JP3475183B2 - Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）の非構造タンパク質３（ＮＳ３）領域からのポリ
ペプチド、かかるペプチドをコードする核酸並びに免疫
学的試験方法における抗原として又はヘリカーゼタンパ
ク質としてのこのポリペプチドの使用に関する。
ＣＶ）の非構造タンパク質３（ＮＳ３）領域からのポリ
ペプチド、かかるペプチドをコードする核酸並びに免疫
学的試験方法における抗原として又はヘリカーゼタンパ
ク質としてのこのポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】非Ａ非Ｂ肝炎といわれる病気は、多くの
場合Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされ
る。ＨＣＶはそのゲノムが約９から10,000個の塩基から
成る一本鎖被包性の(encapsulated)ＲＮＡウイルスであ
る。このゲノムは、構造タンパク質（コア及びエンベロ
ープタンパク質）並びに非構造タンパク質をコードす
る。ＨＣＶの非構造タンパク質３（ＮＳ３）領域は、プ
ロテアーゼ及びヘリカーゼを含む。プロテアーゼ活性
は、ＮＳ３領域の第三アミノ末端(amino terminal thir
d)に存在する。
場合Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされ
る。ＨＣＶはそのゲノムが約９から10,000個の塩基から
成る一本鎖被包性の(encapsulated)ＲＮＡウイルスであ
る。このゲノムは、構造タンパク質（コア及びエンベロ
ープタンパク質）並びに非構造タンパク質をコードす
る。ＨＣＶの非構造タンパク質３（ＮＳ３）領域は、プ
ロテアーゼ及びヘリカーゼを含む。プロテアーゼ活性
は、ＮＳ３領域の第三アミノ末端(amino terminal thir
d)に存在する。
【０００３】ＨＣＶの部分ヌクレオチド配列はヨーロッ
パ特許出願第318 216号明細書に開示されている。この
出願はのためのＨＣＶからの核酸フラグメント又はポリ
ペプチドフラグメントの診断試験及び治療処置への使用
を特許請求している。
パ特許出願第318 216号明細書に開示されている。この
出願はのためのＨＣＶからの核酸フラグメント又はポリ
ペプチドフラグメントの診断試験及び治療処置への使用
を特許請求している。
【０００４】ヨーロッパ特許出願第450 931号明細書
は、ＨＣＶの完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を開
示している。さらに、Ｃドメインからの第１のＨＣＶ抗
原及び非構造ドメインＮＳ３，ＮＳ４又はＮＳ５及びエ
ンベロープドメインＳの１つからの少なくとも１個の他
のＨＣＶ抗原を含む合成ＨＣＶ抗原の組み合わせが記載
されている。ドメインＮＳ３からの好適な抗原は、ヨー
ロッパ特許出願第450 931号明細書の第１図に示される
ＨＣＶゲノムのアミノ酸1192から1457を含むＣ３３とい
われる抗原である。
は、ＨＣＶの完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を開
示している。さらに、Ｃドメインからの第１のＨＣＶ抗
原及び非構造ドメインＮＳ３，ＮＳ４又はＮＳ５及びエ
ンベロープドメインＳの１つからの少なくとも１個の他
のＨＣＶ抗原を含む合成ＨＣＶ抗原の組み合わせが記載
されている。ドメインＮＳ３からの好適な抗原は、ヨー
ロッパ特許出願第450 931号明細書の第１図に示される
ＨＣＶゲノムのアミノ酸1192から1457を含むＣ３３とい
われる抗原である。
【０００５】国際特許出願第WO92/11370号は、ＨＣＶゲ
ノムからの種々のポリペプチドのクローニング及び配列
決定並びに試験キットにおける外来タンパク質部分のな
いこれらのポリペプチドの使用及びワクチンとしてのこ
れらのポリペプチドの使用に関する。寄託番号6847で
“ドイッチェ ザムルング フューア ミクロオルガニ
ズメン ウント ツェルクルツーレン ＧｍｂＨ，マッ
シェルオーデル ベーク１ｂ，38124 ブラウンシュバイ
ク，ＢＲＤ（ＤＳＭ) ”に、この出願に関連して寄託さ
れたクローンＮＳ−３は、ＨＣＶのＮＳ３領域からの 5
27個のアミノ酸のポリペプチドに関する遺伝子情報を含
んでいる。
ノムからの種々のポリペプチドのクローニング及び配列
決定並びに試験キットにおける外来タンパク質部分のな
いこれらのポリペプチドの使用及びワクチンとしてのこ
れらのポリペプチドの使用に関する。寄託番号6847で
“ドイッチェ ザムルング フューア ミクロオルガニ
ズメン ウント ツェルクルツーレン ＧｍｂＨ，マッ
シェルオーデル ベーク１ｂ，38124 ブラウンシュバイ
ク，ＢＲＤ（ＤＳＭ) ”に、この出願に関連して寄託さ
れたクローンＮＳ−３は、ＨＣＶのＮＳ３領域からの 5
27個のアミノ酸のポリペプチドに関する遺伝子情報を含
んでいる。
【０００６】森らは（日本，J. Cancer Res. 83 (199
2), 264-268)、抗原としてウイルスタンパク質を使用し
て血中におけるウイルス抗体を検出することによるＨＣ
Ｖ感染の診断学的検出を記載している。これらのＨＣＶ
タンパク質は、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク
質として大腸菌内で発現される。ＨＣＶゲノムの第1295
番目から1541番目のアミノ酸を含むＮＳ３領域からのタ
ンパク質は、高い感受性を示した。しかしながら、この
融合タンパク質の欠点は、融合タンパク質部分との交差
反応が生じ、これが試験反応の特異性を減少させること
である。
2), 264-268)、抗原としてウイルスタンパク質を使用し
て血中におけるウイルス抗体を検出することによるＨＣ
Ｖ感染の診断学的検出を記載している。これらのＨＣＶ
タンパク質は、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク
質として大腸菌内で発現される。ＨＣＶゲノムの第1295
番目から1541番目のアミノ酸を含むＮＳ３領域からのタ
ンパク質は、高い感受性を示した。しかしながら、この
融合タンパク質の欠点は、融合タンパク質部分との交差
反応が生じ、これが試験反応の特異性を減少させること
である。
【０００７】血中におけるＨＣＶ試験は、試験における
高度の特異性及び感受性を必要とする。さらに、試験で
使用される抗原は高収率で発現可能であり、かつ安定で
なければならない。ＨＣＶゲノムからの既知の抗原は、
上述の要件の１つ又は幾つかを満足しないという欠点を
有する。
高度の特異性及び感受性を必要とする。さらに、試験で
使用される抗原は高収率で発現可能であり、かつ安定で
なければならない。ＨＣＶゲノムからの既知の抗原は、
上述の要件の１つ又は幾つかを満足しないという欠点を
有する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】このため、本発明の目
的は、上記の公知技術の欠点が少なくとも部分的に除か
れ、特に既知の抗原に比較して、一層高い特異性及び感
受性を有し、高収率で発現可能でありかつ安定である、
ＨＣＶゲノムからのポリペプチドを提供することであ
る。
的は、上記の公知技術の欠点が少なくとも部分的に除か
れ、特に既知の抗原に比較して、一層高い特異性及び感
受性を有し、高収率で発現可能でありかつ安定である、
ＨＣＶゲノムからのポリペプチドを提供することであ
る。
【０００９】
【発明を解決するための手段】この目的は、Ｃ型肝炎ウ
イルスのアミノ酸1207±10から1488±10から成り、20未
満の、好ましくは15未満の外来アミノ酸を有するポリペ
プチドにより達成される。本発明のポリペプチドは、ヨ
ーロッパ特許出願(EP-A)第450 931号明細書の第１図で
言及されている番号付与において、好適には1207±５か
ら1488±５、特に好適には1207±２から、1488±２、そ
して最も好適には1207から1488のＣ型肝炎ウイルスのア
ミノ酸を含有する。
イルスのアミノ酸1207±10から1488±10から成り、20未
満の、好ましくは15未満の外来アミノ酸を有するポリペ
プチドにより達成される。本発明のポリペプチドは、ヨ
ーロッパ特許出願(EP-A)第450 931号明細書の第１図で
言及されている番号付与において、好適には1207±５か
ら1488±５、特に好適には1207±２から、1488±２、そ
して最も好適には1207から1488のＣ型肝炎ウイルスのア
ミノ酸を含有する。
【００１０】本発明のポリペプチドは、任意のＨＣＶ単
離物、例えばヨーロッパ特許出願第450 931号明細書に
記載されているようなヌクレオチド配列を有するＨＣＶ
単離物に由来することができる。しかしながら、好適に
はポリペプチドは、寄託番号DSM 6847で“ドイッチェ
ザムルング フォン ミクロオルガニズメン ウントツ
ェルクルツーレン ＧｍｂＨ”(ＤＳＭ), マッシェルオ
ーデル ベーク １b, 38124ブラウンシュバイクに寄託
され国際出願WO92/11370にクローンＮＳ３と記載されて
いるＨＣＶ単離物に由来する。本発明のポリペプチド
は、特に好ましくは、ベクターｐＵＣ−Ｄ２６の組換え
発現により得ることができる。
離物、例えばヨーロッパ特許出願第450 931号明細書に
記載されているようなヌクレオチド配列を有するＨＣＶ
単離物に由来することができる。しかしながら、好適に
はポリペプチドは、寄託番号DSM 6847で“ドイッチェ
ザムルング フォン ミクロオルガニズメン ウントツ
ェルクルツーレン ＧｍｂＨ”(ＤＳＭ), マッシェルオ
ーデル ベーク １b, 38124ブラウンシュバイクに寄託
され国際出願WO92/11370にクローンＮＳ３と記載されて
いるＨＣＶ単離物に由来する。本発明のポリペプチド
は、特に好ましくは、ベクターｐＵＣ−Ｄ２６の組換え
発現により得ることができる。
【００１１】配列番号１は本発明のポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す。アミノ酸１〜13は外来アミノ酸であ
る。アミノ酸14〜295はＨＣＶ起源である。本発明のポ
リペプチドは、特に好ましくは配列番号１及び２に示さ
れているアミノ酸配列のアミノ酸14〜295又は少なくと
も90％がこれに相同であるアミノ酸配列を含む。
ノ酸配列を示す。アミノ酸１〜13は外来アミノ酸であ
る。アミノ酸14〜295はＨＣＶ起源である。本発明のポ
リペプチドは、特に好ましくは配列番号１及び２に示さ
れているアミノ酸配列のアミノ酸14〜295又は少なくと
も90％がこれに相同であるアミノ酸配列を含む。
【００１２】本発明は、また、少なくとも１個のマーカ
ー基を含む先に定義したポリペプチドに関する。試験シ
ステムで検出できるすべての既知のマーカー基、例えば
直接又は間接的に検出しうるマーカー基が、マーカー基
として考慮される。これに関連して、直接に検出しうる
マーカー基とは、直接に検出しうる信号、即ち放射性
基、酵素基、発光基、金属複合体等を生成する基として
理解される。一方、マーカー基は、順番に信号発生基を
有する適当な結合パートナー（ストレプトアビジン、ア
ビジン又は抗−ハプテン抗体）と反応して検出しうる、
間接的に検出できる基、例えばビオチン又はハプテン基
であってもよい。マーカー基は、既知の態様で例えば二
官能性スペーサーにより抗原に結合できる。マーカー基
をペプチド抗原に結合させるためのかかる方法は、免疫
学の領域における当業者に知られており、ここで詳細に
記載する必要はない。
ー基を含む先に定義したポリペプチドに関する。試験シ
ステムで検出できるすべての既知のマーカー基、例えば
直接又は間接的に検出しうるマーカー基が、マーカー基
として考慮される。これに関連して、直接に検出しうる
マーカー基とは、直接に検出しうる信号、即ち放射性
基、酵素基、発光基、金属複合体等を生成する基として
理解される。一方、マーカー基は、順番に信号発生基を
有する適当な結合パートナー（ストレプトアビジン、ア
ビジン又は抗−ハプテン抗体）と反応して検出しうる、
間接的に検出できる基、例えばビオチン又はハプテン基
であってもよい。マーカー基は、既知の態様で例えば二
官能性スペーサーにより抗原に結合できる。マーカー基
をペプチド抗原に結合させるためのかかる方法は、免疫
学の領域における当業者に知られており、ここで詳細に
記載する必要はない。
【００１３】本発明のポリペプチドは好ましくは１から
12、特に好ましくは３から７個のマーカー基を有する。
12、特に好ましくは３から７個のマーカー基を有する。
【００１４】加えて、本発明はシステイン残基から派生
する１又は数個のスルフヒドリル基が共有結合的に修飾
された形態で存在する上述のポリペプチドに関する。適
当な共有結合的に修飾する基の例は、マレイミドジオキ
サオクチルアミン（ＭＡＤＯＯ）、Ｎ−メチル−マレイ
ンイミド（ＮＭＭ）、ヨード酢酸及びヨードアセトアミ
ドである。共有結合のシステイン修飾は、特に高度に特
異的な免疫反応性を生ずる。
する１又は数個のスルフヒドリル基が共有結合的に修飾
された形態で存在する上述のポリペプチドに関する。適
当な共有結合的に修飾する基の例は、マレイミドジオキ
サオクチルアミン（ＭＡＤＯＯ）、Ｎ−メチル−マレイ
ンイミド（ＮＭＭ）、ヨード酢酸及びヨードアセトアミ
ドである。共有結合のシステイン修飾は、特に高度に特
異的な免疫反応性を生ずる。
【００１５】直接的に又は間接的に検出可能なマーカー
基は、特に好適にはポリペプチドのスルフヒドリル基に
共有結合している。スルフヒドリル基にカップリングす
るためのＳＨ−反応性二官能性リンカーの例は、マレイ
ミドプロピルアミン（ＭＰ）、マレイミドエチルアミン
（ＭＥＡ）及びマレイミドジオキサオクチルアミン（Ｍ
ＡＤＯＯ）である。
基は、特に好適にはポリペプチドのスルフヒドリル基に
共有結合している。スルフヒドリル基にカップリングす
るためのＳＨ−反応性二官能性リンカーの例は、マレイ
ミドプロピルアミン（ＭＰ）、マレイミドエチルアミン
（ＭＥＡ）及びマレイミドジオキサオクチルアミン（Ｍ
ＡＤＯＯ）である。
【００１６】さらに、一又は数個のシステイン残基が他
の天然の又は人工のアミノ酸で置換された本発明のポリ
ペプチドを使用することが好ましいかもしれない。シス
テイン残基は好適には構造的に類縁のα−アミノ酸、例
えばセリン又はα−アミノ酪酸により置換される。シス
テイン置換は特に高い安定性をもたらす。
の天然の又は人工のアミノ酸で置換された本発明のポリ
ペプチドを使用することが好ましいかもしれない。シス
テイン残基は好適には構造的に類縁のα−アミノ酸、例
えばセリン又はα−アミノ酪酸により置換される。シス
テイン置換は特に高い安定性をもたらす。
【００１７】本発明のポリペプチドは、既知のポリペプ
チドに対して驚くべき利点を有する。ヨーロッパ特許出
願第450 931号明細書に記載されているＨＣＶ配列のア
ミノ酸残基1192から1457を含む抗原Ｃ３３に比較して、
本発明のポリペプチドは実質的に一層高い特異性を示
し、ネガティブ血清において誤ったポジティブは、統計
的に有意な一層低い値のを示す。国際出願第WO92/11370
号に記載されているＨＣＶ配列のアミノ酸第1007から15
34番の領域を含む抗原ＮＳ３に比べると、本発明のポリ
ペプチドは試験状態においてかなり高い安定性を有す
る。ＨＣＶのＮＳ３領域からのアミノ酸1227から1528を
有するポリペプチドに比較して、本発明のポリペプチド
は改善された発現効率及び一層高い感受性という利点を
有している。これらの利点の故に、本発明のポリペプチ
ドはＮＳ３領域からの全ての既知のＨＣＶ抗原よりも実
質的にすぐれている。
チドに対して驚くべき利点を有する。ヨーロッパ特許出
願第450 931号明細書に記載されているＨＣＶ配列のア
ミノ酸残基1192から1457を含む抗原Ｃ３３に比較して、
本発明のポリペプチドは実質的に一層高い特異性を示
し、ネガティブ血清において誤ったポジティブは、統計
的に有意な一層低い値のを示す。国際出願第WO92/11370
号に記載されているＨＣＶ配列のアミノ酸第1007から15
34番の領域を含む抗原ＮＳ３に比べると、本発明のポリ
ペプチドは試験状態においてかなり高い安定性を有す
る。ＨＣＶのＮＳ３領域からのアミノ酸1227から1528を
有するポリペプチドに比較して、本発明のポリペプチド
は改善された発現効率及び一層高い感受性という利点を
有している。これらの利点の故に、本発明のポリペプチ
ドはＮＳ３領域からの全ての既知のＨＣＶ抗原よりも実
質的にすぐれている。
【００１８】さらに、本発明は、本発明のポリペプチド
をコードする核酸に関する。かかる核酸の好適な例は、
ベクターｐＵＣ−Ｄ２６に外来性ＤＮＡを挿入したもの
である。
をコードする核酸に関する。かかる核酸の好適な例は、
ベクターｐＵＣ−Ｄ２６に外来性ＤＮＡを挿入したもの
である。
【００１９】配列番号１は、また、配列番号１及び２の
ポリペプチドをコードする本発明の核酸のヌクレオチド
配列を示す。ヌクレオチド40〜885は、ＨＣＶに由来す
るポリペプチドの領域をコードする。本発明の核酸は好
適には（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の
ヌクレオチド40−885又は（ｂ）遺伝子コードの縮重の
範囲内の（ａ）の配列に相当するヌクレオチド配列を含
む。
ポリペプチドをコードする本発明の核酸のヌクレオチド
配列を示す。ヌクレオチド40〜885は、ＨＣＶに由来す
るポリペプチドの領域をコードする。本発明の核酸は好
適には（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の
ヌクレオチド40−885又は（ｂ）遺伝子コードの縮重の
範囲内の（ａ）の配列に相当するヌクレオチド配列を含
む。
【００２０】本発明は、また、本発明の核酸の少なくと
も１個のコピーを含むベクターに関する。本発明のベク
ターは、好適には原核ベクター、即ち、原核宿主細胞内
での増殖に適当なベクターである。かかるベクターの例
は、サムブルックらの“モリキュラー クローニング．
ラボラトリー マニュアル，第２版., コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー プレス（1989) ”、
殊にその第１〜４章及び17章に示されている。本発明の
ベクターは特に好適には環状プラスミドである。本発明
の核酸は、好適には本発明のポリペプチドの発現を可能
とするプロモーター配列の制御下にあるベクター上に存
在する。本発明のベクターの好適な例は、ｐＵＣ−Ｄ２
６である。
も１個のコピーを含むベクターに関する。本発明のベク
ターは、好適には原核ベクター、即ち、原核宿主細胞内
での増殖に適当なベクターである。かかるベクターの例
は、サムブルックらの“モリキュラー クローニング．
ラボラトリー マニュアル，第２版., コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー プレス（1989) ”、
殊にその第１〜４章及び17章に示されている。本発明の
ベクターは特に好適には環状プラスミドである。本発明
の核酸は、好適には本発明のポリペプチドの発現を可能
とするプロモーター配列の制御下にあるベクター上に存
在する。本発明のベクターの好適な例は、ｐＵＣ−Ｄ２
６である。
【００２１】さらに本発明は、少なくとも１個の本発明
の核酸のコピー又は本発明のベクターで形質転換された
細胞に関する。この細胞は好適には原核細胞、特に好適
にはグラム−陰性の原核細胞、そして最も好適には大腸
菌細胞である。
の核酸のコピー又は本発明のベクターで形質転換された
細胞に関する。この細胞は好適には原核細胞、特に好適
にはグラム−陰性の原核細胞、そして最も好適には大腸
菌細胞である。
【００２２】本発明のポリペプチドは、好ましくは免疫
学的試験方法における抗原として使用される。一方、ポ
リペプチドはまた、しかしながら、ヘリカーゼタンパク
質として、さらに、そのすぐれた抗原作用のゆえにＨＣ
Ｖ感染に対するワクチン製造のために使用できる。
学的試験方法における抗原として使用される。一方、ポ
リペプチドはまた、しかしながら、ヘリカーゼタンパク
質として、さらに、そのすぐれた抗原作用のゆえにＨＣ
Ｖ感染に対するワクチン製造のために使用できる。
【００２３】本発明は、さらに試料液中のＣ型肝炎ウイ
ルスに対する抗体を免疫学的に決定する方法に関し、こ
の方法は、試料液を少なくとも一種の本発明のポリペプ
チドとインキュベートし、上記抗体をポリペプチドへの
結合を介して検出することによって特徴づけられる。こ
の検出方法は、いずれかの既知の試験方式を使用して、
例えば単一の反応相を有する均一のイムノアッセイ又は
１以上の反応相を有する不均一イムノアッセイで実施さ
れ得る。不均一試験方式は、好適には抗体の存在が反応
性固相の存在時に検出される場合に使用される。
ルスに対する抗体を免疫学的に決定する方法に関し、こ
の方法は、試料液を少なくとも一種の本発明のポリペプ
チドとインキュベートし、上記抗体をポリペプチドへの
結合を介して検出することによって特徴づけられる。こ
の検出方法は、いずれかの既知の試験方式を使用して、
例えば単一の反応相を有する均一のイムノアッセイ又は
１以上の反応相を有する不均一イムノアッセイで実施さ
れ得る。不均一試験方式は、好適には抗体の存在が反応
性固相の存在時に検出される場合に使用される。
【００２４】この試験方式の１つの態様は、いわゆる二
重抗原架橋試験概念である。この方法において、試料液
は本発明の少なくとも２個のポリペプチド Ｐ１ 及び
Ｐ２とともにインキュベートされ、その際、ポリペプチ
ドＰ１ は（ａ）固相に結合するか又は（ｂ）固相に結
合しうる形態で存在し、ポリペプチドＰ２ はマーカー
基を保持する。試料液中の抗体は、固定された複合体、
即ち、固相に結合している複合体により、固相又は／及
び液相において、好適には固相において標識を測定する
ことにより検出される。
重抗原架橋試験概念である。この方法において、試料液
は本発明の少なくとも２個のポリペプチド Ｐ１ 及び
Ｐ２とともにインキュベートされ、その際、ポリペプチ
ドＰ１ は（ａ）固相に結合するか又は（ｂ）固相に結
合しうる形態で存在し、ポリペプチドＰ２ はマーカー
基を保持する。試料液中の抗体は、固定された複合体、
即ち、固相に結合している複合体により、固相又は／及
び液相において、好適には固相において標識を測定する
ことにより検出される。
【００２５】この試験方法では、好適には、試料液を精
製標識抗原Ｐ２ 及び精製固相抗原Ｐ１ と混合して標識
抗原、抗体及び固相−結合抗原より成る標識された不動
化複合体を得る。抗体を検出するための他の試験方式に
比較して、架橋試験方式は、ＩｇＭのような付加的な免
疫グロブリンのクラスが検出されること、及び特異性の
改善、即ち、抗−ＩｇＧ結合体との非特異的反応性が減
少して、その感受性が改善される。
製標識抗原Ｐ２ 及び精製固相抗原Ｐ１ と混合して標識
抗原、抗体及び固相−結合抗原より成る標識された不動
化複合体を得る。抗体を検出するための他の試験方式に
比較して、架橋試験方式は、ＩｇＭのような付加的な免
疫グロブリンのクラスが検出されること、及び特異性の
改善、即ち、抗−ＩｇＧ結合体との非特異的反応性が減
少して、その感受性が改善される。
【００２６】標識抗原Ｐ２ は、前述のように直接的に
又は間接的に検出可能なマーカー基を有する。固相抗原
Ｐ１ は、例えば二官能性のスペーサーを介して固体相
に直接結合しうる。しかしながら、Ｐ１ は好適には、
本発明のポリペプチドの及び特異的結合システムの反応
パートナーの固相中に存在する結合体である。特異的結
合システムの他の反応パートナーは、固相に結合して存
在する。かかる特異的結合システムの例は、ビオチン／
アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／
アンチビオチン、ハプテン／アンチハプテン、多糖体／
レクチン及び抗体又は抗体フラグメント及びこの抗体又
は抗体フラグメントに対する抗体である。抗体Ｐ１ は
好適にはビオチン結合体の形態にある。
又は間接的に検出可能なマーカー基を有する。固相抗原
Ｐ１ は、例えば二官能性のスペーサーを介して固体相
に直接結合しうる。しかしながら、Ｐ１ は好適には、
本発明のポリペプチドの及び特異的結合システムの反応
パートナーの固相中に存在する結合体である。特異的結
合システムの他の反応パートナーは、固相に結合して存
在する。かかる特異的結合システムの例は、ビオチン／
アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／
アンチビオチン、ハプテン／アンチハプテン、多糖体／
レクチン及び抗体又は抗体フラグメント及びこの抗体又
は抗体フラグメントに対する抗体である。抗体Ｐ１ は
好適にはビオチン結合体の形態にある。
【００２７】かかる二重抗原架橋試験において、本発明
のポリペプチド抗原は、ブランクにおける増大及び抗原
の集合による望ましくない信号／ノイズ比を回避するた
めに可溶形態で使用される。この目的のために、抗原は
適当な発現システム内で可溶な形態ですでに発現されて
いるか、又は可溶な形態での発現の後で、既知の方法で
インビトロにて再生される。さらに、共有結合で架橋結
合された分子の凝集物の形成を回避するために、免疫試
験は穏和な還元状態〔穏和な還元試薬、好適にはスルフ
ヒドリル試薬、好ましくはＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル）又はＤＴＥ（ジチオ−エリスリトール）を１ミリモ
ル／ｌから25ミリモル／ｌの濃度範囲で添加する〕で実
施することができ又は／及び好適には共有結合で修飾さ
れたスルフヒドリル基を有する抗原又は／及び少なくと
も部分的に置換されたシステイン残基を有する抗原が使
用される。
のポリペプチド抗原は、ブランクにおける増大及び抗原
の集合による望ましくない信号／ノイズ比を回避するた
めに可溶形態で使用される。この目的のために、抗原は
適当な発現システム内で可溶な形態ですでに発現されて
いるか、又は可溶な形態での発現の後で、既知の方法で
インビトロにて再生される。さらに、共有結合で架橋結
合された分子の凝集物の形成を回避するために、免疫試
験は穏和な還元状態〔穏和な還元試薬、好適にはスルフ
ヒドリル試薬、好ましくはＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル）又はＤＴＥ（ジチオ−エリスリトール）を１ミリモ
ル／ｌから25ミリモル／ｌの濃度範囲で添加する〕で実
施することができ又は／及び好適には共有結合で修飾さ
れたスルフヒドリル基を有する抗原又は／及び少なくと
も部分的に置換されたシステイン残基を有する抗原が使
用される。
【００２８】本発明のポリペプチド抗原は、ブランクに
おける増大及び抗原の凝集による好ましくない信号／ノ
イズ比を回避するために、二重抗原架橋試験のように可
溶な形態で使用される。架橋試験方式の詳細は、ヨーロ
ッパ特許出願第280 211号明細書に記載されている。本
明細書では、この開示を参考とする。 本発明のポリペ
プチドは、しかしながら、他の試験方式でも使用しう
る。この例は、固定された特異抗原に結合させて特異的
イノムグロブリンを認識すること及び第２の抗体との結
合体を介して間接的に検出することによる間接イムノア
ッセイである。本発明の方法のこの態様において、試料
液は（ａ）固体相に結合している又は（ｂ）固相に結合
することのできる形態で存在しているポリペプチドＰ１
とともにマーカー基を有するＰ１ に対しての他の抗体
とともにインキュベートされる。測定される抗体は固相
中で又は／及び液相中で、好適には固相中で標識を測定
することにより、間接的に検出される。この方法におい
ては、標識された抗体と固相に結合された抗原の固定さ
れた複合体により固相上で生成される信号は、試料液中
で測定されるべき抗体の濃度に間接的に比例する。
おける増大及び抗原の凝集による好ましくない信号／ノ
イズ比を回避するために、二重抗原架橋試験のように可
溶な形態で使用される。架橋試験方式の詳細は、ヨーロ
ッパ特許出願第280 211号明細書に記載されている。本
明細書では、この開示を参考とする。 本発明のポリペ
プチドは、しかしながら、他の試験方式でも使用しう
る。この例は、固定された特異抗原に結合させて特異的
イノムグロブリンを認識すること及び第２の抗体との結
合体を介して間接的に検出することによる間接イムノア
ッセイである。本発明の方法のこの態様において、試料
液は（ａ）固体相に結合している又は（ｂ）固相に結合
することのできる形態で存在しているポリペプチドＰ１
とともにマーカー基を有するＰ１ に対しての他の抗体
とともにインキュベートされる。測定される抗体は固相
中で又は／及び液相中で、好適には固相中で標識を測定
することにより、間接的に検出される。この方法におい
ては、標識された抗体と固相に結合された抗原の固定さ
れた複合体により固相上で生成される信号は、試料液中
で測定されるべき抗体の濃度に間接的に比例する。
【００２９】本発明は、さらに、少なくとも１つの本発
明のポリペプチドを含むＣ型肝炎ウイルスに対して向け
られた抗体を免疫的に測定するための試薬に関する。試
薬が二重抗原架橋試験で使用される場合は、試薬は好適
には少なくとも２個のポリペプチドＰ１ 及びＰ２ を含
んでおり、ここでポリペプチドＰ１ は（ａ）固体相に
結合しているか又は（ｂ）固相に結合可能な形態で存在
するものであり、ポリペプチドＰ２ はマーカー基を有
する。ポリペプチドＰ１ の固相への結合は、直接結合
により又は特異的な結合対手段、好ましくはストレプト
アビジン／アビジン及びビオチンのいずれかにより達成
できる。ポリペプチドＰ１ は、特に好ましくはビオチ
ン結合形態で存在する。
明のポリペプチドを含むＣ型肝炎ウイルスに対して向け
られた抗体を免疫的に測定するための試薬に関する。試
薬が二重抗原架橋試験で使用される場合は、試薬は好適
には少なくとも２個のポリペプチドＰ１ 及びＰ２ を含
んでおり、ここでポリペプチドＰ１ は（ａ）固体相に
結合しているか又は（ｂ）固相に結合可能な形態で存在
するものであり、ポリペプチドＰ２ はマーカー基を有
する。ポリペプチドＰ１ の固相への結合は、直接結合
により又は特異的な結合対手段、好ましくはストレプト
アビジン／アビジン及びビオチンのいずれかにより達成
できる。ポリペプチドＰ１ は、特に好ましくはビオチ
ン結合形態で存在する。
【００３０】もし間接的免疫試験において使用される場
合には、本発明の試薬は好ましくは（ａ）固相に結合し
た又は（ｂ）固相に結合しうる形態で存在するポリペプ
チドＰ１ とマーカー基を有するＰ１ に対しての抗体を
含む。本発明のポリペプチドに対する抗体の製造は、既
知の方法、即ち、実験動物を相応の抗体で免疫させ、こ
の実験動物からポリクローナル抗血清を分離することに
より実施される。代わりに、抗原に対するモノクローナ
ル抗体は、ケラー及びミルスタインの方法又はこの方法
の改良法により製造することができる。抗体フラグメン
ト又は抗体誘導体は、また、完全抗体に代えて使用でき
る。
合には、本発明の試薬は好ましくは（ａ）固相に結合し
た又は（ｂ）固相に結合しうる形態で存在するポリペプ
チドＰ１ とマーカー基を有するＰ１ に対しての抗体を
含む。本発明のポリペプチドに対する抗体の製造は、既
知の方法、即ち、実験動物を相応の抗体で免疫させ、こ
の実験動物からポリクローナル抗血清を分離することに
より実施される。代わりに、抗原に対するモノクローナ
ル抗体は、ケラー及びミルスタインの方法又はこの方法
の改良法により製造することができる。抗体フラグメン
ト又は抗体誘導体は、また、完全抗体に代えて使用でき
る。
【００３１】本発明のポリペプチドの応用の他の領域
は、ワクチンの製造である。このために、本発明のポリ
ペプチドは好適には精製された形態で製造され、次いで
ポリペプチド溶液又は懸濁液のいずれかであってもよい
注射可能な液体の形態とされる。ポリペプチドはまた、
リポゾーム内にとり込ませることもできる。これらのワ
クチンの他の構成成分は、例えば水、塩溶液、グルコー
ス又はグリセロールである。加えて、このワクチンは乳
化剤、緩衝物質のような少量の補助物質、及び所望によ
り免疫応答を増大するアジュバントを含む。ワクチンは
通常、注射、好ましくは皮下投与又は筋肉内投与によ
り、非経口的に投与される。
は、ワクチンの製造である。このために、本発明のポリ
ペプチドは好適には精製された形態で製造され、次いで
ポリペプチド溶液又は懸濁液のいずれかであってもよい
注射可能な液体の形態とされる。ポリペプチドはまた、
リポゾーム内にとり込ませることもできる。これらのワ
クチンの他の構成成分は、例えば水、塩溶液、グルコー
ス又はグリセロールである。加えて、このワクチンは乳
化剤、緩衝物質のような少量の補助物質、及び所望によ
り免疫応答を増大するアジュバントを含む。ワクチンは
通常、注射、好ましくは皮下投与又は筋肉内投与によ
り、非経口的に投与される。
【００３２】本発明のその他の目的は、試料液中のＣ型
肝炎ウイルスに向けられた抗体の免疫学的測定のための
方法であり、ここで試料液はＣ型肝炎ウイルスからの配
列領域、特にＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からの配列
領域を有する少なくとも１個のポリペプチドとともにイ
ンキュベートされ、そして抗体はポリペプチドへの結合
により検出される。その際に、少なくとも１個のシステ
イン残基を有する領域からのポリペプチドを使用し、
（ａ）抗体は還元状態下で測定され、（ｂ) １又は数個
のシステイン残基は共有結合的に修飾され又は／及び
（ｃ）１又は数個のシステイン残基が他のアミノ酸で置
換されていることを特徴とするものである。
肝炎ウイルスに向けられた抗体の免疫学的測定のための
方法であり、ここで試料液はＣ型肝炎ウイルスからの配
列領域、特にＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からの配列
領域を有する少なくとも１個のポリペプチドとともにイ
ンキュベートされ、そして抗体はポリペプチドへの結合
により検出される。その際に、少なくとも１個のシステ
イン残基を有する領域からのポリペプチドを使用し、
（ａ）抗体は還元状態下で測定され、（ｂ) １又は数個
のシステイン残基は共有結合的に修飾され又は／及び
（ｃ）１又は数個のシステイン残基が他のアミノ酸で置
換されていることを特徴とするものである。
【００３３】ＨＣＶからの他の抗原性領域に対比して、
ＮＳ３領域は特別に多くのシステイン残基の蓄積を有す
る。ウイルス複製の過程の間に合成されたＮＳ３タンパ
ク質は安定であるが、生理学的緩衝状態、例えば免疫学
的試験処理におけるＮＳ３抗原の使用は極めて問題であ
ることが判明した、というのは、システイン残基の遊離
のスルフヒドリル基はこれらの条件下で容易に酸化する
からである。これは抗原の分子内並びに分子間の架橋を
もたらし、その免疫反応性を有意に減少させる。
ＮＳ３領域は特別に多くのシステイン残基の蓄積を有す
る。ウイルス複製の過程の間に合成されたＮＳ３タンパ
ク質は安定であるが、生理学的緩衝状態、例えば免疫学
的試験処理におけるＮＳ３抗原の使用は極めて問題であ
ることが判明した、というのは、システイン残基の遊離
のスルフヒドリル基はこれらの条件下で容易に酸化する
からである。これは抗原の分子内並びに分子間の架橋を
もたらし、その免疫反応性を有意に減少させる。
【００３４】驚くべきことに、修飾されたシステイン残
基をもつ又は／及び置換したシステイン残基をもつ１又
は複数のＮＳ３抗原が使用されるか、又は例えばスルフ
ヒドリル試薬を添加することにより緩和な還元状態が存
在する試験方式手段により、これらのＮＳ３抗原の免疫
反応を有意に改善することが可能であった。こうして、
セロコンバージョンの早期認識が達成され、かつ、測定
シグナルの有意な増幅が達成される。
基をもつ又は／及び置換したシステイン残基をもつ１又
は複数のＮＳ３抗原が使用されるか、又は例えばスルフ
ヒドリル試薬を添加することにより緩和な還元状態が存
在する試験方式手段により、これらのＮＳ３抗原の免疫
反応を有意に改善することが可能であった。こうして、
セロコンバージョンの早期認識が達成され、かつ、測定
シグナルの有意な増幅が達成される。
【００３５】本発明は、さらに、以下の実施例及び配列
プロトコールにより記載される。
プロトコールにより記載される。
【００３６】配列番号１：本発明の好適なポリペプチド
のヌクレオチド配列を示す。
のヌクレオチド配列を示す。
【００３７】配列番号２：本発明の好適な核酸のアミノ
酸配列を示す。
酸配列を示す。
【００３８】配列番号３：プライマー（１）のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００３９】配列番号４：プライマー（２）のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００４０】配列番号５：プライマー（３）のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００４１】配列番号６：プライマー（４）のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００４２】配列番号７：プライマー（５）のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００４３】配列番号８：プライマー（６）のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
【００４４】
【実施例】実施例１
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からのアミノ酸1207から
1488を有するポリペプチドのクローニング及び発現 配列番号３及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列
をもつプライマー（１）及び（２）を使用し、クローン
ＮＳ３（DSM 6847) により開始するＰＣＲ手段により、
ＤＮＡフラグメントを増幅させた。クローニングのため
の配列（BamHI,BspHI, EcoRI制限開裂部位）並びに発現
増大のためのＡＴＧコドン及びＡＡＡ（Ｌｙｓ) コドン
は、このＤＮＡフラグメントの5'末端に存在している。
HindIII及びEcoRI の制限部位並びに停止コドン（ＴＴ
Ａ）は3'末端に存在している。プライマー（１）及び
（２）において、ＨＣＶに相同の領域は第19番目のヌク
レオチドで始まる。
1488を有するポリペプチドのクローニング及び発現 配列番号３及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列
をもつプライマー（１）及び（２）を使用し、クローン
ＮＳ３（DSM 6847) により開始するＰＣＲ手段により、
ＤＮＡフラグメントを増幅させた。クローニングのため
の配列（BamHI,BspHI, EcoRI制限開裂部位）並びに発現
増大のためのＡＴＧコドン及びＡＡＡ（Ｌｙｓ) コドン
は、このＤＮＡフラグメントの5'末端に存在している。
HindIII及びEcoRI の制限部位並びに停止コドン（ＴＴ
Ａ）は3'末端に存在している。プライマー（１）及び
（２）において、ＨＣＶに相同の領域は第19番目のヌク
レオチドで始まる。
【００４５】こうして得られたＤＮＡフラグメントが、
BamHI 及びHindIII で切断されたｐＵＣ８ベクターにお
いて使用された。生成したプラスミドは、ｐＵＣ−Ｄ２
６と命名された。
BamHI 及びHindIII で切断されたｐＵＣ８ベクターにお
いて使用された。生成したプラスミドは、ｐＵＣ−Ｄ２
６と命名された。
【００４６】プラスミドｐＵＣ−Ｄ２６で形質転換され
たE.Coli株ＪＭ１０９（ヤーニッシ−ペーロンら., Gen
e 33 (1985), 103) を 100mlの媒地（Ｌ培養液／アンピ
シリン）中で１晩インキュベートした。翌朝、この培養
物は３ｌのフラスコ内で900ml のＬ培養液（10g トリプ
トン、10g 酵母抽出物、５g NaCl／ｌ）／アンピシリン
で２回希釈した。２mlのグリセロール及び１〜２滴のシ
リコンの消泡用エマルジョン（Serva 社）を添加した後
で、培養物を約185rpm及び37℃で２時間振盪させた。誘
導及び抗原製造は、２ミリモル／ｌの誘導物質であるイ
ソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を
添加し、３から４時間さらに振盪することにより達成さ
れる。次いで、バクテリアを遠心分離によりペレット状
にし、さらに処理する。
たE.Coli株ＪＭ１０９（ヤーニッシ−ペーロンら., Gen
e 33 (1985), 103) を 100mlの媒地（Ｌ培養液／アンピ
シリン）中で１晩インキュベートした。翌朝、この培養
物は３ｌのフラスコ内で900ml のＬ培養液（10g トリプ
トン、10g 酵母抽出物、５g NaCl／ｌ）／アンピシリン
で２回希釈した。２mlのグリセロール及び１〜２滴のシ
リコンの消泡用エマルジョン（Serva 社）を添加した後
で、培養物を約185rpm及び37℃で２時間振盪させた。誘
導及び抗原製造は、２ミリモル／ｌの誘導物質であるイ
ソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を
添加し、３から４時間さらに振盪することにより達成さ
れる。次いで、バクテリアを遠心分離によりペレット状
にし、さらに処理する。
【００４７】２個の１ｌの培養物からのバクテリアのペ
レットを 200mlの50ミリモル／ｌTris-HCl、pH 8.5、0.
2mg／mlリソチーム及び２ミリモル／ｌのジチオエリス
リトール（ＤＴＥ）中に再懸濁させた。続いて、ＥＤＴ
Ａ（最終濃度：15ミリモル／ｌ）、フェニルメチルスル
ホニル フルオリド（最終濃度：１ミリモル／L ）と４
mgのＤＮアーゼを添加した。懸濁物は磁気攪拌器で数分
間混合し、水浴中37℃で45分間インキュベートした。
レットを 200mlの50ミリモル／ｌTris-HCl、pH 8.5、0.
2mg／mlリソチーム及び２ミリモル／ｌのジチオエリス
リトール（ＤＴＥ）中に再懸濁させた。続いて、ＥＤＴ
Ａ（最終濃度：15ミリモル／ｌ）、フェニルメチルスル
ホニル フルオリド（最終濃度：１ミリモル／L ）と４
mgのＤＮアーゼを添加した。懸濁物は磁気攪拌器で数分
間混合し、水浴中37℃で45分間インキュベートした。
【００４８】その後、トリトン−Ｘ100（最終濃度：１
％）を添加し、磁気攪拌器で30分間攪拌した。−20℃に
おいて一晩凍結し、そして解凍した後で、37℃で細胞を
少なくとも１時間攪拌し、必要ならば音波処理した（so
nified) 。37℃でのインキュベーション及び／又は超音
波処理は、溶解した細胞の懸濁液の粘度が有意に減少す
る迄、続けられた。
％）を添加し、磁気攪拌器で30分間攪拌した。−20℃に
おいて一晩凍結し、そして解凍した後で、37℃で細胞を
少なくとも１時間攪拌し、必要ならば音波処理した（so
nified) 。37℃でのインキュベーション及び／又は超音
波処理は、溶解した細胞の懸濁液の粘度が有意に減少す
る迄、続けられた。
【００４９】続いて、35,000ｇ及び４℃で20分間遠心分
離した。得られたペレットは30mlの50ミリモル／l Tris
-HCl、pH 8.5、２ミリモル／l ＤＴＥ、150ミリモル／l
ＥＤＴＡ及び1.５％ ＯＧＰ（オクスチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド、Biomol社）中で再懸濁した。この懸濁
物を室温で磁気攪拌器にて少なくとも３時間激しく攪拌
し、続いて35,000ｇ及び４℃で20分間遠心した。
離した。得られたペレットは30mlの50ミリモル／l Tris
-HCl、pH 8.5、２ミリモル／l ＤＴＥ、150ミリモル／l
ＥＤＴＡ及び1.５％ ＯＧＰ（オクスチル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド、Biomol社）中で再懸濁した。この懸濁
物を室温で磁気攪拌器にて少なくとも３時間激しく攪拌
し、続いて35,000ｇ及び４℃で20分間遠心した。
【００５０】このペレットを 100mlの８モル／l 尿素、
20ミリモル／l Tris-HCl、pH 8.5、２ミリモル／l ＤＴ
Ｅ中に溶解し、攪拌した。ここで溶解した抗原は、次に
処理する迄−20℃で凍結できる。
20ミリモル／l Tris-HCl、pH 8.5、２ミリモル／l ＤＴ
Ｅ中に溶解し、攪拌した。ここで溶解した抗原は、次に
処理する迄−20℃で凍結できる。
【００５１】タンパク質は、室温で実施された以下に記
載するクロマトグラフィー工程で精製された。抗原は各
クロマトグラフィー工程の間は−20℃で保存された。
載するクロマトグラフィー工程で精製された。抗原は各
クロマトグラフィー工程の間は−20℃で保存された。
【００５２】最初のクロマトグラフィー工程は、20ミリ
モル／l Tris-HCl pH 8.5、８モル／l 尿素、２ミリモ
ル／l ＤＴＥ緩衝液を有するＱ−セファロース ファー
ストフロー カラム（ファルマシア）で実施された。こ
れは、NaCl勾配（０から0.７モル／L ）で溶出させた。
空（void）容積及び分画物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ手段に
より試験した。本発明のポリペプチドは最初のメインピ
ークに存在する。ポジティブの分画物はプールされ、10
倍容量の４モル／l 尿素、２ミリモル／l ＤＴＥ、20ミ
リモル／l Tris-HCl pH 7.3 に対して１晩透析した。
モル／l Tris-HCl pH 8.5、８モル／l 尿素、２ミリモ
ル／l ＤＴＥ緩衝液を有するＱ−セファロース ファー
ストフロー カラム（ファルマシア）で実施された。こ
れは、NaCl勾配（０から0.７モル／L ）で溶出させた。
空（void）容積及び分画物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ手段に
より試験した。本発明のポリペプチドは最初のメインピ
ークに存在する。ポジティブの分画物はプールされ、10
倍容量の４モル／l 尿素、２ミリモル／l ＤＴＥ、20ミ
リモル／l Tris-HCl pH 7.3 に対して１晩透析した。
【００５３】２番目のクロマトグラフ工程において、同
じカラムが使用された。カラム緩衝液は、最初のクロマ
トグラフ工程の後で使用された透析用緩衝液であった。
これをNaCl勾配（０から0.５モル／l ）、次いで１モル
／l NaCl、NaOH pH 13、４モル／l 尿素を使用して溶出
した。
じカラムが使用された。カラム緩衝液は、最初のクロマ
トグラフ工程の後で使用された透析用緩衝液であった。
これをNaCl勾配（０から0.５モル／l ）、次いで１モル
／l NaCl、NaOH pH 13、４モル／l 尿素を使用して溶出
した。
【００５４】ポジティブな分画物をプールし、上述の同
一の緩衝液に対して１晩透析した。
一の緩衝液に対して１晩透析した。
【００５５】最後に、Ｓ−セファロース ファースト
フロー カラム（ファルマシア）でクロマトグラフを行
った。緩衝液及び溶出条件は先のクロマトグラフ工程の
ものと同一であった。
フロー カラム（ファルマシア）でクロマトグラフを行
った。緩衝液及び溶出条件は先のクロマトグラフ工程の
ものと同一であった。
【００５６】抗原は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに
おいて約41KDa の大きさを有している。収率は、培養媒
地リットル当たり約10mgの抗原であった。実施例２ ＨＣＶ ＮＳ３領域からの他の抗原と比較した本発明の
抗原の発現以下の抗原を発現させた： ａ）本発明の抗原Ｄ２６（アミノ酸1207から1488） ｂ）抗原Ｃ３３（ヨーロッパ特許出願第450 391号のア
ミノ酸1192から1457） ｃ）抗原Ｄ２７（アミノ酸1227から1528） ｄ）抗原ＮＳ３（アミノ酸1007から1534） 寄託されたクローンＮＳ−３（DSM 6847) を使用して、
抗原ＮＳ３を発現させた。抗原Ｃ３３及びＤ２７のクロ
ーニング及び発現は、実施例１に記載された方法に従っ
て実施された。Ｃ３３に対するアミノ酸1192から1457及
びＤ２７に対するアミノ酸1227から1528のコード領域
は、クローンＮＳ−３からのプラスミドｐＵＣ−Ｎ３で
開始するＰＣＲを使用する標準方法により増幅させた。
おいて約41KDa の大きさを有している。収率は、培養媒
地リットル当たり約10mgの抗原であった。実施例２ ＨＣＶ ＮＳ３領域からの他の抗原と比較した本発明の
抗原の発現以下の抗原を発現させた： ａ）本発明の抗原Ｄ２６（アミノ酸1207から1488） ｂ）抗原Ｃ３３（ヨーロッパ特許出願第450 391号のア
ミノ酸1192から1457） ｃ）抗原Ｄ２７（アミノ酸1227から1528） ｄ）抗原ＮＳ３（アミノ酸1007から1534） 寄託されたクローンＮＳ−３（DSM 6847) を使用して、
抗原ＮＳ３を発現させた。抗原Ｃ３３及びＤ２７のクロ
ーニング及び発現は、実施例１に記載された方法に従っ
て実施された。Ｃ３３に対するアミノ酸1192から1457及
びＤ２７に対するアミノ酸1227から1528のコード領域
は、クローンＮＳ−３からのプラスミドｐＵＣ−Ｎ３で
開始するＰＣＲを使用する標準方法により増幅させた。
【００５７】プライマー（３）及び（４）が、配列番号
５及び配列番号６に示されているヌクレオチド配列を有
するＣ３３のために使用された。配列番号７及び配列番
号８に示されているヌクレオチド配列を有するＤ２７に
対してプライマー（５）及び（６）が使用された。ＨＣ
Ｖに相同の領域は、プライマー（３）及び（５）におい
てはヌクレオチド番号19で始まり、プライマー（４）及
び（６）においてはヌクレオチド番号13で始まる。
５及び配列番号６に示されているヌクレオチド配列を有
するＣ３３のために使用された。配列番号７及び配列番
号８に示されているヌクレオチド配列を有するＤ２７に
対してプライマー（５）及び（６）が使用された。ＨＣ
Ｖに相同の領域は、プライマー（３）及び（５）におい
てはヌクレオチド番号19で始まり、プライマー（４）及
び（６）においてはヌクレオチド番号13で始まる。
【００５８】制限酵素BamHI 及びHindIII で処理し、次
いでアガロースゲル電気泳動で精製した後で、増幅した
ＤＮＡフラグメントをBamHI 及びHindIII で開裂したベ
クターｐＵＣ８に挿入した。ｐＵＣベクターで発現され
た抗原は両方とも、Ｎ末端に13個の非ＨＣＶ−コード化
外来アミノ酸の領域を有している（Met-Thr-Met-Ile-Th
r-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Ile-Met-Lys)。
いでアガロースゲル電気泳動で精製した後で、増幅した
ＤＮＡフラグメントをBamHI 及びHindIII で開裂したベ
クターｐＵＣ８に挿入した。ｐＵＣベクターで発現され
た抗原は両方とも、Ｎ末端に13個の非ＨＣＶ−コード化
外来アミノ酸の領域を有している（Met-Thr-Met-Ile-Th
r-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Ile-Met-Lys)。
【００５９】その後、このプラスミドで E.coli ＪＭ１
０９を形質転換させた。Ｃ３３抗原をコードするＤＮＡ
フラグメントを受け入れたクローンは、約34kDa (SDS-P
AGE)の分子量をもつ抗原を発現する。抗原Ｄ２７をコー
ドするＤＮＡフラグメントを有するクローンにおいて
は、48kDa の帯が見い出された。
０９を形質転換させた。Ｃ３３抗原をコードするＤＮＡ
フラグメントを受け入れたクローンは、約34kDa (SDS-P
AGE)の分子量をもつ抗原を発現する。抗原Ｄ２７をコー
ドするＤＮＡフラグメントを有するクローンにおいて
は、48kDa の帯が見い出された。
【００６０】Ｃ３３の場合には、全タンパク質中のその
パーセントは約10％であり、本発明のポリペプチドＤ２
６とほぼ同じ程度である。５％又はそれ以下の範囲のか
なり少量の発現がＤ２７について見られる。
パーセントは約10％であり、本発明のポリペプチドＤ２
６とほぼ同じ程度である。５％又はそれ以下の範囲のか
なり少量の発現がＤ２７について見られる。
【００６１】Ｄ２６、Ｄ２７及びＣ３３を発現するクロ
ーンの溶解物がＳＤＳゲルにおいて同時に分離され、ニ
トロセルロース上に移された。種々のＨＣＶ−ポジティ
ブ血清と１：100 の希釈度で１晩インキュベートした
後、結合抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体−パーオキシダーゼ接
合体及び３，3'−ジアミノベンジジンテトラクロリド
（ＤＡＢ）／過酸化水素との呈色反応により検出され
た。
ーンの溶解物がＳＤＳゲルにおいて同時に分離され、ニ
トロセルロース上に移された。種々のＨＣＶ−ポジティ
ブ血清と１：100 の希釈度で１晩インキュベートした
後、結合抗体は抗ヒトＩｇＧ抗体−パーオキシダーゼ接
合体及び３，3'−ジアミノベンジジンテトラクロリド
（ＤＡＢ）／過酸化水素との呈色反応により検出され
た。
【００６２】強力にポジティブである血清を有するすべ
てのＨＣＶ抗原セグメントにおいて、良好な反応性が見
い出された。ポジティブ度が弱いＮＳ３−ＨＣＶ血清の
場合には、Ｃ３３抗原は本発明の抗原に比較してある場
合には同程度であり、他の場合には僅かに弱い反応性を
示す。しかしながら、Ｄ２７の場合には、弱いＮＳ３−
ポジティブ血清とかなり弱まった呈色反応が見い出され
た。実施例３ ＨＣＶのＮＳ３領域からの種々の抗原の特異性及び感受
性の検討ＮＳ−３領域から得られる種々の抗原の反応性
を、間接試験コンセプトを使用して、全部で 960個のネ
ガティブ血清において比較して評価した。この評価にお
いて、本発明の抗原Ｄ２６は、それ自体有意に減少した
数の誤ったポジティブ結果を示す参照抗原Ｃ３３に比較
して、有意にすぐれた特異性を有していることが見い出
された。
てのＨＣＶ抗原セグメントにおいて、良好な反応性が見
い出された。ポジティブ度が弱いＮＳ３−ＨＣＶ血清の
場合には、Ｃ３３抗原は本発明の抗原に比較してある場
合には同程度であり、他の場合には僅かに弱い反応性を
示す。しかしながら、Ｄ２７の場合には、弱いＮＳ３−
ポジティブ血清とかなり弱まった呈色反応が見い出され
た。実施例３ ＨＣＶのＮＳ３領域からの種々の抗原の特異性及び感受
性の検討ＮＳ−３領域から得られる種々の抗原の反応性
を、間接試験コンセプトを使用して、全部で 960個のネ
ガティブ血清において比較して評価した。この評価にお
いて、本発明の抗原Ｄ２６は、それ自体有意に減少した
数の誤ったポジティブ結果を示す参照抗原Ｃ３３に比較
して、有意にすぐれた特異性を有していることが見い出
された。
【００６３】
構 築 物 誤りのポジティブ分類 正しいネガティブ分類
Ｃ３３ ８ ９５２
Ｄ２６ ２ ９５８
さらに、証明されたＨＣＶ状態の20個の血清における間
接試験コンセプトを使用して、種々のＮＳ３構築物の反
応性が比較評価された。抗原Ｄ２７の減少した感受性
は、構築物ＮＳ３（アミノ酸1007から1534）、Ｃ３３、
Ｄ２６及びＤ２７に匹敵する感受性であることが見い出
された。
接試験コンセプトを使用して、種々のＮＳ３構築物の反
応性が比較評価された。抗原Ｄ２７の減少した感受性
は、構築物ＮＳ３（アミノ酸1007から1534）、Ｃ３３、
Ｄ２６及びＤ２７に匹敵する感受性であることが見い出
された。
【００６４】
構 築 物 正しいポジティブ分類 誤りのネガティブ分類
ＮＳ３ ２０ ０
Ｃ３３ ２０ ０
Ｄ２６ ２０ ０
Ｄ２７ １９ １実施例４
ＨＣＶのＮＳ３領域からの抗原の安定性についての検討
間接試験コンセプトを使用して、抗原ＮＳ３及びＤ２６
の安定性を比較評価した。抗原ＮＳ３は、本発明の抗原
Ｄ２６に比較して有意に劣った安定性しか有しないこと
が見い出された。抗原の安定性は、37℃で72時間インキ
ュベートした後で調査した。
の安定性を比較評価した。抗原ＮＳ３は、本発明の抗原
Ｄ２６に比較して有意に劣った安定性しか有しないこと
が見い出された。抗原の安定性は、37℃で72時間インキ
ュベートした後で調査した。
【００６５】
構 築 物 試料番号 信号回収
ＮＳ３ １ ＜２０％
２ ＜２０％
Ｄ２６ １ ９９％
２ １０３％実施例５
還元剤の存在下又は非存在下でのＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカ
ーゼ抗原の反応性の検討 セロコンバーション時間は、20ミリモル／l のＤＴＴの
存在時又は非存在時に生理的条件におかれたＨＣＶ−Ｎ
Ｓ３ヘリカーゼ抗原で異なる時間ごとに回収された血清
試料の反応性に基づいて試験した。
ーゼ抗原の反応性の検討 セロコンバーション時間は、20ミリモル／l のＤＴＴの
存在時又は非存在時に生理的条件におかれたＨＣＶ−Ｎ
Ｓ３ヘリカーゼ抗原で異なる時間ごとに回収された血清
試料の反応性に基づいて試験した。
【００６６】試験コンセプトは、すべてのイムノグロブ
リンのクラス−非依存性認識のための二重抗原架橋試験
であり、この場合電気化学的マーカー基（ルテニウム金
属複合体）を有する抗原及び固体相に結合可能な抗原
（ビオチン化抗原）が使用された。
リンのクラス−非依存性認識のための二重抗原架橋試験
であり、この場合電気化学的マーカー基（ルテニウム金
属複合体）を有する抗原及び固体相に結合可能な抗原
（ビオチン化抗原）が使用された。
【００６７】この試験の結果は、次表に示される。20ミ
リモル／l のＤＴＴの存在下では、38日以前にセロコン
バージョンを認識することが可能であったことが判明し
た。加えて、改善された信号強度がＤＴＴの存在下で見
られた。
リモル／l のＤＴＴの存在下では、38日以前にセロコン
バージョンを認識することが可能であったことが判明し
た。加えて、改善された信号強度がＤＴＴの存在下で見
られた。
【００６８】
【表１】
【００６９】
（１）一般情報：
（ｉ） 出願人：
（Ａ）名称：ベーリンガー マンハイム ＧｍｂＨ
（Ｂ）街区：サンドホーフェル ストラ．112-132
（Ｃ）市 ：マイハイム
（Ｅ）国名：ドイツ
（Ｆ）郵便番号：68305
（ii） 出願の名称：Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域か
らの組換え抗原 (iii) 配列の数：８ （iv） コンピュータ リーダーブル フォーム （Ａ）データキャリア：フロッピー（登録商標）ディス
ク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）操作 システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0、
バージョン #1.25（ＥＰＡ） （２）配列番号１についての情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ）長さ：885 塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖フォーム：両方 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii） 分子の型：ｃＤＮＡ (vi) 最初の起源： （Ａ）微生物：Ｃ型肝炎ウイルス (viii) ゲノム内の位置 （Ａ）染色体／セグメント：ＮＳ３ (ix) 特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）ロケーション：1..885 (xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.１：
らの組換え抗原 (iii) 配列の数：８ （iv） コンピュータ リーダーブル フォーム （Ａ）データキャリア：フロッピー（登録商標）ディス
ク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）操作 システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース #1.0、
バージョン #1.25（ＥＰＡ） （２）配列番号１についての情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ）長さ：885 塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖フォーム：両方 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii） 分子の型：ｃＤＮＡ (vi) 最初の起源： （Ａ）微生物：Ｃ型肝炎ウイルス (viii) ゲノム内の位置 （Ａ）染色体／セグメント：ＮＳ３ (ix) 特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）ロケーション：1..885 (xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.１：
【００７０】
【化１】
【００７１】
【００７２】（２）配列番号２についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：295 アミノ酸
（Ｂ）型 ：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：タンパク質
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.２：
【００７３】
【化２】
【００７４】（２）配列番号３についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：40 塩基対
（Ｂ）型 ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：ｃＤＮＡ
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.３：
【００７５】
【化３】
【００７６】（２）配列番号４についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：39 塩基対
（Ｂ）型 ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：ｃＤＮＡ
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.４
【００７７】
【化４】
【００７８】（２）配列番号５についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：39 塩基対
（Ｂ）型 ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：ｃＤＮＡ
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.５
【００７９】
【化５】
【００８０】（２）配列番号６についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：33 塩基対
（Ｂ）型 ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：ｃＤＮＡ
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.６
【００８１】
【化６】
【００８２】（２）配列番号７についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：39 塩基対
（Ｂ）型 ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：ｃＤＮＡ
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.７：
【００８３】
【化７】
【００８４】（２）配列番号８についての情報：
（ｉ） 配列の特徴：
（Ａ）長さ：33 塩基対
（Ｂ）型 ：核酸
（Ｃ）鎖フォーム：シングル
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii） 分子の型：ｃＤＮＡ
(xi) 配列の記述：配列ＩＤ NO.８
【００８５】
【化８】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ａ
Ｇ０１Ｎ 33/53 33/537
33/532 33/569 Ｌ
33/537 33/68
33/569 Ａ６１Ｋ 39/29
33/68 Ａ６１Ｐ 1/16
// Ａ６１Ｋ 39/29 31/14
Ａ６１Ｐ 1/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
31/14 5/00 Ａ
(72)発明者 ウルバン シュミット
ドイツ連邦共和国 ディー−82386 オ
ーベルハオセン，ヴァルドシュトラーセ
36番地
(72)発明者 マンフレッド モッツ
ドイツ連邦共和国 ディー−81543 ミ
ュンヘン，シレンシュトラーセ 16番地
(72)発明者 ミッシェル ヴィードマン
ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペ
ンツバーグ，イン デル アオ 11番地
(72)発明者 バーバラ アップマイアー
ドイツ連邦共和国 ディー−82393 イ
ッフェルドルフ，エーゲルランダーシュ
トラーセ 12シー番地
(72)発明者 エルヴィン ソウトシェック
ドイツ連邦共和国 ディー−82335 バ
ーグ，エンツィアンヴェーグ 49番地
(56)参考文献 特開 平８−127592（ＪＰ，Ａ)
特表 平６−505164（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (14)
- 【請求項１】（ａ）配列番号１のアミノ酸１４−２９５
（Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３領域からのアミノ酸１２０
７から１４８８）からなるアミノ酸配列および （ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスに存在しない２０未満のアミノ
酸のアミノ酸配列からなるポリぺプチド。 - 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルスの少なくともアミノ酸
１２１７から１４７８から成り、Ｃ型肝炎ウイルスのア
ミノ酸１１９７から１４９８を越えるものを含まず、そ
して任意の２０を越えない外来アミノ酸を含む請求項１
に記載のポリぺプチド。 - 【請求項３】 Ｃ型肝炎ウイルスのアミノ酸1207から148
8を含む請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 共有結合的に修飾された形態の１又は数
個のスルフヒドリル基を含む請求項１から３のいずれか
に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】 １又は数個のシステイン残基が他のアミ
ノ酸により置換された請求項１から３のいずれかに記載
のポリペプチド。 - 【請求項６】 請求項１から５のいずれかに記載のポリ
ペプチドをコードする核酸。 - 【請求項７】（ａ）配列番号１に示される核酸配列ヌク
レオチド４０−８８５または（ｂ）配列番号１のアミノ
酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸配列から
なる、請求項６に記載の核酸。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載の核酸の少なくと
も１個のコピーを含むベクター。 - 【請求項９】 請求項６又は７に記載の核酸の少なくと
も１個のコピー又は請求項８に記載のベクターの少なく
とも１個のコピーで形質転換された細胞。 - 【請求項１０】 試料液中のＣ型肝炎ウイルスに対する
抗体の免疫学的測定方法であって、試料液が請求項１か
ら５のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチド
とともにインキュベートされ、該抗体が該ポリペプチド
への結合により検出される方法。 - 【請求項１１】 試料液が２個のポリペプチドＰ1 及び
Ｐ2 とともにインキュベートされ、ここでポリペプチド
Ｐ1 は（ａ）固相に結合しているか又は（ｂ) 固相に結
合可能な形態で存在しており、ポリペプチドＰ2 はマー
カー基を有しており、そして、抗体は固相中又は／及び
液相中の標識を測定することにより検出される請求項１
０に記載の方法。 - 【請求項１２】 試料液を（ａ）固相に結合しているか
又は（ｂ）固相に結合可能な形態で存在しているポリペ
プチドＰ1 とともに、そしてマーカー基を有するＰ1 に
対するさらなる抗体とともにインキュベートし、測定し
ようとする抗体は固相又は／及び液相中の標識を測定す
ることにより検出される請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 抗体の測定が還元状態で実施される請
求項１０から１２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項１から５のいずれかに記載され
た少なくとも１個のポリペプチドを含む、Ｃ型肝炎ウイ
ルスに対する抗体の免疫学的測定用試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4428705A DE4428705A1 (de) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
| DE4428705:4 | 1994-08-12 |
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|---|---|---|---|
| JP2003136377A Division JP3632027B2 (ja) | 1994-08-12 | 2003-05-14 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３領域からの組換え抗原 |
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| JP (3) | JPH08127592A (ja) |
| AT (1) | ATE410692T1 (ja) |
| DE (2) | DE4428705A1 (ja) |
| ES (1) | ES2315434T3 (ja) |
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