchos casos, la propiedad nucleofilica del grupo mejora con la presencia de una histidina, mantenida en un "estado aceptor de

35 protones" por un aspartato. Las cadenas laterales alineadas de serina, histidina y aspartato forman la triada analitica comun a la ma yoria de las serina proteasas. El sitio acti vo de las seri na proteasas tiene forma de hendidura en la que se une el sustrato polipeptidico. Schechter y Berger, Biochim. Biophys. Res. Commun. (1967) 27:157-162 marcaron los residuos de aminoacidos desde el extremo N al C del sustrato polipeptidico (Pi, ..., P3, P2, P1, P1', P2', P3', ..., Pj) y sus subsitios de union respectivos (Si,..., S3, S2, S 1, S1', S2', S3',..., Sj) y descubrieron que la

escision se cataliza entre P1 y P1'. La NS3 proteasa adopta un pliegue similar al de la quimotripsina e incluye un sitio muy largo de union al sustrajo expuesto al disolvente, consistente con el requisito de sustratos peptidicos muy largos (P6-P4'). La proteasa NS3 tiene preferencia por los residuos de cisteina en la posicion del sustrato P1. Por tanto, en base a la estructura y funcion conocidas como se ha descrito anteriormente yen la tecnica, un experto en la tecnica puede determinar facilmente otras sustituciones, adiciones y deleciones de aminoacidos que serviran para romper la actividad proteolitica de la proteasa NS3.

La presencia o ausencia de la actividad proteolitica de NS3 se puede determinar usando procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la actividad proteasa, o ausencia de la misma, se puede determinar usando el procedimiento que se describe mas adelante en los ejemplos, ademas de usar ensayos bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Takeshita y col., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi y col., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali y col., Biochemistry (1998) 37:3392,3401-3401; Cho y col., J. Virol. Meth. (1 998) 72:109115; Cerretani y col., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; �hang y col., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; 268275; Kakiuchi y col., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler y col., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; y Kim y col., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48.

En la molecula NS3 tambien puede haber mutaciones adicionales, pero no tienen que estar, tales como mutaciones en el dominio helicasa, por ejemplo la sustitucion de uno o ambos res iduos de aminoacidos encontrados en las posiciones 1428 y 1429, tal como Pro y Thr normalmente presentes en la posicion 1428 e Ile por Ser normalmente presente en la posicion 1429. Estas mutaciones se denominan mutantes "PI" en el presente documento. La figura 4B muestra un a construccion NS3 mod ificada repr esentativa. La pr oteina inc luye una Met en N-t erminal y los aminoacidos 1027-1657 de NS3 y, por tanto, incluye los dominios NS3 de longitud completa de la poliproteina del VHC. La Ser que norma lmente esta presente en la posi cion 1165 esta sustituida con Ala. Ad emas, el mutant e incluye la sustitucion PI descrita anteriormente. Las secuencias de ADN y de aminoacidos de esta construccion se representan en las Figuras 6A-6C.

Los polipeptidos NS3 modificados de la presente invencion tambien pueden incluir, ademas de un dominio proteasa NS3 modificada, el dominio helicasa de NS3 (es decir, toda l a secuencia polipeptidica de NS3 y/o uno o ma s polipeptidos de una o mas otras regiones de una poliproteina del VHC. Preferentemente, los polipeptidos NS3 modificados incluiran el polipeptido NS4a o un fragmento del mismo. De hecho, todas las regiones de la poliproteina del VHC pueden estar presentes en dichas fusiones. Estos polipeptidos pueden derivar del mismo aislamiento del VHC como el polipeptido NS3 o de diferentes cepas y aislamientos, incluidos los aislamientos que tienen cualquiera de los diversos genotipos del VHC, para proporcionar mayor proteccion contra un amplio abanico de genotipos del VHC. Adicionalmente, los polipeptidos se pueden seleccionar en base a los clados virales concretos endemicos de regiones geograficas especificas en las que se usaran los inmunodiagnosticos. Es facilmente evidente que las proteinas modificadas del VHC proporcionan un modo eficaz de diagnosticar la infeccion por VHC en una amplia variedad de contextos.

Se han determinado las secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de una serie de cepas y aislamientos de VHC, incluidas las secuencias de acido nucleicoy de aminoacidos de las diversas regiones de la poliproteina del VHC, incluidos los genes y polipeptidos del nucleo, NS2, p7, E1, E2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b . Por ejemplo, el aislamiento J1.1 del VHC se describe en Kubo y col. (1989) Japan. Nucl. Acids Res. 17:10367-10372; Takeuchi y col., (1990) Gene 91:287-291; Takeuchi y col. (1990) J. Gen. virol. 71:3027-3033; yTakeuchi ycol., (1990) Nucl. Acids Res. 18:4626. Las secuencias codificadoras completas de dos aislamientos independientes, HCV-J y BK, se describen en Kato y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9524-9528 yTakamizawa y col., (1991) J. Viol 65:1105-1113 respectivamente.

Las publicaciones que describen los aislamientos del VHC-1 incluyen Choo y col. (1990) Brit. Med. Bull. 46:423-441; Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455 y Han y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:17111715. Los aislamientos del VHC HC-J1 y HC-J4 se describen en 0kamoto y col. (1991) Japan J. Exp. Med 60:167

177. Los aislamientos del VHC HCT 18�, HCT 23, Th, HCT 27, EC1 y EC10 se describen en Weiner y col. (1991) Virol. 180:842-848. Los aislamientos del VHC Pt-1, HCV-K1 yHCV-K2 se describen en Enomoto y col. (1990) Biochem. Biophy s. Res. Commun. 17 0:1021-1025. Los ai slamientos del VHC A, C, D y E se describen e n Tsukiyama-Kohara y col. (1991) Virus Genes 5:243-254.

Cada uno de los componentes de una proteina de fusion se puede obtener de la misma cepa o aislamiento del VHC

o de diferentes cepas o aislamientos del VHC. Por ejemplo, el polipeptido de NS3 modificado se puede obtener de una primera cepa de VHC y otros polipeptidos de VHC presentes se pueden obtener de una segunda cepa de VHC. Como alternativa, uno o mas de los otros polipeptidos del VHC, por ejemplo NS2, NS4a, NS4b, Nucleo, p7, E1 y/o E2, so estan presentes, se p uede obtener de una primera cepa de VHC y el resto de los polipeptidos de VHC se pueden obtener de una segunda cepa de VHC. Adicionalmente, cada uno de los polipeptidos de VHC presentes se puede obtener de diferentes cepas de VHC.

En ciertas realizaciones, la proteina NS 3 modificada tambien comprende un dominio NS4a, o un a porcion del mismo, por ejemplo un dominio NS4a y/o un NS4b, o un fragmento del mismo. La proteina NS3 modificada (con o sin el dominio NS4a) tambien se puede fusionar con otras regiones del VHC, tal como con un dominio NS5a, un polipeptido del nucleo de un VHC, y similares. Estas regiones no tienen que estar en el orden en el que estan de

forma naturalen la poliproteina nativa del VHC. Por tanto, por ejemplo, si esta presente, el polipeptido NS4a se puede fusionar con el extremo C y/o C del polipeptido NS3.

Las Figuras 4A y 4C muestran polipeptidos NS3 modificados representativos. En las Figuras, la Ser normalmente presente en la posicion 1165 esta sustituida por Ala. Adicionalmente, los mutantes incluyen la sustitucion PI descrita anteriormente, es decir una sustitucion de Pro por Thr normalmente presente en la posicion 1428 e Ile por la Ser normalmente presente en la posicion 429. En la Figura 4A, la proteina incluye en direccion N-terminal a C-terminal, una Met en N-terminal y los aminoacidos 1027-1657 de NS3 y los aminoacidos 1658-1711 de NS4a. Por tanto, esta fusion i ncluye los domi nios NS3 y NS 4a de lon gitud compl eta de l a pol iproteina del VHC. L a secuenc ia d e nucleotidos y la correspondiente secuencia de aminoacidos de la proteina se muestran en las Figuras 5A-5C. En la Figura 4C, la proteina incluye en direccion N-terminal a C-terminal, una Met en N-terminal y los aminoacidos 16781690 de de NS4a, seguida de la secuencia de aminoacidos SGS, despues los aminoacidos 1029 a 1657 de NS3. Por tanto, est a fusio n i ncluye 13 aminoacidos del dom inio NS4 a, s eguido de una secu encia l igadora fl exible tripeptidica (denominada una secuencia de "giro") y, despues, casi todo el dominio NS3 (excepto los dos primeros aminoacidos en N-terminal). La secuencia de giro permite que NS4a se pliegue en el bolsillo dentro de la proteasa. La secuencia de nucleotidos y la corres pondiente secuencia de aminoacidos de la proteina se muestran en las Figuras 7A-7C. La numeracion del presente documento hace referencia a la poliproteina de longitud completa del VHC-1 y se determinan con facilidad regiones equivalentes en otros serotipos del VHC.

Los polipeptidos NS3 modificados descritos con anterioridad se pueden usar en inmunoensayos con antigenos de fusion de multiples epitopos (denominados "MEFA"), como se ha descrito en la publicacion internacional n° W0 97/44469 y las patentes de EE.UU. n° 6.514.731 y 6.428.792. Dichos MEFA incluyen multiples epitopos de dos o mas de las diversas regiones virales de la poliproteina del VHC mostradas en la Figura 1 y la Tabla 1, y como se ha descrito con detalle mas adelante. El uso de dichos polipeptidos NS3 modificados con los MEFA garantiza que no se producira la escision proteolitica de NS3 proteasa, de modo que se proporcionan mejores reactivos para usar en inmunoensayos del VHC.

Los multiples antigenos del VHC estan dispuestos como una unica cadena continua de aminoacidos, cadena que no se produce como tal en la naturaleza. Por tanto, el orden lineal de los epitopos es diferente de su orden lineal en el genoma en el que se producen. El orden lineal de las secuencias de los MEFA para uso en el presente documento se dispone, preferentemente, para antigeneicidad optima. Preferentemente, los epitopos proceden de mas de una cepa del VHC, de modo que proporcionan la capacidad anadida de detectar multiples cepas del VHC en un unico ensayo. Por t anto, los ME FA para usar en el pr esente doc umento pu eden c omprender diversas reg iones inmunogenicas derivadas de la poliproteina descrita anteriormente. Ademas, se puede usar una proteina resultante de un cambio de marco de lectura en la region central de la poliproteina, tal como se describe en la publicacion internacional n° W0 99/63941, en los MEFA o fusiones con la NS3 modificada descrita anteriormente. Si se desea, en la proteina de fusion se pueden producir al menos 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1 0 o mas de uno o mas epitopos derivados de la poliproteina del VHC.

Epitopos del VHC adicionales para uso en los MEFA incluyen epitopos derivados de la region hipervariable de E2, tal como una region que abraca los aminoacidos 384-414 o 390-410, o la secuencia consenso de esta region, Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr- S er-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn (SEC ID N° 11), que representa una secuencia consenso para los aminoacidos 390-410 del genoma del VHC de tipo 1. Un epitopo de E2 representativo en un MEFA de la invencion puede comprender un epitopo hibrido que abarca los aminoacidos 384

414. Dicho epitopo de E2 hibrido puede incluir una secuencia consenso que representa los aminoacidos 390-410 condensados a una secuencia consenso de una segunda cepa. Como alternativa, el epitopo de E2 presente puede comprender un epitopo hibrido que abarca los aminoacidos 390-444. Dicho epitopo de E2 hibrido puede incluir una secuencia consenso que representa los aminoacidos 390-410 como se ha detallado anteriormente condensado a, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos nativa para los aminoacidos 411-444 para E2 del VHC.

Adicionalmente, los antigenos pueden derivar de varias cepas del VHC. Se conocen multiples cepas virales del VHC y se pueden usar los epitopos derivados de cualquiera de estas cepas en una proteina de fusion. Se sabe bien que cualquier especie de organismo dada varia de un organismo individual a otro y, ademas, que un organismo dado, tal como un virus, puede tener una serie de cepas diferentes. Por ejemplo, como se ha explicado anteriormente, el VHC incluye al menos 6 genotipos. Cada uno de estos genotipos incluye determinantes antigenicos equivalentes. Mas especificamente, cada cepa incluye una serie de determinantes antigenicos que estan presentes en todas las cepas del virus, pero que son ligeramente diferentes de una cepa viral a otra. Por ejemplo, el VHC incluye el determinante antigenico co nocido como 5 -1-1 (veas e la F igura 1). El epitopo 5-1-1 se encu entra en apr oximadamente l as posiciones 1694-1735, numeradas con respecto a la secuencia de la poliproteina del VHC-1. Este determinante antigenico concreto aparece en tres formas diferentes en VHC-1, VHC-2 y VHC-3. De acuerdo con esto, en una realizacion preferida de la invencion, las tres formas de 5-1-1 aparecen en el antigeno de fusion de multiples epitopos usado en los inmunoensayos objeto. De forma similar, puede tambien haber determinantes antigenicos equivalentes de la r egion d el n ucleo d e diferentes c epas de VHC. En ge neral, l os determi nantes anti genicos equivalentes tienen un grado alto de homologia en terminos de secuencia de aminoacidos cuyo grado de homologia es, en general, 30 % o mas, prefere ntemente 40 % o mas, cuand o estan alineados. El epitopo de multiples copias de la presente invencion tambien puede incluir multiples copias que son copias exactas del mismo epitopo.

Las Figuras 8 y 11A-11C muestran MEFA representativas para usar en la presente invencion que derivan del VHC. No obstante, debe entenderse que otros epitopos derivados del genoma del VHC tambien encontraran utilidad en los presentes ensayos.

La secu encia de ADN y la correspondiente secue ncia d e amin oacidos de un antig eno de fusi on de multi ples

5 epitopos representativos, MEFA 7,1 se muestra en las Figuras 9A-9F. Este MEFA tambien se describe en la patente de EE.UU. n° 6.632.601. La formula estructural general de MEFA 7.1 se muestra en la Figura 8 yes la siguiente: hS0D-E1(tipo 1)-E2 HVR co nsenso (tipo 1a)-E2 HVR consenso (tipos 1 y 2)-helicasa (tipo 1)-5-1-1 (tipo 1)-5-1-1 mutado (tipo 3)-5-1-1 (tipo 2)-c10 0(tipo 1) -NS5(tipo 1)-NS5(tipo 1)-nucleo (tipos 1+2)-nucleo (tip os 1+ 2). Este epitopo de multiples copias incluye la siguiente secuencia de aminoacidos, numerada con respecto al VHC-1 (la

10 numeracion de los aminoacidos que se indica a continuacion sigue la designacion de numeracion proporcionada en Choo y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:24 51-2455, en la que el aminoacido n° 1 es la prim era metionina codificada p or la secue ncia de codific acion de l a reg ion de l nucl eo): los amino acidos 1-1 56 d e la super oxido dismutasa (S0D, usada para potenciar la expresion recombinante de la proteina), los aminoacidos 303 a 320 de la poliproteina de la region E1; los aminoacidos 390 a 410 de la poliproteina, que representan una secuencia consenso

15 para la region hipervariable del VHC-1aE2; los aminoacidos 384 a 414 de la poliproteina de la region E2, que representan una secuencia consenso para las regi ones hipervariables E2 del V HC-1 y VHC-2; los aminoacidos 1193-1658 de la poliproteina del VHC-1 que define la helicasa; tres copias de un epitopo de 5-1-1, los aminoacidos 1689-1735, uno del VHC-1, uno del VHC-3 y uno del VHC-2, copias que son determinantes antigenicos equivalentes de las tres cepas virales diferentes del VHC; el polipeptido C100 del VHC del VHC-1, los aminoacidos 1901-1936 de

20 la poliproteina; dos copias exactas de un epitopo de la region NS5 del VHC-1, cada una con los aminoacidos 2278 a 2313 de la poliproteina del VHC; y dos copias exactas de un epitopo de la region del nucleo, una del VHC-1 y una del VHC-2, copias que son determinantes antigenicos equivalentes representados por los aminoacidos 9 a 32, 39-42 y 64-88 del VHC-1 y 67-84 del VHC2.

La Tabla 2 muestra las posiciones de los aminoacidos de los diversos epitopos con referencia a las Figuras 9A-9F 25 en e presente documento.

Tabla 2. MEFA 7.1

MEFA n° aa

Sitio en extremo 5' epitopo VHC n° aa Cepa

1-156 Nco1

hS0D

159-176 Eco

R1 E1 303-320 1

179-199

Hind111 E2 HVR1 consenso 390-410 1

200-230

E2 HVR1 +2 consenso 384-414 1+2

231-696 Sal1

Helicasa 1193-1658 1

699-745 Sph1

5-1-1 1689-1735 1

748-794 Nru1

5-1-1 1689-1735 3

797-843 Cla1

5-1-1 1689-1735 2

846-881 Ava1

C100 1901-1936 1

884-919 Xb

a1 NS5 2278-2313 1

922-957 Bgl1

1 NS5 2278-2313 1

958-1028

Nco1 Epitopos del nucleo 9-32, 39-42 64-88 67-84 1 1 2

1029-1099

Bal1 Epitopos del nucleo 9-32, 39-42, 64-88 67-84 1 1 2

En una realizacion de la invencion, representada en laFigura 2, se realiza un inmunoensayo de captura rapida usando un polipeptido NS3 modificado, o fusion que incluye un polipeptido NS3 modificado y uno o mas antigenos de fusion de multiples epitopos, tales como MEFA 7.1. La muestra se combina con los antigenos que pueden estar presentes sobre un soporte solido, como se describe adicionalmente mas adelante. Si la muestra esta infectada por VHC, los anti cuerpos a nti-VHC frente a dichos e pitopos presentes sobre el soporte solido se unir an a los componentes de soporte solido. La deteccion se realiza mediante la fijacion de un marcador detectable (tal como peroxidasa de rabano (HRP) como se muestra en la Figura 2) a un miembro del complejo antigeno/anticuerpo. La fijacion se puede realizar por medios covalentes o mediante la posterior union de anticuerpos marcados de forma detectable, tales como en un ensayo de tipo sandwich estandar, 0 mediante reaccion enzimatica cuyo producto es detectable. El marcador detectable puede incluir, entre otros, un cromoforo, un anticuerpo, un antigeno, una enzima, un compuesto reactivo a la enzima cuyo producto de escision es detectable, rodamina o derivado de rodamina, biotina, avidina, estreptavidina, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, tal como ester de dimetilacridinio (DMAE), derivadosy/o combinaciones de estos marcadores. Convenientemente se puede usar un anticuerpo anti-humano marcado de forma detectable, capaz de detectar una molecula de IgG humana presente.

Produccion de antigenos del VHC

Como se ha explicado anteriormente, lasmoleculas de la presente invencion se producen, en general, de forma recombinante. Por tanto, los polinucleotidos que codifican antigenos del VHC para usar con la presente invencion se pueden fabricar usando tecnicas estandar de biologia molecular. Por ejemplo, las secuencias polinucleotidicas que codifican las moleculas descritas anteriormente se p ueden obtener usando procedimientos recombinantes, tales como mediante deteccion selectiva de bibliotecas de ADNc y genomicas de celulas que expresan el gen o derivando el ge n d e un vector qu e se sabe q ue l as inclu ye. A demas, el ge n d eseado se puede aislar dir ectamente d e moleculas de acido nucleico viral usando tecnicas descritas en la tecnica, tal como en Houghton y col., la patente de EE.UU. n° 5.3 50.671. El g en de i nteres t ambien se puede prod ucir sinteticam ente en lu gar de clonarse. Las moleculas se pueden disenar con los codones adecuados para la secuencia concreta. Despues, la secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleotidos solapados preparados mediante procedimientos convencionales y reunidos en una secuencia codificadora completa. Vease, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair y col. (1984) Science 223:1299; y Jay y col. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Por tanto, se pueden obtener secuencias nucleotidicas concretas de vectores que alojan las secuencias deseadas o se pueden sintetizar completamente o en parte usando diversas tecnicas de sintesis de oligonucleotidos conocidas en la tecnica, tal como las tecnicas de mutagenesis dirigida a sitio y reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) cuando sea adecuado. Vease, por ejemplo, Sambrook, ant. En particular, un procedimiento de obtener secuencias nucleotidicas que codifican las secuencias deseadas es mediante hibridacion de conjuntos complementarios de oligonucleotidos sinteticos s olapantes pro ducidos e n u n sintetiza dor aut omatico c onvencional d e nucl eotidos, seguido de union con una ADN ligasa adecuada y amplificacion de la secuencia de nucleotidos ligada mediante PCR. Vease, por ejemplo, Jayaraman,y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Adicionalmente, se pueden usar sintesis dir igida a o ligonucleotidos (J ones y c ol. (19 86) Nature 54:75-82), mutag enesis diri gida a oligonucleotidos de regiones nucleotidicas preexistentes (Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-327 y Verhoeyan y col. (19 88) Science 2 39:1534-1536), y llena do e nzimatico de h uecos de o ligonucleotidos us ando la ADN polimerasa de T4 (0ueen y co l. (198 9) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 86:10 029-10033) e n la invenc ion pa ra proporcionar moleculas que tienen alteradas o potenciadas las capacidades de union a antigeno o reducida la inmunogenicidad.

Los procedimientos para producir mutantes o analogos de la secuencia de nucleotidos deseada, tal como NS3 u otros antigenos del VHC, son bien conocidos. Vease, por ejemplo, Dasmahapatra y col., la patentede EE.UU. n° 5.843.752, y �hang y col., la patente de EE.UU. n° 5.990.276. Los mutantes o analogos de Lns3 y otras proteinas del VHC para usar en inmunoensayos pueden prepararse mediante la delecion de una porcion de la secuencia que codifica el polipeptido de interes, mediante insercion de una secuenciay/o mediante sustitucion de uno o m as nucleotidos de ntro de l a se cuencia. Los expertos en l a te cnica c onocen b ien las tecnicas p ara modificar l as secuencias de nucleotidos, tales como mutagenesis dirigida al sitio y similares. Vease, por ejemplo, Sambrook y col., ant.; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder y col. (1987) BioTechniques 5:786;

�oller y Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79:6409.

Una vez que se han preparado o aislado las secuencias codificadoras, dichas secuencias se pueden clonar en cualquier vector adecuado o replicon. Los expertos en la tecnica conocen numerosos vectores de clonacion y la seleccion de un vector de clonacion adecuado es cuestion de eleccion. Vectores adecuados incluyen, entre otros, plasmidos, fa gos, transp osones, cosmic os, cromos omas o virus, q ue s on c apaces de re plicarse c uando esta n asociados con los elementos de control adecuados.

Despues, la secuencia de codificacion se introduce bajo el control de elementos de control adecuados en funcion del sistema que se va a usar para la expresion. Por tanto, la secuencia de codificacion se puede introducir bajo el control de un promotor, sitio de union al ribosoma (para expresion bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN de interes se transcribe en ARN mediante un transformante adecuado. La secuencia

codificadora puede o no contener un peptido senal o secuencia lider que despuespuede eliminarse mediante el procesamiento postraduccional del huesped. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. numeros 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.

Ademas de las decencias control, puede ser deseable anadir secuencias reguladoras que permitan la regulacion de la expresion de las secuencias respecto al crecimiento de la celula huesped. Las secuencias reguladoras son conocidas para el experto en la tecnica y entre los ejemplos se incluyen aquellos que causan la expresion de un gen que se encendera o apagara en respuesta a un estimulo quimico o fisico, incluida la presencia de un compuesto regulador. 0tros tipos de elementos reguladores tambienpueden estar presentes en el vector. Por ejemplo, en el presente documento se pueden usar elementos potenciadores para incrementar los niveles de expresion de las construcciones. Ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema y col. (1985) EMB0 J. 4:761), el potenciador/promotor derivado de la repeticion larga terminal (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Gorman y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) yelementosderivados del CMV humano (Boshart y col. (1985) Cell 41:521), tales como los elementos incluidos en la secuencia del intron A del CMV (patente de EE.UU. n° 5.688.688). El casete de expresion puede incluir ademas un origen de replicacion para la replicacion autonoma en una celula huesped adecuada, uno o mas marcadores seleccionables, uno o mas sitios de restriccion, un potencial paraun numero de copias altas y un promotor fuerte.

Se construye un vector de expresion de modo que la secuencia codificadora concreta se localiza en el vector con las secuencias reguladoras adecuadas, siendo la posicion y orientacion de la secuencia codificadora con respecto a las secuencias control tales que la secuencia codificadora se transcribe bajo el "control" de las secuencias control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molecula de ADN en las secuencias control transcribe la secuencia codificadora). La modificacion de las sec uencias que codifican la molecula de interes puede ser deseable para conseguir este extremo. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia codificadora de modo que pueda unirse a las secuencias control con la orientacion adecuada; es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden unirse a la secuencia codificadora antes de la insercion en un vector. Como alternativa, la secuencia codificadora se puede clonar directamente en un vector de expresion que ya contiene las secuencias control y un sitio de restriccion adecuado.

Las mol eculas se pue den expresar e n un a ampl ia vari edad d e sistem as, inclu idos sistemas de e xpresion d e insectos, mamiferos, bacterias, virus y levaduras, todos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los sistemas de expresion en celulas de insectos, tales como los sistemas de baculovirus, son conocidos para el experto en la tecnica y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materi ales y procedimientos para los sistemas de e xpresion en celu las d e insecto/baculovirus est an disponibles comercialmente en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). De forma similar, los sistemas de expresion en bacterias y celulas de mamifero son bien conocidos en la tecnica y se describe en, por ejemplo, Sambrook y col., ant. Los sistemas de expresion en levaduras tambien se conocen en la tecnica y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr y col., eds., 1989) Butterworths, London..

Tambien se c onocen una serie de celulas huesped adecuadas con los sistemas a nteriores. Por ejem plo, en la tecnica se conocen lineas celulares de mamifero e incluyen lineas de celulas inmortalizadas disponibles en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), tales como, entre otras, celulas de ovario de hamster chino (CH0), celulas H eLa, celu las d e ri non de cria de hamster (B HK), celu las d e rin on de m ono ( C0S), celul as d e ri non embrionario humano, celulas de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), celulas de rinon bovino de MAdin-Darby ("MDBK"), ademas de otras. De igual forma , con los p resentes constructos de expresion pueden encontrar utilidad huespedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp. Las celulas huesped de levaduras utiles en la presente invencion incluyen, entre otras, saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, C andida maltas e, Hans enula polymorpha, Kl uyveromyces fragilis, Kluy veromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Entre las celulas de insecto para usar con los vectores de expresion de baculovirus se incluyen Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni

Las moleculas de acido nucleico que comprenden las secuencias de nucleotidos de interes se pueden integrar de forma estable en el genoma de una celula huesped o se pueden mantener en un elemento episomal estable en una celula huesped adecuada usando varias tecnicas de liberacion genica bien conocidas en la tecn ica. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 5.399.346.

Segun el sistema de expresion y el huesped seleccionado, las moleculas son producidas por celulas huesped en crecimiento transformadas por un vector de expresion descrito en lo que antecede en las condiciones en las que se expresa la proteina. La proteina expresada se aisla despues en la celula huespedy se purifica. Si el sistema de expreso secreta la proteina en el medio de crecimiento, el producto se puede purificar directamente del medio. Si no se secreta, se puede aislar de lisados celulares. La seleccion de las condiciones de crecimiento adecuadas y los procedimientos de recuperacion estan dentro de la experiencia en la tecnica.

Se ha descrito la produccion recombinante de varios antigenos del VHC, incluidos antigenos usados en las diversas fusiones d escritas ant eriormente. Ve ase, por e jemplo, l as pu blicaciones in ternacionales n° W 0 9 4/01778, W 0 93/00365, W0 04/00547 y W0 01/38360; las patentes de EE.UU. n° 5.350.671, 5.683.864, 6.346.375, 6.150.087,

6.514.731, 6.428.792 y 6.632.601; Chien y col., J. Gastr oent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien, D.Y., publicacion internacional n° W0 94/01778; Chien y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1992) 89:10011-10015. Un procedimiento preferido de producir polipeptidos de NS3 modificados se describe en el Ejemplo 1.

Ensayos inmunodiagnosticos

Una vez que se han producido, los antigenos del VHC pueden usarse en casi cualquier formato de ensayo que usa un antigeno conocido para detectar anticuerpos. Una caracteristica comun a todos estos ensayos es que el antigeno se pone en contacto con el componente del cuerpo del que se sospecha que contiene anticuerpos anti-VHC en condiciones q ue permit an q ue el a ntigeno se una a c ualquier antic uerpo pr esente en el comp onente. Dic has condiciones normalmente seran la temperatura fisiologica, pH y fuerza ionica usando un exceso de antigeno. A la incubacion del antigeno con la muestra le sigue la deteccion de complejos inmunitarios formados con el antigeno.

El diseno de los inmunoensayos esta sujeto a una gran cantidad de variaciones y en la tecnica se conocen muchos formatos. Por ejemplo, los formatos pueden usar soportes solidos o inmunoprecipitacion. La mayoria de los ensayos implican el us o d e a nticuerpos o p olipeptidos m arcados; los marc adores p ueden s er, por ejemplo, molec ulas enzimaticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivos o colorantes, como se trata con detalle anteriormente. Tambien se c onocen ensayos amplifican las senales del complejo inmunitarios, ejemplos de los cuales son los ensayos que usan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, tales como ensayos ELISA.

El inmunoensayo puede ser, sin limitaciones, un formato heterogeneo u homogeneo, y de un tipo convencional o competitivo. En un formato heterogeneo, normalmenteel polipeptido se une a una matriz o soporte solido para facilitar la separacion de la muestra del polipeptido tras la incubacion. Para los fines de la presente invencion, un soporte solido puede ser cualquier material que sea unamatriz insoluble y puede tener una superficie rigida o semirigida. Ejemplos de soportes solidos incluyen, entre otros, sustratos tales como nitrocelulosa (p. ej., en forma de membrana o pocillos d e mi crotitulacion; p olivinilcloruro ( p. ej., laminas o pocil los d e microtitulac ion); late x de poliestireno (p. ej., perlas o p lacas de microtitulacion) fluoruro de polivinilideno; papel diazotizado; membranas de nylon; perlas activadas, perlas respondedoras magneticamente, y similares. Soportes concretos incluyen placas, pastillas, discos, capilares, fibras huecas, agujas, alfileres, fibras solidas, perlas de celulosa, perlas de vidrio poroso, geles de silice, perlas de poliestireno opcionalmente reticuladas con divinilbenceno, perlas de copolimero injertado, perlas de p oliacrilamida, pe rlas de l atex, perlas d e di metilacrilamida opcio nalmente reticul adas con N-N'-bisacriloiletilendiamina y perlas recubiertas con un polimero hidrofobo.

Si se desea, las moleculas que se van a anadir al soporte solido se pueden funcionalizar facilmente para crear restos de estireno o acrilato, de modo que se permite la incorporacion de las moleculas en poliestireno, poliacrilato u otros polimer os, tales como poliim ida, po liacriamida, pol ietileno, po livinilo, p olidiacetileno, pol ifenileno-vinileno, polipeptido, polisacarido, polisulfona, polipirrol, poliimidazol, politiofeno, polieter, epoxis, vidrio de silice, gel de silice, siloxano, polifosfato, hidrogel, agarosa, celulosa y similares.

Si en los ensayos se usa mas de un antigeno del VHC, por ejemplo un polipeptido NS3 modificado y un MEFA u otro antigeno del VHC, los antigenos se pueden proporcionar sobre el mismo sustrato solido o sobre diferentes sustratos solidos que se combinan en el ensayo. Por tanto, por e jemplo, los antigenos pueden estar presentes en forma de entidades pequenas sobre, por ejemplo, una placa, o puede estar presentes enforma de, por ejemplo, microperlas individuales que se anaden para el uso en el ensayo de interes.

En un contexto, como se representa en la Figura 2, primero se hace reaccionar un soporte solido con los antigenos del VHC, tales como un polipeptido NS3 modificado, por ejemplo NS3PI.1165 o d.4a.t.N S3PI.1165, y un MEFA, tal como MMEFA 7,1 (en conju nto denominados en el pr esente documento "los componentes de fase solida") en condiciones de union adecuadas de modo que las moleculas queden suficientemente inmovilizadas sobre el soporte. En ocasiones, la inmovilizacion sobre el soporte se puede potenciar acoplando primero el antigeno a una proteina con mejores propiedades de union en fas e solida. Proteinas de ac oplamiento adecuadas incluyen, entre otras, macromoleculas tales como seroalbuminas, incluida seroalbumina bovina (BSA), hemocianina de lapa californiana, moleculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbumina y otras proteinas bien conocidas para los expertos en la tecnica. 0tros reactivos qu e se pue den usar para u nir moleculas al soporte i ncluyen po lisacaridos, acido s polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos, copolimeros de aminoacidos y similares. Los expertos en la tecnica conocen bien dichas moleculas y procedimientos de acoplamiento de estas moleculas a antigenos. Vease, por ejemplo, Brinkley, M.A. (1992) Bioconjugate Chem. 3:2-13; Hashida y col. (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; y Anjaneyulu y Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

Despues de la reaccion del soporte solido con los componentes de fase solida, mediante lavado se eliminan del soporte todos los componentes de fase solida no inmovilizados y, despues, los componentes unidos al soporte se ponen e n con tacto con un a muestra bi ologica de l a q ue se sos pecha qu e co ntiene antic uerpos anti-VH C (denominados en conjunto en el presente documento "moleculas ligando") en condiciones de union adecuadas. Si en la muestra hay anticuerpos frente al VHC, formaran un complejo con los antigenos del VHC. Despues de lavar para eliminar todas las moleculas ligando no unidas se anaden los anticuerpos marcados de forma detectable, tales como anticuerpos anti-xenogenicos (p. ej., anti-h umanos) que reconocen un epitopo sobre anticuerpos anti-VHC.

Estos anticuerpos se unen debido a la formacion del complejo.

En la Figura 12 se muestra otro formato de ensayo. Este formato de ensayo, bien conocido en la tecnica, usa un soporte solido recubierto con estreptavidina que ha reaccionado con anticuerpos marcados con biotina que se unen a NS3 modificada y, opcionalmente, a un MEFA, tal como MEFA 7,1. La muestra se anade en condiciones de union adecuadas. Si en la muestra hayanticuerpos frente al VHC, formaran un complejo con los antigenos del VHC. Despues de lavar para eliminar todas las moleculas ligando no unidas se anaden los anticuerpos marcados de forma detectable, como se ha descrito anteriormente.

En un formato homogeneo, la muestra de prueba se incuba con la combinacion de antigenos en solucion. Por ejemplo, puede ser en condiciones que precipiten cualquier complejo antigeno-anticuerpo que se haya formado. En la tecnica tambien se conocen formatos tanto convencionales como competitivos para los ensayos homogeneos.

En un formato convencional, la cantidad de anticuerpos frente al VHC que forman el complejo antigeno-anticuerpo esta controlada directamente. Esto se puede conseguir determinando su los anticuerpos anti-xenogenicos (p. ej., anti-humanos) que reconocen un epitopo sobre anticuerpos anti-VHC se uniran debido a la formacion del complejo. En un formato competitivo, la cantidad deanticuerpos contra el VHC en la muestra se deduce monitorizando el efecto de la competicion sobre la union de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando competitivo) en el complejo.

Mas particularmente, los complejos formados que comprenden anticuerpo anti-VHC (o, en el caso de los ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo competitivo) se detectan mediante cualquiera de una serie de tecnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, los anticuerpos frente al VHC no marcados en el complejo se pueden detectar usando un conjugado de Ig anti-xenogeneica en complejo con un marcador (p. ej., un marcador enzimatico). En un formato de ensayo de inmunoprecipitacion o aglutinacion, la reaccion entre los antigenos del VCH t el anticuerpo forma una red que precipita en la solucion o suspension y forma una capa o pelicula visible de precipitado. Si no hay anticuerpo anti-VHC presente en la muestra de prueba, no se forma ningun precipitado visible. Los reactivosde ensayo descritos con anterioridad, incluido el soporte solido de inmunoensayocon anticuerpos y antigenos unidos, asi como los anticuerpos y antigenos que se van a hacer reaccionar con la muestra capturada, se pueden proporcionar en kit, con instrucc iones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin d e realizar los inmunoensayos tal como se ha descrito anteriormente. Normalmente el kit contendra en contenedores separados la combinacion de antigenos (ya unidos a una matriz solida o por separado con reactivos para su union a la matriz), formulaciones de anticuerpo control (positivos y/o negativos), anticuerpos marcados cuando el formato de ensayo lo requiere y r eactivos ge neradores d e se nal (p. ej., sustrato enz imatico) si el marc ador n o g enera un a se nal directamente. Normalmente en el kit vienen incluidas las instrucciones (p. ej., por escrito, cinta, VCR, CD-R0M etc.) para llevar a cabo el ensayo. El kit tambien puede contener, segun el inmunoensayo concreto usado, otros reactivos y materiales envasados (es decir, tampones de lavado y similares). Los inmunoensayos estandar, como los que se han descrito en lo que antecede, se pueden realizar usando estos kits.

III. Parte experimental

A continu acion se enc uentran ej emplos de formas d e realiz acion e specificas par a llev ar a ca bo la pr esente invencion. Los ejemplos se ofrecen unicamente con fines ilustrativos y no estan destinados a limitar el ambito de la presente invencion de ningun modo.

Se han realizado esfuerzos para asegurar la precision con respecto a los numeros usados (p. ej., cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se pemiten algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1

Produccion de proteinas NS3 modificadas

I. NS34aPI

NS34aPI, con mutaciones en el dominio helicasa de NS3 pero no en el dominio proteasa, se produjo para la expresion en el vector d e expres ion de leva duras pBS 24.1, del siguiente. NS3 4aPI inclu ye la s ecuencia d e aminoacidos p ara el pol ipeptido NS3/4a n ativo, con la excepcion d e que el ami noacido T hr-1428 y Ser-1429, numerados respecto a la secuencia de longitud completa del VHC-1, han mutado a Pro e Ile, respectivamente. el vector de expresion de levaduras pBS24.1 contiene 2 secuencias para la replicacion autonoma en levaduras y los genes de levaduras leu2-d y URA3 como marcadores seleccionables. El gen de la 1-lactamasa y el orige n de replicacion de ColE1, requerido para la replicacion del plasmido en bacterias, tambien estan presentes en este vector de expresion. El plasmido pd.hcvla.ns3ns4aPI, que codifica NS34aPI, se produjo del siguiente modo. Se uso un procedimiento de dos etapas. Primera, se ligaron las siguientes piezas de ADN: (a) oligonucleotidos sinteticos que proporcionarian un sitio de clonacion HindIII en 5', seguido de una secuencia ACAAAACAAA (SEC ID N° 12), el iniciador ATG, y los codones para VHC1a, comenzando con el aminoacido 1027 y continuando a un sitio BglI en el aminoacido 1046; (b) un fragmento de restriccion de 683 bp BglI-ClaI (que codifica los aminoacidos 1046-1274) de pAcHLTns3ns4aPI; y (c) un vector pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Numero de Registro X65332) que se ha digerido con HindIII y ClaI, desfosforilado y purificado en gel. El plasmido pAcHLTns3ns4aPI se obtuvo de

pAcHLT, un vector de expresion en baculovirus disponible comercialmente en BD Pharmin-gen (San Diego, CA). En concreto, se prepar o un vec tor pAcHLT EcoRI-PstI, asi como los fragmentos siguientes: EcoRI-Alw nI, 935 pb correspondiente a los aminoacidos 1027-1336 del genoma del VHC-1; AlwnI-SacII, 247 pb, correspondiente a los aminoacidos 1336-1419 del genoma del VHC-1; HinfI-BglI, 175 pb, correspondiente a los aminoacidos 1449-1509 del genoma del VHC-1; BglI-PstI, 619 pb , correspondiente a los aminoacidos 1510-1711 del geno ma del VHC-1, mas el codon de terminacion de la transcripcion. Un fragmento de 91 pb generado sinteticamente con SacII-HinfI correspondiente a los aminoacidos 1420-1448 del genoma de VHC-1 y que contiene las mutaciones PI (Thr-1428 mutada a Pro, Ser-1429 mutada a Ile), se unio con el fragmento HinfI-BglI de 175 pb y el fragmento BglI-PstI de 619 pb descritos anteriormente ysubclonados en un vector pGEM-5�f (+) digerido con SacII y PstI. pGEM-5�f(+) es un vector de E. coli disponible comercialmente (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Numero de Registro X65308). Tras la transformacion de las celulas HB101 competentes, el analisis de minicribado de los clones individuales y la verificacion de la secuencia, un fragmento SacII-PstI de 885 pb del clon 2 de pGEM5.PI se purifico en gel. Este fragmento se ligo con el fragmento de 935 pb de EcoRI-AlwnI, el fragmento de 247 pb de AlwnI-SacII y el vector pAcHLT EcoRI-PstI, como se ha descrito anteriormente. La construccion resultante se denomino pAcHLTns3ns4aPI.

La mezcla de union anterior se transformo en celulas HB101 competentes y se sembro en placas de agar Luria que contienen 100 !g/ml de ampicilina. Los analisis miniprep de los clones individuales condujeron a la identificacion de supuestos positivos, dos de l os cuales se amplificaron. El ADN plasmid ico para pSP72 1aHC, se pr epararon los clones n° 1 y 2 con un kit 0iagen Maxip y se secuenciaron.

Despues, se ligaron los siguient es fragm entos: (a) un fragmento HindIII-ClaI de 761 pb de pSP721aHC #1 (pSP72.1aHC se genero uniendo los siguientes: pSP72 que se habia digerido con HindIII y ClaI, oligonucleotidos sinteticos que proporcionarian un sitio de clonacion HindIII en 5', seguido de una secuencia ACAAAACAAA (SEC ID N° 12), el codon de iniciacion ATG, y los codones para VHC1a, comenzando con el aminoacido 1027 y continuando a un sitio B glI en el amin oacido 10 46, y un fragment o de restriccio n BglI-Cl aI de 683 bp ( que codifica l os aminoacidos 1046-1274) de pAcHLTns3ns4aPI); (b) un fragmento B amHI-HindIII de 1353 pb par a el pr omotor hibrido de levaduras ADH2/GAPDH; (c) un fragme nto ClaI-SalI de 1320 pb (que contiene los aminoacidos 10461711 del VHC1a con la Thr 1428 mutada a Pro y la ser 1429 mutada a Ile) de pAcHLTns3ns4aPI; y (d) el vector de expresion en levaduras pBS24.1 que se habia digerido con BamHI y SalI, desfosforilado y purificado en gel. La mezcla de union se transformo en celulas HB101 competentes y se sembro en placas de agar Luria que contienen 100 !g/ml de ampicilina. Los analisis miniprep. De los clones individuales condujeron a la identificacion de clones con el inserto BamHI-SalI de 3446 pb que estaba compuesto porel promotor ADH2/GAPDH, el codon de iniciacion ATG y NS34a de VHC1a de los aminoacidos 1027-1711, co la Thr 1428 mutada a Pro y la Ser 1429 mutada a Ile. La construccion resultante se denomino pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

La cep a AD3 de S. cerevi siae se tra nsformo con pd.HCV1a.ns3ns4aPI y los tra nsformantes s encillos s e comprobaron para detector la expresion tras la deplecion de glucosa en el medio. La proteina recombinante se expreso a niveles altos en levaduras, detectado mediante tincion con azul de Coomassie y se confirmo mediante analisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal frente al dominio helicasa de NS3.

La proteina NS3/4a se purifico del siguiente modo. Las celulas de S. cerevisiae anteriores que expresan la proteina NS34aPI se recogieron y las celulas se suspendieron en tampon de lisis (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl, 0,5 M, EDTA 1mM, PMSF 1 mM, pepstati na 0,1 !M, leupeptina 1 !M) y se lisaron en un Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basilea, Suiza) o un apar ato equivalente usando perlas de vidrio, a una proporcion de 1:1:1 de cel ulas:tampon: perlas de vidrio de0,5 mm. El lisado se centrifugo a 30100xg durante 30 minutos a 4 °C y el sedimento que contenia la fraccion de proteina insoluble se anadio al tampon de lavado (6 ml/g peso inicial del sedimento celular) y se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos. El tampon de lavado consistio en NaP04 50 mM, a pH 8,0, NaCl 0,3M, 8-mercaptoetanol 5 mM, 10% de glicerol octilglucosido al 0,05 %, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 !M, leupeptina 1 !M.

Los resi duos celul ares se eliminaron me diante centrifu gacion a 3 0.100 x g dur ante 30 min utos a 4 °C. E sobrenadante se desecho y se conservo el precipitado.

La proteina se extrajo del precipitado del siguiente modo.Se anadio tampon de extraccion 6 ml/g t se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos. El tampon de extraccion consistio en Tris 50 mM, p H 8,0, NaCl 1M, 8mercaptoetanol 5 mM, 10% de glicerol, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 !M, leupeptina 1 !M. Esto se centrifugo a 30.100 c g durante 30 minutos a 4 °C. El sobrenadante se conservo y se anadio sulfato amonico al 17,5 % usando la formula siguiente: Volumen del sobrenadante (ml) multiplicado por x % de sulfato amonico/(1-x% de sulfato amonico)= Ml de sulfato amonicosaturado 4,1M para anadir al sobrenadante. Gota a gota se anadio el sulfato amonico en agitacion en hielo y la solucion se agito en hielo durante 10 minutos, La solucion se centrifugo a

17.700 x g durante 30 minutos a 4 °C y el precipitado se conservo y se almaceno a una temperatura de 2 °C a 8 °C durante hasta 48 horas.

El precipitado se resuspendio y paso por una columna de poli U (Sefarosa 4B Poli U, Amersham Pharmacia) a 4 °C del siguiente modo. El precipitado se resuspendio en 6 ml de tampon de equilibrado poli U por gramo de peso de precipitado. El tampon de equilibrado consistio en HEPES 25 mM a pH 8,0, Na Cl 200 mM, DTT 5 mM (fresco anadido), 10% de glicerol, 1,2 de octilglucosido. La solucion se agito a 4 °C durante 15 minutos y se centrifugo a

31.000 x g durante 30 minutos a 4 °C.

Se preparo una columna de Poli U (1 ml de resina por gramo de peso del precipitado de partida). El caudal lineal fue 60 cm/h y el caudal de empaquetamiento fue 133 % de 60 cm/h. La columna se equilibro con tampon de equilibrado y el sobrenadante del precipitado de sulfato amonico resuspendido se cargo sobre la columna equilibrada. La

5 columna se lavo hasta el nivel basal con el tampon de equilibrado y la proteina eluyo con una etapa de elucion en el siguiente tampon de eluc ion de poli U: HEPES 25 mM a pH 8,0, NaCl 1M, D TT 5 mM (fresco anadido), 10% de glicerol, 1,2 de octilglucosido. El eluado de la columna se paso con SDS-PAGE (con tincion de Coomassie) ylas alicuotas s e cong elaron y a lmacenaron a -80 °C. La pr esencia d e la proteina NS 34aPI se confir mo medi ante transferencia de tipo Western usando un anticuerpo policlonal dirigido contra el dominio de la NS3 proteasa y un

10 anticuerpo monoclonal contra el epitopo 5-1-1 (VHC4a).

Adicionalmente, la actividad de la enzima proteasa se monitorizo durante la purificacion del siguiente modo. Un peptido NS4a (KKGS-VVIVGRIVLSGKPAIIPKK, SEC ID N° 13) y la muestra que contenia la proteina NS34aPI se diluyeron en 90 !l del tampon de reaccion (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,15M, EDTA 0,5 mM, 10% de glicerol, 0,05 ndodecil-B-D-Maltosido, DTT 5 mM) y se dejo mezclar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron 90

15 !l de la mezcla a una placa de microtitulacion (Costar, Inc., Coming, NY) y se anadieron 10 !l del sustrato del VHC (AnaSpec, Inc., San Jose C A). La placa se mezclo y leyoen un lector de placas Fluostar. Los resultados se expresaron como unidades de fluorescencia relativa (UFR) por minuto.

Usando estos procedimientos, el producto de la extraccion con NaCl 1M que contenia actividad de 3,7 UFR/min, el precipitado de sulfato amonicotenia una actividad de 7,5 UFR/min y el producto de la purificacion con poliU tenia

20 una actividad de 18,5 UFR/min.

II. Antigenos NS3 modificados con mutaciones en el dominio de proteasa

Los antigenos NS3 m odificados, c on una mutaci on e n el d ominio de NS 3 proteasa, se produjeron us ando mutagenesisdirigida de la secuencia de NS34aPI descritaanteriormente. En particular, el codon para la Ser-1165, en la triada catalitica de la proteasa, se muto a un codon de Ala. Un diagrama de la construccion NS34aPI que

25 incluye una sustitucion de Ala por Ser en la posicion 1165 se muestra en la Figura 4A. La secuencia de nucleotidos y la corres pondiente sec uencia de am inoacidos d e esta construccion s e muestra n e n las F iguras 5A-5C. Esta construccion se denomino "NS34aPI. 1165."

Adicionalmente se produjo la proteina NS3 modificada representada en la Figura 4C. Como con la proteina descrita anteriormente, esta NS3 modificada tambien incluia la mutacion PI en el dominio helicasa. La proteina incluia los

30 aminoacidos 1678-1690 de NS4a, seguido de la secuencia de aminoacidos SGS, despues los aminoacidos 1029 a 1657 de NS3. La secuencia SGS proporciona una secuencia ligadora flexible que permite que el polipeptido NS4a se pliegue en el bolsito dentro de la proteasa para crear una molecula enzimaticamente activa. La secuencia de nucleotidos yla correspondiente secuencia de aminoacidos de la proteina se muestran en las Figuras 7A-7C. Esta construccion se denomino "d.4a.t.NS3PI.1165."

35 Por ultimo, una proteina NS3 modificada, mostrada en la Figura 4B, que incluia la sustitucion Ala en el aminoacido 1165, asi c omo l as sustituc iones PI en e l domi nio h elicasa, se pro dujo d el s iguiente mo do. L a s ecuencia d e nucleotidos y la correspondiente secuencia de aminoacidos de esta proteina se muestran en las Figuras 6A-6C. Esta construccion se denomino "NS3PI.1165."

Para construir el vector de expresion en levaduras NS3PI.1165 se realizaron las etapas siguientes. En primer lugar,

40 se genero el plasmido pSP72NS3NS4a.P I.HindIII/ClaI n° 9 mediante union de un fragmento BglI/ClaI (aislado de pAcHLT NS3NS4aPI, descrito anteriorment e) con un oligonucleotido sintetico HindIII/BglI de 97 pb (mas adelante), despues se transformo en HB101.

AGCTTACAAAACAAAATGCATCACCATCACCATCACGCGCC HBgI-1 (SEC ID N° 14)

45 Hbgl-2 (SEC ID N° 15)

Hbgl-5 (SEC ID N° 16)

AGGCTGGTGATTATGCACCCTAGGAGGCCCCTTGTCTGCTGG Hbgl-6 (SEC ID N° 17) 21

Despues de minicribados y la confirmacion de la secuencia, el plasmido pSP72NS3NS4a.PIHindIII/ClaI n° 9 se volvio a transformar en celulas competentes SCS110 de E. coli que se habian sometido a metilacion Dam-. Este plasmido se uso despues como molde para mutar la Serina 1165 de la triada catalitica de la NS3 proteasa de VHC1a en Alanina usando mutagenesis dirigida (GeneTailor Site-Directed Mutagenesis, Invitrogen, San Diego CA), usando los

5 siguientes cebadores para PCR:

5' TTTCCTACTTGAAAGGCTCCgcaGGGGGTCCGCT3' (SEC ID N° 18)

3'GGGGCCGGGTAAAGGATGAACTTTCCGAGG5' (SEC ID N° 19)

Despues de los analisis de minicribado y la verificacion de la secuencia, el clon co n la secuencia correcta se denomino pS P72NS3NS4aPImut1165 n° 32. Despues, este plasmido se digirio c on HindIII y A vrII (BlnI) par a

10 preparar un vector para union con un oligonucleotido sintetico de 58 pares de bases que codifica los 14 aa d el extremo N del dominio NS3 del VHC1a original, usando los codones preferidos de levaduras.

HA-1 (SEC ID N° 20)

HA-2 (SEC ID N° 21)

Despues de la transformacion en HB101, los analisis de minicribado y la verificacion de la secuencia, el plasmido nuevo con la secuencia correcta se denomino pSP72H3/ClaINS3mut1165 #15. Dado que el sitio ClaI del dominio NS3 de VHC1a esta metilado, se usaron celulas competentes de E. coli SCS1 10 para transformar el subclon

20 pSP72H3/ClaINS3mut1165 #15. Despues, este plasmido se digirio con HindIII y ClaI para preparar un fragmento de 761 pb.

En se gundo lugar, un fra gmento C laI/EagI de 1129 pb se aislo d el pl asmido de e xpresion d e bacu lovirus pAcHLTns3ns4aPI. El fragmento ClaI/EagI se unio con un oligonucleotido sintetico de 195 pb que codifica el extremo C del dominio de NS3 mas el peptido NS4a en el vector pSP72 ClaI/SalI para crear el subclon pSP72NS3NS4aPI

25 ClaI/EagI #30 que se volvio a transformar en celulas competentes SCS110, una cepa en la que el sitio ClaI no estaba metilado como lo estaba en HB101:

PI3p-1 (SEC ID N° 22)

30 PI3p-2 (SEC ID N° 23)

PI3p-3 (SEC ID N° 24)

PI3p-4 (SEC ID N° 25) 35 CGAGAGTTCGATGAGATGGAAGAGTGCTGATAAG PI3p-5 (SEC ID N° 26)

PI3p-6 (SEC ID N° 27)

A partir de este plasmido se preparo un vector mediante digestion con las enzimas de restriccion Ava3 y SalI, de modo que se elimino el dominio NS4a. En este vector se unio un oligonucleotido sintetico de 37 pb yse transformo 5 en HB101.

TGTCGGCCGACCTGGAGGTCGTCACGTGATAAG avsal-1 (SEC ID N° 28)

TCGACTTATCACGTGACGACCTCCAGGTCGGCCGACATGCA avsal-2 (SEC ID N° 29)

Despues de analisis de minicribado y confirmacion de secuencia se genero el subclon n° 101 de pSP72 ClaI/SalI NS3PI. Este plasmido se volvio a transformar de nuevo en SCS110, como se ha descrito anteriormente para aislar 10 un fragmento ClaI/SalI de 1320 pb.

Por ultimo, el promotor BamHI/HindIII ADH2/GAPDH, el fragmento HindIII/ClaI de 761 pb yel fragmento ClaI/SalI d 1320 pb se u nieron en el ve ctor de expres ion en l evaduras pBS24.1 B amHI/SalI y se transformo usand o la cep a HB101 de E. coli d e celu las competent es. Los ana lisis miniprep. de l as colo nias i ndividuales co ndujeron a l a identificacion de los clones con un fragmento previsto de 3284 pb. La construccion se denomino pd.NS3PI.1165 #21.

15 La expresion en la cepa AD· de levaduras S. cerevisiae se comprobo como se ha descrito anteriormente para pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

El plasmido de expresion en levaduras .4a.t.NS3PI.1165 se produjo del siguiente modo. Un oligonucleotido sintetico de 100 pb que codificaba el peptido NS4a, seguido de la secuencia de aminoacidos Ser-Gly-Ser y los aminoacidos 1029-1039 del dominio NS 3 se unieron en el vect or pSP72N S3NS4aPImut1165 #32 HindIII/AvrII (descrit o

20 anteriormente) y se transformaron en HB101.

AGCTTACAAAACAAAATGGGCTGCGTG HA-5 (SEC ID N° 30)

GACCCTGCCCACTATGACCACGCAGCCCATTTTGTTTTGTA HA-6 (SEC ID N° 31)

HA-7 (SEC ID N° 32)

HA-8 (SEC ID N° 33)

Despues de analisis de minicribado y confirmacion de secuencia se genero pSP724a-t-NS3PI.1165 #14. Despues, el consiguiente plasmido se transformo en SCS 110 por los motivos descritos anteriormente y se aislo un fragmento HindIII/ClaI de 803 pb. Par a crear el plasmido de expresion en levaduras d.4a.t.NS3PI.1165, el promotor

30 ADH2/GAPDH BamHI/HindIII se ligo con el fragmento HindIII/ClaI de 803 pb y el fragmento ClaI/SalI de 1158 pb que codifica el extremo 3' de la region NS3PI en el vector de expresion en levaduras pAB24 BamHI/SalI. pd.4a-tns3.1165 #4 se transformo en la cepa de levaduras AD3 de S. cer evisiae y se comrpobaron los transformantes sencillos para determinar la expresion como se ha descrito anteriormente para pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

Las proteinas se purificaron como se ha descrito en lo que antecede. Todas las proteinas mutantes tenian niveles de

35 expresion en levaduras similares a los deNS34aPI y se purificaron hasta una pureza similar a NS34aPI (pureza superior al 90 %). El SDS-PAGE y la transferencia Western confirmo la ausencia deactividad proteolitica delos polipeptidos NS3 modificados. En particular, se demostro que NS34aPI.1165 era la proteina de longitud completa sin escindir, y NS3PI.1165 y NS34aPI 1165 no escindieron el MEFA 7.1. Por tanto, las proteinas modificadas carecian de actividad proteolitica.

40 Ejemplo 2

Inmunoensayos usando los antigenos mutados del VHC

Los antigenos del VHC y, en algunos casos segun se especifique, el antigeno MEFA 7.1, se introdujeron en placas para inmunoensayo del siguiente modo. El MEFA 7.1 se produjo como se ha descrito en la patente de EE.UU. n°

6.632.601. MEFA 7.1 es un sustrato natural de la proteasa NS3. El tampon de revestimiento del VHC (NaP04 50

mM a pH 7,0, EDTA 0,2 mM y 0,1% decloroacetamida) se filtro a traves de una unidad de filtro de 0,22 !. A continuacion, secuencialmente se anadieron los reactivos siguientes al tampon de revestimiento del VHC y se agito tras cada ad icion: 2 !g/ml de BSA-sulfhi drilo mod ificado, de una so lucion d e 10 mg /ml (Ba yer C orp. Pente x, Kankakee, Illinois); DTT 5 mM de una solucion 1M (Sigma, St. Louis, M0); 0,45 !g/ml de NS3/4a (concentracion de proteina de 0,3 mg/ml); 0,375 !g/ml de MEFA 7.1 (concentracion de proteina de 1 mg/ml). La solucion final se agito a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A cada pocillo de una placa de fondo plano de union alta Costar (Corning Inc., Corning, New York) se anadieron 200 !l de la solucion anterior ylas placas se incubaron durante la noche en una camara de humedad. Despues, las placas se lavaron con tampon de lavado (1 x PBS, 0.1% TWEEN-20), se dieron golpecitos para secar y se anadieron 285 !l de tampon posrevestimiento 0rto (1 x PBS, pH 7,4, 1% BSA, 3% sacarosa). Las placas se incubaron durante al menos 1 hora, se dieron golpecitos y se secaron durante la noche a 2-8 °C. Las placas se introdujeron en una bolsa con desecantes para usos futuros.

Se estudio el rendimiento de los antigenos NS3 modificados en comparacion con NS34aPI que carecia de la mutacion en el dominio proteolitico. Se usaron paneles de muestras de sangre humana disponibles comercialmente que estaban i nfectados por VHC. Los p aneles d e PHV mostrados en las tabl as q ue figura n mas adelante se adquirieron en Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI).

El ensayo del VHC se realizo del siguiente modo: 200 !l del tampon diluyente de muestras (1 g/l de caseina, 10 0 mg/l de S0D recombinante humana, 1 g/l de cloroacetamida, 10 g/l de BSA, 500 mg/l de extracto de levadura, 0,366 g/l de EDTA, 1,162 g/l de KP04, 5 ml/l de Tween 20, 29,22 g/l de NaCl, 1,627 g/l de NaP04, 1 % de SDS) se anadieron a las placas revestidas. Despues, se anadieron 20 !l de la muestra. Esto se incubo a 37°C durante una hora. Las placas se lavaron con tampon de lavado (1 x PBS, pH 7,4, 0,1% de Tween-20). Se anadieron 200 !l de la solucion conjugada (una IgG anti-humana de raton-HRP, tal como IgG anti-humana de raton-HRP diluida a 1:22.000 en el sistema del ensayo 0RTH0 HCV 3.0 ELISA c on diluyente conjugado en masa Enhanced SAVe (-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) y seincubaron durante 60 minutos a 37 °C. Esto se lavo como se ha indicado anteriormente y se anadieron 200 !l de la solucion sustrato (1 comprimido de 0PD/10 ml). El comprimido de 0PD contiene o-fenilendiamina diclorhidrato y peroxido de hidrogeno para el desarrollo del color con la reaccion con peroxidasa de rabano. Esto se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 50 !l de H2S04 4N y las placas se leyeron a 492 nm respecto a la absorbancia a 690 nm como control.

Los resultados se muestran en las Tablas 3-6. En concreto, la Tabla 3 muestra los resultados de una comparacion del rendimiento en el inmunoensayo de NS3PI.1165 yNS34aPI.1165 frente a NS34aPI. Como se muestra en la Tabla 3, ambos mutantes deficientes en proteasa eran inmunorreactivos y tienen aproximadamente el 80-90 % de la reactividad de la molecula control NS34aPI que conservaba la actividad proteolitica cuando se ha revestido a 2X la cantidad. La Tabla 6 mues tra los resulta dos de u na comparacion del re ndimiento en el i nmunoensayo de d.4a.t.NS3PI.1165, NS3PI.1165 and NS34aPI.1165 frente a NS34aPI. Como se puede ver en la Tabla 6, cuando se revisten a niveles adecuados, d.4a.t.NS3PI.1165, NS3PI.1165 and NS34aPI.1165 mostraron una inmunorreactividad similar a la de NS34aPI con d.4a.t.NS3PI.1165 y muestra la inmunorreactividad mas cercana a NS34aPI.

Como se puede ver en las Tablas 4 y 7, NS3PI.1165, NS34aPI.1165 y d.4a.t.NS3PI.1165 tambien alcanzaron una inmunorreactividad muy similar a la de NS34aPI cuando se usan en combinacion con MEFA 7.1.

La Tabla 5 muestra los resultados de una comparacion del rendimiento en el inmunoensayo de NS3PI.1165 y d.4a.t.NS3PI. 1165 frente a NS34aPI, en los ensay os en comb inacion con MEFA 7.1 o si n MEFA 7.1. Como se puede ver, ambos mutantes, usados solos o en combinacion con MEFA 7.1, alcanzaron una inmunorreactividad muy similar a la del NS34aPI nativo. Por tanto, las tres proteinas NS3 analizadas tienen in inmunorreactividad.

Estas tres proteinas NS3 modificadas tenian actividad helicasa (datos no mostrados), pero estaban desprovistas de actividad proteasa. Ademas, como se muestra en las Figuras 13 y 14, las proteinas mutantes NS3 modificadas no escindieron el MEFA 7.1, un sustrato natural de la NS3 proteasa.

Segun el mejor conocimiento de los inventores, esta es la primera demostracion de que la inmunorreactividad y la actividad proteasa de NS3 se pueden separar y de que eliminar la actividad de serina proteasa no afecta a los sitios de reconocimiento de anticuerpos de la proteina.

Ejemplo 3

Deteccion de seroconversion precoz de y comparacion con los ensayos disponibles comercialmente

Los antigenos C33c y C200son muy inmunorreactivos y los anticuerposfrente a estos antigenos se encuentranen los paneles de seroconv ersion precoz. Por tanto, el rendimiento de d.4a.t.NS3PI.1165 mas MEFA 7.1 o NS34aPI mas MEF A 7.1 en los inm unoensayos se estudi o us ando l os pan eles de C33c y C200 bi en c aracterizados disponibles comercialmente de muestras de sangre humana infectada por el VHC para evaluar la sensibilidad de la seroconversion y estos resultados se compararon con los obtenidos en los kit de ELISA anti-VHC co merciales. En

concreto, el ensayo Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) está disponible comercialmente y es un ensayo de detección basado en anticuerpos. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. El sistema ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System (HCV 3.0) (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) es un ensayo de detección basado en anticuerpos. El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los resultados se muestran en la Tabla 7. Para los paneles estudiados, tanto NS34aPI más MEFA 7.1 como d.4a.t.NS3PI.1165 más MEFA 7.1 detectaron anticuerpos de tipo c33c-y c200 en los paneles de seroconversión precoz. Las detecciones se realizaron 2-12 días antes de los ensayos Ortho HCV 3.0 y Abbott Prism.

TABLA 3: Inmunorreactividad de las proteínas NS3 mutantes introducidas solas sin MEFA 7.1

NS3 PI.116

NS34a PI.1165 NS34a PI

(90 ng)

(180 ng) (90 ng) (180 ng)

(90 ng)

Señal

S/CO Señal S/CO Señal S/CO Señal S/CO Señal S/CO

PHV9D4-1

0,024 0,04 0,027 0,04 0,029 0,05 0,037 0,06 0,034 0,054

PHV904-2

0,023 0,04 0,026 0,04 0,033 0,05 0,037 0,06 0,024 0,038

PHV904-3

0,523 0,85 0,785 1,28 0,904 1,47 1,041 1,68 1,590 2,560

PHV904-4

1,002 1,64 1,785 2,90 3,020 4,91 3,211 5,19 3,435 5,532

PHV904-5

1,521 2,49 2,720 4,42 3,528 5,74 3,559 5,75 3,547 5,711

PHV904-6

2,076 3,39 3,210 5,22 3,569 5,80 3,582 5,79 3,533 5,689

PHV904-7

2,466 4,03 3,903 6,35 3,874 6,30 3,874 6,26 3,874 6,238

PHV913-1

0,012 0,02 0,013 0,02 0,02 0,03 0,026 0,04 0,025 0,041

PHV913-2

0,013 0,02 0,013 0,02 0,016 0,03 0,022 0,04 0,023 0,037

PHV913-3

0,044 0,07 0,057 0,09 0,033 0,05 0,053 0,09 0,057 0,092

PHV913-4

0,182 0,3 0,26 0,42 0,145 0,23 0,175 0,28 0,346 0,557

PHV914-1

0,012 0,02 0,011 0,02 0,014 0,02 0,023 0,04 0,02 0,032

PHV914-2

0,012 0,02 0,014 0,02 0,016 0,03 0,018 0,03 0,018 0,029

IPHV914-3

0,056 0,09 0,085 0,14 0,018 0,03 0,021 0,03 0,086 0,139

PHV914-4

0,388 0,63 0,606 0,99 0,163 0,27 0,268 0,43 1,732 2,780

PHV914-5

0,606 0,99 1,040 1,69 0,728 1,18 1,164 1,88 3,098 4,989

PHV914-6

0,687 1,12 1,186 1,93 0,722 1,17 1,507 2,44 3,314 5,337

PHV914-7

0,974 1,59 1,536 2,50 2,565 4,17 3,122 5,04 3,442 5,542

PHV914-8

1,550 2,53 2,510 4,08 3,416 5,55 3,474 5,61 3,453 5,560

PHV914-9

2,122 3,47 3,098 5,04 3,480 5,66 3,494 5,64 3,486 5,614

TABLA 4: Inmunorreactividad de las proteinas NS3 mutantes introducidas con MEFA 7.1

MEFA 7.1 75 ng

MEFA 7.1 75 ng

MEFA 7.1 75 ng

NS34a PI. 90ng

NS.3 PI. 1165 180 NS34a PI.1165 180 ng

Sena

l S/C0 Senal S/C0 Se nal S/C0

PHV904- 0,02

0,0 0,02 0,0 0,04 0,0

PHV904- 0,02

0,0 0,02 0,0 0,04 0,0

PHV904- 0,78

1,2 1,18 1,9 1,02 1,6

PHV904- 2,40

3,9 3,29 5,3 3,49 5,5

PHV904- 3,27

5,3 3,55 5,7 3,61 5,7

PHV904- 3,43

5,6 3,57 5,8 3,63 5,8

PHV904- 3,89

6,3 3,88 6,3 3,85 6,1

PHV913- 0,04

0,0 0,02 0,0 0,04 0,0

PHV913- 0,27

0,4 0,10 0,1 0,22 0,3

PHV913- 1,26

2,0 0,60 0,9 1,39 2,2

PHV913- 1,40

2,3 0,85 1,3 1,76 2,8

PHV914- 0,01

0,0 0,01 0,0 0,02 0,0

PHV914- 0,01

0,0 0,01 0,0 0,02 0,0

IPHV914- 0,02

0,0 0,07 0,1 0,02 0,0

PHV914- 0,42

0,7 0,97 1,5 0,29 0,4

PHV914- 1,26

2,0 2,31 3,7 1,63 2,6

PHV914- 1,50

2,4 2,42 3,9 2,10 3,3

PHV914- 2,33

3,8 3,04 4,9 3,42 5,4

PHV914- 3,30

5,4 3,4, 5,5 3,53 5,6

PHV914- 3,38

5,5 3,47 5,6 3,55 5,6

TABLA 5: Inmunorreactividad de las proteínas NS3 mutantes introducidas con MEFA 7.1 (panel izquierdo) o son

MEFA 7,1 (panel derecho)

NS34a y NS3 mutantes en combinación con MEFA 7.1

NS34a PI. y MEFA 7.1

NS.3 PI. 1165 y MEFA 7.1 4 a.t. NS3 y MEFA 7.1

(90 ng)

(75 ng) (360 ng) (75 ng) (180 ng) (75 ng)

Señal

S/CO Señal S/CO Señal S/CO

PHV9D41

-0,008 -0,01 0,002 0,00 0,029 0,05

PHV9042

-0,007 -0,01 0,006 0,01 0,022 0,04

PHV9043

2,075 3,40 0,833 1,37 1,485 2,46

PHV9044

3,090 5,06 1,753 2,87 2,930 4,85

PHV9045

3,263 5,34 2,820 4,62 3,374 5,59

PHV9046

3,405 5,57 3,297 5,40 3,459 5,73

PHV9047

3,854 6,31 3,860 6,33 3,857 6,38

PHV9131

0,009 0,01 0,010 0,02 0,004 0,01

PHV9132

0,124 0,20 0,028 0,05 0,091 0,15

PHV9133

0,739 1,21 0,240 0,39 0,522 0,86

PHV9134

1,186 1,94 0,297 0,49 0,724 1,20

PHV9141

0,001 0,00 -0,004 -0,01 0,004 -0,01

PHV9142

0,005 0,01 -0,014 0,02 0,001 0,00

IPHV9143

0,323 0,53 0,032 0,05 0,069 0,11

PHV9144

1,870 3,06 0,410 0,67 1,157 1,92

PHV9145

2,889 4,73 1,013 1,66 2,615 4,33

PHV9146

2,941 4,81 1,158 1,90 2,567 4,25

PHV9147

3,227 5,28 2,008 3,29 3,165 5,24

PHV9148

3,327 5,44 3,014 4,94 3,327 5,51

PHV9149

3,282 5,37 3,012 4,94 3,364 5,57

NS34aPI y mutantes solos

NS34a PI.

NS.3 PI. 1165 4 a.t. NS3 (S11665A)

(90 ng)

(360 ng) (180 ng)

Señal

S/CO Señal S/CO Señal S/CO

0,120

0,019 0,021 0,03 0,059 0,09

0,018

0,03 0,100 0,16 0,054 0,09

1,853

2,98 1,784 2,76 1,779 2,81

3,015

4,85 3,127 4,83 3,150 4,97

3,169

5,10 3,472 5,37 3,474 5,48

3,388

5,46 3,483 5,38 3,537 5,58

3,907

6,29 3,881 6,00 3,881 6,12

0,016

0,03 0,007 0,01 0,019 0,03

0,017

0,03 0,009 0,01 0,024 0,04

0,115

0,19 0,099 0,15 0,072 0,11

0,600

0,97 0,517 0,8 0,465 0,73

0,026

0,04 0,006 0,01 0,023 0,04

0,023

0,04 0,01 0,02 0,018 0,03

0,151

0,24 0,109 0,17 0,104 0,16

1,389

2,24 1,502 2,32 1,225 1,93

2,444

3,93 ,2,832 4,38 2,820 4,45

2,365

3,81 2,751 4,25 2,863 4,52

2,728

4,39 3,377 5,22 3,221 5,08

3,285

5,29 3,368 5,21 3,429 5,41

3,327

5,36 3,348 5,17 3,392 5,35

Tabla 6: Rendimiento de ensayo de NS3/4aPI introducida sola

NS3/4a PI

4a.t NS3PI (S1165 A) NS3PI (S1165 A) NS3/4a PI (S1165 A)

90 ng

90 ng

180 ng 360 ng 90 ng 180 ng 360 ng 90 ng 180 ng 360 ng

Senal S

/C0 Senal S /C0 Senal S/C0 Senal S /C0 Senal S /C0 Senal S/C0 Senal S/ C0 Senal S /C0 Senal S/C0 Senal S /C0

PHV9D4-1

0,120 0, 19 0,027 0, 04 0,059 0,09 0, 0046 ,07 0,034 0, 05 0, 042 0,07 0, 0021 ,03 0,036 0, 006 ,032 0,05 0, 0041 ,06

PHV904-2 0,0

18 0,03 0,06 0,10 0,054 0,09 0, 0071 ,11 0,027 0, 04 0, 033 0,05 0, 0100 ,16 0,030 0, 005 ,033 0,05 0, 0038 ,06

PHV904-3

1,853 2, 98 1,005 1, 63 1,779 2,81 2, 3055 ,29 0,568 0, 91 1, 117 1,79 1, 2784 ,76 0,880 1, 141 ,247 1,97 1, 2709 ,67

PHV904-4

3,015 4, 85 1,983 3, 22 3,150 4,97 3, 5496 ,59 0,957 1, 53 2, 202 3,52 3, 4127 ,83 2,480 3, 398 ,096 4,90 3, 5298 ,16

PHV904-5

3,169 5, 10 2,854 4, 63 3,474 5,48 3, 5552 ,68 1,430 2, 29 2, 928 4,69 3, 5472 ,37 2,998 4, 381 ,411 5,40 3, 5496 ,47

PHV904-6

3,388 5, 46 3,133 5, 09 3,537 5,58 3, 5575 ,72 1,796 2, 87 3, 191 5,11 3, 5483 ,38 3,190 5, 312 ,450 5,46 3, 5494 ,47

PHV904-7

3,907 6, 29 3,899 6, 33 3,881 6,12 3, 6881 ,21 2,004 3, 21 3, 906 6,25 3, 6881 ,00 3,906 6, 327 ,892 6,16 3, 6881 ,07

PHV913-1

0,016 0, 03 0,007 0, 01 0,019 0,03 0, 0023 ,04 0,030 0, 05 0, 011 0,02 0, 0007 ,01 0,026 0, 004 ,025 0,04 0, 0042 ,07

PHV913-2

0,017 0, 03 0,017 0, 03 0,024 0,04 0, 0014 ,02 0,012 0, 02 0, 013 0,02 0, 0009 ,01 0,018 0, 003 ,025 0,04 0, 0041 ,06

PHV913-3

0,115 0, 19 0,081 0, 13 0,072 0,11 0, 0094 ,15 0,063 0, 10 0, 058 0,09 0, 0099 ,15 0,053 0, 009 ,070 0,11 0, 0093 ,14

PHV913-4

0,600 0, 97 0,339 0, 55 0,465 0,73 0, 1677 ,08 0,237 0, 38 0, 376 0,60 0, 0517 ,80 0,211 0, 034 ,323 0,51 0, 0393 ,62

PHV914-1

0,026 0, 04 0,015 0, 02 0,023 0,04 0, 0026 ,04 0,010 0, 02 0, 014 0,02 0, 0006 ,01 0,024 0, 004 ,014 0,02 0, 0015 ,02

PHV914-2

0,023 0,04 0,012 0,02 0,018 0,03 0, 0028 ,04 0,017 0, 03 0, 015 0,02 0, 0010 ,02 0,014 0, 002 ,019 0,03 0, 0013 ,02

IPHV914-3 0,1

51 0,24 0,077 0,13 0,104 0,16 0, 0175 ,28 0,067 0, 11 0, 095 0,15 0, 0109 ,17 0,024 0, 004 ,025 0,04 0, 0043 ,07

PHV914-4

1,389 2, 24 0,782 1, 27 1,225 1,93 2, 3306 ,69 0,432 0, 69 0, 895 1,43 1, 2502 ,32 0,209 0, 034 ,418 0,66 0, 1717 ,12

PHV914-5

2,444 3, 93 1,540 2, 50 2,820 4,45 3, 5424 ,48 0,733 1, 17 1, 592 2,55 2, 4832 ,38 0,836 1, 134 ,575 2,49 2, 3257 ,53

PHV914-6

2,365 3, 81 1,593 2, 59 2,863 4,52 3, 5455 ,53 0,744 1, 19 1, 779 2,85 2, 4751 ,25 1,113 1, 279 ,068 3,27 2, 4602 ,07

PHV914-7

2,728 4, 39 1,994 3, 24 3,221 5,08 3, 5505 ,61 0,936 1, 50 2, 053 3,29 3, 5377 ,22 2,175 3, 349 ,091 4,89 3, 5262 ,10

PHV914-8

3,285 5, 29 2,681 4, 35 3,429 5,41 3, 5487 ,58 1,446 2, 31 2, 897 4,63 3, 5368 ,21 3,251 5, 322 ,428 5,42 3, 5456 ,41

PHV914-9

3,327 5, 36 2,782 4, 52 3,392 5,35 3, 5461 ,54 1,525 2, 44 3, 038 4,86 3, 5348 ,17 3,258 5, 323 ,463 5,48 3, 5476 ,44

TABLA 7: Rendimiento del ensayo: Direccion de seroconversion precoz

BBI

NS34a PI. & MEFA 7.1 4 a.t. NS3 & MEFA 7.1 Dato de campo Dias de antelacion

ID

(90 ng) (75 ng) (180 ng) (75 ng) VHC 3.0 Prism of Prism

Senal

S/C0 Senal S/C0 S/C0 S/C0

PHV9D4-1 -0,00

8 -0,01 0,029 0,05

PHV904-2 -0,00

7 -0,01 0,022 0,04

PHV904-3 2,075

3,40 1,485 2,46

PHV904-4 3,090

5,06 2,930 4,85

PHV904-5 3,263

5,34 3,374 5,59

PHV904-6 3,405

5,57 3,459 5,73

PHV904-7 3,854

6,31 3,857 6,38

PHV913-1 0,009

0,01 0,004 0,01 0,01 0,08

PHV913-2 0,124

0,20 0,091 0,15 0,02 0,10 > 2 dias

PHV913-3 0,739

1,21 0,522 0,86 0,43 0,50

PHV913-4 1,186

1,94 0,724 1,20 0,54 0,59

PHV914-1 0,001

0,00 0,004 -0,01 0,00 0,06

PHV914-2 0,005

0,01 0,001 0,00 0,01 0,06

IPHV914-3 0,32

3 0,53 0,069 0,11 0,01 0,06

PHV914-4 1,870

3,06 1,157 1,92 0,04 0,09 > 12 dias

PHV914-5 2,889

4,73 2,615 4,33 0,33 0,47

PHV914-6 2,941

4,81 2,567 4,25 0,82 0,90

PHV914-7 3,227

5,28 3,165 5,24 3,10 2,41

PHV914-8 3,327

5,44 3,327 5,51 4,85 4,06

PHV914-9 3,282

5,37 3,364 5,57 4,85 4,52

TABLA 8: Rendimiento de ensayo: Sensibilidad dilucional del genotipo

Genotipo D

ioniluc NS3NS4a PI MEFA 7.1 MEFA 7.1 + NS3NS4a PI 0rtho HCV 3.0 Monolisa Ver. 2 Pasteur

D.0. D.0.

D.0. D.0. D.0.

1b 1:500

0 2,929 1,396 2,074 0,393 0,218

1:100

00 2,506 0,826 1,099 0,159 0,084

1:200

00 1,78 0,355 0,403 0,045 0,028

2 a/c

1:2500 1,952 0,467 1,653

1:500

0 1,868 0,717 0,917 0,136 0,782

1:100

00 0,863 0,312 0,395 0,049 0,286

2b 1:250

0 ND ND 1,430 0,295 0,658

1:500

0 ND ND 0,551 0,108 0,207

1:100

00 ND ND 0,225 0,032 0,061

3a 1:250

0 2,580 0,514 0,941

1:500

0 2,879 0,964 1,622 0,218 0,353

1:100

00 1,676 0,432 0,873 0,067 0,164

1:200

00 0,864 0,165 0,398 0,023 0,050

4a 1:250

0 23,831 0,632 0,462

1:500

0 2,4 0,824 1,752 0,193 0,181

1:100

00 1,169 0,265 0,717 0,069 0,0763

5a 1:500

0 2,889 1,763 2,744 0,827 0,988

1:100

00 2,317 1,036 1,587 0,316 0,395

1:200

00 1,315 0,416 0,726 0,097 0,120

6 1:100

3,406 2,872 3,602 3,594 ND

1:100

0 2,978 2,455 3,224 2,863 ND

1:100

00 2,841 0,984 1,192 0,380 ND

1:200

00 2,262 0,509

De acuerdo con esto se han divulgado proteinas NS3 del VHC modificadas y usos de las mismas en los ensayos de deteccion. A partir de lo anterior se apreciara que, aunque en el presente documento se han descrito realizaciones de la invencion a efectos ilustrativos, se pueden realizar varias modificaciones sin desviarse del alcance de la invencion.

LISTADO DE SECUENCIAS

�110> CHIR0N C0RP0RATI0N �120> MUTANTES DE PR0TE�NAS N0 ESTRUCTURALES DEL VHC Y US0S DE L0S MISM0S

5 �130> 2300-22731.40 (PP22731.0004) �150> 60/621.790 �151> �150> 60/621.502 �151> �150> 60/618.390 �151> �150> 60/604.858 �151>

10 �160> 33

�170> PatentIn version 3.3

�210> 1

�211> 2061

�212> ADN

15 �213> Artificial �220>

�223> NS34aPI.1165

�400> 1

�210> 2

�211> 686

�212> PRT

�213> Artificial

�220>

�223> NS34aPI.1165

�400> 2

�210> 3

�211> 1899

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> NS3PI.1165

�400> 3

�210> 4

�211> 632

�212> PRT

�213> Artificial

�220>

�223> NS3PI.1165

�400> 4

�210> 5

�211> 1941

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> d.4a.t.NS3PI.1165

�400> 5

�210> 6

�211> 646

�212> PRT

�213> Artificial

�220>

�223> d.4a.t.NS3PI.1165

�400> 6

�210> 7

�211> 546

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> dominio de NS3 proteasa no modificado nativo

�400> 7

�210> 8

�211> 182

�212> PRT

�213> Artificial

�220>

�223> dominio de NS3 proteasa no modificado nativo

�400> 8

�210> 9 10 �211> 3297

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> MEFA 7.1

15 �400> 9

�210> 10

�211> 1099

�212> PRT

�213> Artificial

�220>

�223> MEFA 7.1

�400> 10

�210> 11

�211> 21

�212> PRT

�213> Artificial

�220>

�223> epitopos del VHC

�400> 11

�210> 12 10 �211> 10

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> oligonucleotido sintetico

15 �400> 12

�210> 13

�211> 23

�212> PRT 20 �213> Artificial

�220>

�223> un peptido NS4a

�400> 13

25 �210> 14

�211> 41

�212> ADN

�213> Artificial

�220> 30 �223> HBgl-1

�400> 14

�210> 15

�211> 52 35 �212> ADN

�213> Artificial

�220> 56

�223> Hbgl-2

�400> 15

�210> 16 5 �211> 60

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> Hbgl-5

10 �400> 16

�210> 17

�211> 42

�212> ADN 15 �213> Artificial

�220>

�223> Hbgl-6

�400> 17

20 �210> 18

�211> 34

�212> ADN

�213> Artificial

�220> 25 �223> Cebador para PCR

�400> 18

�210> 19

�211> 30 30 �212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> Cebador para PCR

�400> 19

�210> 20

�211> 57

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> HA-1

�400> 20

5 �210> 21

�211> 57

�212> ADN

�213> Artificial

�220> 10 �223> HA-2

�400> 21

�210> 22

�211> 84 15 �212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> PI3p-1

�400> 22

�210> 23

�211> 73

�212> ADN

�213> Artificial

25 �220>

�223> PI3p-2

�400> 23

�210> 24 30 �211> 78

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> PI3p-3

�210> 25

�211> 60

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> PI3p-4

�400> 25

10 �210> 26

�211> 34

�212> ADN

�213> Artificial

�220> 15 �223> PI3p-5

�400> 26

�210> 27

�211> 53 20 �212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> PI3p-6

�400> 27

�210> 28

�211> 33

�212> ADN

�213> Artificial

30 �220>

�223> avsal-1

�400> 28

�210> 29 35 �211> 41

�212> ADN

�213> Artificial �220>

�223> aveal-2

�400> 29

5 �210> 30

�211> 27

�212> ADN

�213> Artificial

�220> 10 �223> HA-5

�400> 30

�210> 31

�211> 41 15 �212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> HA-6

�400> 31

�210> 32

�211> 72

�212> ADN

�213> Artificial

25 �220>

�223> HA-7

�400> 32

�210> 33 30 �211> 58

�212> ADN

�213> Artificial

�220>

�223> HA-8

35 �400> 33

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipeptido aislado que comprende la secuencia deaminoacidos de la SEC ID N° 2, 4 o 6, en el que el polipeptido comprende un epitopo conformacional de NS3.

2. 2.

   Um soport e solid o p ara i nmunoensayo que c omprende un polipeptido d e la r eivindicacion 1 q ue re acciona especificamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC.

3. 3.

   El soporte solido de inmunoensayo de la reivindicacion 2, en el que el soporte solido comprende ademas un antigeno de fusion de multiples epitopos unido al soporte, en el que dicho polipeptido y/o dicho antigeno de fusion de multiples epitopos reacciona especificamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC.

4. 4.

   El soporte solido del inmunoensayo de la reivindicacion 3, en el que dichol antigeno de fusion de multiples epitopos c omprende l a sec uencia d e am inoacidos re presentada en l a SEC ID N° 10 o una s ecuencia de aminoacidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % que reacciona especificamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biologica de un individuo infectado por VHC.

5. 5.

   Un procedimiento de detectar infeccion por el virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra biologica, en el que dicho procedimiento comprende:

   (a)

   pro porcionar u n so porte soli do par a i nmunoensayo de acuerdo c on c ualquiera de c ualquiera de las reivindicaciones 2-4;

   (b)

   combin ar una mu estra biol ogica con dicho so porte solid o en c ondiciones q ue permita n que l os anticuerpos anti-VHC, cuando estan presentes en la muestra biologica, se unan a dicho polipeptido y/o dicho antigeno de fusion de multiples epitopos para formar un primer complejo inmunitario;

   (c)

   anadir al soporte solido de la etapa (b) en condiciones formadoras de complejo dicho anticuerpo marcado de forma que se pueda detectar, en el que el anticuerpo marcado reacciona con dicho complejo inmunitario;

   (d)

   detectar un segundo complejo inmunitario formado entre el anticuerpo marcado de forma que se pueda detectar y el primer complejo inmunitario, si existe, como indicacion de infeccion por VHC en la muestra biologica.

6. 6.

   Un kit de ensayo para inmunodiagnostico que comprende el soporte solido para inmunoensayo de cualquiera de las reivindicaciones 2-4 e instrucciones para realizar el ensayo inmunodiagnostico.

7. 7.

   Un polinucleotido que comprende una secuencia codificadora para el polipeptido de la reivindicacion 1.

8. 8.

   Un vector recombinante que comprende:

   (a)

   un polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 7;

   (b)

   y elementos control unidos operablemente a dichopolinucleotido de modo que la secuenciacodificadora se pueda transcribir y traducir en una celula huesped.

9. 9.

   Una celula huesped transformada con el vector recombinante de la reivindicacion 8.

10. 10.

    Un procedimiento para producir un polipeptido recombinante, que comprende:

    (a)

    proporcionar una poblacion de celulas huesped de acuerdo con la reivindicacion 9; y

    (b)

    cultivar dicha poblacion de celulas en condiciones mediante las cuales se expresa el polipeptido codificado por la secuencia codificadora presente en dicho vector recombinante.

11. 11.

    Un procedimiento para producir un soporte solido para inmunoensayo, que comprende:

    (a)

    proporcionar un soporte solido; y

    (b)

    unir al soporte solido al menos un polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicacion 11, que comprende ademas unir al soporte solido en una posicion pequena un antigeno de fusion de multiples epitopos.