NO310241B1 - Kombinasjoner av hepatitt C-virus-(HCV)-antigener og fremgangsmåte for detektering av antistoffer og sett for utförelseav en analyse - Google Patents
Kombinasjoner av hepatitt C-virus-(HCV)-antigener og fremgangsmåte for detektering av antistoffer og sett for utförelseav en analyse Download PDFInfo
- Publication number
- NO310241B1 NO310241B1 NO19923839A NO923839A NO310241B1 NO 310241 B1 NO310241 B1 NO 310241B1 NO 19923839 A NO19923839 A NO 19923839A NO 923839 A NO923839 A NO 923839A NO 310241 B1 NO310241 B1 NO 310241B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hcv
- domain
- antigen
- combination
- hcv polyprotein
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 107
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 8
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 52
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 47
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 15
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 4
- 239000006069 physical mixture Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 14
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 10
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 9
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 9
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 9
- 101710144117 Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 9
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 7
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Thermistors And Varistors (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører kombinasjoner av fremgangsmåte for detektering av antistoffer in vitro og sett for utførelse av en analyse.
Foreliggende oppfinnelse hører inn under området immunoanaly-ser for HCV (tidligere betegnet Non-A, Non-B hepatitt-virus). Den vedrører spesielt kombinasjoner av HCV-antigener som muliggjør bredspektrede immunanalyser for anti-HCV-antistoffer.
Sykdommen som tidligere er kjent som Non-A, Non-B hepatitt (NANBH) ble betraktet å være en overførbar sykdom eller familie av sykdommer som ble antatt å være viralindusert, og som var forskjellige fra andre former av viralt assosierte leversykdommer, inkludert den forårsaket av de kjente hepatit-virusene, dvs. hepatitt A virus (HAV), hepatitt B virus (HBV) og delta hepatitt virus (HDV) samt hepatitt indusert av cytomegalovirus (CMV) eller Epstein-Barr virus (EBV). NANBH ble først identifisert i transfuserte individer. Overføring fra menneske til chimpanse og serie-overføringer i chimpanser, ga bevis for at NANBH var forårsaket av et overførbart infeksiøst middel eller midler. Epidemiologiske bevis tydet på at det kan være tre typer NANBH: en vann-båret epidemisk type; en blod-båret eller parenteral overført type; og en sporadisk forekommende ("community acquired" ) type. Inntil nylig er det ikke blitt identisfisert noe overførbart middel ansvarlig for NANBH, og klinisk diagnostikk og identifikasjon av NANBH er blitt oppnådd hovedsakelig ved eksklusjon av andre virale markører. Blant metodene anvendt for å detektere putative NANBH antigener og antistoffer, var agar-gel diffusjon, motimmun-elektroferese, immunfluorescens-mikroskopi, immun-elektron-mikroskopi , radioimmunanalyse og enzymbundet immunsorbent analyse. Ingen av disse analysene har derimot vist seg å være tilstrekkelig sensitive, spesifikke og reproduserbare for å bli anvendt som en diagnostisk test for NANBH.
I 1987 identifiserte naturviterne ved Chiron Corporation (eieren av foreliggende søknad) den første nukleinsyren definitivt koblet til blod-båret NANBH. Se f.eks. EPO pub. nr. 318.216; Houghton et al., Science 244:359 (1989). Disse publikasjonene beskriver kloningen av et isolat fra en ny viral klasse, hepatitt C virus (HCV), idet prototypisolatet beskrevet deri er betegnet "HCV1". HCV er et Flavi-lignende virus med et RNA-genom.
U.S. patentsøknad serienr. 456.637 (Houghton et al.), inkorporert heri som referanse, beskriver fremstilling av forskjellige rekombinante HCV-polypeptider ved uttrykking av HCV cDNA og screening av de polypeptidene for immunologisk reaktivitet med sera fra HCV-pasienter. Den begrensede screeningen viste at minst fem av polypeptidene som ble testet, var meget immunogene; spesifikt de som er identifisert som 5-1-1, C100, C33c, CA279a og CA290a. Av disse fem polypeptidene er 5-1-1 beliggende i den antatte NS4-domenen; C100 dekker antatte NS3 og NS4 domenene; C33c er beliggende innenfor den antatte NS3 domenen og CA279a og CA290a er beliggende innenfor den antatte C-domenen. Screeningen viste også at ikke noe enkelt testet polypeptid var immunologisk reaktivt med alle sera. Forbedrede tester som reagerte med alle eller flere prøver fra HCV-positive individer, er derfor ønskelig.
Søkerne har utført ytterligere serologiske studier på HCV-antigener som bekrefter at ikke noe enkelt HCV-polypeptid identifisert opp til nå er immunologisk reaktivt med alle sera. Denne mangelen på et enkelt polypeptid som er univer-sielt reaktivt med alle sera fra individer med HCV, kan være forårsaket av stamme-til-stamme-variasjonen i HCV-epitopene, variabilitet i humoral respons fra individ-til-individ og/eller variasjon i serologi med sykdomstilstanden.
Disse ytterligere studiene har også muliggjort at søkerne kan identifisere kombinasjoner av HCV-antigener som tilveiebrin-ger mer effektiv deteksjon av HCV-antistoffene enn noe enkelt HCV-polypeptid.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en kombinasjon av hepatitt C virus (HCV) epitopesekvenser i en eller flere polypeptider fremstilt ved kjemisk syntese eller rekombinant ekspresjon, immobilisert på overflaten av en fast matrise egnet for deteksjon av HCV ved immunoanalyse, kjennetegnet ved at den omfatter: a) en første epitopesekvens fra C-domenen til HCV polyproteinet; b) en andre epitopesekvens fra en andre domene av HCV-polyproteinet i det domenen er: i) et HCV-antigen omfattende NS3 domenen til HCV polyproteinet; ii) NS4 domenen til HCV polyproteinet; eller iii) NS5 domenen til HCV polyproteinet; og c) en tredje epitopesekvens fra en tredje domene av HCV polyproteinet i det domenen er: i) NS3 domenen til HCV polyproteinet;
ii) NS4 domenen til HCV polyproteinet; eller iii) NS5 domenen til HCV polyproteinet;
i det den tredje domenen er forskjellig fra den andre domenen; med den forutsetningen at kombinasjonen ikke er peptid pl med C100-3, peptidet p35 med C100-3 eller peptidet p99 med C100-3.
I en utførelsesform er kombinasjonen av HCV-antigener i form av et fusjonsprotein omfattende antigener. I en alternativ utførelsesform er kombinasjonen av antigener i form av individuelle antigener bundet til en felles fast matrise. I en ytterligere utførelsesform er kombinasjonen av antigener i form av en blanding av individuelle antigener.
Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for detektering in vitro av antistoffer mot hepatitt C viruser (HCV) i en pattedyrlegemekomponent antatt å inneholde nevnte antistoffer, kjennetegnet ved å kontakte nevnte legemekomponent med kombinasjonen som tidligere nevnt, under betingelser som muliggjør antistoff-antigen reaksjon og detektering av tilstedeværelse av immunkompleksene til nevnte antistoffer og nevnte polypeptidepitope sekvenser.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også et sett for å utføre en analyse for detektering av antistoffer mot hepatitt C antigen (HCV) i en pattedyrlegeme komponent antatt å inneholde nevnte antistoffer, kjennetegnet at det omfatter i pakket kombinasjon: a) kombinasjon av HCV-epitopesekvenser som tidligere nevnt,
b) standard kontroll reagenser; og
c) instruksjoner for å utføre analysen.
I tegningene:
Figur 1 angir nukleotidsekvensen til cDNA-sens og anti-sens tråden for HCV-polyproteinet og aminosyresekvensen som blir kodet av senstråden. Figur 2 angir et skjema av aminosyresekvensen ifølge figur 1 som viser de antatte domenene til HCV-polypeptidet.
Def inisjoner
"HCV-antigen" angir et polypeptid på minst omtrent 5 aminosyrer, vanligvis minst omtrent 8 til 10 aminosyrer som definerer en epitope funnet i et isolat av HCV. Epitopen er fortrinnsvis unik overfor HCV. Når et antigen blir betegnet med en alfa-numerisk kode, er epitopen fra HCV-domenen spesifisert ved den alfa-nukleriske koden.
"Syntetisk" blir anvendt for å karakterisere et HCV-antigen og viser at HCV-antigenet enten er blitt isolert fra native kilder eller manuelt laget så som ved kjemisk eller rekombinant syntese.
"Domener" angir de segmentene av HCV-polyproteinet vist i figur 2 som generelt tilsvarer de antatte strukturelle og ikke-strukturelle proteinene til HCV. Domenebetegnelsene følger generelt konvensjonen anvendt for å benevne flavivira-le proteiner. Beliggenhetene til domenene vist i figur 2, er bare omtrentlige. Betegnelsene "NS" betegner "ustrukturelle" domener, mens "S" angir envelope-domenen og "C" angir nukleokapasiet eller kjernedomenen.
"Fusjons-polypeptid" angir et polypeptid der HCV-antigene(er ) er del av en enkel, kontinuerlig kjede av aminosyrer, og der kjeden ikke oppstår i naturen. HCV-antigenene kan bli koblet direkte til hverandre ved hjelp av peptidbindinger eller bli separert av mellomliggende aminosyresekvenser. Fusjonspoly-peptidene kan også inneholde aminosyresekvenser eksogene overfor HCV.
"Felles fast matrise" angir et fast legeme hvorpå de individuelle HCV-antigenene eller fusjonspolypeptidet bestående av HCV-antigener er kovalent bundet, eller ved hjelp av ukovalente midler så som hydrofob adsorpsjon.
"Pattedyrkroppskomponent" angir et fluid eller vev fra et pattedyrindivid (f.eks. et menneske) som vanligvis inneholder antistoffet produsert av individet. Slike komponenter er kjent innenfor fagområdet og omfatter, uten begrensning, blod, plasma, serum, spinalvæske, lymfevæske, sekresjoner fra respirasjonen, tarm- eller genitalurinkanaler, tårer, spytt, melk, hvite blodceller og myelom.
"Immunologisk reaktiv" betyr at antigenet som det gjelder, vil reagere spesifikt med anti-HCV-antistoff som vanligvis er
tilstede i en betraktelig proporsjon av sera fra individer infisert med HCV.
"Immunkompleks" angir kombinasjonen eller aggregatet dannet når et antistoff blir bundet til en epitope på et antigen.
Kombinasjoner av HCV- antigener
Figur 2 viser de antatte domenene til HCV-polyproteinet. Domenene som antigenene anvendt i kombinasjonene er avledet fra, er: C, S (eller E) NS3, NS4 og NS5. C-domenen antas å definere nukleokapsidproteinet til HCV. Den utgår fra N-terminalen av polyproteinet til omtrent aminosyre 120 ifølge figur 1. S-domenen antas å definere virus-envelope-proteinet og muligens matrise (M) proteinet og antas å utgå fra omtrent aminosyre 120 til aminosyre 400 ifølge figur 1. NS3-domenen utgår fra omtrent aminosyre 1050 til aminosyre 1640 og antas å utgjøre den virale proteasen. NS4-domenen utgår fra terminusen til NS3 til omtrent aminosyre 2000. Funksjonen til NS4-proteinet er ikke enda kjent. NS5-domenen utgår fra omtrent aminosyre 2000 til slutten av polyproteinet og antas å definere den virale polymerasen.
Sekvensen vist i figur 1 er sekvensen til HCVl-isolatet. Det er ventet at sekvensene til andre stammer av blod-båret HCV kan være forskjellig fra sekvensen ifølge figur 1, spesielt i envelope (S) og nukleokapsid (C) domenene. Anvendelse av HCV-antigenene med slike forskjellige sekvenser antas å være innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse, forutsatt derimot at variasjonen ikke betraktelig reduserer den immunologiske reaktiviteten til antigenet overfor sera infisert med HCV.
HCV-antigener vil generelt omfatte hele eller forkortede domener, og domenfragmentene blir lett screenet for antigeni-sitet av fagfolk innenfor området. De individuelle HCV-antigenene anvendt i kombinasjonen, vil fortrinnsvis omfatte den immundominante delen (dvs. delen som hovedsakelig er ansvarlig for den immunologiske reaktiviteten til polypeptidet) av den angitte domenen. Når det gjelder C-domenen, er det foretrukket at C-domeneantigenet omfatter en hoveddel av hele sekvensen til domenen. Antigenet betegnet C22 (se eksempel 4, infra), er spesielt foretrukket. S-domeneantigenet omfatter fortrinnsvis den hydrofobe subdomenen ved den N-terminale enden av domenen. Denne hydrofobe subdomenen utgår fra omtrent aminosyre 199 til aminosyre 328 ifølge figur 1. HCV-antigenet betegnet S2 (se eksempel 3, infra), er spesielt foretrukket. Sekvensen nedstrøms for den hydrofobe subdomenen kan bli innbefattet i S-domeneantigenet om ønskelig.
Et foretrukket NS3-domeneantigen er antigenet betegnet C33c. Det antigenet omfatter aminosyrene 1192 til 1457 ifølge figur 1. Et foretrukket NS4-antigen er C100 som omfatter aminosyrene 1569 til 1931 ifølge figur 1. Et foretrukket NS5-antigen omfatter aminosyrene 2054 til 2464 ifølge figur 1.
HCV-antigenet kan være i form av et polypeptid bestående fullstendig av HCV-aminosyresekvensen eller det kan inneholde sekvensen eksogen for HCV (dvs. det kan være i form av et fusjonsprotein som innbefatter den eksogene sekvensen). I tilfelle av rekombinant produsert HCV-antigen ved produsering av antigenet som et fusjonsprotein så som med SOD, kan alfa-faktor eller ubiquitin (se commonly owned U.S. patent nr. 4.751.180, U.S. patent nr. 4.870.008 og U.S. patent-søknad serienr. 390.599, inngitt 7. august 1989, og beskrivelsen er inkorporert heri, og som beskriver ekspresjon av SOD, alfa-faktor og ubiquitin fusjonsproteiner) som kan øke eks-presjonsnivået og/eller øke vannoppløseligheten til antigenet. Fusjonsproteinene så som alfa-faktor og ubiquitinfusjon blir prosessert av ekspresjonsverten for å fjerne den heterologe sekvensen. Alfa-faktor er et sekresjonssystem, mens ubiquitinfusjonene forblir i cytoplasma.
Kombinasjon av antigenene kan videre bli produsert som et fusjonsprotein. Et kontinuerlig fragment av DNA kodende for
C22 og C33c kan bli konstruert, klonet inn i en ekspresjonsvektor og anvendt for å uttrykke et fusjonsprotein ifølge C22 og C33c. På lignende måte kan fusjonsproteinene ifølge C22 og C100; C22 og S2; C22 og et NS5-antigen; C22, C33c og S2; C22, C100 og S2 og C22, C33c, C100 og S2 bli fremstilt. Alternati-ve fragmenter fra den eksemplifiserte domenen kan også bli anvendt.
Preparering av HCV- antigener
HCV-antigenene blir fortrinnsvis fremstilt rekombinant eller ved hjelp av kjente fastfasekjemiske synteser. De kan derimot også bli isolert fra dissosierte HCV eller HCV partikler ved anvendelse av affinitetskromatografiteknikker som anvender antistoffer mot antigenene.
Når produsert ved rekombinante teknikker, kan standardprose-dyrer for konstruering av DNA-kodende antigen, kloning av DNA inn i ekspresjonsvektorer, transformering av vertsceller så som bakterier, gjær, insekter eller pattedyrceller, og uttrykking av slikt DNA for å produsere det antigenet, bli anvendt. Som tidligere angitt, kan det være ønskelig å uttrykke antigenet som et fusjonsprotein for å forsterke ekspresjonen, lette rensingen eller forsterke oppløselig-heten. Eksempler på spesifikke prosedyrer for å produsere representative HCV-antigener er beskrevet i eksemplene, infra, og i opprinnelig søknad serie nr. 456.637.
Formulering av antigener for anvendelse i immunanalyse
HCV-antigenene kan bli kombinert ved å produsere dem i form av et fusjonsprotein bestående av to eller flere antigener, ved immobilisering av disse individuelt på en felles fast matrise, eller ved fysisk blanding av disse. Fusjonsproteiner til antigenet kan også bli immobilisert på (bundet til) en fast matrise. Fremgangsmåter og midler for kovalentlig eller ikke-kovalentelig binding av proteiner til faste matriser, er kjent innenfor dette området. Naturen til den faste overflaten vil variere avhengig av analyseformatet. For analyser utført i mikrotiterbrønner, vil den faste overflaten være veggen til brønnen eller koppen. For analyser som anvender kuler, vil den faste overflaten være overflaten til kulene. I analyser som anvender en dyppestrimmel (dvs. et fast legeme fremstilt fra et porøst eller fibrøst materiale så som stoff eller papir) vil overflaten være overflaten til materialet som dyppestrimmelen er fremstilt fra. I agglutinasjonsanaly-ser kan den faste overflaten være overflaten av lateks eller gelatinpartikler. Når individuelle antigener er bundet til matrisen, kan de bli fordelt homogent på overflaten eller fordelt derpå i et mønster, så som bånd, slik at dette mønster av antigenbinding kan fremkomme. Enkle blandinger av antigenene omfatter antigenene i et hvilket som helst egnet oppløsningsmiddel eller dispergeringsmedium.
Analyseformater ved anvendelse av kombinasjoner av antigener HCV-antigenene kan bli anvendt i faktisk talt hvilke som helst analyseformat som anvender et kjent antigen for å detektere antistoffene. Et fellestrekk ved alle disse analysene, er at antigenet blir kontaktet med legemekomponen-ten som antas å kontakte HCV-antistoffene under betingelser som muliggjør at antigenet blir bundet til et hvilket som helst slikt antistoff tilstede i komponenten. Slike betingelser vil vanligvis være fysiologisk temperatur, pH og ionestyrke ved anvendelse av et overskudd av antigen. Inkubasjonen av antigenet med prøven, blir etterfulgt av deteksjon av immunkomplekser bestående av antigenet.
Designet til immunanalysene er gjenstand for en god del variasjon, og mange formater er kjent innenfor fagområdet. Protokoller kan for eksempel anvende faste bærere eller immunpresipitasjon. De fleste analysene involverer anvendelse av merket antistoff eller polypeptid, og markørene kan for eksempel være enzymatiske, flurescerende, kjemiluminiscente, radioaktive eller farvemolekyler. Analyser som amplifiserer signalene fra immunkomplekset er også kjent, og eksmepler på dette er analyser som anvender biotin og avidin og enzym-merkede og formidlede immunanalyser så som ELISA-analyser.
Immunanalysen kan, uten å være begrenset av dette, være i et heterogent eller i et homogent format, og av en standard eller konkurrerende type. I et heterogent format er polypeptidet vanligvis bundet til en fast matrise eller bærer for å lette separeringen av prøven fra polypeptidet etter inkubasjon. Eksempler på faste bærere som kan bli anvendt, er nitrocellulose (f.eks. i membran eller mikrotiter-brønnform ) , polyvinylklorid (f. i ark eller mikrotiterbrønner), po-lystyrenlateks, f.eks. i kuler eller mikrotiterskåler, polyvinylidenfluorid (kjent som Immulon®), diasotisert papir, nylonmembraner, aktiverte kuler og protein A kuler. Dynatech Immulon® 1 eller Immulon® 2 mikrotiterskåler eller 0,63 cm polystyrenkuler (Precision Plastic Ball) kan for eksempel bli anvendt i det heterogenet formatet. Den faste bæreren inneholdende de antigene polypeptidene blir vanligvis vasket etter separering av disse fra testprøven, og før deteksjon av bundede antistoffer. Både standard og konkurrerende formater er kjent innenfor dette området.
I et homogent format, blir testprøven inkubert med kombinasjonen av antigener i oppløsning. Dette kan for eksempel være under betingelser som vil felle ut eventuelle antigen-antistoffkomplekser som blir dannet. Både standard og konkurerende formater for disse analysene er kjent innenfor dette området.
I et standardformat blir mengden av HCV-antistoff som danner antistoff-antigen-komplekset direkte registrert. Dette kan bli oppnådd ved å bestemme om de merkede anti-xenogeniske (f.eks. anti-humane) antistoffene som gjenkjenner en epitope på anti-HCV-antistoffene vil bli bundet på grunn av kompleks-dannelsen. I et konkurrerende format, blir mengden av HCV-antistoffer i prøven bestemt ved registrering av den konkurrerende effekten på bindingen av en kjent mengde av merket antistoff (eller annen konkurrerende ligand) i komplekset.
Dannede komplekser omfattende anti-HCV-antistoff (eller, i tilfelle av konkurrerende analyser, mengden av konkurrerende antistoff) blir detektert ved hvilke som helst av et antall kjente teknikker, avhengig av formatet. For eksempel kan umerkede HCV-antistoffer i komplekset bli detektert ved anvendelse av et konjugat av antieksenogenisk lg kompleks-bundet med en markør (f.eks. en enzymmarkør ).
I et immunopresipiterings- eller agglutineringsanalyseformat, danner reaksjonen mellom HCV-antigenene og antistoffet et nettverk som presipiterer fra oppløsningen eller suspensjonen og danner et synlig lag eller en film av presipitatet. Dersom det ikke er noe anti-HCV-antistoff tilstede i testprøven, blir det ikke dannet noe synlig resipitat.
HCV-antigenene vil vanligvis bli pakket i form av et sett for anvendelse i disse immunanalysene. Kitet vil normalt inneholde i separate beholdere kombinasjonen av antigener (enten allerede merket til en fast matrise eller separat med reagenser for binding av disse til matrisen), kontrollan-tistoff-formuleringer (positive og/eller negative), merket antistoff når analyseformatet krever dette og signaldannende reagenser (f.eks. enzymsubstrat) dersom markøren ikke danner et signal direkte. Instruksjoner (f.eks. skrevne, tape, VCR, CD-ROM, osv,) for å utføre analysen, vil vanligvis være innbefattet i kitet.
Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.
Eksempel 1: Syntese av HCV- antigen C33c
HCV-antigen C33c inneholder en sekvens fra NS3-domenen. Det omfatter spesifikt aminosyrene 1192-1457 ifølge figur 1. Dette antigenet ble produsert i bakterier som et fusjonsprotein med human superoksid-dismutase (SOD) som følger. Vektoren pSODcfl (Steiner et al. (1986), J. Virol. 58:9) ble fullstendig spaltet med EcoRI og BamHI og det resulterende EcoRI, BamHI-fragmentet ble ligert til følgende linker for å danne pcflEF:
En cDNA-klon kodende for aminosyrene 1192-1457 og med EcoRI-ender, ble satt inn i pcflEF for å danne pcflEF/C33c. Denne ekspresjonskonstruksjonen ble transformert inn i D1210 E. coli-cellene.
Transformantene ble anvendt for å uttrykke et fusjonsprotein bestående av SOD ved N-terminusen og i-ramme C33c HCV-antigenet ved C-terminusen. Ekspresjon ble oppnådd ved inokulering av 1500 ml Luria kraft inneholdende ampicillin (100 jjg/ml) med 15 ml av en overnattkultur av transformantene. Cellene ble dyrket til en O.D. på 0,3, IPTG ble tilsatt for å tilveiebringe en sluttkonsentrasjon på 2 mM, og veksten ble fortsatt helt til cellene oppnådde en tetthet på 1 O.D., og deretter ble de høstet ved sentrifugering ved 3.0000 x/g ved 4°C i 20 minutter. De pakkede cellene kan bli lagret ved -80°C i flere måneder.
For å rense S0D-C33C polypeptidet ble de bakterielle cellene hvori polypeptidet ble uttrykt, utsatt for osmotisk sjokk og mekanisk ødelegging, den uoppløselige fraksjonen inneholdende S0D-C33c ble isolert og utsatt for differensialekstrahering med en alkalin-NaCl-oppløsning, og fusjonspolypeptidet i ekstraktet ble renset ved kromatografi på kolonner av S-Sepharose og Q-Sepharose.
Råekstraktet som resulterte fra osmotisk sjokk og mekanisk ødelegging, ble preparert ved følgende prosedyre. Ett gram av de pakkede cellene ble suspendert i 10 ml av en oppløsning inneholdende 0,02 M Tris HC1, pH 7,5, 10 mM EDTA, 20% sukrose og inkubert i 10 minutter på is. Cellene ble deretter pelletert ved sentrifugering ved 4.000 x g i 15 min. ved 4°C. Etter at supernatanten var fjernet, ble cellepelletene resuspendert i 10 ml buffer Al (0.01M Tris HC1, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mM beta-merkaptoetanol [BME] ), og inkubert på is i 10 minutter. Cellene ble påny pelletert ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4°C. Etter fjerning av den klare supernatanten (periplasmisk fraksjon I), ble cellepelletene resuspendert i buffer Al, inkubert på is i 10 minutter og påny sentrifugert ved 4.000 x g i 15 minutter ved 4°C. Den klare supernatanten (periplasmisk fraksjon II) ble fjernet, og cellepelleten ble resuspendert i 5 ml buffer A2 (0,02 M Tris HC1, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). For å ødelegge cellene, ble suspensjonen (5 ml) og 7,5 ml Dyno-mill blyfrie syrevaskede glasskuler (0,10-0,15 mm diameter) (oppnådd fra Glen-Mills, Inc.) plassert i et Falcon-rør, og vortekset ved topp hastighet i to minutter, etterfulgt av avkjøling i minst 2 min. på is; og den forteksing-avkjølende prosedyren ble gjentatt ytterligere fire ganger. Etter vorteksing ble oppslemmingen filtrert gjennom en scintret glasstrakt ved anvendelse av lavt sug; og glasskulene ble vasket to ganger med buffer A2, og filtratet og vaskeblandingene ble kombinert .
Den uoppløselige fraksjonen av råekstraktet ble samlet ved sentrifugering ved 20.000 x g i 15 min. ved 4°C, vasket to ganger med 10 ml buffer A2, og resuspendert i 5 ml MILLI-Q-vann.
En fraksjon inneholdende S0D-C33c ble isolert fra det uoppløselige materialet ved tilsetning til suspensjonen NaOH (2 M) og NaCl (2 M) for å tilveiebringe en sluttkonsentrasjon på 20 min. hver, vorteksing av blandingen i 1 minutt, sentrifugering av denne ved 20.000 x g i 20 min. ved 4°C, og opprettholdelse av supernatanten.
For å rense S0D-C33c på S-Sepharose, ble supernatantfrak-sjonen justert til en sluttkonsentrasjon på 6M urea, 0,05M Tris HC1, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA. Denne fraksjonen ble deretter applisert på en kolonne av S-Sepharose Fast Flow (1,5 x 10 cm) som er blitt ekvilibrert med buffer B (0.05M Tris HC1, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA). Etter anvendelsen ble kolonnen vasket med to kolonnevolum buffer B. Det gjennomstrømmende og vaskefraksjonene ble oppsamlet. Strømningshastigheten av anvendelsen av vaskingen, var 1 ml/min.: og de oppsamlede fraksjonene var på 1 ml. For å identifisere fraksjonene inneholdende S0D-C33c, ble aliquoter av fraksjonene analysert ved elektroforese på 10% polyakrylamidgeler inneholdende SDS etterfulgt av farving med Coomas-sie-blå. Fraksjonene kan også analyseres ved Western blots ved anvendelse av et antistoff rettet mot SOD. FRaksjoner inneholdende S0D-C33c ble slått sammen.
Ytterligere rensning av S0D-C33c var på en Q-Sepharose-kolonne (1,5 x 5 cm) som ble ekvilibrert med buffer B. De sammenslåtte fraksjonene inneholdende S0D-C33c oppnådd etter kromatografi på S-Sepharose, ble applisert på kolonnen. Kolonnen ble deretter vasket med buffer B, og eluert med 60 ml av en gradient bestående av 0,0 til 0,4 M NaCl i buffer B. Strømningshastigheten for applikasjonen, vaskingen og elueringen var 1 ml/min.; og de oppsamlede fraksjonene var på 1 ml. Alle fraksjonene fra Q-Sepharose-kolonnen ble analysert som beskrevet for S-Sepharose-kolonnen. Toppen av S0D-C33c eluerte fra kolonnen ved omtrent 0,2 M NaCl.
S0D-C33c oppnådd fra Q-Sepharosekolonnen var mer enn omtrent 90% rent, som vurdert ved analyse på polyakrylamid-SDS-gelene og immunoblottingen ved anvendelse av et monoklonalt antistoff rettet mot humant SOD.
Eksempel 2: Syntese av HCV- antigen C100
HCV-antigen C100 inneholder sekvenser fra NS3 og NS4 domenene. De inneholder spesifikt aminosyrene 1569-1931 ifølge figur 1. Dette antigenet ble produsert i gjær. Et cDNA-fragment av en 1270 bp kodende for ovennevnte aminosyrer og med EcoRI-termini, ble dannet.
Konstruksjonen av en gjærekspresjonsvektor hvori dette fragmentet var kondensert direkte til S. cerevisiae ADH2/GAP-promoteren, ble oppnådd ved hjelp av en protokoll som innbefatter ampiifikasjon av C100 sekvens ved anvendelse av en PCR-metode, etterfulgt av ligering av den amplifiserte sekvensen inn i en kloningsvektor. Etter kloning ble C100-sekvensen spaltet ut, og med en sekvens som inneholdt ADH2/GAP-promoteren, ble den ligert til et større fragment av en gjærvektor for å tilveiebringe en gjærekspresjonsvektor.
PCR amplifikasjonen av C100 ble utført ved anvendelse av vektor pS3-56c^QQm som templat, og som var blitt lineærisert ved spaltning med Sali. pS3-56, som er et pBR322-derivat, inneholder en ekspresjonskassett som består av ADH2/GAPDH hybridgjærpromoteren oppstrøms for det humane superoksid-dismutasegenet, og en nedstrøms alfa faktor transkripsjons-terminator.
01igonukleotidprimerne anvendt for amplifikasjon ble konstruert for å lette kloningen inn i ekspresjonsvektoren, og for å innføre et translasjons-termineringskodon. Nye 5'-Hindlll og 3'-Sall-seter ble dannet med PCR-oligonukleotide-ne . 01igonukleotidet innholdende Sall-setet koder også for de doble termineringskodonene, TAA og TGA. 01igonukleotidet inneholdende HindiII-setet inneholder også en utranslatert ledersekvens avledet fra pgap63-genet, beliggende rett oppstrøms for AUG-kodonet. pEco63GAPDH-genet er beskrevet av Holland og Holland (1980) og av Kniskern et al. (1986). PCR-primersekvensene anvendt for den direkte ekspresjon av ClOOrn var:
Ampiifikasjon ved PCR, anvendelse av primere og templat, var med en Cetus-Perkin-Elmer PCR-kit, og ble utført ifølge forhandlerens instruksjoner. PCR-betingelsene var 29 sykluser ved 94°C i ett minutt, 37°C i 2 minutter, 72°C i 3 minutter; og den endelige inkubasjonen var ved 72°C i 10 minutter. DNA kan bli lagret ved 4°C eller -20°C overnatt.
Etter amplifikasjon ble PCR-produktene spaltet med Hindlll og Sali. Hovedproduktet med 1,1 kb ble renset ved elektroforese på en gel, og det eluerte rensede produktet ble ligert med et større Sall-Hindlll-fragment av pBR322. For å isolere riktige rekombinanter, ble kompetente HB101 celler transformert med rekombinante vektorer, og etter kloning ble de ønskede rekombinantene identifisert på grunnlag av den antatte størrelsen av Hindlll- Sall-fragmentene spaltet ut fra klonene. En av klonene som inneholdt et HindIII-SalI-fragment med riktig størrelse, ble betegnet pBR322/C100~d. Bekreftelse av at denne klonen inneholdet C100 ble utført ved direkte sekvensanalyse av HindIII-SalI-fragmentet.
Ekspresjonsvektoren som inneholdt C100, ble konstruert ved ligering av Hindlll-Sall-fragmentet fra pBR322/C100~d til et 13,1 kb BamHI-SalI-fragment av pBS24,l, og et 1369 bm BamHI-Hindlll-fragment inneholdende ADH2/GAP promoteren. (Sist-nevnte fragment er beskrevet i EPO 164.556). pBS24.1 vektoren er beskrevet i U.S.S.N. 382.805, inngitt 19. juli 1989. ADH2/GAP promoterfragmentet ble oppnådd ved spaltning av vektoren pPGAP/AG/Hindlll med Hindlll og BamHI, etterfulgt av rensing av 1369 bp fragmentet på en gel.
Kompetente HB101 celler ble transformert med de rekombinante vektorene; og riktige rekombinanter ble identifisert ved dannelse av et 2464 bp fragment og et 13,1 kb fragment dannet ved BamHI og Sali spaltning av de klonede vektorene. En av de klonede korrekte rekombinante vektorene ble betegnet pClOO-d#3.
For å uttrykke C100, ble kompetente celler av Saccharomyces cerevisiae stamme AB122 (MATa leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl-407 [cir-0] transformert med ekspresjonsvektor pClOO-d#3. De transformerte cellene ble sådd ut på URA-sorbitol , og individuelle transformanter ble deretter sådd ut på Leu-skåler.
Individuelle kloner ble dyrket i Leu-, ura- medium med 2% glukose ved 30° C i 24-36 timer. En liter gjaerekstrakt peptonmedium (YEP) inneholdnede 2% glukose, ble inokulert med 10 ml overnattkultur, og den resulterende kulturen ble dyrket ved 30°C ved en agitasjonsrate på 400 rpm og en utluftnings-rate av 1 1 luft pr. 11 medium pr. minutt (dvs. lvvm) i 48 timer. pH til mediet ble ikke kontrollert. Kulturen ble dyrket i en BioFlo II fermentor fremstilt av New Brunswick Science Corp. Etter fermentering ble cellene isolert og analysert for C100 ekspresjon.
Analyse for uttrykt C100 polypeptid av de transformerte cellene ble utført på de totale cellelysatene og råekstraktene fremstilt fra enkelte gjørkolonier oppnådd fra Leu~ skålene. Cellelysatene og råekstraktene ble analysert ved elektroforese på SDS-polyakrylamidgeler og ved Western blots. Western-blotene ble probet med kaninpolyklonate antistoffer rettet mot SOD-C100 polypeptid uttrykt i gjær. Den ventede størrelsen til C100 polypeptidet er 364 aminosyrer. Ved gelanalyse har det uttrykte polypeptidet en MWr på 39,9K.
Begge de analytiske metodene demonstrerer at de uttrykte C100 polypeptidet var tilstede i totale cellelysater, men var fraværende fra råekstraktene. Disse resultatene foreslår at det uttrykte C100 polypeptidet kan være uoppløselig.
Eksempel 3: Ekspresjon av HCV- antigen S2
HCV-antigen S2 inneholder en sekvens fra den hydrofobe N-terminusen til S-domenen. Det innbefatter aminosyrene 199-328 ifølge figur 1.
Protokollen for konstruksjon av ekspresjonsvektoren kodende for S2-polypeptidet og for dets ekspresjon i gjær, var analog med den som ble anvendt for ekspresjon av C100 polypeptidet, beskrevet i eksempel 2.
Templatet for PCR-reaksjonen var vektoren pBR322/Pil4a, som var blitt lineærisert ved spaltning med Hindlll. Pil4a er en cDNA-klon som koder for aminosyrene 199-328.
01igonukleotidene anvendt som primere for amplifikasjonen ved PCR av den S2-kodende sekvensen var som følger.
For 5'-regionen av S2-sekvensen:
og for 3'-regionen til S2-sekvensen:
Primeren for 5'-regionen introduserer et Hindlll-sete og et ATG startkodon inn i det amplifiserte produktet. Primeren for 3'-regionen introduserer translasjons-stoppkodoner og et Sall-sete inn i det amplifiserte produktet.
PCR-betingelsene var 29 sykluser ved 94°C i 1 minutt, 37°C i 2 minutter, 72°C i 3 minutter og den endelige inkubasjon var ved 72°C i 10 minutter.
Hovedproduktet ifølge PCR-reaksjonen var et 413 bp fragment, og ble renset på gel. Det rensede fragmentet ble ligert til det store fragmentet oppnådd fra pBR322 spaltet med Hindlll og Sali fragmentet, for tilveiebringing av plasmidet pBR322/S2d.
Ligering av 413 bp Hindlll-Sall S2-fragmentet med 1,36 kb BamHI-Hindlll fragmentet inneholdende ADH2/GAP-promoteren, og med det. store BamHI-SalI-fragmentet av gjærvektoren pBS24,l ga de rekombinante vektorene, som ble klonet. Korrekte rekombinante vektorer ble identifisert ved tilstedeværelse av et 1,77 kb-fragment etter spaltning med BamHI og Sali. En ekspresjonsvektor konstruert fra den amplifiserte sekvensen, og inneholdende sekvensen kodende for S2 koblet direkte til ADH2/GAP-promoteren er identifisert som pS2d#9.
Eksempel 4: Syntese av HCV C- antigen
HCV-antigen C22 er fra C-domenen. Det omfatter aminosyrene 1-122 ifølge figur 1.
Protokollen for konstruksjonen av ekspresjonsvektoren kodende for C-polypeptid og for ekspresjonen i gjær, var analog med den som ble anvendt for ekspresjon av C100 polypeptidet beskrevet ovenfor, med unntagelse av følgende.
Templatet for PCR-reaksjonen var pBR322/Ag30a som var blitt lineærisert med Hindlll. Ag30 er en cDNA-klon som koder for aminosyrene 1-122. 01igonukleotidene anvendt som primere for ampiifikasjon av PCR av den C-kodende sekvensen var følgende.
For 5'-regionen av C-sekvensen:
for 3'-regionen av C-sekvensen:
Primeren for 5'-regionen innfører et Hindlll-sete inn i det amplifiserte produktet, og primeren for 3'-regionen innfører translasjonsstoppkodoner og et Sall-sete. PCR ble kjørt i 29 sykluser ved 94°C i 1 minutt, 37°C i 2 minutter, 72°C i 3 minutter og den siste inkubasjonen var ved 72°C i 10 minutter.
Hovedproduktet fra PCR-amplifikasjonen er et 381 bp polynuk-leotid. Ligering av dette fragmentet med Sall-Hindlll store Sall-Hindlll fragmentet til pBR322 ga plasmidet pBR322/C2.
Ligering av 381 bp Hindlll-Sall C-kodende fragmentet spaltet fra pBR322/C2 med 1,36 kb BamHI-HindiII-fragmentet inneholdende ADH2/GAP promoteren, og med det store BamHI-SalI fragmentet fra gjærvektoren pBS24,l ga de rekombinante vektorene, som ble klonet. Riktig rekombinante vektorer ble identifisert ved tilstedeværelsen av et 1,74 kb-fragment etter spaltning med BamHI og Sali. En ekspresjonsvektor konstruert fra den amplifiserte sekvensen og inneholdende sekvensen kodende for C koblet direkte til ADH2/GAP-promoteren er identifisert som pC22.
Analyse for uttrykt C-polypeptid ved hjelp av de transformerte cellene, ble utført på totale cellelysater og rå-ekstrakter fremstilt fra enkelte gjærkolonier oppnådd fra Leu~ skålene. Cellelysatene og råekstraktene ble analysert ved elektroforese på SDS-polyakrylamidgeler. C-polypeptidet er ventet å ha 122 aminosyrer og ved gelanalyse har det uttrykte polypeptidet en MWr på omtrent 13,6 Kd.
Eksempel 5: Syntese av NS5- polypeptid
Dette polypeptidet inneholder sekvensen fra N-terminusen av NS5-domenen. Det innbefatter spesifikt aminosyrene 2054 til 2464 ifølge figur 1. Protokollen for konstruksjonen av ekspresjonsvektoren kodende for NS5 polypeptidet og for ekspresjonen derav, var analog med den som ble anvendt for ekspresjon av C33c (se eksempel 1).
Eksempel 6: Radioimmunanalyse ( RIA) for antistoffer mot HCV
HCV-antigenene ifølge eksemplene 1-5 ble testet i et RIA-format for deres evne til å detektere antistoffer mot HCV i serum fra individer klinisk diagnostisert å ha HCV (Non-A, Non-B) og i serum fra blod gitt fra betalte blodgivere.
RIA var basert på prosedyren til Tsu og Herzenberg (1980) i SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOOGY (W.H. Freeman & Co.), s. 373-391. Mikrotiterskåler (Immulon 2, Removawell strips) blir belagt med renset HCV-antigen. De belagte skålene blir inkubert med serumprøver eller hensiktsmessige kontroller. I løpet av inkubasjonen blir antistoff, om tilstede, immunologisk bundet til fastfaseantigenet. Etter fjerning av det ubundete materialet og vasking av mikrotiterskålene, blir komplekser av humant antistoff-NANBV antigen detektert ved inkubasjon med <125>I-merket saue-antihumant immunoglobulin. Ubundet merket antistoff blir fjernet ved utsugning, og skålene blir vasket. Radioaktiviteten i de individuelle brønnene blir bestemt, og mengden av bundet humant anti-HCV-antistoff er proporsjonalt med radioaktiviteten i brønnen.
100 pl aliquoter inneholdende 0,1 til 0,5 jjg av HCV-antigenet 1 0,125 M Na boratbuf f er, pH 8,3, 0,075 M NaCl (BBS) ble tilsatt til hver brønn av en mikrotiterskål (Dynatech Immulon
2 Removawell Strips). Skålene ble inkubert ved 4°C overnatt i et fuktekammer, og deretter ble antigenoppløsningen fjernet, og brønnene vasket tre ganger med BBS inneholdende 0,02% Triton X-100 (BBST). For å forhindre uspesifikk binding, ble brønnene belagt med bovint serumalbumin (BSA) ved tilsetning av 100 pl av en 5 mg/ml oppløsning (BSA) i BBS etterfulgt av inkubasjon i romtemperatur i 1 time; og etter denne inkubasjonen ble BSA-oppløsningen fjernet. Antigenene i de belagte brønnene ble reagert med serum ved tilsetning av 100 pl serumprøver fortynnet 1:100 i 0,01M Na fosfatbuffer, pH 7,2, 0,15 M NaCl (PBS) inneholdende 10 mg/ml BSA, og inkubering av de seruminneholdende brønnene ilt ved 37°C. Etter inkubasjon ble serumprøvene fjernet ved utsuging, og brønnene ble vasket 5 ganger med BBST. Antistoff bundet til antigenet ble bestemt ved binding av <15>1-merket F' (ab)2 saue-antihumant IgG til de belagte brønnene. Aliquoter av 100 pl av den merkede prøven (spesifikk aktivitet 5-20 mikrokurier/Mg) ble tilsatt til hver brønn, og skålene ble inkubert ved 37"C i 1 time, etterfulgt av fjerning av overskuddsprobe ved utsugning og 5 vaskinger med BBST. Mengden av radioaktivitet bundet til hver brønn, ble bestemt ved telling i en teller som detekterer gammabestrålning.
Tabell 1 nedenfor presenterer resultatene av testene på serumet fra individer diagnostisert å ha HCV.
Ifølge disse resultatene reagerte ikke noe enkelt antigen med alle sera. C22 og C33c var det mest reaktive og S2 reagerte med noe serum fra noen antatte, akutte HCV-tilfeller som ikke noe annet antigen reagerte med. Basert på disse resultatene er kombinasjonen av to antigener som ville tilveiebringe det største deteksjonsområdet C22 og C33c. Dersom man ønsker å detektere et maksimum av akutte infeksjoner, vil S2 være inkludert i kombinasjonen.
Tabell 2 nedenfor presenterer resultatene av testing av betalte blodgivere.
Resultatene ifølge betalte givere, bekrefter generelt resultatene fra serumet til de infiserte individene.
Eksempel 7: ELISA- bestemmelser av HCV- antistoffer ved anvendelse av kombinasjoner av HCV- antigener.
Skåler belagt med en kombinasjon av C22 og C33c antigener blir preparert som følger. En oppløsning inneholdende beleggsbuffer (50 mM Na borat, pH 9,0), 21 ml skål, BSA (25 ug/ml), C22 og C33c (2,50 pg/ml hver) blir preparert like før tilsetning til Removeawell Immulon I skålene (Dynatech Corp.). Etter blanding i 5 minutter, blir 0,2 ml/brønn av oppløsningen tilsatt til skålene, de blir dekket og inkubert i 2 timer ved 37°C, og deretter blir oppløsningen fjernet ved utsugning. Brønnene blir vasket én gang med 400 pl vaskebuffer (100 mM natriumfosfat) , pH 7,4, 140 mM natr iumklorid, 0,1% (v/v) kasein, 1% (v/v) Triton x-100, 0,01% (v/v) Thimerosal). Etter fjerning av vaskeoppløsningen blir 200 pl/brønn Postcoat oppløsning (10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM natriumklorid, 0,1% (v/v) kasein, 3% sukrose og 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)) tilsatt, og skålene blir løselig dekket for å forhindre avdampning, og blir latt stå ved romtemperatur i 30 minutter. Brønnene blir deretter utsuget for å fjerne oppløsningen, og lyofilisert tørr overnatt, uten hylleoppvarming. De preparerte skålene kan bli lagret ved 2-8°C i forseglede aluminiumbeholdere med dessikant (3 g Sorb-it® pakker).
For å utføre ELISA-bestemmelsen blir 20 pl serumprøve eller kontrollprøve tilsatt til en børnn inneholdende 200 pl prøvefortynningsmiddel (100 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM natriumklorid, 1 mM EDTA, 0,1% (v/v) kasein, 0,01% (v/v) timerosal , 1% (v/v Triton X-100, 100 pg/ml gjærekstrakt). Skålene blir forseglet og blir inkubert ved 37°C i to timer, og deretter blir oppløsningen fjernet ved utsugning og brønnene blir vasket tre ganger med 400 pl vaskebuffer (fosfatbuffret saltvann (PBS) inneholdende 0,05% Tween 20). De vaskede brønnene blir behandlet med 200 ul muse-anti-human IgG-pepperrot-peroksidase (HRP) konjugat innbefattet i en oppløsning av orto-konjugat fortynningsmiddel (10 mM natriumfosfat, pH 7,2, 150 mM natriumklorid, 50% (v/v) fetalt bovint serum, 1% (v/v) varmebehandlet hesteserum, 1 mM K3Fe(CNN)6, 0,05% (v/v) Tween 20, 0,02% (v/v) Thimerosal). Behandlingen utføres i 1 time ved 37° C og oppløsningen blir fjernet ved utsugning, og brønnene vasket tre ganger med 400 ml vaskebuffer, som også blir fjernet ved utsugning. For å bestemme mengden av bundet enzymkonjugat, blir 200 ul substratoppløsning (10 mg 0-fenylendiamin-dihydroklorid pr. 5 ml utviklingsoppløsning) tilsatt. Utviklingsoppløsningen inneholder 50 mM natriumsitrat justert til pH 5,1 med fosforsyre, og 0,6 pl/ml 30% HgC^- Skålene inneholdende substratoppløsningen blir inkubert i mørket i 30 minutter ved romtemperatur, og reaksjonene blir stoppet ved tilsetning av 50 pl/ml 4N svovelsyre og OD blir bestemt.
På lignende måte kan ELISA ved anvendelse av fusjonsproteinene til C22 og C33c, og C22, C33c, og S2 og kombinasjoner av C22 og C100, C22 og S2, C22 og et NS5-antigen, C22, C33c, og S2, og C22, C100, og S2 bli utført.
Modifikasjoner av ovennevnte metode for å utføre oppfinnelsen som er innlysende for fagfolk innenfor området molekylær biologi, immunologi og beslektede områder, skal inngå innenfor rammen av foreliggende krav.
Claims (10)
1.
Kombinasjon av hepatitt C virus (HCV) epitopesekvenser i en eller flere polypeptider fremstilt ved kjemisk syntese eller rekombinant ekspresjon, immobilisert på overflaten av en fast matrise egnet for deteksjon av HCV ved immunoanalyse, karakterisert ved at den omfatter: a) en første epitopesekvens fra C-domenen til HCV polyproteinet ; b) en andre epitopesekvens fra en andre domene av HCV-polyproteinet i det domenen er: i) et HCV-antigen omfattende NS3 domenen til HCV polyproteinet; ii) NS4 domenen til HCV polyproteinet; eller iii) NS5 domenen til HCV polyproteinet; og c) en tredje epitopesekvens fra en tredje domene av HCV polyproteinet i det domenen er: i) NS3 domenen til HCV polyproteinet; ii) NS4 domenen til HCV polyproteinet; eller iii) NS5 domenen til HCV polyproteinet;
1 det den tredje domenen er forskjellig fra den andre domenen; med den forutsetningen at kombinasjonen ikke er peptid pl med C100-3, peptidet p35 med C100-3 eller peptidet p99 med C100-3.
2 .
Kombinasjon ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre domenen er NS3.
3.
Kombinasjon ifølge krav 1, karakterisert ved at den den andre domenen er NS4.
4 .
Kombinasjon ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: a) en første epitopesekvens fra C domenen til HCV polyproteinet; b) en andre epitopesekvens fra NS3 domenen til HCV polyproteinet; og c) en tredje epitopesekvens fra NS4 domenen til HCV polyproteinet.
5 .
Kombinasjon ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den faste matrisen er overflaten av en mikrotiterplatebrønn, en kule eller en dyppinne.
6.
Kombinasjon ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at første, andre og tredje epitopesekvenser er innbefattet i første, andre og tredje polypeptider individuelt bundet til den faste matrisen.
7.
Kombinasjon ifølge krav 6, karakterisert ved at den faste matrisen er en dyppinne og polypeptidene er fordelt individuelt i et mønster slik at bindingen til første, andre og tredje polypeptider kan bli erkjente.
8.
Kombinasjon av hvilke som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at kombinasjonen er i form av et fusjonspolypeptid.
9.
Fremgangsmåte for detektering av antistoffer in vitro mot hepatitt C vimser (HCV) i en pattedyrlegemekomponent antatt å inneholde nevnte antistoffer, karakterisert ved å kontakte nevnte legemekomponent med kombinasjonen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8 under betingelser som muliggjør antistoff-antigen reaksjon og detektering av tilstedeværelse av immunkompleksene til nevnte antistoffer og nevnte polypeptidepitope sekvenser.
10.
Sett for å utføre en analyse for detektering av antistoffer mot hepatitt C antigen (HCV) i en pattedyrlegeme komponent antatt å inneholde nevnte antistoffer, karakterisert ved at det omfatter i pakket kombinasjon: a) kombinasjon av HCV-epitopesekvenser ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, b) standard kontroll reagenser; og c) instruksjoner for å utføre analysen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US50435290A | 1990-04-04 | 1990-04-04 | |
| PCT/US1991/002225 WO1991015771A1 (en) | 1990-04-04 | 1991-03-29 | Combinations of hepatitis c virus (hcv) antigens for use in immunoassays for anti-hcv antibodies |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO923839D0 NO923839D0 (no) | 1992-10-01 |
| NO923839L NO923839L (no) | 1992-11-19 |
| NO310241B1 true NO310241B1 (no) | 2001-06-11 |
Family
ID=24005897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19923839A NO310241B1 (no) | 1990-04-04 | 1992-10-01 | Kombinasjoner av hepatitt C-virus-(HCV)-antigener og fremgangsmåte for detektering av antistoffer og sett for utförelseav en analyse |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0693687B2 (no) |
| JP (1) | JP2733138B2 (no) |
| KR (1) | KR100206150B1 (no) |
| AT (2) | ATE182684T1 (no) |
| BG (1) | BG61291B1 (no) |
| BR (1) | BR9106309A (no) |
| CY (1) | CY1881A (no) |
| DE (2) | DE69131488T2 (no) |
| DK (2) | DK0450931T3 (no) |
| ES (2) | ES2134388T5 (no) |
| FI (1) | FI106317B (no) |
| GB (1) | GB2257784B (no) |
| GR (2) | GR3020964T3 (no) |
| HU (1) | HU217025B (no) |
| IE (1) | IE911105A1 (no) |
| IL (2) | IL97741A0 (no) |
| LT (1) | LT3808B (no) |
| LV (2) | LV10344B (no) |
| MY (1) | MY107499A (no) |
| NO (1) | NO310241B1 (no) |
| PL (1) | PL172133B1 (no) |
| RO (1) | RO109916B1 (no) |
| RU (1) | RU2130969C1 (no) |
| UA (1) | UA41266C2 (no) |
| WO (1) | WO1991015771A1 (no) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7166287B1 (en) | 1989-12-18 | 2007-01-23 | Glaxo Wellcome Inc. | Viral agent |
| LU87861A1 (fr) | 1989-12-18 | 1991-10-08 | Wellcome Found | Agent viral |
| KR940000755B1 (ko) * | 1990-02-16 | 1994-01-29 | 유나이티드 바이오메디칼 인코오포레이티드 | Hcv에 대한 항체 검출, hcv 감염의 진단 및 백신으로서의 그 예방에 특히 적합한 합성 펩티드 |
| US6194140B1 (en) * | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
| DE69132332T2 (de) * | 1990-04-06 | 2000-11-30 | Genelabs Tech Inc | Hepatitis c-virus-epitope |
| CA2049679C (en) * | 1990-08-24 | 2005-06-21 | Sushil G. Devare | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens |
| US6274148B1 (en) * | 1990-11-08 | 2001-08-14 | Chiron Corporation | Hepatitis C virus asialoglycoproteins |
| RO115446B1 (ro) * | 1990-11-08 | 2000-02-28 | Chiron Corp | Procedeu de obtinere a asialoglicoproteinelor purificate provenind de la virusul hepatitei c |
| US6007982A (en) * | 1990-12-14 | 1999-12-28 | Innogenetics N.V. | Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus |
| DK0644202T3 (da) * | 1990-12-14 | 1997-09-15 | Innogenetics Nv | Syntetiske antigener til påvisning af antistoffer imod hepatitis C virus |
| US5910404A (en) | 1990-12-14 | 1999-06-08 | Innogenetics N.V. | Synthetic antigens for the detection of antibodies to hepatitis C virus |
| DE4041304A1 (de) * | 1990-12-21 | 1992-06-25 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Von strukturproteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide, testkits, die diese polypeptide enthalten und impfstoffe gegen infektionen von hepatitis c-viren |
| US5574132A (en) * | 1991-04-05 | 1996-11-12 | Biochem Immunosystems Inc. | Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV) |
| CA2099883A1 (en) * | 1991-11-07 | 1993-05-08 | John A. Kink | Epitope mapping of the c33c region of hcv |
| WO1993010239A2 (en) * | 1991-11-21 | 1993-05-27 | Common Services Agency | Hepatitis-c virus testing |
| WO1993015207A2 (en) * | 1992-02-04 | 1993-08-05 | Viagene, Inc. | Hepatitis therapeutics |
| GB9203803D0 (en) * | 1992-02-21 | 1992-04-08 | Wellcome Found | A recombinant polypeptide |
| UA39944C2 (uk) * | 1992-07-07 | 2001-07-16 | Чірон Корпорейшн | Спосіб визначення ранньої сероконверсії у ссавця-хазяїна до вірусу гепатиту с і набір для використання в способі |
| US6153378A (en) * | 1992-10-16 | 2000-11-28 | Bionova Corporation | Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus |
| EP0593291A3 (en) * | 1992-10-16 | 1995-03-15 | Evernew Biotech Inc | Non-structural protein of the hepatitis C virus, as well as diagnostic procedure and test kit. |
| JP2778886B2 (ja) * | 1992-10-16 | 1998-07-23 | エバーニュー バイオテック インコーポレイティド | Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
| WO1994013164A1 (en) | 1992-12-10 | 1994-06-23 | Nike International Ltd. | Bonding of rubber to plastic in footwear |
| UA46707C2 (uk) | 1993-05-10 | 2002-06-17 | Чірон Корпорейшн | Спосіб типування вірусу гепатиту с (варіанти), набір поліпептидів (варіанти), реагент, що включає комбінацію поліпептидів, які містять типоспецифічні епітопи гепатиту с (варіанти) |
| DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
| JPH0862219A (ja) * | 1994-08-19 | 1996-03-08 | Dainabotsuto Kk | 還元型抗原に対する抗体アッセイ試薬及びそれを使用した測定方法 |
| JP3665371B2 (ja) * | 1994-08-31 | 2005-06-29 | 株式会社先端生命科学研究所 | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
| CA2172305A1 (en) * | 1995-03-30 | 1996-10-01 | Muneo Aoyama | Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides |
| WO1996037606A1 (en) * | 1995-05-22 | 1996-11-28 | Bionova Corporation | Compositions and methods for the diagnosis of, and vaccination against, hepatitis c virus (hcv) |
| FR2734639B1 (fr) * | 1995-05-26 | 1997-10-03 | Parteurop | Methode de pronostic de l'evolution d'une infection par le virus de l'hepatite c, et necessaire pour sa mise en oeuvre |
| FR2737209B1 (fr) | 1995-07-25 | 1997-09-19 | Bio Merieux | Peptide capable d'etre reconnu par des anticorps reconnaissant l'antigene c33 du virus de l'hepatite c |
| US6127116A (en) | 1995-08-29 | 2000-10-03 | Washington University | Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof |
| JP3715027B2 (ja) | 1996-05-07 | 2005-11-09 | シスメックス株式会社 | Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬 |
| US7338759B1 (en) | 1997-03-04 | 2008-03-04 | Washington University | HCV variants |
| US7049428B1 (en) | 1998-03-04 | 2006-05-23 | Washington University | HCV variants |
| PT1021719E (pt) * | 1997-09-22 | 2007-03-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Método para detecção de anticorpos numa amostra |
| AU6098900A (en) * | 1999-07-15 | 2001-02-05 | Bayer Corporation | The use of specific antibody titers to predict hepatic failure in people infected with hepatitis c virus |
| WO2001030812A2 (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-03 | Chiron Corporation | Activation of hcv-specific t cells |
| CA2390082C (en) * | 1999-11-24 | 2010-06-29 | Chiron Corporation | Novel hcv non-structural polypeptide |
| US6986892B1 (en) | 1999-11-24 | 2006-01-17 | Chiron Corporation | Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides |
| ATE368221T1 (de) | 2000-06-15 | 2007-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunoassays für anti-hcv-antikörper |
| US7491808B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-02-17 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HCV non-structural protein mutants and uses thereof |
| US6680059B2 (en) | 2000-08-29 | 2004-01-20 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| AU9215101A (en) | 2000-08-17 | 2002-02-25 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| US7022830B2 (en) | 2000-08-17 | 2006-04-04 | Tripep Ab | Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene |
| US6858590B2 (en) | 2000-08-17 | 2005-02-22 | Tripep Ab | Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof |
| FR2839722A1 (fr) | 2002-05-17 | 2003-11-21 | Bio Merieux | Nouvelles compositions peptidiques et leur utilisation notamment dans la preparation de compositions pharmaceutiques actives contre le virus de l'hepatite c |
| JP4585314B2 (ja) | 2002-09-09 | 2010-11-24 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | Ｈｃｖアッセイ |
| JP4864891B2 (ja) | 2004-06-09 | 2012-02-01 | パサジャン リムーヴァル アンド ダイアグナスティック テクノロジーズ インコーポレイテッド | サンプルから標的因子を除去するためのデバイス及び方法 |
| JP2005274584A (ja) * | 2005-05-25 | 2005-10-06 | Sysmex Corp | Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬の製造方法 |
| JP4005093B2 (ja) * | 2005-05-25 | 2007-11-07 | シスメックス株式会社 | Ｃ型肝炎ウイルス感染症診断薬および抗ｈｃｖ抗体検出方法 |
| US7968697B2 (en) | 2005-05-25 | 2011-06-28 | Chrontech Pharma Ab | Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene |
| JP5188400B2 (ja) * | 2006-03-09 | 2013-04-24 | トランスジーン エス．エー． | Ｃ型肝炎ウイルスの非構造融合タンパク質 |
| US20080227111A1 (en) | 2007-03-16 | 2008-09-18 | Sysmex Corporation | Reagent kit and method for measuring hcv antibody |
| WO2009022236A2 (en) | 2007-08-16 | 2009-02-19 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| US20090214593A1 (en) | 2007-08-16 | 2009-08-27 | Tripep Ab | Immunogen platform |
| FR2984328B1 (fr) | 2011-12-20 | 2016-12-30 | Bio-Rad Innovations | Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c |
| WO2016069762A2 (en) * | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Abbott Laboratories | Subject anti-hcv antibody detection assays employing ns3 capture peptides |
| JP2018124277A (ja) * | 2017-02-02 | 2018-08-09 | 三洋化成工業株式会社 | 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US456637A (en) | 1891-07-28 | Fence | ||
| US390599A (en) | 1888-10-02 | Tool for weaver s use | ||
| SE7804231L (sv) | 1978-04-14 | 1979-10-15 | Haessle Ab | Magsyrasekretionsmedel |
| US4870008A (en) * | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| CA1341482C (en) † | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
| US4751180A (en) * | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
| JPH02500880A (ja) * | 1987-11-18 | 1990-03-29 | カイロン コーポレイション | Ｎａｎｂｖの診断用薬およびワクチン |
| JP2656995B2 (ja) † | 1989-03-17 | 1997-09-24 | カイロン コーポレイション | Ｎａｎｂｖの診断用薬 |
| LU87861A1 (fr) * | 1989-12-18 | 1991-10-08 | Wellcome Found | Agent viral |
| AU638304B2 (en) † | 1989-12-22 | 1993-06-24 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay |
-
1991
- 1991-03-29 RO RO92-01275A patent/RO109916B1/ro unknown
- 1991-03-29 KR KR1019920702437A patent/KR100206150B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-03-29 UA UA93004190A patent/UA41266C2/uk unknown
- 1991-03-29 BR BR919106309A patent/BR9106309A/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-03-29 PL PL91296329A patent/PL172133B1/pl unknown
- 1991-03-29 RU SU5053084A patent/RU2130969C1/ru active
- 1991-03-29 WO PCT/US1991/002225 patent/WO1991015771A1/en active IP Right Grant
- 1991-03-29 HU HU9203146A patent/HU217025B/hu unknown
- 1991-03-29 JP JP3507636A patent/JP2733138B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-01 IL IL97741A patent/IL97741A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-04-01 IL IL170719A patent/IL170719A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-04-02 MY MYPI91000551A patent/MY107499A/en unknown
- 1991-04-03 EP EP95114016A patent/EP0693687B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 AT AT95114016T patent/ATE182684T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-03 IE IE110591A patent/IE911105A1/en unknown
- 1991-04-03 DK DK91302910.4T patent/DK0450931T3/da active
- 1991-04-03 DK DK95114016T patent/DK0693687T4/da active
- 1991-04-03 AT AT91302910T patent/ATE139343T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-03 DE DE69131488T patent/DE69131488T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 ES ES95114016T patent/ES2134388T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 ES ES91302910T patent/ES2088465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 EP EP91302910A patent/EP0450931B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-03 DE DE69120138T patent/DE69120138T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-09-28 GB GB9220480A patent/GB2257784B/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-28 FI FI924349A patent/FI106317B/fi active
- 1992-10-01 NO NO19923839A patent/NO310241B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-10-02 BG BG96943A patent/BG61291B1/bg unknown
-
1993
- 1993-05-31 LV LVP-93-438.1A patent/LV10344B/en unknown
- 1993-05-31 LV LV930038D patent/LV10344A/en unknown
- 1993-12-30 LT LTIP1747A patent/LT3808B/lt not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-05 CY CY188196A patent/CY1881A/xx unknown
- 1996-09-05 GR GR960402319T patent/GR3020964T3/el unknown
-
1999
- 1999-09-29 GR GR990402455T patent/GR3031361T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO310241B1 (no) | Kombinasjoner av hepatitt C-virus-(HCV)-antigener og fremgangsmåte for detektering av antistoffer og sett for utförelseav en analyse | |
| US5683864A (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
| US5712087A (en) | Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens | |
| JP4837229B2 (ja) | 抗ｈｃｖ抗体についてのイムノアッセイ | |
| US7056658B2 (en) | Multiple epitope fusion protein | |
| US6596476B1 (en) | Hepatitis C assay | |
| JP3188717B2 (ja) | Ｃ型肝炎アッセイ | |
| NO321185B1 (no) | In vitro fremgangsmate for deteksjon av antistoffer som oppstar relativt tidlig i lopet av infeksjonsforlopet i en kroppsdel hos en mammalsk vert mot hepatitt C virus (HCV), samt et sett for anvendelse i nevnte fremgangsmate. | |
| EP0642666B1 (en) | Hepatitis c assay | |
| JP2005139204A (ja) | Ｈｉｖウイルスに対して免疫反応性である抗体の検出用の合成抗原 | |
| AU2012356512A1 (en) | Method for detecting an infection by the hepatitis C virus | |
| Wienhues et al. | Characterization of a linear epitope in the nonstructural region 4 of hepatitis C virus with reactivity to seroconversion antibodies | |
| AU639560C (en) | Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies | |
| KR100605322B1 (ko) | 씨형 간염 바이러스 항-코아 단백질 항체 진단에 유용한민감도 높은 항원성 에피토프 | |
| PT97247B (pt) | Processo de preparacao de combinacoes de antigenios do virus da hepapite c (hcv) para uso em imunoensaios para anticorpos anti-hcv |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |