WO2006011543A1 - プローブ複合体 - Google Patents

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Katsumi Aoyagi
Kumiko Iida
Naoko Matsubara
Takehiko Ishida
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Advanced Life Science Institute, Inc.
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    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G01N33/547—Synthetic resin with antigen or antibody attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention relates to a technique for producing a probe complex in which a probe and a detection marker such as a peptide, a peptide, or a low molecular weight peptide are bound to a carrier via an intermediary substance.
  • a detection marker such as a peptide, a peptide, or a low molecular weight peptide are bound to a carrier via an intermediary substance.
  • immunoassays that utilize immune reactions such as enzyme immunoassays and immunohistochemistry.
  • Immunohistochemical methods and immunoassay methods utilize the immune reaction between antigens and antibodies, and self-antigens in vivo are used as methods for detecting foreign antigens. Since these methods have high specificity and sensitivity, they can be detected without isolating trace amounts of substances present in the living body.
  • the immunohistological method is a technique for detecting the localization of a target antigen in a cell or tissue using a specific reaction between an antigen and an antibody.
  • the generally used immunohistochemical method by the ABC method is performed in the following steps. Prepare tissue sections from frozen tissue or paraffin-fixed tissue force. Next, in order to suppress non-specific binding, blocking is performed with bovine serum albumin. This is reacted with an antibody that binds to the target antigen and a biotinylated antibody that binds piotin to form an immune complex of the antigen and the biotinylated antibody.
  • avidin conjugated with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) to form a pyotin avidin enzyme complex
  • HRP horseradish peroxidase
  • the target antigen is detected by the chromogenic or luminescent substrate of the enzyme. It is also possible to detect a target antigen by introducing a fluorescent substance such as fluorescein or a luminescent substance such as attalizium ester into avidin.
  • An immunoassay for detecting an antigen in a biological sample such as serum is performed in the following steps. First, a capture antibody that binds to an antigen to be measured is immobilized on a carrier such as a microplate. After that, blocking with bovine serum albumin is performed to prevent non-specific adsorption to antibodies and carriers. Add a sample containing the antigen to be measured, capture antibody and target Bind antigen. Further, a probe complex in which a probe such as an antibody recognizing an antigen and a hapten such as piotin are bound is added, and the captured antigen and the probe complex are bound. Thereby, an immune complex of a capture antibody-antigen-probe complex is formed on a carrier such as a microplate. Piotin of this immune complex and HRP-labeled avidin are bound, HRP chromogenic substrate or luminescent substrate is added, and the target antigen is measured.
  • a probe complex in which a probe such as an antibody and piotin are combined is used.
  • haptens such as di-trophell (DNP), digoxigenin (DIG), and FITC are combined with an antibody to form a probe complex, and an antibody that recognizes these haptens
  • DNP di-trophell
  • DIG digoxigenin
  • FITC FITC
  • An immunoassay method has been developed in which an enzyme is combined with a fluorescent substrate such as fluorescein or a luminescent substrate such as atheridium ester instead of piotin and an antibody to form a probe complex and detected by fluorescence or luminescence. .
  • the normal serum concentration of human gastrin-releasing peptide precursor is about 14 pg / ml
  • the normal serum concentration of carcinoembryonic antigen (CEA) and ⁇ -fetoprotein is 5 Compared with ⁇ 20ngZml, it should be about 1000 times more sensitive.
  • Hepatitis C virus a foreign antigen, has a very small amount of virus present in the blood, so sensitivity to detect 100-1000 copies of viral RNA is required, and the protein concentration is very high. It should be sensitive to detect 0.03-0. 3 pgZml of antigen.
  • one method of conjugating thiotin to an antibody is to produce the antibody by reacting an amino group of the antibody with an NHS ester introduced into piotine and covalently bonding it.
  • an NHS ester introduced into piotine introduced into piotine and covalently bonding it.
  • the number of amino groups in an antibody is limited, and the number of molecules of piotin bound is limited.
  • binding of the antibody and the antigen may be inhibited by steric hindrance or the like.
  • the hydrophobicity of the entire probe complex becomes stronger when a large number of hydrophobic haptens bind to the antibody.
  • immunohistochemistry and immunoassays if the probe complex is highly hydrophobic, non-specific binding occurs due to hydrophobic binding to the tissue or plate, leading to increased background and sufficient sensitivity. Can not be.
  • Non-Patent Document 1 Harlow, E. and Lane, D., "Antibodies: A LABORATORY MANUA LJ (USA), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, p. 340-341.
  • an object of the present invention is to provide a highly functional probe complex that can be used in a highly sensitive immunoassay, and to provide a soluble and highly sensitive probe complex. is there.
  • the inventors of the present application bind a hydrophilic mediator to a carrier, and the mediator is a detection marker such as an antibody and piotin, a hapten, a radioisotope, or a low molecular weight peptide.
  • the mediator is a detection marker such as an antibody and piotin, a hapten, a radioisotope, or a low molecular weight peptide.
  • the inventors have found that a highly sensitive probe complex can be produced by binding, and have completed the present invention.
  • a hydrophilic mediator By binding a hydrophilic mediator to the carrier, many of the aforementioned detection markers are bound, and the hydrophilicity of the probe complex as a whole increases, so a highly functional probe that is difficult to cause non-specific reactions.
  • the complex was completed. The invention's effect
  • the probe complex of the present invention is an improved probe complex in order to detect antigens and proteins present in the living body.
  • antigens and proteins that could not be measured conventionally can be measured by immunohistochemistry or immunoassay.
  • the mediator is hydrophilic, even if the detection marker such as hapten, piotin, radioisotope, and low molecular weight peptide is hydrophobic, the hydrophilicity of the probe complex is increased, and the whole is hydrophobic. Sexuality is weakened. Therefore, an effect of reducing non-specific reactions due to hydrophobic bonds in immune reactions can be expected.
  • a hydrophilic substance is bound to a carrier as an intermediary substance, and a probe and a detection marker such as piotin, hapten, radioisotope, low molecular weight peptide, lectin and the like are directly bound to the hydrophilic substance. is there.
  • This detection marker is a label for using the probe complex of the present invention for an immune reaction.
  • the carrier used in the present invention is not particularly limited as long as it has a molecular weight of 20,000 to 4,000,000. However, in order to further improve the sensitivity, it is desirable to have a molecular weight of a certain level or more so that a large number of probes such as antibodies, pentene, etc. can bind.
  • Examples of carriers include polysaccharides, high molecular weight proteins and peptide polymers, and their molecular weights are 0,000 to 20,000,000, preferably ⁇ 20,000 to 4,000,000, and more Suitable for ⁇ 70, 000 to 2,000, 000! Also, when using polysaccharides or peptide polymers, more mediators can be bound to those with the same molecular weight but richer in side chains.
  • Examples of the polysaccharide carrier in the present invention include dextran, aminodextran, ficoll, dextrin, agarose, various celluloses, chitin, water-soluble chitosan, soluble starch and the like.
  • examples of the high molecular weight protein carrier in the present invention include j8-galatatosidase, thyroglobulin, hemocyanin and the like.
  • various peptide polymers can be used as the carrier for the peptide polymer in the present invention.
  • As the mediator in the present invention various substances can be used as long as they are water-soluble substances having a molecular weight of 2000 or more.
  • proteins such as bovine serum albumin, human serum albumin, transferrin, ribonuclease, casein, hemoglobin, ovalbumin, and avidin, and water-soluble chitosan.
  • Peptide polymers such as polylysine can also be used.
  • antibodies monoclonal antibodies, polyclonal antibodies
  • fragments thereof are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies
  • F (ab,) 2, Fab ⁇ Fab, F (abc,), Fabc, etc. various receptors, etc., any protein that binds to the substance to be measured.
  • Various avidins such as avidin D and streptavidin
  • protein A, protein G, protein L, various lectins such as concanapalin A, lentil lectin, and kidney bean lectin
  • nucleic acid binding probes to be analyzed can also be used.
  • the antibody should be one that binds to the target antigen or analyte.
  • Antibodies can be obtained from fragments such as F (ab,) 2 and Fab using proteases such as pepsin and papain.
  • heavy chains (H chains) of antibodies are bound to each other by S—S bonds, and the bonds are cleaved by a reducing agent.
  • the reducing agent include cysteamine and mercaptoethanol, and F (ab ′) 2 is also cleaved to Fab ′ by such a reducing agent to newly generate a thiol (SH) group.
  • these fragments of antibodies (F (ab ′) 2, Fab ⁇ Fab, F (abc ′), Fabc ′, etc.) can also be used.
  • a substance that can be used for detection of an immune reaction signal can be bound to the mediator of the present invention as a detection marker.
  • the detection marker is a label for using the probe complex for immunoassay.
  • a detection marker may be piotin or a hapten.
  • Paptenes include dinitrophenol (DNP), digoxigenin (DIG), FITC, etc.
  • DNP dinitrophenol
  • DIG digoxigenin
  • FITC FITC
  • an avidin having an affinity for piotin is labeled with an enzyme such as HRP, a fluorescent substance such as fluorescein, or a phosphor such as ataridi-umester, and the probe complex.
  • the signal can be detected by color development, fluorescence, luminescence, etc.
  • fluorescein As hapten, fluorescein. Isothiocyanate (FITC) and Atari-Jumesu Fluorescent materials such as tellurium and luminescent materials can also be bound directly to mediators. In this case, the signal can be detected by fluorescence or luminescence.
  • FITC Isothiocyanate
  • Atari-Jumesu Fluorescent materials such as tellurium and luminescent materials can also be bound directly to mediators. In this case, the signal can be detected by fluorescence or luminescence.
  • a radioisotope can be directly bound to a mediator, or a hapten labeled with a radioisotope can be bound to a mediator, and in this case, a signal can be detected by the radioactivity.
  • DIG or DNP can be bound as a hapten.
  • antibodies labeled with DIG or DNP labeled with enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, etc. are reacted and detected as signals.
  • any substance can be used as a detection marker for the immunoassay system as long as an antibody against the hapten can be obtained.
  • a low molecular weight peptide or the like can be used as the detection marker.
  • a signal can be detected by binding a low molecular weight peptide to the probe complex mediator and labeling the antibody against this peptide with an enzyme, fluorescent substance, or luminescent substance.
  • These peptides contain sugar chains and lipids, and even those that are irresponsible.
  • the detection marker is an antigenic substance that can be obtained by the antibody, so long as it can bind to an intermediary substance.
  • Substances other than peptides can also be used.
  • a substrate for luminescent and chromogenic enzymes can also be used as a detection marker by binding to a mediator.
  • the detection marker to be bound to the probe complex of the present invention preferably has a molecular weight of 10,000 or less. This is because high molecular weight molecules are limited in the number of molecules that can bind to the mediator, and may not contribute to the increased sensitivity of immunoassays.
  • various lectins can also be used as detection markers.
  • a complex in which a carrier and a mediator are bound is prepared.
  • a protein such as BSA or casein as a mediator
  • sodium periodate is added to dextran-ficoll.
  • an aldehyde group is generated. This aldehyde group reacts with the amino group of a protein such as BSA to form a complex of a carrier and a mediator.
  • This complex has increased hydrophilicity as compared with the carrier alone, and the region to which probes, haptens, and the like can bind is also increased.
  • a hapten is bound to the mediator as a probe and a detection marker.
  • the NHS ester of Sulfo-NHS-LC-Biotin in which NHS (N-hydroxysuccinimide) ester is introduced into biotin is bonded to the amino group of BSA.
  • a linker is introduced into BSA to bind Fab and BSA.
  • the S—S bond inside the BSA is reduced with cysteamine hydrochloride or DTT to generate a thiol group.
  • This thiol group reacts with 1.2-bismaleimide as a linker to introduce a maleimide group.
  • detection markers include various noptenes, radioisotopes and peptides.
  • cysteine can be introduced at the end of the peptide, and this thiol group can be bound using an amino group such as BSA of the mediator. It can also be achieved by using a linker and introducing a succimidyl group into the mediator and reacting with the amino group of the peptide.
  • Covalent bonds can be used for the above-described carrier-mediator binding, mediator-detection marker binding, and mediator-probe binding.
  • Various functional groups can be used for covalent bonding. Examples include aldehyde groups and amino groups, hydrazine groups and aldehyde groups, maleimide groups and thiol groups, succimidyl groups and amino groups, vinyl groups and hydroxy groups, and vinyl groups and covalent bonds of thiol groups. It is not limited to bonding of groups. If there is no functional group suitable for binding to the carrier, mediator, detection marker, or probe, binding can be achieved by introducing a linker molecule having a functional group.
  • the linker may have two or more types of functional groups, but the two or more types of functional groups may be different functional groups or the same functional group.
  • the prepared carrier, mediator, probe, and probe complex of a hapten or low molecular weight peptide as a detection marker can be used for immune reactions such as immunohistochemistry and immunoassay.
  • immune reactions such as immunohistochemistry and immunoassay.
  • piotin when piotin is used, it can be detected by binding the target antigen and the probe complex, reacting with avidin HRP, and adding a chromogenic substrate or a luminescent substrate.
  • HRP detection can be performed using avidin bound with an enzyme such as alkaline phosphatase, 13 galactosidase, glucose oxidase, or luciferase.
  • Ataridi-um ester or a derivative thereof can also be bound to the probe complex.
  • Ataridium-umester has NHS ester, so it reacts with and binds to an amino group such as BSA.
  • Ataridinium ester can be used for chemiluminescent immunoassay and can be used as a highly sensitive measurement system.
  • a low molecular weight peptide can be covalently bound to a mediator.
  • an enzyme such as HRP to the antibody that specifically binds to these substances.
  • Ficoll400 (Amersham Bioscienses) was weighed and dissolved in 0.8 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and 0.4 mL of sodium periodate solution was added and mixed. After reacting at room temperature for 2 hours, excess sodium periodate was removed by gel filtration (Sephadex G25, Amersham Biosciences), Bovine Serum Albumin (BSA) solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours. BSA was introduced. Dimethylamine Borate (DMAB; Seikagaku Corporation) is added and mixed to stabilize the reaction product. After reacting for 1 hour at temperature, Tris solution was added to block unreacted aldehyde groups on Ficoll.
  • DMAB Dimethylamine Borate
  • the reaction product was purified by gel filtration (SephacrylS300, 1.6 * 30), and the absorbance at 280 nm was measured to calculate the concentration of the carrier BSA conjugate.
  • This carrier BSA conjugate lmg was reduced with cysteamine hydrochloride, excess cysteamine hydrochloride was removed by gel filtration (Sep hadex G25, Amersham Biosciences), and 1,2-bismaleimide and Sulf o—NHS—LC-dissolved in Dimethylfolmamide An aqueous solution of Biotin (Pierce # 21335) was added and mixed, and reacted at room temperature for 1.5 hours to introduce a maleimide group and a piotine into the carrier BSA conjugate.
  • Recombinant HCV core antigen prepared at concentrations of Ofmol / L, 148 fmol / L, 444 fmol / L, 1333 fmol / L, 4000 fmol / L, 12 OOOfmol / L, 36000 fmol / L as samples The mixture was incubated at room temperature for 1 hour with stirring. 0. After washing 6 times with 10 mM phosphate buffer pH 7.3 (washing solution) containing 05% Tween20, the secondary antibody prepared in Example 1 was the piotin-anti-HCV core antigen monoclonal antibody complex and Example 2.
  • Piotin-anti-HCV core antigen monoclonal antibody prepared by an existing method was diluted to a concentration of 1 ⁇ g / ml and 200 1 cells were incubated at room temperature for 1 hour. The plate was washed 6 times with a washing solution, and one HRP-conjugated avidin solution (5000-fold diluted solution 200) was added and incubated at room temperature for 30 minutes. Further, the plate was washed 6 times with a washing solution, and 200 1 of a substrate solution (orthophenol-diamine 'hydrogen peroxide mixture) was added, incubated at room temperature for 30 minutes, and the reaction was stopped by adding 50 N of 5N sulfuric acid one by one.
  • a substrate solution orthophenol-diamine 'hydrogen peroxide mixture
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a probe complex of the present invention.

Abstract

【課題】　本発明の目的は高感度の免疫測定法に用いることができる高機能であり、かつ可溶性の感度の高いプローブ複合体を提供することである。 【解決手段】　担体に親水性の仲介物質を結合させ、その仲介物質に抗体及びビオチン、ハプテンまたは低分子量のペプチドなどの検出マーカーを結合させることにより、高感度なプローブ複合体を作製し得る。また、担体に親水性の仲介物質を結合させることにより、多くのハプテン分子を結合させ、且つプローブ複合体全体として親水性となるため、非特異的な反応を起こさない、高機能なプローブ複合体が得られる。

Description

明 細 書
プローブ複合体
技術分野
[0001] 本発明は、担体に仲介物質を介してプローブおよびノ、プテンまたは低分子べプチ ドなどの検出マーカーが結合したプローブ複合体作製の技術に関するものであり、 作製されたプローブ複合体は酵素免疫測定法や免疫組織化学などの免疫反応を利 用する免疫測定に広く用いられる。
背景技術
[0002] 免疫組織化学法や免疫測定法は抗原と抗体の免疫反応を利用して、生体内の自 己の抗原ある ヽは外来抗原を検出する方法として用いられて ヽる。これらの方法は 特異性と感度が高いため、生体内に存在する微量な物質を単離することなぐ検出 することができる。
[0003] 免疫組織ィ匕学法は抗原と抗体の特異的な反応を用いて、目的とする抗原の細胞 内の局在や組織内での局在を検出する手法である。一般に広く使用されている AB C法による免疫組織ィ匕学法は次のような工程で行う。凍結組織やパラフィン固定した 組織力ゝら組織切片を作製する。次に非特異的な結合を抑えるため、牛血清アルブミ ンなどでブロッキングを行う。これに目的の抗原に結合する抗体とピオチンを結合さ せたピオチン化抗体を反応させ、抗原とピオチン化抗体の免疫複合体が形成される 。この免疫複合体に西洋わさびペルォキシダーゼ (HRP)などの酵素が結合したアビ ジンを添加しピオチン アビジン酵素コンプレックスを形成させ、酵素の発色基質や 発光基質により目的の抗原を検出する。アビジンにフルォレツセインなどの蛍光物質 やアタリジ-ゥムエステルなどの発光物質を導入して目的の抗原を検出することもで きる。
[0004] また血清などの生体試料中の抗原を検出する免疫測定法は次のような工程で行う 。まずマイクロプレート等の担体に、測定する抗原と結合する捕捉抗体を固相化する 。その後、抗体や担体への非特異的な吸着を防ぐために、牛血清アルブミンなどで ブロッキングを行う。これに測定する抗原が含まれる試料を加え、捕捉抗体と目的の 抗原を結合させる。さらに抗原を認識する抗体などのプローブとピオチンなどのハプ テンが結合したプローブ複合体を添加し、捕捉された抗原とプローブ複合体を結合 させる。これにより、捕捉抗体—抗原—プローブ複合体の免疫複合体がマイクロプレ ートなどの担体上に形成される。この免疫複合体のピオチンと HRP標識アビジンを 結合させ、 HRPの発色基質や発光基質を加え、目的の抗原を測定する。
[0005] 上記のように免疫組織化学法や免疫測定法では、抗体などのプローブとピオチン の結合したプローブ複合体が用いられて 、る。（例えば非特許文献 1参照）このピオ チンの代わりにジ-トロフエ-ル（DNP)、ジゴキシゲニン（DIG)、 FITCなどのハプ テンを抗体と結合させプローブ複合体とし、これらのハプテンを認識する抗体に酵素 を結合させ、検出する方法も開発されている。
[0006] 酵素を用いず、ピオチンの代わりにフルォレツセインなどの蛍光基質やアタリジ-ゥ ムエステルなどの発光基質と抗体を結合させプローブ複合体とし、蛍光や発光により 検出する免疫測定法も開発されている。
[0007] これらの免疫組織化学法や免疫測定法は感度と特異性の高い検出法であるが、生 体内には通常の方法では検出することが困難な微量物質も数多く存在する。例えば 、ヒトガストリン放出ペプチド前駆体 (proGRP)の正常人の血清濃度は 14pg/ml程 度であり、癌胎児性抗原 (CEA)や α—フエトプロテインの正常人の血清中濃度であ る 5〜20ngZmlと比較すると 1000倍ほどの感度が必要である。また外来抗原であ る C型肝炎ウィルス（HCV)は、血中に存在するウィルス量が非常に少ないため、 10 0— 1000コピーのウィルス RNAを検出する感度が必要で、蛋白質の濃度ではおよ そ 0. 03-0. 3pgZmlの抗原を検出する感度が必要である。
[0008] 生体内の微量物質の検出のため、免疫組織化学法や免疫測定法の感度を上昇さ せるための改良が行われてきて ヽる。免疫組織化学法や免疫測定法の感度の上昇 には、様々な要素が関係している力 上記の抗原と結合する抗体などのプローブとビ ォチンなどの結合したプローブ複合体の機能を改良することも 1つの要素である。例 えば、一分子の抗体に結合させるピオチンの分子数を増加させることにより、そのビ ォチンに結合するアビジン、アビジンに結合した酵素などの分子数が増加し、発色や 発光のシグナルが上昇し感度が上昇する。 [0009] しかし、従来の抗体などのプローブとピオチンゃハプテンなどが結合したプローブ 複合体は、抗体に直接ノ、プテンを結合させるものである。例えば、抗体にピオチンを 結合させる 1つの方法は、抗体のァミノ基とピオチンに導入した NHSエステルを反応 させ、共有結合により作製するものである。この場合、反応条件の検討により一分子 の抗体に結合するピオチンの分子数を増加させることができる。しかし抗体のアミノ基 の数は限られており、結合するピオチンの分子数も限界がある。また抗体の抗原決定 基の近傍のァミノ基にピオチンが結合した場合は、逆に立体障害などにより抗体と抗 原の結合を阻害することも考えられる。
[0010] さらに結合させるハプテンが疎水性の物質である場合は、抗体に多数の疎水性の ハプテンが結合すると、プローブ複合体全体としての疎水性が強まる。免疫組織ィ匕 学法や免疫測定法において、プローブ複合体の疎水性が強いと、組織やプレートへ の疎水結合による非特異的な結合が起こり、バックグラウンドの上昇につながり十分 な感度を得ることができなくなる。
非特許文献 1 : Harlow, E.および Lane, D.著，「Antibodies: A LABORATORY MANUA LJ (米国）， Cold Spring Harbor Laboratory, 1988年 , p. 340-341.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 従って、本発明の目的は高感度の免疫測定法に用いることのできる高機能のプロ ーブ複合体を提供することであり、かつ可溶性の感度の高いプローブ複合体を提供 することである。
課題を解決するための手段
[0012] 本願発明者らは上記の課題を解決するため、担体に親水性の仲介物質を結合さ せ、その仲介物質に抗体及びピオチン、ハプテン、放射性同位体または低分子量の ペプチドなどの検出マーカーを結合させることにより、高感度なプローブ複合体を作 製できることを見出し、本願発明を完成させたものである。担体に親水性の仲介物質 を結合させることにより、多くの前述した検出マーカーを結合させ、且つプローブ複合 体全体として親水性が増加するため、非特異的な反応を起こしにくぐ高機能なプロ ーブ複合体を完成させた。 発明の効果
[0013] 本発明のプローブ複合体は生体内に存在する抗原、蛋白質を検出するためにプロ ーブ複合体を改良したものである。このプローブ複合体を用いることにより、従来測定 不可能であった抗原や蛋白質が免疫組織化学法や免疫測定法により測定可能とな る。
[0014] さらに仲介物質が親水性であるため、ハプテン、ピオチン、放射性同位体、低分子 量ペプチドなどの検出マーカーが疎水性であってもプローブ複合体の親水性が増 加し、全体として疎水性が弱まる。そのため免疫反応における疎水結合による非特 異反応を軽減させる効果も期待できる。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 本発明は担体に仲介物質として親水性の物質を結合させ、さらに親水性の物質に プローブとピオチン、ハプテン、放射性同位体、低分子量ペプチド、レクチンなどの 検出マーカーを直接結合させるものである。この検出マーカ一とは本願発明のプロ ーブ複合体を免疫反応に利用するための標識物である。
[0016] 本発明でいう担体とは、分子量 20, 000〜4, 000, 000のものであれば特別な制 限はない。し力しながら、感度をより向上させるためには、多数の抗体などのプローブ ゃノ、プテンなどが結合できるように、ある程度以上の分子量をもったものが望まし 、。 担体の例としては、多糖類や高分子量蛋白質やペプチドポリマーが挙げられ、それ らの分子量力 0, 000〜20, 000, 000、好まし <は 20, 000〜4, 000, 000、さら に好ましく ίま 70, 000〜2, 000, 000のもの力適して!/ヽる。また、多糖類やペプチド ポリマーを使用する場合、同じ分子量でも側鎖に富んだもののほうが、より多くの仲介 物質を結合させることができる。
[0017] 本発明における多糖類の担体としては、デキストラン、アミノデキストラン、フイコール 、デキストリン、ァガロース、各種セルロース、キチン、水溶性キトサン、可溶性でんぷ んなどが例示される。また、本発明における高分子量蛋白質の担体としては、 j8—ガ ラタトシダーゼ、サイログロブリン、へモシァニンなどが例示される。また、本発明にお けるペプチドポリマーの担体としては、ポリリジンのほか各種ペプチドポリマーが使用 できる。 [0018] 本発明における仲介物質としては、水溶性の分子量 2000以上の物質であれば様 々なものを使用することができる。例えば、牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、トラ ンスフェリン、リボヌクレアーゼ、カゼイン、ヘモグロビン、オボアルブミン、アビジンな どの蛋白質や、水溶性キトサンなどが挙げられる。またポリリジンのようなペプチドポリ マーも利用可能である。
[0019] プローブとしては、抗体 (モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）およびその断片
(F (ab，）2、 Fab \ Fab, F (abc，）、 Fabc，など）、各種レセプターなどで、測定しょう とする物質結合する蛋白質であればよい。また各種アビジン (アビジン D、ストレプトァ ビジンなど）、プロテイン A、プロテイン G、プロテイン L、各種レクチン（コンカナパリン A、レンチルレクチン、インゲンマメレクチンなど）、各被分析核酸結合プローブなども 使用できる。
[0020] 抗体は、 目的とする抗原あるいは被分析物と結合するものであればょ 、。抗体はぺ プシンやパパインといったプロテアーゼを用いて、 F (ab，） 2や Fabといった断片を得 ることができる。一般的に抗体の重鎖 (H鎖）は、 S— S結合により重鎖同士が結合し ており、その結合は還元剤にて切断される。還元剤としては、システアミンやメルカプ トエタノールなどがあげられ、 F (ab' ) 2もこのような還元剤で Fab'に切断されチォー ル（SH)基が新たに生じる。本発明には、抗体のこれらの断片（F (ab' ) 2、 Fab \ Fa b、 F (abc' )、 Fabc'など)も使用することができる。
[0021] 本発明の仲介物質には検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レク チンなどの免疫反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させることができる。 検出マーカーとはプローブ複合体を免疫測定に利用するための標識物である。この ような検出マーカーとしては、ピオチンまたはハプテンが考えられる。パプテンにはジ ニトロフエ-ル（DNP)、ジゴキシゲニン（DIG)、 FITCなどが含まれる。例えばビォチ ンをプローブ複合体に結合させた場合、ピオチンに親和性のあるアビジンに HRPの ような酵素、フルォレツセインのような蛍光物質又はアタリジ -ゥムエステルのような発 光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを 検出することができる。
[0022] またハプテンとしてフルォレセイン.イソチオシァネート（FITC)やアタリ-ジゥムエス テルなどの蛍光物質や発光物質を直接仲介物質に結合させることもできる。この場 合も蛍光や発光でシグナルを検出できる。
[0023] また、放射性同位体を直接仲介物質に結合させたり、放射性同位体でラベルされ たハプテンを仲介物質に結合することもでき、この場合その放射活性でシグナルを検 出することができる。
[0024] さらにハプテンとして DIGや DNPを結合させることができる。これらの場合は、 DIG や DNPに結合する抗体を酵素、蛍光物質、発光物質などで標識したものを反応させ シグナルとして検出する。この場合はハプテンに対する抗体が取得できるものであれ ば、どのような物質でも免疫測定系の検出マーカーとして使用可能である。
[0025] 検出マーカーとしてはハプテン以外に低分子量のペプチドなども利用可能である。
プローブ複合体の仲介物質に低分子量のペプチドを結合させ、このペプチドに対す る抗体に酵素、蛍光物質、発光物質を標識しシグナルを検出することができる。これ らのペプチドは糖鎖や脂質を含んで 、るものでも力まわな 、。
[0026] 検出マーカーに対する抗体を用いて免疫反応のシグナルを検出する場合は、検出 マーカーは抗体の取得できる抗原性のある物質であり、仲介物質と結合できるもので あればノ、プテンや低分子量ペプチド以外の物質も利用可能である。
[0027] さらに発光、発色酵素の基質も仲介物質に結合させ検出マーカーとして利用できる
。基質に対する酵素を反応させることにより、シグナルを検出することができるからで ある。
[0028] 本願発明のプローブ複合体に結合させる検出マーカーは分子量 1万以下のものが 望ましい。高分子量のものは仲介物質に結合できる分子数が制限され免疫測定法の 感度の上昇に寄与できないことが考えられるからである。
[0029] さらに各種レクチン（コンカナバリン八、レンチノレレクチン、インゲンマメレクチンなど） なども検出マーカーとして利用可能である。
[0030] 以下に非限定的にプローブ複合体の製造方法を概説する。
[0031] 本願発明は、まず担体と仲介物質が結合した複合体を作製する。例えば担体とし て糖鎖を有するデキストランゃフイコールなどと、仲介物質として BSAやカゼインなど の蛋白質を結合させる場合、まずデキストランゃフイコールに過ヨウ素酸ナトリウムを 反応させることにより、アルデヒド基が生成される。このアルデヒド基と BSAなどの蛋白 質のアミノ基が反応し、担体と仲介物質の複合体が形成される。
[0032] この複合体は担体単独のものに比べて、親水性が増しており、またプローブおよび ハプテン等の結合できる領域も増加して 、る。
[0033] 次に仲介物質にプローブと検出マーカーとしてハプテンを結合させる。プローブと ハプテンの結合量をコントロールするため、それぞれの結合に用 、る官能基は異な るものを用いることが望ましい。例えば仲介物質 BSAにハプテンとしてピオチンを、プ ローブとして Fab'を結合させる場合は、次のような方法が考えられる。
[0034] BSAのァミノ基には、ビォチンに NHS (N— hydroxysuccinimide)エステルを導 入した Sulfo— NHS— LC— Biotinの NHSエステルを結合させる。一方、 Fab，と B SAを結合させるため、 BSAにリンカ一を導入する。 BSA内部の S— S結合をシステ ァミン塩酸や DTTなどで還元し、チオール基を生成させる。このチオール基にリンカ 一として 1. 2—bismaleimideなどを反応させ、マレイミド基を導入する。このマレイミ ド基と抗体の Fabのチオール基を反応させ、担体、仲介物質、検出マーカー、プロ一 ブのプローブ複合体を作製することができる。
[0035] 検出マーカーとしては各種ノヽプテン、放射性同位体やペプチドなどがある。ぺプチ ドを仲介物質に結合させる場合、例えばペプチドの末端にシスティンを導入し、この チオール基と仲介物質の BS Aなどのアミノ基を利用して結合させることができる。ま たリンカ一を用い、仲介物質にスクシミジル基などを導入し、ペプチドのァミノ基と反 応させることちでさる。
[0036] 上記の担体と仲介物質の結合、仲介物質と検出マーカーの結合および仲介物質と プローブの結合には共有結合が利用できる。共有結合には様々な官能基を利用で きる。例えば、アルデヒド基とアミノ基、ヒドラジン基とアルデヒド基、マレイミド基とチォ ール基、スクシミジル基とアミノ基、ビニル基とヒドロキシ基、ビニル基とチオール基の 共有結合などがあるが、これらの官能基の結合に限られるものではない。また担体、 仲介物質、検出マーカー、プローブに結合のための適当な官能基が存在しない場 合は、官能基を有するリンカ一分子を導入することによって、結合させることができる [0037] リンカ一は 2種以上の官能基を有しているものであればよいが、 2種以上の官能基 は異なる官能基でも、同じ官能基でも構わない。
[0038] 作製した担体、仲介物質、プローブおよび検出マーカーとしてハプテンまたは低分 子量のペプチドのプローブ複合体は免疫組織化学や免疫測定法などの免疫反応に 利用できる。例えば、ピオチンを用いた場合は、 目的の抗原とプローブ複合体を結合 させた後、アビジン HRPを反応させ、発色基質または発光基質などを加えて検出 することができる。 HRPの代わりにアルカリフォスファターゼ、 13 ガラクトシダーゼ、 グルコースォキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素が結合したアビジンを利用し検 出することちでさる。
[0039] またアタリジ -ゥムエステルやその誘導体をプローブ複合体に結合させることもでき る。アタリジ-ゥムエステルは NHSエステルを有しているため、 BSAなどのァミノ基と 反応し結合する。アタリジニゥムエステルは化学発光免疫測定に利用可能であり、高 感度な測定系として利用できる。
[0040] また検出マーカーとして DNP、 DIG, FITCなどを用いた場合や低分子量のぺプ チドは共有結合で仲介物質に結合させることができる。そして、これらの物質特異的 に結合する抗体に HRPなどの酵素を結合させ、発色や発光で検出することも可能で ある。
[0041] 本発明をさらに詳しくかつ非限定的に説明するために、以下に酵素プローブ複合 体の製造方法およびそれらの性能について実施例を挙げる。
実施例 1
[0042] 担体として Ficoll400を用いたピオチンー抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体複 合体の調製
Ficoll400 (Amersham Bioscienses) 44mgを秤量し、 0. 1Mリン酸緩衝液（pH 7. 0) 0. 8mLに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を 0. 4mL添加混合した。室温で 2 時間反応させた後、ゲルろ過（SephadexG25, Amersham Bioscienses)により 余剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、 Bovine Serum Albumin (BSA)溶液を添 加して、室温で 3時間反応させ、 Ficollに BSAを導入した。反応産物の安定化のた め、 Dimethylamine Borate (DMAB；生化学工業株式会社）を添加混合して室 温で 1時間反応させた後、 Ficoll上の未反応のアルデヒド基をブロックするために Tri s溶液を添カ卩した。室温で 1晚反応させた後、ゲルろ過（SephacrylS300, 1. 6* 30 )により反応産物を精製し、 280nmの吸光度を測定して担体 BSA結合物の濃度を 算出した。この担体 BSA結合物 lmgをシステアミン塩酸塩で還元し、ゲルろ過（Sep hadexG25, Amersham Bioscienses)により余剰のシステアミン塩酸塩を除去し、 Dimethylfolmamideに溶解した 1, 2— bismaleimideおよび Sulf o— NHS— LC -Biotin (Pierce # 21335)水溶液を添加混合し、室温で 1. 5時間反応させ、担 体 BS A結合物にマレイミド基およびピオチンを導入した。余剰の 1, 2-bismaleimi deと Sulfo— NHS— LC— Biotinはゲルろ過（SephadexG25, Amersham Bios cienses)により除去した。 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 0)中の抗 HCVコア抗原モノク ローナル抗体の F (ab) ' 2溶液（CI 1 14F (ab)， 2と CI 1 9F (ab) ' 2を等量混合） に、 0. 15Mシステアミン塩酸塩を 1Z10容量添カ卩し、 37°Cで 1. 5時間インキュベー シヨンを行い、ゲルろ過（SephadexG25, Amersham Bioscienses)により余剰の システアミン塩酸塩を除去し、抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体 Fab，を得た。この Fab 'とマレイミドおよびピオチンを導入した担体 BSA結合物を混合し、 4°Cで 1晚反 応させた後、ゲルろ過（Sephacryl S300, 1. 6x30)を行い、遊離の Fab 'を除去し た。このとき、本発明の担体 BSA— Fab '複合体は、ボイド分画近傍に出現し、 Seph acryl S300の排除限界は分子量 150万であることから、数十万以上の分子量であ ることが推測された。このようにして調製された担体 BSA— Fab，複合体の 280nmの 吸光度を測定し、抗体の吸光度とみなして濃度を算出した。
実施例 2
既存の方法を用いたピオチンィ匕抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体の調製
Sulfo NHS— LC Biotin (Pierce # 21335)の添付文書に記載の方法に従 つて行った。 PBS中の抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体（C11— 14 IgGと C11 9 IgGを等量混合）に Sulfo— NHS— LC Biotinを混合し、室温で 1時間反応 させた後、余剰の Sulfo— NHS—LC— Biotinをゲルろ過（SephadexG25, Amer sham Bioscienses)により除去した。調製したピオチン化抗 HCVコア抗原モノクロ ーナル抗体の 280nmの吸光度を測定し、抗体濃度を算出した。 実施例 3
[0044] 実施例 1で調製したピオチン一抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体複合体と実施 例 2で既存の方法により調製したピオチンィ匕抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体と の比較
抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体を 0. 1M酢酸 ·0. 1Mリン酸緩衝液 (ρΗ4. 8) で 4 μ gZmlに調整し、 96穴マイクロプレートの各ゥエルに 250 μ 1ずつ加え、 4°Cで 1 晚インキュベーションを行った。 PBSで洗浄後、 0. 5%カゼインを各ゥエル〖こ 350 1 ずつ加え、室温で 3時間インキュベーションを行った。組み換え体 HCVコア抗原（cl 1)を Ofmol/L, 148fmol/L, 444fmol/L, 1333fmol/L, 4000fmol/L, 12 OOOfmol/L, 36000fmol/Lの濃度に調製したものをサンプルとして添カ卩し、攪拌 しながら室温で 1時間インキュベーションを行った。 0. 05% Tween20を含む 10m Mリン酸緩衝液 pH7. 3 (洗浄液)で 6回洗浄後、 2次抗体として、実施例 1で調製した ピオチンー抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体複合体および実施例 2で既存の方 法により調製したピオチンィ匕抗 HCVコア抗原モノクローナル抗体を 1 μ g/mlの濃 度に希釈して 200 1カ卩え、室温で 1時間インキュベーションを行った。洗浄液で 6回 洗浄し、 HRP結合アビジンを 5000倍希釈液 200 を 1カ卩え、室温で 30分間インキュ ベーシヨンを行った。さらに洗浄液で 6回洗浄し、基質溶液 (オルトフエ-レンジァミン '過酸化水素混合液）を 200 1カ卩え、室温で 30分間インキュベーションを行い、 5N 硫酸を 50 1ずつ加えて反応を停止させた。 492nmの吸光度（リファレンス波長 600 nm)をマイクロプレートリーダー（MPRA4i, TOSOH)で測定した。各濃度の糸且換え 体 HCVコア抗原（cl l)をカ卩えたゥエルの吸光度カゝら OfmolZLの吸光度の値を差し 引いた値を表 1に示した。
[0045] [表 1] 表 1
Figure imgf000013_0001
[0046] 表 1より、既存法によりピオチン化した抗体を用いた場合、 444fmolZLのコア抗原 量では、 OfmolZLとの差を確認できないが、実施例 1で調製した本発明によるピオ チン一抗体複合体を用いることにより、 444fmolZLおよびさらに 3倍希釈された 14 8fmolZLのコア抗原量を充分に検出できることは明らかであった。また、吸光度を 比較すると、 1333fmolZLで約 5倍、 444fmolZLで約 6倍ほど本発明のピオチン 抗体複合体が既存の方法よりも高 、値を示した。
図面の簡単な説明
[0047] [図 1]本発明のプローブ複合体の模式図。

Claims

請求の範囲
[1] 担体に親水性の仲介物質が結合し、仲介物質にプローブおよび検出マーカーが 結合したプローブ複合体。
[2] 検出マーカーがピオチンである請求項 1に記載のプローブ複合体。
[3] 検出マーカーがハプテンである請求項 1に記載のプローブ複合体。
[4] 検出マーカーが放射性同位体を有するものである請求項 1に記載のプローブ複合 体。
[5] 検出マーカーが抗体との結合能を有する物質である請求項 1に記載のプローブ複 合体。
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