WO2011129357A1 - 標識化プローブ－水溶性担体複合体 - Google Patents

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WO2011129357A1
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water
complex
soluble carrier
biotinylated
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義幸 大廣
進 高安
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栄研化学株式会社
株式会社先端生命科学研究所
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a labeled probe-water-soluble carrier complex in which a plurality of probes are bound to a water-soluble carrier and a label is further bound, and a labeled probe-water-soluble carrier complex produced by the method. , And its usage.
  • This labeled probe-water-soluble carrier complex highly sensitive and stable detection / measurement can be performed.
  • the sensitivity is generally measured by the probe And the number of molecules of the label. That is, the number of molecules of the label that binds to one molecule of probe is limited, and the ratio determines the sensitivity.
  • Patent Document 2 a labeled probe complex having a large molecular weight and a large number of labeled substances bound by separately covalently binding an enzyme labeled substance and a probe to a carrier such as polylysine and aminodextran has been proposed (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 a labeled probe complex having a large molecular weight and a large number of labeled substances bound by separately covalently binding an enzyme labeled substance and a probe to a carrier such as polylysine and aminodextran.
  • an enzyme label is bound to a carrier such as polylysine, a label-probe complex (Patent Document 3) in which a probe is bound via a label on the carrier, a probe is bound to a carrier such as dextran, and the carrier A water-soluble carrier-probe complex in which a label is bound via the above probe (Patent Document 4), a hydrophilic mediator is bound to the carrier, and a probe and a detection marker label are bound to the mediator A probe complex (Patent Document 5) and a blocked label probe (Patent Document 6) in which a probe is bound to a complex in which two or more molecules of carriers are bound via an enzyme label have been proposed.
  • a carrier such as polylysine
  • Patent Document 3 a label-probe complex in which a probe is bound via a label on the carrier, a probe is bound to a carrier such as dextran, and the carrier
  • a hydrophilic mediator is bound to the carrier
  • a probe and a detection marker label are bound to the mediator
  • the above prior art also includes the technical problem that the reaction at the blank value increases as the reactivity increases.
  • the reaction at the blank value increases as the reactivity increases.
  • a highly sensitive and stable complex is required. It was difficult to get.
  • the carrier is first bound to the probe or the label in the complex formation, it is difficult to produce a desired complex with good reproducibility due to the multifunctionality of the carrier.
  • the inventors have come to consider using a specific binding between avidin and biotin in the binding of the probe and the label in the preparation of the labeled probe-carrier complex, and the binding between the avidin and the probe. It was found that a highly sensitive and stable complex can be produced with good reproducibility by performing the step prior to the binding to the carrier. In addition, when chemical modification of a probe for chemical bonding, it was found that introduction of a thiol group into the probe does not affect the binding ability of the probe, and a water-soluble carrier is used as the carrier. Thus, a labeled probe-water-soluble carrier complex useful for highly sensitive and stable detection and measurement was constructed.
  • the present invention relates to a method for producing a labeled probe-water-soluble carrier complex including the following steps.
  • Step 1. A probe conjugate that binds a probe having a thiol group and capable of binding to a test substance and avidin having a maleimide group, Step 2.
  • the probe conjugate having a thiol group and the polymeric water-soluble carrier having a maleimide group are bound to form a probe conjugate-water-soluble carrier complex
  • Step 3 Further, the probe conjugate-water-soluble carrier complex and the biotinylated label are mixed to bind the avidin of the probe conjugate-water-soluble carrier complex and biotinylated label biotin.
  • the present invention also relates to a labeled probe-water-soluble carrier complex produced by this step.
  • the present invention relates to a measurement method, an immunoassay method or a highly sensitive measurement method using a labeled probe-water-soluble carrier complex prepared by the above-described steps.
  • the “probe” means a binding partner that interacts with a test substance, and non-limiting examples include an antibody or antibody fragment, protein G, protein A, protein L, lectin, or receptor. I can do it.
  • Non-limiting examples of antibodies or antibody fragments include Fab ′, F (ab ′) 2 , Fab or IgG.
  • Two or more types of antibodies or antibody fragments can be used as the antibody or antibody fragment.
  • the “avidins” means those that form a stable complex with a biotin compound, such as low-molecular basic glycoprotein avidin, a protein similar thereto, or a fragment thereof, and the “avidins”.
  • a biotin compound such as low-molecular basic glycoprotein avidin, a protein similar thereto, or a fragment thereof, and the “avidins”.
  • avidin or streptavidin can be mentioned.
  • the “water-soluble carrier” preferably has a molecular weight of 500,000 or more.
  • Non-limiting examples of the water-soluble carrier of the present invention include dextran, aminodextran, dextrin, cluster dextrin, ficoll or pullulan.
  • biotinylated label is used.
  • biotin is one of the vitamin B complexes and is known to bind very strongly to avidin.
  • biotinylated label include biotinylated luciferase, biotinylated alkaline phosphatase, biotinylated POD (peroxidase), biotinylated GOD (glucose oxidase), biotinylated FITC (fluorescein isothiocyanate), Examples include biotinylated acridinium, biotinylated acridinium derivatives, biotinylated tris (2,2′bipyridyl) ruthenium (II), and the like.
  • any known means including chemical modification or the like can be used for the binding of biotin and the labeled product in the “biotinylated labeled product”, but it is particularly preferable to use genetic recombination. This is because the chemical modification for chemical bonding is not performed, so that the activity of the label is not reduced.
  • a thiol group is introduced into the probe. Any known method can be used to introduce a thiol group.
  • a reducing agent such as 2-mercaptoethanol is used to reduce the thiol group by reducing the existing disulfide bond. Introducing a group is particularly advantageous because it can minimize the effect on the binding ability of the probe.
  • a maleimide group is introduced into avidins.
  • Any known method can be used for introduction of the maleimide group.
  • a known maleimide reagent such as Sulfo-KMUS (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) can be used.
  • any known method can be used for binding between a probe having a thiol group and capable of binding to a test substance, and avidin having a maleimide group.
  • the binding reaction can be carried out by dissolving the probe and avidin in a buffer solution at appropriate concentrations and reacting the solution.
  • unreacted maleimide groups can be blocked with a thiol reagent such as 2-mercaptoethanol after completion of the above binding reaction.
  • the probe-avidin conjugate after blocking can be purified by a known method such as gel filtration.
  • a thiol group is first introduced into the probe-avidin conjugate produced in step 1.
  • any known method can be used, for example, using 2-iminothiolane.
  • any known method can be used to introduce the maleimide group into the water-soluble carrier.
  • a carboxyl group is introduced by reacting a water-soluble carrier with an acid, the acid is removed by dialysis or the like, and then the carboxyl group is replaced with an amino group using a known amino group introduction reagent such as ethylenediamine. . After substitution, an unreacted amino group introduction reagent is removed by dialysis or the like, and a known maleimide reagent is added and reacted to obtain a water-soluble carrier having a maleimide group.
  • any known method can be used for binding of the probe-avidin conjugate having a thiol group and the water-soluble carrier having a maleimide group.
  • the probe conjugate / water-soluble carrier complex after blocking can be purified by a known method such as gel filtration.
  • the probe conjugate-water-soluble carrier complex is mixed with a biotinylated labeled product, whereby the avidin of the probe conjugate-water-soluble carrier complex and biotin of the biotinylated labeled product are mixed. Combine.
  • the affinity between avidins and biotin is very strong, for example, the probe conjugate-water-soluble carrier complex and the biotinylated label are prepared at appropriate concentrations, and the preparation is mixed. Thus, the binding reaction between the avidin and biotin can be performed.
  • the labeled probe-water-soluble carrier complex prepared by the process according to the present invention reacts with the test substance targeted by the probe with high sensitivity and stability, it can be used in any known measurement method. I can do it.
  • the probe is an antibody or an antibody fragment
  • the labeled probe-water-soluble carrier complex according to the present invention can be used in any known immunoassay method.
  • the labeled probe-water-soluble carrier complex prepared by the process according to the present invention is extremely stable even after long-term storage. Even under an accelerated stability test at 37 ° C. for 1 week, the stability over time was maintained.
  • biotinylated luciferase as a biotinylated label
  • Fab ′ as a probe
  • streptavidin as an avidin
  • dextran T2000
  • F (ab ′) 2 obtained by digesting an IgG antibody with pepsin and subjected to reduction treatment, followed by purification by gel filtration to obtain Fab ′ having a thiol group.
  • the Fab ′ introduced with the thiol group obtained by the above method and the streptavidin introduced with the maleimide group were mixed and reacted, and then 2-mercaptoethanol was added to block the unreacted maleimide group, and gel filtration was performed. Purify to obtain the Fab′-streptavidin conjugate.
  • the resulting Fab'-streptavidin conjugate is reacted by adding 2-iminothiolane and then purified by gel filtration to obtain a Fab'-streptavidin conjugate having a thiol group introduced therein.
  • An aminodextran having an amino group introduced into dextran (T2000) is prepared, further reacted with a maleimide reagent, and then purified by gel filtration to obtain dextran (T2000) having a maleimide group introduced.
  • the Fab′-streptavidin conjugate introduced with the thiol group obtained by the above method and the dextran (T2000) introduced with the maleimide group were mixed and reacted, and then 2-mercaptoethanol was added to unreacted maleimide group. And purified by gel filtration to yield the Fab′-streptavidin conjugate-dextran complex.
  • T2000 Fab′-streptavidin conjugate-dextran (T2000) complex and biotinylated luciferase are mixed and reacted to obtain a luciferase-labeled Fab′-dextran (T2000) complex.
  • luciferase-labeled Fab'-dextran (T2000) complex When the obtained luciferase-labeled Fab'-dextran (T2000) complex is used as a labeled antibody and a sandwich immunoassay is performed in combination with a solid phase on which an antibody prepared separately is immobilized, a highly sensitive detection / measurement method is completed.
  • the fact that a highly sensitive and stable labeled probe-water-soluble carrier complex can be obtained with high reproducibility according to the present invention as compared with the prior art is that This is mainly due to the fact that the label was bound via a high affinity between avidin and biotin, and that the probe and avidin were bound prior to binding to the carrier. It is thought that.
  • the binding between the probe and avidin, and the binding between avidin and biotin make it easy to control the ratio of the number of molecules related to the binding. Therefore, a labeled probe-water-soluble carrier complex having an equivalent structure can be easily reproduced. It will be possible to produce it stably.
  • the labeled probe-water-soluble carrier complex thus stably produced increases only the specific reaction constituting the signal while relatively suppressing the non-specific reaction constituting the noise. It is considered to have a structure that is extremely suitable for.
  • the sample After reacting the sample with an insoluble carrier on which a probe that specifically binds to the test substance is immobilized, the sample is removed and washed, and then the labeled probe-water-soluble carrier complex is added and reacted, and then removed and washed again. By measuring the activity of the label on the insoluble carrier, the test substance in the sample is detected and measured.
  • IgG having thiol group by reduction treatment Anti-HCV core antigen mouse monoclonal IgG antibodies c11-9 and c11-14 were dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2), and a solution of 5 mg / mL each was prepared. Prepared. 30 ⁇ L of 0.2M 2-mercaptoethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 300 ⁇ L of these IgG solutions, and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours. After the reaction, gel filtration purification was performed with PD-10 (manufactured by GE Healthcare) to obtain IgG having a thiol group obtained by reducing disulfide bonds present in the antibody. As a result of quantifying the number of each thiol group, the presence of 8.0 thiol groups per IgG molecule was confirmed.
  • PD-10 manufactured by GE Healthcare
  • Anti-HCV core antigen mouse monoclonal IgG antibodies c11-9 and c11-14 were prepared to a concentration of 10 mg / mL with 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.5). .
  • 0.2 mg of pepsin was added to 1 mL of these IgG solutions, and IgG was digested with pepsin by stirring at 37 ° C. for 6 hours. After digestion with pepsin, it was neutralized with 2N NaOH and further purified with a Superdex 200 column (manufactured by GE Healthcare) to obtain F (ab ′) 2 .
  • maleimide group into streptavidin 20 mg of streptavidin (manufactured by MP Bio) was dissolved in 2 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) and dissolved in dimethylformamide to a concentration of 6 mg / mL. Sulfo-KMUS (manufactured by Dojindo) 133 ⁇ L was added. After reacting at 30 ° C. for 1 hour, gel filtration purification was performed with PD-10 (manufactured by GE Healthcare) to obtain streptavidin having a maleimide group introduced. As a result of quantifying the number of maleimide groups, it was confirmed that 3.7 maleimide groups exist per one streptavidin molecule.
  • IgG-Streptavidin Conjugate IgG introduced with the thiol group of c11-9 and c11-14 prepared in Example 1 was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2), and each 2.5 mg / An IgG solution into which mL of thiol group was introduced was prepared.
  • the streptavidin introduced with maleimide groups prepared in Example 3 was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) to prepare a streptavidin solution having 13.0 mg / mL maleimide groups introduced.
  • Luciferase-Labeled IgG 8.2 ⁇ L of 61 ⁇ M biotinylated luciferase (Kikkoman) was added to 50 ⁇ L of the 10 ⁇ M c11-9 and c11-14 IgG-streptavidin conjugate prepared in Example 4 at 25 ° C. The luciferase-labeled IgG was prepared by reacting for 1 hour.
  • Luciferase-Labeled Fab ′ 4.3 ⁇ L of 61 ⁇ M biotinylated luciferase (Kikkoman) was added to 10 ⁇ L of 26.4 ⁇ M c11-9 and c11-14 Fab′-streptavidin conjugate prepared in Example 6.
  • the luciferase-labeled Fab ′ was prepared by reacting at 25 ° C. for 1 hour.
  • IgG-Streptavidin Conjugate-Dextran Complex Each of the c11-9 and c11-14 IgG-streptavidin conjugates prepared in Example 4 was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2). A 2.5 mg / mL solution was mixed to prepare an IgG-streptavidin conjugate solution.
  • the IgG-streptavidin conjugate-dextran (T2000) complex prepared in Example 9 has an IgG-streptavidin conjugate concentration of 570 nM. And 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2).
  • T2000 IgG-streptavidin conjugate-dextran
  • a 61 ⁇ M biotinylated luciferase (Kikkoman) solution is added and reacted at 25 ° C. for 1 hour, whereby luciferase-labeled IgG A dextran (T2000) complex was obtained.
  • aminodextran (T2000) and (T500) introduced with maleimide group prepared in Example 8 and Fab′-streptavidin conjugate introduced with thiol group were mixed and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour.
  • Each aminodextran having a maleimide group introduced therein and each Fab′-streptavidin conjugate having a thiol group introduced therein were combined at the following concentrations and liquid amounts to produce a total of four types of polymers.
  • T2000 Fab'-streptavidin conjugate-dextran (T2000) complex in which c11-9 and c11-14 are mixed 21 ⁇ M of thiol group introduced into 21 ⁇ M c11-9 Fab'-streptavidin conjugate introduced into 200 ⁇ L and 18 ⁇ M thiol group introduced
  • the c11-14 Fab′-streptavidin conjugate 240 ⁇ L and aminodextran (T2000) 142 ⁇ L into which 0.625 ⁇ M maleimide group was introduced were mixed.
  • T2000 c11-9 Fab′-streptavidin conjugate-dextran (T2000) complex 200 ⁇ L of c11-9 Fab′-streptavidin conjugate introduced with 21 ⁇ M thiol group and aminodextran introduced with 0.625 ⁇ M maleimide group (T2000) 71 ⁇ L was mixed.
  • Anti-HCV core antigen mouse monoclonal antibodies c11-3, c11-7, and AOT3 were immobilized on magnetic particles by the carbodiimide method using WSC, and 0.2% antibody solid-phase magnetism Particles were made. Meanwhile, 100 ⁇ L of normal human serum and two kinds of HCV positive sera confirmed by PCR and 100 ⁇ L of sample treatment solution (6 M guanidine hydrochloride, 0.5 NHCl, 12.5% Triton X100, 0.75% Tween 20) were mixed at 37 ° C.
  • reaction solution 0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.5% casein, 0.05% Tween 20, pH 7.3
  • 140 ⁇ L and 20 ⁇ L of 1M Tris buffer were mixed, and 80 ⁇ L of the pretreated sample was added to 160 ⁇ L of the mixed solution to neutralize the pretreated sample.
  • the primary reaction was performed by adding 20 ⁇ L of 0.2% antibody-immobilized magnetic particles to 240 ⁇ L of the neutralized pretreated specimen and placing it at 37 ° C. for 15 minutes. After the reaction, the magnetic particles were washed three times with a washing solution, and the luciferase-labeled IgG produced in Example 5 and the luciferase-labeled IgG-dextran (T2000) complex produced in Example 10 were added. The amount of the labeled antibody was 120 ⁇ L of luciferase diluted to 18 nM, and after stirring, the mixture was further reacted at 37 ° C. for 15 minutes. After the reaction, the magnetic particles were washed three times with a washing solution and resuspended in 100 ⁇ L of 50 mM Tris buffer (pH 8.5).
  • the substrate solution (luciferin) 100 ⁇ L was added to the tube in which the magnetic particles were resuspended, and the luminescence of luciferase was measured using Lumat LB9507 (manufactured by Berthold). Luminescence was measured by integrating the luminescence for 5 seconds after 0.5 seconds from the addition of luciferin. As a result, as shown in Table 1, the luciferase-labeled IgG-dextran (T2000) complex showed a higher luminescence value than the luciferase-labeled IgG. When estimated from the S / N ratio of the panel specimen M, it was estimated that the reactivity was improved by about 50 to 100 times.
  • the enzyme immunoassay using the luciferase-labeled antibody fragment was carried out in the same manner as in Example 13 except that the antibody prepared in Example 7 and Example 12 was used.
  • the luciferase-labeled Fab′-dextran (T2000) complex or the luciferase-labeled Fab′-dextran (T500) complex showed a higher luminescence value than the luciferase Fab ′ label. It was confirmed that the reactivity was improved by about 50 to 100 times by polymerization in the same manner as in Example 1.
  • the c11-9 or c11-14 antibody fragments were individually polymerized, the reactivity was improved, but it was confirmed that the reactivity was further improved by combining the two.
  • a probe complex was prepared by applying the method described in International Publication No. 2006/011543.
  • 44 mg of dextran (T2000) was weighed and dissolved in 0.8 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and 0.4 mL of sodium periodate solution was added and mixed. After reacting at room temperature for 2 hours, excess sodium periodate was removed by gel filtration (PD-10; manufactured by GE Healthcare), and streptavidin (SA) solution and CAPS solution (10%) were added. Streptavidin was introduced into dextran by reacting at room temperature for 5 hours.
  • DMBA dimethylamine borate
  • 1M Tris solution 1M Tris solution
  • the reaction product was purified by gel filtration (Sephaacryl S-300HR 1.6 ⁇ 30; manufactured by GE Healthcare) to obtain a dextran-SA conjugate.
  • a dextran-SA conjugate was prepared to 2 mg / mL using 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and dimethylformamide was added to 0.5 mL of this dextran-SA conjugate solution.
  • the prepared dextran T2000-SA-Fab ′ polymer was prepared in a 0.1 M phosphate buffer so that the SA concentration was 570 nM. Polymerization applying the existing method by adding 3.0 ⁇ L of biotinylated luciferase (Kikkoman) 61 ⁇ M to 300 ⁇ L of this dextran T2000-SA-Fab ′ polymer solution and reacting at 25 ° C. for 1 hour. A labeled antibody was prepared.
  • Anti-HCV core antigen mouse monoclonal antibodies c11-3, c11-7, and AOT3 were immobilized on magnetic particles by the carbodiimide method using WSC, and 0.2% antibody solid-phase magnetism Particles were made. Meanwhile, 100 ⁇ L of normal human serum and two types of HCV core antigen positive sera and 100 ⁇ L of sample treatment solution (6 M guanidine hydrochloride, 0.5 NHCl, 12.5% Triton X100, 0.75% Tween 20) are mixed and incubated at 37 ° C. for 15 minutes.
  • reaction solution 0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.5% casein, 0.05% Tween 20, pH 7.3
  • 1 M Tris 20 ⁇ L of the buffer solution was mixed, and 80 ⁇ L of the pretreated sample was added to 160 ⁇ L of this mixed solution, thereby neutralizing the pretreated sample.
  • a primary reaction was performed by adding 20 ⁇ L of 0.2% antibody-immobilized magnetic particles to 240 ⁇ L of the neutralized pretreated specimen and placing it at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the magnetic particles were washed with a washing solution three times, and the luciferase-labeled IgG prepared in Example 5, the luciferase-labeled IgG-dextran (T2000) complex prepared in Example 10 and an existing method were applied. Polymerized labeled antibody was added. The amount of the labeled antibody was 120 ⁇ L of luciferase diluted to 18 nM, and after stirring, the mixture was further reacted at 37 ° C. for 15 minutes. After the reaction, the magnetic particles were washed three times with a washing solution and resuspended in 100 ⁇ L of 50 mM Tris buffer (pH 8.5).
  • luciferin the substrate solution (luciferin) was added to the tube in which the magnetic particles were resuspended, and luminescence of luciferase was measured using Lumat LB9507 (manufactured by Bertrand). Luminescence was measured by integrating the luminescence for 5 seconds after 0.5 seconds from the addition of luciferin.
  • Table 3 the luciferase-labeled IgG-dextran (T2000) complex showed higher reactivity than the polymerized labeled antibody prepared by applying the existing method.
  • the luciferase-labeled IgG-dextran (T2000) complex reacted about 3 to 5 times more than the labeled antibody produced by applying the existing method. Improved. In the case of a polymerized labeled antibody prepared by applying an existing method, even if the amount of antibody used was increased, the S / N ratio was not greatly improved.
  • POD-labeled Fab ′ 56.8 ⁇ M biotinylated POD (manufactured by Invitrogen) with respect to 30 ⁇ L of 15.4 ⁇ M c11-9 and c11-14 Fab′-streptavidin conjugate prepared in Example 6
  • POD-labeled Fab ′ was prepared by adding 1 ⁇ L and placing it overnight at 4 ° C.
  • Anti-HCV core antigen mouse monoclonal antibodies c11-3, c11-7, and AOT3 were immobilized on magnetic particles by a carbodiimide method using WSC using an enzyme immunoassay using POD-labeled antibody , and 0.2% antibody-immobilized magnetism Particles were made.
  • the recombinant HCV core antigen (c11) was diluted with normal human serum so as to be 0 nM, 0.12 nM, and 1.2 nM, and 100 ⁇ L of these samples and the sample treatment solution (6 M guanidine hydrochloride, 0.5 NHCl, 12.
  • Samples were pretreated by mixing 100 ⁇ L of 5% Triton X100, 0.75% Tween 20) and placing at 37 ° C. for 15 minutes. Furthermore, 140 ⁇ L of the reaction solution (0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.5% casein, 0.05% Tween 20, pH 7.3) and 20 ⁇ L of 1 M Tris buffer were mixed. The pretreated sample was neutralized by adding 80 ⁇ L of the pretreated sample to 160 ⁇ L. Next, a primary reaction was performed by adding 20 ⁇ L of 0.2% antibody-immobilized magnetic particles to 240 ⁇ L of the neutralized pretreated specimen and placing it at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the reaction solution 0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.5% casein, 0.05% Tween 20, pH 7.3
  • the pretreated sample was neutralized by adding 80 ⁇ L of the pretreated sample to 160 ⁇ L.
  • a primary reaction was performed by adding 20 ⁇
  • the magnetic particles were washed three times with a washing solution, and POD-labeled Fab ′ and POD-labeled Fab′-dextran (T2000) complex prepared by the above method were added.
  • the amount of the labeled antibody 120 ⁇ L of POD concentration diluted to 18 nM was added, and after stirring, the mixture was further reacted at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the magnetic particles were washed with a washing solution three times. Next, 200 ⁇ L of a substrate solution (luminol) was added to a tube of magnetic particles, and POD luminescence was measured using Lumat LB9507 (manufactured by Berthold).
  • Luminescence was measured by integrating luminescence for 3 seconds after 12 seconds from the addition of luminol.
  • the POD-labeled Fab′-dextran (T2000) complex showed a higher luminescence value than the POD-labeled Fab ′, confirming the amplification of the signal according to the present invention as in the case of luciferase. From the above results, it was shown that the present invention can be carried out using an enzyme other than luciferase.
  • FITC-labeled Fab ′ With respect to 30 ⁇ L of the 15.4 ⁇ M c11-9 and c11-14 Fab′-streptavidin conjugate prepared in Example 6, 2.9 ⁇ L of 160 ⁇ M biotinylated FITC (Invitrogen) was used. In addition, FITC-labeled Fab ′ was prepared by placing at 4 ° C. overnight.
  • Anti-HCV core antigen mouse monoclonal antibodies c11-3, c11-7, and AOT3 were immobilized on magnetic particles by a carbodiimide method using WSC with a fluorescence immunoassay using FITC-labeled antibody , and 0.2% antibody solid-phase magnetism Particles were made.
  • the recombinant HCV core antigen (c11) was diluted with normal human serum so as to be 0 nM, 0.12 nM, and 1.2 nM, and 100 ⁇ L of these samples and the sample treatment solution (6 M guanidine hydrochloride, 0.5 NHCl, 12.
  • Samples were pretreated by mixing 100 ⁇ L of 5% Triton X100, 0.75% Tween 20) and placing at 37 ° C. for 15 minutes. Furthermore, 140 ⁇ L of the reaction solution (0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.5% casein, 0.05% Tween 20, pH 7.3) and 20 ⁇ L of 1 M Tris buffer were mixed. The pretreated sample was neutralized by adding 80 ⁇ L of the pretreated sample to 160 ⁇ L. Next, a primary reaction was performed by adding 20 ⁇ L of 0.2% antibody-immobilized magnetic particles to 240 ⁇ L of the neutralized pretreated specimen and placing it at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the reaction solution 0.1 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.5% casein, 0.05% Tween 20, pH 7.3
  • the pretreated sample was neutralized by adding 80 ⁇ L of the pretreated sample to 160 ⁇ L.
  • a primary reaction was performed by adding 20 ⁇
  • the magnetic particles were washed three times with a washing solution, and FITC-labeled Fab ′ and FITC-labeled Fab′-dextran (T2000) complex prepared by the above method were added.
  • As the amount of the labeled antibody 200 ⁇ L of FITC concentration diluted to 65 nM was added, and after stirring, the mixture was further reacted at 4 ° C. overnight.
  • the magnetic particles were washed with a washing solution three times. Next, 200 ⁇ L of 10 mM PBS (pH 7.4) was added to the magnetic particle tube to suspend the magnetic particles, and the suspension was dispensed into a 96-well white plate (Thermo Fisher).
  • the fluorescence of FITC was measured using a fluorescence plate reader infinite 200 (manufactured by Tecan). The fluorescence measurement was performed by exciting at a wavelength of 485 nm and measuring fluorescence at 535 nm.
  • the FITC-labeled Fab′-dextran (T2000) complex showed higher fluorescence activity than the FITC-labeled Fab ′, and the signal amplification according to the present invention was the same as in the case of luciferase and POD. was confirmed. From the above results, it was shown that the present invention can be implemented using a low-molecular label other than the enzyme.
  • the labeled probe-water-soluble carrier complex according to the present invention exhibits excellent accelerated stability. That is, it was observed that the labeled probe-water-soluble carrier complex according to the present invention retained about 90% or more of residual activity even after storage at 37 ° C. for 1 week. In addition, an increase in background associated with the acceleration condition was not observed.
  • the labeled probe-water-soluble carrier complex of the present invention in a method for detecting and measuring a test substance in a sample by utilizing the specific binding between the test substance and the probe, compared with the conventional method. Therefore, more sensitive and stable detection / measurement becomes possible.

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Abstract

【課題】被験物質を高感度かつ安定的に検出・測定を行うために用いる標識化プローブ－担体複合体を高い再現性において作製する。 【解決手段】標識物とプローブ－水溶性担体の結合に、アビジン、ストレプトアビジン等のアビジン類とビオチンの特異的な結合を利用し、かつ、当該アビジン類とプローブとの結合を、担体との結合に先立って行う。すなわち、被験物質と結合する物質とアビジン類を結合させた後に、この結合体と高分子の水溶性担体を結合させてアビジン化プローブ－水溶性担体複合体を作製し、このアビジン化プローブ－水溶性担体複合体にビオチン化標識物を混合することにより、アビジン類とビオチンの特異的な結合を介して、被験物質を高感度に検出・測定出来る、安定な標識化プローブ－水溶性担体複合体を再現性良く得る。

Description

標識化プローブ－水溶性担体複合体
　本発明は、水溶性担体に複数のプローブを結合させ、さらに標識物を結合させた標識化プローブ－水溶性担体複合体の作製方法、当該方法によって作製される標識化プローブ－水溶性担体複合体、およびその使用方法に関するものである。この標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いることにより、高感度で安定な検出・測定を行うことが可能となる。
　被験物質と特異的に結合するプローブと標識物との結合物を用いて、プローブを介した被験物質と標識物の結合量を指標として被験物質を検出・測定する方法において、その感度は一般にプローブおよび標識物の分子数により定まる。すなわち、１分子のプローブに対して結合する標識物の分子数は限られ、その比率が感度を定める。
　そこで、プローブ自体を重合化させて重合体を作製することにより分子量を大きくし、その重合体に結合する標識物の分子数を多くすることにより反応性を向上させた高感度化がなされた（特許文献１）。しかしながら、プローブの重合化を制御することが容易ではなく、実用化には至っていない。
　また、ポリリジン、アミノデキストラン等の担体に酵素標識物およびプローブを別個に共有結合させて分子量が大きく、標識物の結合数が多い標識物プローブ複合体が提案された（特許文献２）。しかしながら、本技術により反応性は増加したものの、ブランク値での反応も増加し、検出・測定を行うときの高感度化には至っていない。
　さらに、ポリリジン等の担体に酵素標識物を結合させ、担体上の標識物を介してプローブを結合させた標識物－プローブ複合体（特許文献３）、デキストラン等の担体にプローブを結合させ、担体上のプローブを介して標識物を結合させた水溶性担体－プローブ複合体（特許文献４）、担体に親水性の仲介物質を結合させ、仲介物質にプローブおよび検出マーカーの標識物を結合させたプローブ複合体（特許文献５）、酵素標識物を介して２分子以上の担体を結合させた複合体にプローブを結合させたブロック化標識物プローブ（特許文献６）が提案された。
　しかし、上記先行技術も、反応性の増加とともにブランク値での反応も増加するという技術的課題を内包しており、シグナル／ノイズ比として反応性を評価する場合、高感度かつ安定な複合体を得ることは困難であった。また、複合体形成において、担体とプローブまたは標識物の結合を最初に行うと、担体の多官能性に起因して、所望の複合体を再現性良く作製することは困難であった。
特開平１１－２９５３１３号公報 特開２０００－８８８５０号公報 特開２００１－１８１２９９号公報 特開２００３－１９４８２１号公報 国際公開２００６／０１１５４３ 国際公開２００６／０７０７３２
　被験物質と特異的に結合するプローブと標識物の結合物を用いて、プローブを介した被験物質と標識物の結合量を指標として、高感度に被験物質を検出・測定するためには、１分子のプローブと標識物の結合物に多量の標識物が含まれなければならない。そのために、大分子のプローブと標識物の結合物を作製する必要がある。
　しかしながら、大分子の結合物を形成すべく担体を使用した場合、反応性は増加するものの、ブランク値での反応も増加し、結果として高感度かつ安定な複合体を得ることは困難である。また、担体とプローブまたは標識物の結合を複合体形成の最初の段階として行うと、担体の多官能性に起因して、所望の複合体を再現性良く作製することは困難である。そこで、上記課題を解決する結合物および当該結合物を安定的に作製する方法が期待される。
　発明者等は、標識化プローブ－担体複合体の作製におけるプローブと標識物の結合において、アビジン類とビオチンとの特異的な結合を利用することに思い至り、また、アビジン類とプローブとの結合を、担体との結合に先立って行うことで、極めて高感度かつ安定な複合体を再現性良く作製し得ることを見出した。加えて、化学結合のためにプローブの化学修飾を行うときに、プローブにチオール基を導入することが、プローブの結合能に影響を与えないことを見出し、さらに、担体として水溶性担体を用いることで、高感度で安定な検出・測定に有用な標識化プローブ－水溶性担体複合体を構築した。
　すなわち、本発明は、以下の工程を含む、標識化プローブ－水溶性担体複合体の作製方法に関するものである。
工程１．チオール基を有し被験物質に対して結合可能なプローブと、マレイミド基を有するアビジン類を結合させてプローブ結合体とし、
工程２．次にチオール基を有する前記プローブ結合体と、マレイミド基を有する高分子の水溶性担体を結合させてプローブ結合体－水溶性担体複合体とし、
工程３．さらに前記プローブ結合体－水溶性担体複合体とビオチン化標識物を混合して、プローブ結合体－水溶性担体複合体のアビジン類とビオチン化標識物のビオチンを結合させる。
　また、本発明は、当該工程により作製する標識化プローブ－水溶性担体複合体に関するものである。
　さらに、本発明は、上記工程により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いる測定法、免疫測定法または高感度測定法に関するものである。
　本発明において、「プローブ」とは、被験物質と相互作用する結合パートナーを意味し、非限定的な例として、抗体もしくは抗体断片、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、レクチンまたは受容体等を挙げることが出来る。また、抗体または抗体断片の非限定な例として、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂまたはＩｇＧ等を挙げることが出来る。
　また、当該抗体または抗体断片として、二種類以上の抗体または抗体断片を用いることが出来る。
　本発明において、「アビジン類」とは、低分子の塩基性糖タンパク質のアビジン、それに類似するタンパク質またはその断片等、ビオチン化合物と安定した複合体を形成するものを意味し、当該「アビジン類」の非限定な例として、アビジンまたはストレプトアビジン等を挙げることが出来る。
　本発明において、「水溶性担体」は、分子量が５０万以上であることが好ましい。本発明の水溶性担体の非限定な例として、デキストラン、アミノデキストラン、デキストリン、クラスターデキストリン、フィコールまたはプルラン等を挙げることが出来る。
　本発明では「ビオチン化標識物」を使用する。ここで「ビオチン」は、ビタミンＢ複合体の一つであり、アビジンと非常に強く結合することが知られているものである。本発明における「ビオチン化標識物」の非限定な例として、ビオチン化ルシフェラーゼ、ビオチン化アルカリホスフォターゼ、ビオチン化ＰＯＤ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン化ＧＯＤ（ｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン化ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ビオチン化アクリジニウム、ビオチン化アクリジニウム誘導体またはビオチン化トリス（２，２‘ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）等を挙げることが出来る。当該「ビオチン化標識物」におけるビオチンと標識物の結合には、化学修飾等を含む既知の何れの手段を利用することが出来るが、特に遺伝子組換えを利用することが好ましい。なぜなら、化学結合のための化学修飾をしないことから、その標識物の活性を低下させないからである。
　本発明に係る工程１においては、まず被験物質に対して結合可能なプローブが十分なチオール基を有していない場合、当該プローブにチオール基を導入する。チオール基の導入には既知の何れの方法を用いることが出来るが、プローブが抗体または抗体断片である場合、２－メルカプトエタノール等の還元剤を使用し、内在するジスルフィド結合を還元することによりチオール基を導入することは、プローブの結合能に対する影響を最小限化出来るので、特に有利である。
　次に、アビジン類へマレイミド基を導入する。マレイミド基の導入には、既知の何れの方法を用いることが出来、例えば、Ｓｕｌｆｏ－ＫＭＵＳ（同仁化学社製）といった既知のマレイミド試薬を使用することが出来る。
　チオール基を有し被験物質に対して結合可能なプローブと、マレイミド基を有するアビジン類との結合には、既知の何れの方法を用いることが出来る。例えば、プローブおよびアビジン類をそれぞれ適切な濃度において緩衝液に溶解し、当該溶解液を反応させることで結合反応を行うことが出来る。また、以降の工程における非特異反応を回避すべく、上記結合反応完了後、２－メルカプトエタノール等のチオール試薬を用いて未反応のマレイミド基をブロックすることが出来る。ブロック後のプローブ－アビジン類結合体は、ゲル濾過等既知の方法によって精製することが出来る。
　本発明に係る工程２においては、まず工程１において作製したプローブ－アビジン類結合体にチオール基を導入する。チオール基の導入には、例えば、２－イミノチオランを使用するといった、既知の何れの方法を用いることが出来る。
　水溶性担体へのマレイミド基の導入は、既知の何れの方法を用いることが出来る。例えば、水溶性担体を酸と反応させることにより、カルボキシル基を導入し、当該酸を透析等により除去した後、エチレンジアミン等の既知のアミノ基導入試薬を用いて、カルボキシル基をアミノ基に置換する。置換後、透析等により未反応のアミノ基導入試薬を除去し、既知のマレイミド試薬を加え反応させることにより、マレイミド基を有する水溶性担体を得ることが出来る。
　チオール基を有するプローブ－アビジン類結合体と、マレイミド基を有する水溶性担体との結合には、既知の何れの方法を用いることが出来る。また、以降の工程における非特異反応を回避すべく、結合反応完了後、２－メルカプトエタノール等のチオール試薬を用いて水溶性担体に導入した未反応のマレイミド基をブロックすることが好ましい。ブロック後のプローブ結合体－水溶性担体複合体は、ゲル濾過等既知の方法によって精製することが出来る。
　本発明に係る工程３においては、上記プローブ結合体－水溶性担体複合体をビオチン化標識物と混合することにより、プローブ結合体－水溶性担体複合体のアビジン類とビオチン化標識物のビオチンを結合させる。上記の通り、アビジン類とビオチンとの親和性は非常に強いため、例えば、プローブ結合体－水溶性担体複合体およびビオチン化標識物をそれぞれ適切な濃度に調製し、当該調製液を混合することによって、当該アビジン類とビオチンとの結合反応を行うことが出来る。
　本発明に係る工程により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体は、当該プローブが標的とする被験物質と高感度、かつ安定的に反応するため、既知の何れの測定法において利用することが出来る。また、当該プローブが抗体または抗体断片である場合、本発明に係る標識化プローブ－水溶性担体複合体は、既知の何れの免疫測定法において利用すること出来る。
　さらに、本発明に係る工程により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体は長期間保存後においても極めて安定である。３７℃で１週間の加速安定性試験下においても、その経時的な安定性を保持していた。
　本発明を、一例としてビオチン化標識物にビオチン化ルシフェラーゼを、プローブとしてＦａｂ’を、アビジン類としてストレプトアビジンを、水溶性担体としてデキストラン（Ｔ２０００）を各々用いて説明するが、本例に限定されることはない。
　ＩｇＧ抗体をペプシン消化して得たＦ（ａｂ’）２に２－メルカプトエタノールを加えて還元処理した後にゲルろ過により精製し、チオール基を有するＦａｂ’を得る。
　一方、ストレプトアビジンにマレイミド基を導入する試薬を加えて処理した後にゲルろ過により精製し、マレイミド基を導入したストレプトアビジンを得る。
　上記した方法で得られたチオール基を導入したＦａｂ’およびマレイミド基を導入したストレプトアビジンを混合して反応させた後に２－メルカプトエタノールを添加して未反応のマレイミド基をブロックし、ゲルろ過により精製してＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体を得る。
　得られたＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体に２－イミノチオランを加えて反応させた後にゲルろ過により精製し、チオール基を導入したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体を得る。
　デキストラン（Ｔ２０００）にアミノ基を導入したアミノデキストランを作製し、さらにマレイミド試薬を加えて反応させた後にゲルろ過により精製し、マレイミド基を導入したデキストラン（Ｔ２０００）を得る。
　上記した方法で得られたチオール基を導入したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体およびマレイミド基を導入したデキストラン（Ｔ２０００）を混合して反応させた後に２－メルカプトエタノールを添加して未反応のマレイミド基をブロックし、ゲルろ過により精製してＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体を得る。
　得られたＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体とビオチン化ルシフェラーゼを混合して反応させて、ルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を得る。
　得られたルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を標識抗体として用い、別に用意した抗体を固定化した固相と組み合わせてサンドイッチイムノアッセイを行うと、高感度の検出・測定法が完成する。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明によって、従来と比較して、極めて高感度かつ安定な標識化プローブ－水溶性担体複合体が再現性良く得られることは、プローブと標識物の結合を、アビジン類とビオチンとの高い親和性を介して行ったこと、かつ、当該プローブとアビジン類との結合を、担体との結合に先立って行ったことに主に起因するものであると考えられる。プローブとアビジン類との結合、およびアビジン類とビオチンとの結合は、その結合に関する分子数比等を制御し易く、従って、同等の構造を有する標識化プローブ－水溶性担体複合体を再現性良く安定的に作製できるのであろう。また、このように安定的に作製された標識化プローブ－水溶性担体複合体は、ノイズを構成する非特異的反応を相対的に抑制しつつ、シグナルを構成する特異的反応のみを増加させるのに極めて適した構造を有するものと考えられる。
　本発明を実施することにより、被験物質と特異的に結合する高感度かつ安定な標識化プローブ－水溶性担体複合体が再現性良く得られ、この標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いることにより、高感度かつ安定な検出・測定が可能となる。
ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体の溶出パターン Ｆａｂ’（ｃ１１－９＋ｃ１１－１４）－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体の溶出パターン Ｆａｂ’（ｃ１１－９）－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体の溶出パターン Ｆａｂ’（ｃ１１－１４）－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体の溶出パターン Ｆａｂ’（ｃ１１－９＋ｃ１１－１４）－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ５００）複合体の溶出パターン ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’とＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’－デキストラン複合体の反応性の比較
　被験物質と特異的に結合するプローブを固定化した不溶性担体と検体を反応させた後に検体を除去洗浄し、その後に標識化プローブ－水溶性担体複合体を加えて反応させ、再度除去洗浄した後に不溶性担体上の標識物の活性を測定することにより、検体中の被験物質の検出・測定を行う。
　還元処理によるチオール基を有するＩｇＧの調製
　抗ＨＣＶコア抗原マウスモノクローナルＩｇＧ抗体ｃ１１－９およびｃ１１－１４を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解して、各々５ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。これらのＩｇＧ溶液３００μＬに０．２Ｍの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）３０μＬを添加し、３７℃で１．５時間反応させた。反応後、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、抗体に内在するジスルフィド結合を還元して得られるチオール基を有するＩｇＧを得た。各々のチオール基の数を定量した結果、ＩｇＧ１分子あたり８．０個のチオール基の存在が確認された。
　還元処理によるチオール基を有するＦａｂ’の調製
　抗ＨＣＶコア抗原マウスモノクローナルＩｇＧ抗体ｃ１１－９およびｃ１１－１４を０．１Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４．５）にて１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。次に、これらのＩｇＧ溶液１ｍＬに対してペプシン０．２ｍｇを添加し、３７℃で６時間攪拌することによりＩｇＧをペプシン消化した。ペプシン消化後、２Ｎ　ＮａＯＨにて中和し、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）で精製することによりＦ（ａｂ’）２を得た。
　各々３．０ｍｇ／ｍＬのＦ（ａｂ’）２１３００μＬに０．２Ｍの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）１３０μＬを添加し、３７℃で１．５時間反応させた。反応後、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、抗体に内在するジスルフィド結合を還元して得られるチオール基を有するＦａｂ’を得た。各々のチオール基の数を定量した結果、ｃ１１－９ではＦａｂ’１分子あたり３．３個、ｃ１１－１４ではＦａｂ’１分子あたり３．４個のチオール基の存在が確認された。
　ストレプトアビジンへのマレイミド基の導入
　２０ｍｇのストレプトアビジン（ＭＰ　Ｂｉｏ社製）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２ｍＬに溶解し、ジメチルホルムアミドに６ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したマレイミド試薬Ｓｕｌｆｏ－ＫＭＵＳ（同仁化学社製）１３３μＬを加えた。３０℃で１時間反応させた後、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）にてゲルろ過精製し、マレイミド基を導入したストレプトアビジンを得た。マレイミド基の数を定量した結果、ストレプトアビジン１分子あたり３．７個のマレイミド基の存在が確認された。
　ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体の作製
　実施例１で作製したｃ１１－９およびｃ１１－１４のチオール基を導入したＩｇＧを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、各々２．５ｍｇ／ｍＬのチオール基を導入したＩｇＧ溶液を調製した。一方、実施例３で作製したマレイミド基を導入したストレプトアビジンを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１３．０ｍｇ／ｍＬのマレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液を調製した。
　次に、各々のチオール基を導入したＩｇＧ溶液５００μＬに対して、マレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液３８μＬを添加し、３０℃で１時間反応させた。反応後、０．２Ｍの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）５４μＬを添加し、４℃で一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体を得た。
　ルシフェラーゼ標識ＩｇＧの作製
　実施例４で作製した１０μＭのｃ１１－９およびｃ１１－１４のＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体５０μＬに対して、６１μＭのビオチン化ルシフェラーゼ（キッコーマン社製）８．２μＬ加えて、２５℃で１時間反応させることによりルシフェラーゼ標識ＩｇＧを作製した。
　Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体の作製
　実施例２で作製したｃ１１－９ およびｃ１１－１４の チオール基を導入したＦａｂ’を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、各々２．６ｍｇ／ｍＬのチオール基を導入したＦａｂ’溶液を調製した。一方、実施例３で作製したマレイミド基を導入したストレプトアビジンを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１３．０ｍｇ／ｍＬのマレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液を調製した。
　次に、各々のチオール基を導入したＦａｂ’溶液１４００μＬに対して、マレイミド基を導入したストレプトアビジン溶液３６５μＬを添加し、３０℃で１時間反応させた。反応後、０．２Ｍの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）１７７μＬを添加し、４℃で一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体を得た。
　ルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’の作製
　実施例６で作製した２６．４μＭのｃ１１－９およびｃ１１－１４のＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体１０μＬに対して、６１μＭのビオチン化ルシフェラーゼ（キッコーマン社製）４．３μＬ加えて、２５℃で１時間反応させることにより、ルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’を作製した。
　アミノ基を導入したデキストランへのマレイミド基の導入
　デキストラン（Ｔ２０００）およびデキストラン（Ｔ５００）各々２ｇとモノクロロ酢酸４．７ｇを５０ｍＬの３Ｎ　ＮａＯＨ溶液に溶解し、室温で７０分間攪拌することによってデキストラン（Ｔ２０００）およびデキストラン（Ｔ５００）にカルボキシル基を導入した。次に、リン酸２水素ナトリウム０．２ｇを添加し、６Ｎ　ＨＣｌで混合液を中和することにより反応を停止させ、透析により未反応のモノクロロ酢酸を除去した。
　透析後、１６．４ｇのエチレンジアミンと１．２ｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、室温で４時間攪拌することによりデキストラン（Ｔ２０００）およびデキストラン（Ｔ５００）に導入したカルボキシル基をアミノ基に変換した。次に、透析により未反応のエチレンジアミンとカルボジイミドを除去し、凍結乾燥することによってアミノデキストラン（Ｔ２０００）およびアミノデキストラン（Ｔ５００）を回収した。
　アミノデキストラン（Ｔ２０００）およびアミノデキストラン（Ｔ５００）各々１．５ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）３ｍＬに溶解し、ジメチルホルムアミド中に１２ｍｇ／ｍＬに溶解したマレイミド試薬Ｓｕｌｆｏ－ＫＭＵＳ（同仁化学社製）を３０μＬ加え、３７℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、マレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ２０００）およびアミノデキストラン（Ｔ５００）を得た。マレイミド基の数を定量した結果、デキストラン（Ｔ２０００）１分子あたり２９４個、デキストラン（Ｔ５００）１分子あたり６５個のマレイミド基の存在が確認された。
　ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体の作製
　実施例４で作製したｃ１１－９およびｃ１１－１４のＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体の各々を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解して２．５ｍｇ／ｍＬの溶液とし、等量混合してＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体溶液を調製した。
　このＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体溶液２６４μＬに対して、ジメチルホルムアミドに１ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した２－イミノチオラン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を２μＬ添加し、３０℃で３０分間反応させた。反応後、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）にてゲルろ過精製し、チオール基を導入したＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体を得た。チオール基の数を定量した結果、ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体１分子あたり４．８個のチオール基の存在が確認された。
　次に、実施例８で作製した０．６２５μＭのマレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ２０００）溶液４０μＬに８．６μＭのチオール基を導入したＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体２９０μＬを混合し、３０℃で１時間静置した。その後、０．２Ｍの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）３３μＬを添加し、４℃で一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、図１に示すボイドピーク画分よりＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を得た。
　ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体へのビオチン化ルシフェラーゼの導入
　実施例９で作製したＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を、ＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体濃度として５７０ｎＭになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて調製した。このＩｇＧ－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体溶液３００μＬに対して、６１μＭのビオチン化ルシフェラーゼ（キッコーマン社製）溶液３．０μＬを加え、２５℃で１時間反応させることにより、ルシフェラーゼ標識ＩｇＧ－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を得た。
　Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体の作製
　実施例６で作製した４．０ｍｇ／ｍＬのｃ１１－９Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体４２０μＬおよび２．６ｍｇ／ｍＬのｃ１１－１４Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体６４６μＬに対して、ジメチルホルムアミドに１ｍｇ／ｍＬになるように溶解した２－イミノチオラン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を２μＬ添加し、３０℃で３０分間反応させた。
　反応後、ＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）にてゲルろ過精製し、チオール基を導入した各々のＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体を得た。チオール基の数を定量した結果、ｃ１１－９Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体１分子あたり４．６個、ｃ１１－１４Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体１分子あたり３．０個のチオール基の存在が確認された。
　次に、実施例８で作製したマレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ２０００）および（Ｔ５００）とチオール基を導入したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体を混合し、３０℃で１時間静置した。なお、マレイミド基を導入した各々のアミノデキストランとチオール基を導入した各々のＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体は以下に示すとおりの濃度、液量で組み合わせ、合計４種類の重合体を作製した。
　１）ｃ１１－９およびｃ１１－１４を混合したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体
　２１μＭのチオール基を導入したｃ１１－９Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体２００μＬ、１８μＭのチオール基を導入したｃ１１－１４Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体２４０μＬ、および０．６２５μＭのマレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ２０００）１４２μＬを混合した。
　２）ｃ１１－９Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体
　２１μＭのチオール基を導入したｃ１１－９Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体２００μＬおよび０．６２５μＭのマレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ２０００）７１μＬを混合した。
　３）ｃ１１－１４Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体
　１８μＭのチオール基を導入したｃ１１－１４Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体２４０μＬおよび０．６２５μＭのマレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ２０００）７１μＬを混合した。
　４）ｃ１１－９およびｃ１１－１４を混合したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ５００）複合体
　２１μＭのチオール基を導入したｃ１１－９Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体２００μＬ、１８μＭのチオール基を導入したｃ１１－１４Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体２４０μＬ、および２．５μＭのマレイミド基を導入したアミノデキストラン（Ｔ５００）１１６μＬを混合した。
　反応後、０．２Ｍの２－メルカプトエタノール（和光純薬社製）を各々の複合体溶液の１／１０量添加し、４℃で一晩反応させ、未反応のマレイミド基をブロックした。翌日、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア社製）でゲル濾過精製し、図２～５に示す各サンプルのボイドピーク画分よりＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体を得た。
　Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体へのビオチン化ルシフェラーゼの導入
　実施例１１で作製した４種類のＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体を、Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体濃度として１．８μＭになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて調製した。これらのＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン複合体溶液１００μＬに対して、６１μＭのビオチン化ルシフェラーゼ（キッコーマン社製）３．０μＬを加え、２５℃で１時間反応させることにより、以下に示す４種類のルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’－デキストラン複合体を作製した。
　１）ルシフェラーゼ標識ｃ１１－９・ｃ１１－１４Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体
　２）ルシフェラーゼ標識ｃ１１－９Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体
　３）ルシフェラーゼ標識ｃ１１－１４Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体
　４）ルシフェラーゼ標識ｃ１１－９・ｃ１１－１４Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ５００）複合体
　ルシフェラーゼ標識抗体を用いた酵素免疫測定
　ＷＳＣを用いたカルボジイミド法により、抗ＨＣＶコア抗原マウスモノクローナル抗体ｃ１１－３、ｃ１１－７、およびＡＯＴ３を磁性粒子に固定化し、０．２％抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、正常ヒト血清およびＰＣＲで確認された２種類のＨＣＶ陽性血清１００μＬと検体処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５ＮＨＣｌ、１２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．７５％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬを混合し、３７℃で１５分間置くことによって検体の前処理を行った後、反応液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３）１４０μＬと１Ｍトリス緩衝液２０μＬを混合し、この混合液１６０μＬに前処理検体８０μＬを加えることにより、前処理検体を中和した。
　次に、中和した前処理検体２４０μＬに０．２％抗体固相化磁性粒子を２０μＬ加え、３７℃で１５分間置くことによって１次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄し、実施例５で作製したルシフェラーゼ標識ＩｇＧおよび実施例１０で作製したルシフェラーゼ標識ＩｇＧ－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を添加した。標識抗体の量は、ルシフェラーゼ濃度として１８ｎＭに希釈したものを１２０μＬ加え、攪拌後さらに３７℃で１５分間反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬに再懸濁させた。
　磁性粒子を再懸濁したチューブに基質溶液（ルシフェリン）１００μＬを加え、ルーマットＬＢ９５０７（ベルトールド社製）を使ってルシフェラーゼの発光を測定した。発光測定は、ルシフェリン添加０．５秒後から５秒間の発光を積算した。その結果、表１に示すとおり、ルシフェラーゼ標識ＩｇＧよりもルシフェラーゼ標識ＩｇＧ－デキストラン（Ｔ２０００）複合体のほうが高い発光値を示した。パネル検体ＭのＳ／Ｎ比から見積もると、およそ５０～１００倍程度、反応性が向上していると推察された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ルシフェラーゼ標識抗体断片を用いた酵素免疫測定
　標識抗体として実施例７および実施例１２で作製したものを使用した以外は、実施例１３と同じ方法で実施した。その結果、表２に示すとおり、ルシフェラーゼＦａｂ’標識よりも、ルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体またはルシフェラーゼ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ５００）複合体のほうが高い発光値を示し、ＩｇＧの場合と同様に重合化することにより５０～１００倍程度反応性が向上していることが確認された。また、ｃ１１－９またはｃ１１－１４抗体断片を個別に重合化した場合も反応性の向上は見られるが、両者を組み合わせることによりさらに反応性が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　既存のプローブ複合体作製方法を応用して作製した重合化標識抗体との性能比較
　既存のプローブ複合体作製方法を応用した重合化標識抗体の作製
国際公開２００６／０１１５４３に記載の方法を応用してプローブ複合体を作製した。まず、デキストラン（Ｔ２０００）４４ｍｇを秤量し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．８ｍＬに溶解し、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を０．４ｍＬ添加混合した。室温で２時間反応させた後、ゲルろ過（ＰＤ－１０；ＧＥヘルスケア社製）により余剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去し、ストレプトアビジン（ＳＡ）溶液とＣＡＰＳ溶液（１０％）を添加して室温で５時間反応させることにより、デキストランにストレプトアビジンを導入した。さらに、反応産物の安定化のため、Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ　Ｂｏｒａｔｅ（ＤＭＢＡ；生化学工業社製）１ｍｇと１Ｍトリス溶液０．４ｍＬを添加混合して室温で一晩反応させた。その後、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００ＨＲ　１．６ｘ３０；ＧＥヘルスケア社製）により反応産物を精製し、デキストラン－ＳＡ結合物を得た。次に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてデキストラン－ＳＡ結合物を２ｍｇ／ｍＬになるように調製し、このデキストラン－ＳＡ結合物溶液０．５ｍＬに対して、ジメチルホルムアミドにて１０ｍｇ／ｍＬになるように溶解したマレイミド試薬ＥＭＣＳ（同仁化学社製）５μＬを加え、室温で１．５時間反応させた。この反応産物をＰＤ－１０（ＧＥヘルスケア社製）にてゲルろ過精製し、未反応のＥＭＣＳを除去することによりマレイミド基を導入したデキストラン－ＳＡ結合物を得た。一方、実施例２に記載した方法によりｃ１１－９とｃ１１－１４のＦａｂ’を作製し、各Ｆａｂ’を等量混合することにより０．５ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’溶液を調製した。次に、２ｍｇ／ｍＬのマレイミド基を導入したデキストラン－ＳＡ結合物０．５ｍＬに対して、０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｆａｂ’溶液を１ｍＬ添加して４℃で一晩反応させた。その後、終濃度が１５ｍＭになるように２－メルカプトエチルアミンを添加し、室温で１時間反応させることにより未反応のマレイミド基をブロックした。反応後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００ＨＲカラム（ＧＥヘルスケア社製）にてゲルろ過精製し、デキストラン－ＳＡ－Ｆａｂ’複合体を得た。精製したデキストラン－ＳＡ－Ｆａｂ’複合体に含まれるＳＡは、濃度既知のＳＡ溶液を標準として、ＨＡＢＡ試薬による発色を指標として定量した。作製したデキストランＴ２０００－ＳＡ－Ｆａｂ’重合体を、ＳＡ濃度として５７０ｎＭになるように０．１Ｍリン酸緩衝液にて調製した。このデキストランＴ２０００－ＳＡ－Ｆａｂ’重合体溶液　３００μＬに対して、ビオチン化ルシフェラーゼ（キッコーマン社製）６１μＭを３．０μＬ添加し、２５℃で１時間反応させることにより、既存の方法を応用した重合化標識抗体を作製した。
　ルシフェラーゼ標識抗体を用いた酵素免疫測定
　ＷＳＣを用いたカルボジイミド法により、抗ＨＣＶコア抗原マウスモノクローナル抗体ｃ１１－３、ｃ１１－７、およびＡＯＴ３を磁性粒子に固定化し、０．２％抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、正常ヒト血清および２種類のＨＣＶコア抗原陽性血清１００μＬと検体処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５ＮＨＣｌ、１２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．７５％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬを混合し、３７℃で１５分間置くことによって検体の前処理を行った後、反応液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３）１４０μＬと１Ｍトリス緩衝液２０μＬを混合し、この混合液１６０μＬに前処理検体８０μＬを加えることにより、前処理検体を中和した。
　次に、中和した前処理検体２４０μＬに０．２％抗体固相化磁性粒子を２０μＬ加え、３７℃で１５分間置くことによって１次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄し、実施例５で作製したルシフェラーゼ標識ＩｇＧ、実施例１０で作製したルシフェラーゼ標識ＩｇＧ－デキストラン（Ｔ２０００）複合体、既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体を添加した。標識抗体の量は、ルシフェラーゼ濃度として１８ｎＭに希釈したものを１２０μＬ加え、攪拌後さらに３７℃で１５分間反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）１００μＬに再懸濁させた。
　磁性粒子を再懸濁したチューブに基質溶液（ルシフェリン）１００μＬを加え、ルーマットＬＢ９５０７（ベルトールド社製）を使ってルシフェラーゼの発光を測定した。発光測定は、ルシフェリン添加０．５秒後から５秒間の発光を積算した。その結果、表３に示すとおりルシフェラーゼ標識ＩｇＧ－デキストラン（Ｔ２０００）複合体は既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体よりも高い反応性を示した。パネル検体ＬおよびＭのＳ／Ｎ比から見積もると、ルシフェラーゼ標識ＩｇＧ－デキストラン（Ｔ２０００）複合体は、既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体よりも、およそ３～５倍程度、反応性が向上していた。なお、既存の方法を応用して作製した重合化標識抗体の場合、使用する抗体量を多くしても、そのＳ／Ｎ比に大きな改善は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ビオチン化ＰＯＤへの応用
　ＰＯＤ標識Ｆａｂ’の作製
　実施例６で作製した１５．４μＭのｃ１１－９およびｃ１１－１４のＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体３０μＬに対して、５６．８μＭのビオチン化ＰＯＤ（インビトロジェン社製）８．１μＬを加えて、４℃で一晩置くことによりＰＯＤ標識Ｆａｂ’を作製した。
　Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体へのビオチン化ＰＯＤの導入
　実施例１１で作製したｃ１１－９およびｃ１１－１４を混合したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を、Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体濃度として１．４μＭになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて調製した。この複合体溶液５０μＬに対して、５６．８μＭのビオチン化ＰＯＤ（インビトロジェン社製）１．２μＬを加えて、４℃で一晩置くことによりＰＯＤ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を作製した。
　ＰＯＤ標識抗体を用いた酵素免疫測定
　ＷＳＣを用いたカルボジイミド法により、抗ＨＣＶコア抗原マウスモノクローナル抗体ｃ１１－３、ｃ１１－７、およびＡＯＴ３を磁性粒子に固定化し、０．２％抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、組み換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を０ｎＭ、０．１２ｎＭ、１．２ｎＭになるように正常ヒト血清で希釈し、これらのサンプル１００μＬと検体処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５ＮＨＣｌ、１２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．７５％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬを混合し、３７℃で１５分間置くことによってサンプルの前処理を行った。さらに、反応液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３）１４０μＬと１Ｍトリス緩衝液２０μＬを混合し、この混合液１６０μＬに前処理検体８０μＬを加えることにより、前処理検体を中和した。
　次に、中和した前処理検体２４０μＬに０．２％抗体固相化磁性粒子を２０μＬ加え、３７℃で１５分間置くことによって１次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄し、上記方法により作製したＰＯＤ標識Ｆａｂ’およびＰＯＤ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を添加した。標識抗体の量は、ＰＯＤ濃度として１８ｎＭに希釈したものを１２０μＬ加え、攪拌後さらに３７℃で１５分間反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄した。
　次に、磁性粒子のチューブに基質溶液（ルミノール）２００μＬを加え、ルーマットＬＢ９５０７（ベルトールド社製）を使ってＰＯＤの発光を測定した。発光測定は、ルミノール添加１２秒後から３秒間の発光を積算した。その結果、表４に示すとおりＰＯＤ標識Ｆａｂ’よりもＰＯＤ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体のほうが高い発光値を示し、ルシフェラーゼの場合と同様に本発明によるシグナルの増幅が確認された。以上の結果から本発明はルシフェラーゼ以外の酵素を用いて実施可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ビオチン化ＦＩＴＣへの応用
　ＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’の作製
　実施例６で作製した１５．４μＭのｃ１１－９およびｃ１１－１４のＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体３０μＬに対して、１６０μＭのビオチン化ＦＩＴＣ（インビトロジェン社製）２．９μＬを加えて、４℃で一晩置くことによりＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’を作製した。
　Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体へのビオチン化ＦＩＴＣの導入
　実施例１１で作製したｃ１１－９およびｃ１１－１４を混合したＦａｂ’－ストレプトアビジン結合体－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を、Ｆａｂ’－ストレプトアビジン結合体濃度として６．３μＭになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて調製した。この複合体溶液２０μＬに対して、１６０μＭのビオチン化ＦＩＴＣ（インビトロジェン社製）１．０μＬを加えて、４℃で一晩置くことによりＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を作製した。
　ＦＩＴＣ標識抗体を用いた蛍光免疫測定
　ＷＳＣを用いたカルボジイミド法により、抗ＨＣＶコア抗原マウスモノクローナル抗体ｃ１１－３、ｃ１１－７、およびＡＯＴ３を磁性粒子に固定化し、０．２％抗体固相化磁性粒子を作製した。一方、組み換え体ＨＣＶコア抗原（ｃ１１）を０ｎＭ、０．１２ｎＭ、１．２ｎＭになるように正常ヒト血清で希釈し、これらのサンプル１００μＬと検体処理液（６Ｍ塩酸グアニジン、０．５ＮＨＣｌ、１２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．７５％Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬを混合し、３７℃で１５分間置くことによってサンプルの前処理を行った。さらに、反応液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３）１４０μＬと１Ｍトリス緩衝液２０μＬを混合し、この混合液１６０μＬに前処理検体８０μＬを加えることにより、前処理検体を中和した。
　次に、中和した前処理検体２４０μＬに０．２％抗体固相化磁性粒子を２０μＬ加え、３７℃で１５分間置くことによって１次反応をおこなった。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄し、上記方法により作製したＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’およびＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体を添加した。標識抗体の量は、ＦＩＴＣ濃度として６５ｎＭに希釈したものを２００μＬ加え、攪拌後さらに４℃で一晩反応させた。反応後、磁性粒子を洗浄液にて３回洗浄した。
　次に、磁性粒子のチューブに１０ｍＭ　ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２００μＬ加え、磁性粒子を懸濁し、懸濁液を９６穴白色プレート（サーモフィッシャー社製）に分注した。その後、蛍光プレートリーダーｉｎｆｉｎｉｔｅ２００（テカン社製）を使ってＦＩＴＣの蛍光を測定した。蛍光測定の条件は、４８５ｎｍの波長で励起し、５３５ｎｍの蛍光を測定した。その結果、表５及び図６に示すとおりＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’よりもＦＩＴＣ標識Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体のほうが高い蛍光活性を示し、ルシフェラーゼやＰＯＤの場合と同様に本発明によるシグナルの増幅が確認された。以上の結果から本発明は酵素以外の低分子標識物を用いても実施可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　標識化プローブ－水溶性担体複合体の加速安定性
　本発明に係る標識化プローブ－水溶性担体複合体の加速安定性を試験した。詳細には、実施例１２で作製したルシフェラーゼ標識ｃ１１－９・ｃ１１－１４Ｆａｂ’－デキストラン（Ｔ２０００）複合体について、４℃保存条件下における活性と、３７℃、１週間での加速条件後の残存活性を測定し、比較検討した。活性の測定は実施例１３と同じ方法で行った。結果は表６に示すとおりであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記結果より、本発明に係る標識化プローブ－水溶性担体複合体が優れた加速安定性を示すことが実証された。即ち、本発明に係る標識化プローブ－水溶性担体複合体は、３７℃で１週間保存しても、約９０％程度乃至それ以上の残存活性を保持したことが観察された。また、当該加速条件に伴うバックグラウンドの上昇は観察されなかった。
　これらの結果から、本発明により、被験物質と特異的に結合する高感度かつ安定な標識化プローブ－水溶性担体複合体が得られ、この標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いることにより、従来と比較して、より高感度かつ安定的な検出・測定が可能となることが実証された。また、本願発明が酵素以外の低分子標識物に対しても有効であることが実証された。
　被験物質とプローブが特異的に結合する事を利用して、検体中の被験物質を検出・測定する方法において、本発明の標識化プローブ－水溶性担体複合物を用いることにより、従来と比較して、より高感度かつ安定な検出・測定が可能となる。

Claims (14)

  1. 　以下の工程を含む、標識化プローブ－水溶性担体複合体の作製方法。
    工程１．チオール基を有し被験物質に対して結合可能なプローブと、マレイミド基を有するアビジン類を結合させてプローブ結合体とし、
    工程２．次にチオール基を有する前記プローブ結合体と、マレイミド基を有する高分子の水溶性担体を結合させてプローブ結合体－水溶性担体複合体とし、
    工程３．さらに前記プローブ結合体－水溶性担体複合体とビオチン化標識物を混合して、プローブ結合体－水溶性担体複合体のアビジン類とビオチン化標識物のビオチンを結合させる。
  2. 　アビジン類がアビジンまたはストレプトアビジンである請求項１に記載の方法。
  3. 　水溶性担体の分子量が５０万以上である請求項１または２に記載の方法。
  4. 　水溶性担体が、デキストラン、アミノデキストラン、デキストリン、クラスターデキストリン、フィコールまたはプルランから選ばれる請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　被験物質に対して結合可能なプローブが抗体または抗体断片である請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　二種類以上の抗体または抗体断片を用いることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　抗体または抗体断片がＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂまたはＩｇＧから選ばれる請求項５または６に記載の方法。
  8. 　被験物質に対して結合可能なプローブがプロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、レクチンまたは受容体から選ばれる請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　ビオチン化標識物がビオチン化ルシフェラーゼ、ビオチン化アルカリホスフォターゼ、ビオチン化ＰＯＤ、ビオチン化ＧＯＤ、ビオチン化ＦＩＴＣ、ビオチン化アクリジニウム、ビオチン化アクリジニウム誘導体またはビオチン化トリス（２，２‘ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）から選ばれる請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　ビオチン化ルシフェラーゼが遺伝子組換えにより作製されたものである、請求項９に記載の方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体。
  12. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いる測定法。
  13. 　請求項１～７または９～１０のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いる免疫測定法。
  14. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法により作製した標識化プローブ－水溶性担体複合体を用いる高感度測定法。
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