JP2001181299A - 酵素−タンパク質複合体 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ポリリジン等の担体にアミノ基等を介し
て２個以上の酵素が結合し、その酵素の少なくとも１個
以上に測定しようとする他の物質（例えば抗原）に特異
的な結合性を示すタンパク質（例えば抗体）が結合した
こと、を特徴とする酵素−タンパク質複合体。 【効果】 本複合体によれば、極く少量の物質であって
も、これを高感度で正確に測定することができる。
て２個以上の酵素が結合し、その酵素の少なくとも１個
以上に測定しようとする他の物質（例えば抗原）に特異
的な結合性を示すタンパク質（例えば抗体）が結合した
こと、を特徴とする酵素−タンパク質複合体。 【効果】 本複合体によれば、極く少量の物質であって
も、これを高感度で正確に測定することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、担体を介して共有
結合した酵素上に、他の物質に特異的な結合性を示すタ
ンパク質を結合させた酵素−タンパク質複合体に関する
もので、その複合体は免疫組織化学、エンザイムイムノ
アッセイなどの免疫測定に利用される。
結合した酵素上に、他の物質に特異的な結合性を示すタ
ンパク質を結合させた酵素−タンパク質複合体に関する
もので、その複合体は免疫組織化学、エンザイムイムノ
アッセイなどの免疫測定に利用される。
【０００２】
【従来の技術】近年の免疫化学の進歩により、抗原抗体
反応を用いて微量の物質を感度良く検出する免疫測定が
広く用いられるようになった。現在、免疫測定の中で一
般的なものは免疫組織染色及び酵素免疫測定の２分野で
ある。
反応を用いて微量の物質を感度良く検出する免疫測定が
広く用いられるようになった。現在、免疫測定の中で一
般的なものは免疫組織染色及び酵素免疫測定の２分野で
ある。
【０００３】免疫組織染色とは、組織上の特定の抗原
を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する
手法である。通常は、組織を固定後パラフィン包埋した
ブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗
体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判
断する。最初に抗原と反応させる抗体を通常、第一抗体
と呼ぶ。第一抗体に、視覚または機器により検出し得る
シグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナ
ルの強度から第一抗体の量がわかり、それは即ち切片上
の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグ
ナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられ
る。免疫組織染色が開発された当初はシグナルを発する
物質として蛍光物質が用いられていた。その際には蛍光
は検出するための蛍光顕微鏡が必要であった。
を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する
手法である。通常は、組織を固定後パラフィン包埋した
ブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗
体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判
断する。最初に抗原と反応させる抗体を通常、第一抗体
と呼ぶ。第一抗体に、視覚または機器により検出し得る
シグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナ
ルの強度から第一抗体の量がわかり、それは即ち切片上
の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグ
ナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられ
る。免疫組織染色が開発された当初はシグナルを発する
物質として蛍光物質が用いられていた。その際には蛍光
は検出するための蛍光顕微鏡が必要であった。
【０００４】その後、Ｎａｋａｎｅらにより酵素抗体法
が確立され、光学顕微鏡での染色像の解析が可能となっ
た。現在では、シグナルを発する物質として酵素を用い
るのが一般的である。免疫組織染色を行う際、第一抗体
に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を
加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、そ
れは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に
対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得ら
れない。
が確立され、光学顕微鏡での染色像の解析が可能となっ
た。現在では、シグナルを発する物質として酵素を用い
るのが一般的である。免疫組織染色を行う際、第一抗体
に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を
加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、そ
れは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に
対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得ら
れない。
【０００５】現在最も広く用いられている方法は、スト
レプトアビジンビオチン法（ＳＡＢ法）と呼ばれ、抗原
に結合した第一抗体のシグナルを増幅させて検出する手
法である。この方法ではまず、組織切片上の特定の物質
を認識する第一抗体を反応させる。次に第一抗体に結合
する第二抗体を反応させる。第二抗体は通常第一抗体を
認識して結合するポリクロナール抗体で、第一抗体に複
数の第二抗体が結合する。第二抗体には予め複数のビオ
チンを結合させてある。この第一抗体−ビチオン結合第
二抗体複合体に酵素結合ストレプトアビジン（酵素試
薬）を反応させる。ストレプトアビジンはビオチンと強
固に結合することが知られている。したがって、第一抗
体−ビオチン結合第二抗体−酵素結合ストレプトアビジ
ンの複合体が形成される。この方法によると第一抗体に
複数のビオチン結合第二抗体が結合、さらにビオチン結
合第二抗体に複数の酵素結合ストレプトアビジンが結合
するため、結果的に第一抗体に結合する酵素量は大幅に
増加する。その結果、高い感度で組織切片上の抗原を検
出できる。
レプトアビジンビオチン法（ＳＡＢ法）と呼ばれ、抗原
に結合した第一抗体のシグナルを増幅させて検出する手
法である。この方法ではまず、組織切片上の特定の物質
を認識する第一抗体を反応させる。次に第一抗体に結合
する第二抗体を反応させる。第二抗体は通常第一抗体を
認識して結合するポリクロナール抗体で、第一抗体に複
数の第二抗体が結合する。第二抗体には予め複数のビオ
チンを結合させてある。この第一抗体−ビチオン結合第
二抗体複合体に酵素結合ストレプトアビジン（酵素試
薬）を反応させる。ストレプトアビジンはビオチンと強
固に結合することが知られている。したがって、第一抗
体−ビオチン結合第二抗体−酵素結合ストレプトアビジ
ンの複合体が形成される。この方法によると第一抗体に
複数のビオチン結合第二抗体が結合、さらにビオチン結
合第二抗体に複数の酵素結合ストレプトアビジンが結合
するため、結果的に第一抗体に結合する酵素量は大幅に
増加する。その結果、高い感度で組織切片上の抗原を検
出できる。
【０００６】このようにＳＡＢ法は抗原に結合した第一
抗体に結果的に多数の酵素が結合し、より強いシグナル
を得ることができる優れた方法である。しかしながら、
その操作面に視点を向けると第一抗体の反応、第二抗体
の反応、酵素試薬の反応という３段階の操作を行う必要
がある。このようにＳＡＢ法は、工程が多く、正確性と
ともに迅速性、簡便性が要求される医療等の現場ではま
だ充分なものとはいえず、改良がまたれている。
抗体に結果的に多数の酵素が結合し、より強いシグナル
を得ることができる優れた方法である。しかしながら、
その操作面に視点を向けると第一抗体の反応、第二抗体
の反応、酵素試薬の反応という３段階の操作を行う必要
がある。このようにＳＡＢ法は、工程が多く、正確性と
ともに迅速性、簡便性が要求される医療等の現場ではま
だ充分なものとはいえず、改良がまたれている。
【０００７】もう１つの一般的な免疫測定の手法として
は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）が知られてい
る。ＥＩＡの代表的な原理及び操作は次のとおりであ
る。まず、ポリスチレンビーズあるいはマイクロプレー
ト等の担体に、測定したい物質を認識する抗体を固相化
する。次いで、アルブミン等のタンパク質によって担体
をブロッキングした後、次に測定目的の物質（抗原）が
含まれる溶液（検体）を加える。その後、抗原を認識す
る抗体に酵素を結合させたもの（酵素標識抗体）を加え
る。即ち２つの抗体で抗原を挟み込む。次に余分な酵素
標識抗体を洗い去った後、酵素の発色性の基質を加え発
色させる。抗原の量は酵素活性に依存するため、あらか
じめ既知の濃度の抗原を試料とした際の発色と比較する
ことにより、検体中の抗原の濃度がわかる。エンザイム
イムノアッセイにおいて感度に関わる要素はいくつかあ
るが、酵素標識抗体の質は重要な要素の一つである。即
ち酵素標識抗体に酵素が多数結合していれば、強いシグ
ナルが得られ、高い感度で抗原を定量できると考えられ
る。
は、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）が知られてい
る。ＥＩＡの代表的な原理及び操作は次のとおりであ
る。まず、ポリスチレンビーズあるいはマイクロプレー
ト等の担体に、測定したい物質を認識する抗体を固相化
する。次いで、アルブミン等のタンパク質によって担体
をブロッキングした後、次に測定目的の物質（抗原）が
含まれる溶液（検体）を加える。その後、抗原を認識す
る抗体に酵素を結合させたもの（酵素標識抗体）を加え
る。即ち２つの抗体で抗原を挟み込む。次に余分な酵素
標識抗体を洗い去った後、酵素の発色性の基質を加え発
色させる。抗原の量は酵素活性に依存するため、あらか
じめ既知の濃度の抗原を試料とした際の発色と比較する
ことにより、検体中の抗原の濃度がわかる。エンザイム
イムノアッセイにおいて感度に関わる要素はいくつかあ
るが、酵素標識抗体の質は重要な要素の一つである。即
ち酵素標識抗体に酵素が多数結合していれば、強いシグ
ナルが得られ、高い感度で抗原を定量できると考えられ
る。
【０００８】このように免疫測定において、酵素標識抗
体の質は大変重要であり、測定系の感度、あるいは操作
の段階数に多大な影響を及ぼす。これまでに高感度の酵
素標識抗体を得るために、下記に例示するように、数々
の試みがなされてきた。その多くは担体に多数の酵素と
抗体を結合させるものである。
体の質は大変重要であり、測定系の感度、あるいは操作
の段階数に多大な影響を及ぼす。これまでに高感度の酵
素標識抗体を得るために、下記に例示するように、数々
の試みがなされてきた。その多くは担体に多数の酵素と
抗体を結合させるものである。
【０００９】特開昭６３−５０３１３８では、薬物、ト
キシン、キレーター、ホウ素付加体などの検出し得る標
識の誘導体が結合した担体に抗体を結合させた。担体と
してはアミノデキストランを使用し、まずアミノデキス
トランにメソトキセートなどの薬物を結合させる。その
後、抗体の糖鎖を過よう素酸ナトリウムで酸化させて生
じるアルデヒド基とアミノデキストランのアミノ基を反
応させた後、水素化シアノホウ素ナトリウムにより還元
し共有結合させ、薬物、抗体、アミノデキストランの複
合体を作製した。
キシン、キレーター、ホウ素付加体などの検出し得る標
識の誘導体が結合した担体に抗体を結合させた。担体と
してはアミノデキストランを使用し、まずアミノデキス
トランにメソトキセートなどの薬物を結合させる。その
後、抗体の糖鎖を過よう素酸ナトリウムで酸化させて生
じるアルデヒド基とアミノデキストランのアミノ基を反
応させた後、水素化シアノホウ素ナトリウムにより還元
し共有結合させ、薬物、抗体、アミノデキストランの複
合体を作製した。
【００１０】特開平３−１５８７５８ではデキストラン
を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、生じたアルデヒド基
とアルカリ性フォスファターゼ及び抗体のアミノ基を反
応させた後、水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、酵
素、抗体、デキストランの複合体を作製した。
を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、生じたアルデヒド基
とアルカリ性フォスファターゼ及び抗体のアミノ基を反
応させた後、水素化ホウ素ナトリウムにより還元し、酵
素、抗体、デキストランの複合体を作製した。
【００１１】また、特表平６−５０９１６７ではデキス
トランなどのポリマーにジビニルスルフォンを反応させ
ビニル基を導入後、酵素及び抗体を反応させることによ
り酵素、抗体、デキストランの複合体を作製した。
トランなどのポリマーにジビニルスルフォンを反応させ
ビニル基を導入後、酵素及び抗体を反応させることによ
り酵素、抗体、デキストランの複合体を作製した。
【００１２】これらの方法により調製された複合体はい
ずれもポリマーに直接、２種の物質が結合することによ
り形成される複合体であった。これらの方法で調製され
た複合体はいずれも、担体を介さずに直接２つの物質を
結合させた場合と比較してその性能は向上したと言う。
しかしながら、これらの方法には次のような欠点があ
る。即ち、一つの担体に２種の物質を結合させる場合、
この担体に結合しうる物質の量には限りがあるため、一
方の物質を多く結合させれば他方の物質の結合量は少な
くなる点である。この問題点を解決できればさらに性能
の良い複合体となる可能性がある。
ずれもポリマーに直接、２種の物質が結合することによ
り形成される複合体であった。これらの方法で調製され
た複合体はいずれも、担体を介さずに直接２つの物質を
結合させた場合と比較してその性能は向上したと言う。
しかしながら、これらの方法には次のような欠点があ
る。即ち、一つの担体に２種の物質を結合させる場合、
この担体に結合しうる物質の量には限りがあるため、一
方の物質を多く結合させれば他方の物質の結合量は少な
くなる点である。この問題点を解決できればさらに性能
の良い複合体となる可能性がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、上記欠点を解消した高品質な酵素−タンパク質複合
体を新たに提供することである。
は、上記欠点を解消した高品質な酵素−タンパク質複合
体を新たに提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、高品質な
酵素−タンパク質結合体を得るために酵素−タンパク質
複合体の製造方法について検討を行った結果、担体に酵
素を結合させ、さらに酵素上にタンパク質を結合させる
ことでその目的が達成されることを見出し、さらに研究
を行い、ついに本発明の完成に至ったものである。
酵素−タンパク質結合体を得るために酵素−タンパク質
複合体の製造方法について検討を行った結果、担体に酵
素を結合させ、さらに酵素上にタンパク質を結合させる
ことでその目的が達成されることを見出し、さらに研究
を行い、ついに本発明の完成に至ったものである。
【００１５】即ち、本発明は、担体に２個以上の酵素が
結合し、その酵素の少なくとも１個以上に他の物質に特
異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵素−タンパ
ク質複合体に関するものである。さらには、このように
して得た酵素−タンパク質複合体の担体上にも、直接他
の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵
素−タンパク質複合体にも関するものである。したがっ
て本発明に係る酵素−タンパク質複合体においては、酵
素と他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合
した酵素が担体に多数結合しているか、又は、酵素と他
の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した酵
素及び担体に直接結合した他の物質に特異的に結合性を
示すタンパク質が、担体に多数結合していることとな
る。以下に本発明を詳細に説明する。
結合し、その酵素の少なくとも１個以上に他の物質に特
異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵素−タンパ
ク質複合体に関するものである。さらには、このように
して得た酵素−タンパク質複合体の担体上にも、直接他
の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合した酵
素−タンパク質複合体にも関するものである。したがっ
て本発明に係る酵素−タンパク質複合体においては、酵
素と他の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合
した酵素が担体に多数結合しているか、又は、酵素と他
の物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した酵
素及び担体に直接結合した他の物質に特異的に結合性を
示すタンパク質が、担体に多数結合していることとな
る。以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】本発明は、当初免疫組織化学、エンザイム
イムノアッセイの分野において使用できる酵素−タンパ
ク質複合体について検討する過程でなされたものである
が、他の分野に適用することに何ら制限はない。
イムノアッセイの分野において使用できる酵素−タンパ
ク質複合体について検討する過程でなされたものである
が、他の分野に適用することに何ら制限はない。
【００１７】本発明でいう担体とは、タンパク質、多糖
類などで特に制限はない。しかし、免疫測定の感度を上
げるには多数の酵素を担体に結合させることが望まし
い。従って、ある程度の大きさの分子量であることと、
酵素を結合させるための反応性官能基が存在することあ
るいは反応性官能基を導入できることが必要である。そ
のような目的を達成する担体の例としては、ペプチドポ
リマー及び／又は多糖類が挙げられ、さらにはそれらの
分子量が５，０００〜５００，０００、さらに好ましく
は１０，０００〜３００，０００の分子量のものが適し
ている。ただし、上記の分子量の範囲は一応の目安を示
したものであって、液中で沈澱や沈降を生じないもので
あれば上記範囲よりも大きな分子量のものであっても使
用可能であり、また、本発明の目的が達成されるのであ
れば上記範囲よりも小さい分子量のものでも使用可能で
ある。
類などで特に制限はない。しかし、免疫測定の感度を上
げるには多数の酵素を担体に結合させることが望まし
い。従って、ある程度の大きさの分子量であることと、
酵素を結合させるための反応性官能基が存在することあ
るいは反応性官能基を導入できることが必要である。そ
のような目的を達成する担体の例としては、ペプチドポ
リマー及び／又は多糖類が挙げられ、さらにはそれらの
分子量が５，０００〜５００，０００、さらに好ましく
は１０，０００〜３００，０００の分子量のものが適し
ている。ただし、上記の分子量の範囲は一応の目安を示
したものであって、液中で沈澱や沈降を生じないもので
あれば上記範囲よりも大きな分子量のものであっても使
用可能であり、また、本発明の目的が達成されるのであ
れば上記範囲よりも小さい分子量のものでも使用可能で
ある。
【００１８】本発明においては、例えば、結合性を有す
る２個以上の多数のアミノ基を含有するペプチドが担体
として適宜使用される。その１例としては、リジン、ア
ルギニン、オルニチン、グルタミン、各種塩基性アミノ
酸等α−アミノ基、ε−アミノ基その他を有するアミノ
基を有するペプチドが例示される。更にその具体例とし
ては、ε−アミノ基を有するリジンのポリマーであるポ
リリジンのほか、リジンを有するとともに他のアミノ酸
も有する各種ペプチドが挙げられる。そして後者のペプ
チドポリマーの例として、リジンとグリシンのランダム
コポリマー、リジンとセリンのランダムコポリマー、リ
ジンとグルタミン酸のランダムコポリマーなどが挙げら
れ、各種分子量のものが市販されている。
る２個以上の多数のアミノ基を含有するペプチドが担体
として適宜使用される。その１例としては、リジン、ア
ルギニン、オルニチン、グルタミン、各種塩基性アミノ
酸等α−アミノ基、ε−アミノ基その他を有するアミノ
基を有するペプチドが例示される。更にその具体例とし
ては、ε−アミノ基を有するリジンのポリマーであるポ
リリジンのほか、リジンを有するとともに他のアミノ酸
も有する各種ペプチドが挙げられる。そして後者のペプ
チドポリマーの例として、リジンとグリシンのランダム
コポリマー、リジンとセリンのランダムコポリマー、リ
ジンとグルタミン酸のランダムコポリマーなどが挙げら
れ、各種分子量のものが市販されている。
【００１９】一方、アルデヒド基、アミノ基あるいはそ
の他の活性基を導入した多糖類も、本発明における担体
として使用することができる。多糖類としては、デキス
トラン、アガロース、デキストリン、可溶性澱粉等が例
示される。アルデヒド基を有する多糖類は、多糖類に過
よう素酸ナトリウムを反応させることにより容易に調製
できる。また、アミノ基も公知の方法により多糖類に導
入できる。例えばアミノ基を有するデキストランは、デ
キストランを過よう素酸ナトリウムで処理しアルデヒド
基を生成させた後、ジアミンと反応させ水素化ホウ素ナ
トリウムにて還元することにより調製できる。また、多
糖類への活性基の導入も公知の方法で行える。例えば、
デキストランにジビニルスルホンを反応させることによ
り、ビニル基を有するデキストランが得られる。
の他の活性基を導入した多糖類も、本発明における担体
として使用することができる。多糖類としては、デキス
トラン、アガロース、デキストリン、可溶性澱粉等が例
示される。アルデヒド基を有する多糖類は、多糖類に過
よう素酸ナトリウムを反応させることにより容易に調製
できる。また、アミノ基も公知の方法により多糖類に導
入できる。例えばアミノ基を有するデキストランは、デ
キストランを過よう素酸ナトリウムで処理しアルデヒド
基を生成させた後、ジアミンと反応させ水素化ホウ素ナ
トリウムにて還元することにより調製できる。また、多
糖類への活性基の導入も公知の方法で行える。例えば、
デキストランにジビニルスルホンを反応させることによ
り、ビニル基を有するデキストランが得られる。
【００２０】本発明において使用する酵素としては、２
個以上のアミノ基を有するものであればすべての酵素が
使用可能であって、免疫測定において一般的に使用され
る酵素が適宜使用される。その例として限定はしない
が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ等が挙げられる。
個以上のアミノ基を有するものであればすべての酵素が
使用可能であって、免疫測定において一般的に使用され
る酵素が適宜使用される。その例として限定はしない
が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ等が挙げられる。
【００２１】本発明でいう他の物質に特異的な結合性を
示すタンパク質とは、特定の抗原と結合する抗体、特定
のリガンドと結合するレセプター等である。例えば、特
定の抗原と結合するモノクローナル抗体及びポリクロー
ナル抗体、ビオチンと特異的に結合するアビジン及びス
トレプトアビジン、抗体と特異的に結合するプロテイン
Ａ及びプロテインＧ、糖鎖と特異的に結合するレクチ
ン、ヒアルロン酸と特異的に結合するヒアルロン酸結合
タンパク質等である。また、これらの他の物質に特異的
な結合性を示すタンパク質の分子中に存在する、特定の
物質に特異的に結合するタンパク質断片をも含有する。
例えば、抗体の断片であるF(ab')２、Fab'、Fabc'など
である。
示すタンパク質とは、特定の抗原と結合する抗体、特定
のリガンドと結合するレセプター等である。例えば、特
定の抗原と結合するモノクローナル抗体及びポリクロー
ナル抗体、ビオチンと特異的に結合するアビジン及びス
トレプトアビジン、抗体と特異的に結合するプロテイン
Ａ及びプロテインＧ、糖鎖と特異的に結合するレクチ
ン、ヒアルロン酸と特異的に結合するヒアルロン酸結合
タンパク質等である。また、これらの他の物質に特異的
な結合性を示すタンパク質の分子中に存在する、特定の
物質に特異的に結合するタンパク質断片をも含有する。
例えば、抗体の断片であるF(ab')２、Fab'、Fabc'など
である。
【００２２】本発明においては、まず担体と酵素の複合
体を調製する。その方法は、例えば担体のアミノ基をチ
オール化し、アミノ基をマレイミド化した酵素と混合す
る。チオール基とマレイミド基は速やかに反応し共有結
合するので、酵素が結合した担体が得られる。
体を調製する。その方法は、例えば担体のアミノ基をチ
オール化し、アミノ基をマレイミド化した酵素と混合す
る。チオール基とマレイミド基は速やかに反応し共有結
合するので、酵素が結合した担体が得られる。
【００２３】担体のアミノ基にチオール基を導入するに
は、Ｓ−アセチルメチルカプト無水コハク酸（S-acetyl
mercaptosuccinic anhydride）、Ｎ−スクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（N-succin
imidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate、SPDP)、Ｓ−
アセチルチオグリコリックアシドＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysucci
nimide、SATA)などを用いる方法が知られている。これ
らの試薬はアミノ基と反応し、ブロックされたチオール
基が導入される。その後、S-acetylmercaptosuccinic a
nhydride、SATAを用いた場合はHydroxylamine、SPDPを
用いた場合はジチオスレイトール(dithiothreitol、DT
T)で処理することによりチオール基をブロックしている
保護基を除去し、チオール基を生成する。
は、Ｓ−アセチルメチルカプト無水コハク酸（S-acetyl
mercaptosuccinic anhydride）、Ｎ−スクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（N-succin
imidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate、SPDP)、Ｓ−
アセチルチオグリコリックアシドＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（S-acetylthioglycolic acid N-hydroxysucci
nimide、SATA)などを用いる方法が知られている。これ
らの試薬はアミノ基と反応し、ブロックされたチオール
基が導入される。その後、S-acetylmercaptosuccinic a
nhydride、SATAを用いた場合はHydroxylamine、SPDPを
用いた場合はジチオスレイトール(dithiothreitol、DT
T)で処理することによりチオール基をブロックしている
保護基を除去し、チオール基を生成する。
【００２４】アミノ基にマレイミド基を導入するには、
１分子中にマレイミド基とスクシンイミドエステル基を
有する化合物を使用する。例えば、一端にマレイミド基
を、他端にＮ−ハイドロキシスクシンイミド基を有する
二価の架橋剤を用いればよい。例えば、Ｎ−（６−マレ
イミドカプロイロキシ）スクシンイミド（N-(6-Maleimi
docaproyloxy)succinimide（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（４−マ
レイミドブチリロキシ）スクシンイミド（N-(4-Maleimi
dobutyryloxy)succinimide（ＧＭＢＳ）などである。
１分子中にマレイミド基とスクシンイミドエステル基を
有する化合物を使用する。例えば、一端にマレイミド基
を、他端にＮ−ハイドロキシスクシンイミド基を有する
二価の架橋剤を用いればよい。例えば、Ｎ−（６−マレ
イミドカプロイロキシ）スクシンイミド（N-(6-Maleimi
docaproyloxy)succinimide（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（４−マ
レイミドブチリロキシ）スクシンイミド（N-(4-Maleimi
dobutyryloxy)succinimide（ＧＭＢＳ）などである。
【００２５】１分子中にマレイミド基とスクシンイミド
基を併有する化合物としては、上記したＥＭＣＳ、ＧＭ
ＢＳのほか、次のものが非限定的に例示される：Ｎ−ス
クシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（N-Succin
imidyl-N-maleimidoacetate）、Ｎ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（N-Succinimidyl
-4-(N-maleimido) butyrate)、Ｎ−スクシミジル−６−
（マレイミド）ヘキサノエート（N-Succimidyl-6-(N-ma
leimido) hexanoate、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclo
hexane-1-carboxylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−
（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（N-succinimidyl-m-
(N-maleimido) benzoate)、Ｎ−スクシミジル−ｐ−
（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Succ
inimidyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate)、Ｎ−ス
ルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（N-Sulfosucci
nimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbox
ylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミ
ド）ベンゾエート（N-Succinimidyl-m-(N-maleimido) b
enzoate)、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マ
レイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Sulfosuccini
midyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate) など。
基を併有する化合物としては、上記したＥＭＣＳ、ＧＭ
ＢＳのほか、次のものが非限定的に例示される：Ｎ−ス
クシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（N-Succin
imidyl-N-maleimidoacetate）、Ｎ−スクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（N-Succinimidyl
-4-(N-maleimido) butyrate)、Ｎ−スクシミジル−６−
（マレイミド）ヘキサノエート（N-Succimidyl-6-(N-ma
leimido) hexanoate、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（N-Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclo
hexane-1-carboxylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−
（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（N-succinimidyl-m-
(N-maleimido) benzoate)、Ｎ−スクシミジル−ｐ−
（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Succ
inimidyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate)、Ｎ−ス
ルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（N-Sulfosucci
nimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbox
ylate)、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミ
ド）ベンゾエート（N-Succinimidyl-m-(N-maleimido) b
enzoate)、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マ
レイミドフェニル）−４−ブチレート（N-Sulfosuccini
midyl-p-(N-maleimidophenyl)-4-butyrate) など。
【００２６】本発明においては担体にさらに別の物質を
結合させる必要はないため、可能な限り酵素が多数結合
した担体−酵素複合体を調製することが望ましい。その
目的を達成する手法の一例を次に示す。前記の酵素−担
体複合体にマレイミド化試薬を大過剰加えて反応させ、
複合体上に残存したアミノ基のほとんどすべてにマレイ
ミド基を導入する。そして、酵素に少なくとも１個以上
のアミノ基が残存する条件で、酵素をチオール化する。
これは後にこの酵素上に残存するアミノ基を利用して、
他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質を結合させ
るためである。このチオール化した酵素と、マレイミド
基を導入した酵素−担体複合体を反応させる。
結合させる必要はないため、可能な限り酵素が多数結合
した担体−酵素複合体を調製することが望ましい。その
目的を達成する手法の一例を次に示す。前記の酵素−担
体複合体にマレイミド化試薬を大過剰加えて反応させ、
複合体上に残存したアミノ基のほとんどすべてにマレイ
ミド基を導入する。そして、酵素に少なくとも１個以上
のアミノ基が残存する条件で、酵素をチオール化する。
これは後にこの酵素上に残存するアミノ基を利用して、
他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質を結合させ
るためである。このチオール化した酵素と、マレイミド
基を導入した酵素−担体複合体を反応させる。
【００２７】その後、残存したマレイミド基をチオール
基を有する物質でブロックする。ブロックに用いられる
チオール基を有する物質の例としてはメルカプトエタノ
ール、システアミン塩酸塩、システインなどが挙げられ
る。メルカプトエタノールでブロックした場合には、酵
素−担体複合体にはチオール化した酵素上にのみアミノ
基が存在する。システアミン塩酸塩、システインでブロ
ックした場合、酵素−担体複合体にはチオール化した酵
素上にアミノ基が存在し、さらに残存したマレイミド基
をブロックした試薬に存在するアミノ基が加わる。
基を有する物質でブロックする。ブロックに用いられる
チオール基を有する物質の例としてはメルカプトエタノ
ール、システアミン塩酸塩、システインなどが挙げられ
る。メルカプトエタノールでブロックした場合には、酵
素−担体複合体にはチオール化した酵素上にのみアミノ
基が存在する。システアミン塩酸塩、システインでブロ
ックした場合、酵素−担体複合体にはチオール化した酵
素上にアミノ基が存在し、さらに残存したマレイミド基
をブロックした試薬に存在するアミノ基が加わる。
【００２８】上記酵素−担体複合体に他の物質に特異的
な結合性を示すタンパク質を結合させるには、酵素−担
体複合体を調製した際と同様にチオール基とマレイミド
基の反応を利用すればよい。例えば、酵素−担体複合体
に存在するアミノ基に上述したマレイミド基を導入する
試薬を反応させる。次に他の物質に特異的な結合性を示
すタンパク質に同じく上述したチオール基を導入する試
薬を反応させる。この両者を混合すれば酵素−他の物質
に特異的な結合性を示すタンパク質−担体の複合体が完
成する。他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質
に、他の物質との結合に関与しないＳ−Ｓ結合が存在す
るなら、チオール化する代わりにシステアミン塩酸塩、
ＤＴＴなどで還元することによりチオール基を生成させ
ることも可能である。
な結合性を示すタンパク質を結合させるには、酵素−担
体複合体を調製した際と同様にチオール基とマレイミド
基の反応を利用すればよい。例えば、酵素−担体複合体
に存在するアミノ基に上述したマレイミド基を導入する
試薬を反応させる。次に他の物質に特異的な結合性を示
すタンパク質に同じく上述したチオール基を導入する試
薬を反応させる。この両者を混合すれば酵素−他の物質
に特異的な結合性を示すタンパク質−担体の複合体が完
成する。他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質
に、他の物質との結合に関与しないＳ−Ｓ結合が存在す
るなら、チオール化する代わりにシステアミン塩酸塩、
ＤＴＴなどで還元することによりチオール基を生成させ
ることも可能である。
【００２９】また、他の物質に特異的な結合性を示すタ
ンパク質が糖鎖を有するならばそれを利用してもよい。
例えば、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質の
糖鎖を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し生成したアルデヒ
ド基と、酵素−担体複合体上のアミノ基を反応させた
後、還元することにより両者を結合させることも可能で
ある。
ンパク質が糖鎖を有するならばそれを利用してもよい。
例えば、他の物質に特異的な結合性を示すタンパク質の
糖鎖を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し生成したアルデヒ
ド基と、酵素−担体複合体上のアミノ基を反応させた
後、還元することにより両者を結合させることも可能で
ある。
【００３０】完成した複合体は、酵素−担体複合体の調
製時の最後に担体上に残存するマレイミド基をメルカプ
トエタノールでブロックした場合は、酵素上にのみ他の
物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した複合
体となる。また、酵素−担体複合体の調製時の最後に担
体上に残存するマレイミド基をシステアミン塩酸塩、あ
るいはシステインでブロックした場合は、酵素上及び担
体上のいずれにも他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質が結合した複合体が形成される。
製時の最後に担体上に残存するマレイミド基をメルカプ
トエタノールでブロックした場合は、酵素上にのみ他の
物質に特異的に結合性を示すタンパク質が結合した複合
体となる。また、酵素−担体複合体の調製時の最後に担
体上に残存するマレイミド基をシステアミン塩酸塩、あ
るいはシステインでブロックした場合は、酵素上及び担
体上のいずれにも他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質が結合した複合体が形成される。
【００３１】本発明の実施態様の一つとして、担体とし
てポリ−Ｌ−リジン、酵素としてペルオキシダーゼ、他
の物質に特異的な結合性を示すタンパク質として抗体断
片であるF(ab')２を用いた場合の酵素−タンパク質−担
体複合体の製造について、以下に概説する。
てポリ−Ｌ−リジン、酵素としてペルオキシダーゼ、他
の物質に特異的な結合性を示すタンパク質として抗体断
片であるF(ab')２を用いた場合の酵素−タンパク質−担
体複合体の製造について、以下に概説する。
【００３２】 チオール基結合担体の作成 ポリ−Ｌ−リジン含有溶液にＳ−アセチルメルカプトス
クシニックアンハイドライドを加え反応させた後、ヒド
ロキシルアミンを反応させ、担体にチオール基を導入す
る（担体−ＳＨの作成）。但し、担体はすべてチオール
化するのではなく、いくつかのアミノ基は遊離のまま残
しておく。
クシニックアンハイドライドを加え反応させた後、ヒド
ロキシルアミンを反応させ、担体にチオール基を導入す
る（担体−ＳＨの作成）。但し、担体はすべてチオール
化するのではなく、いくつかのアミノ基は遊離のまま残
しておく。
【００３３】 マレイミド基結合ペルオキシダーゼの
作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にＥＭＣＳを反
応させ、マレイミド基結合ペルオキシダーゼ（Ｍ−ＰＯ
Ｄ）を作成する。
作成 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にＥＭＣＳを反
応させ、マレイミド基結合ペルオキシダーゼ（Ｍ−ＰＯ
Ｄ）を作成する。
【００３４】 ＰＯＤ−ポリ−Ｌ−リジン複合体１の
作成 チオール基結合担体とＭ−ＰＯＤとを混合、反応させる
ことにより、複合体（担体−Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ）を作成す
る。反応後、メルカプトエタノールにより残存するマレ
イミド基をブロックする。この反応により、上記したＳ
−Ｍ−ＰＯＤ及びＳＨ基が導入される他、遊離のアミノ
基も有する担体（複合体）が得られる。
作成 チオール基結合担体とＭ−ＰＯＤとを混合、反応させる
ことにより、複合体（担体−Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ）を作成す
る。反応後、メルカプトエタノールにより残存するマレ
イミド基をブロックする。この反応により、上記したＳ
−Ｍ−ＰＯＤ及びＳＨ基が導入される他、遊離のアミノ
基も有する担体（複合体）が得られる。
【００３５】 マレイミド基結合前記複合体の作成 前記複合体に大過剰のＥＭＣＳ溶液を加えて反応させ、
前記複合体のすべてのアミノ基にマレイミド基を導入す
る。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、マレイミド基、
ＳＨ基とＥＭＣＳが結合した後ＥＭＣＳのＮ−ハイドロ
キシスクシニックアンハイドライドが加水分解して生じ
るＣＯＯＨ基、が導入された担体（複合体）が得られ
る。
前記複合体のすべてのアミノ基にマレイミド基を導入す
る。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、マレイミド基、
ＳＨ基とＥＭＣＳが結合した後ＥＭＣＳのＮ−ハイドロ
キシスクシニックアンハイドライドが加水分解して生じ
るＣＯＯＨ基、が導入された担体（複合体）が得られ
る。
【００３６】 チオール基結合ペルオキシダーゼの作
成 ＰＯＤにＳ−アセチルチオグリコリックアシド−Ｎ−ハ
イドロキシスクシニックアンハイドライドを反応させた
後、ヒドロキシルアミンを反応させ、ＰＯＤにチオール
基を導入する。その際、ＰＯＤに遊離のアミノ基が残る
ような条件で反応させる（ＳＨ−ＰＯＤ−ＮＨ２）。
成 ＰＯＤにＳ−アセチルチオグリコリックアシド−Ｎ−ハ
イドロキシスクシニックアンハイドライドを反応させた
後、ヒドロキシルアミンを反応させ、ＰＯＤにチオール
基を導入する。その際、ＰＯＤに遊離のアミノ基が残る
ような条件で反応させる（ＳＨ−ＰＯＤ−ＮＨ２）。
【００３７】 ＰＯＤ−ポリ−Ｌ−リジン複合体２の
作成 ＳＨ−ＰＯＤ−ＮＨ２とで得た複合体を反応させるこ
とにより、担体に結合したマレイミド基にチオール化し
たペルオキシダーゼを導入する。その後、残存したマレ
イミド基をメルカプトエタノールで処理し、ＯＨ基に転
換する。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−Ｐ
ＯＤ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基が導入された、担体
（酵素複合体）が得られる。
作成 ＳＨ−ＰＯＤ−ＮＨ２とで得た複合体を反応させるこ
とにより、担体に結合したマレイミド基にチオール化し
たペルオキシダーゼを導入する。その後、残存したマレ
イミド基をメルカプトエタノールで処理し、ＯＨ基に転
換する。この反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−Ｐ
ＯＤ−ＮＨ２、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基が導入された、担体
（酵素複合体）が得られる。
【００３８】 マレイミド基結合ＰＯＤを有するＰＯ
Ｄ−ポリ−Ｌ−リジン複合体２の作成 上記酵素複合体にＥＭＣＳ溶液を反応させ、複合体のＰ
ＯＤのアミノ基をマレイミド化する。Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、
Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基を有する複合
体が形成される。
Ｄ−ポリ−Ｌ−リジン複合体２の作成 上記酵素複合体にＥＭＣＳ溶液を反応させ、複合体のＰ
ＯＤのアミノ基をマレイミド化する。Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、
Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基を有する複合
体が形成される。
【００３９】 還元した抗体断片の作成 ヤギ抗マウスＩｇＧをペプシン処理してそのF(ab')２断
片を得、これにシステアミン塩酸塩を反応させて還元し
た抗体断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を得る。
片を得、これにシステアミン塩酸塩を反応させて還元し
た抗体断片（ＳＨ−Ｆａｂ'）を得る。
【００４０】 酵素抗体複合体の作成 還元した抗体断片とで得た複合体を混合させることに
より、ＰＯＤのマレイミド基に抗体断片が結合する。こ
の反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ−
Ｓ−Ｆａｂ'、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ、ＣＯＯＨ基、ＯＨ
基が結合した担体（酵素抗体複合体）が得られる。必要
あれば、更にメルカプトエタノールで処理して、Ｓ−Ｐ
ＯＤ−Ｍの未反応のマレイミド基をＯＨ基に転換して、
マレイミド基をブロックしてもよい。
より、ＰＯＤのマレイミド基に抗体断片が結合する。こ
の反応により、Ｓ−Ｍ−ＰＯＤ、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ−
Ｓ−Ｆａｂ'、Ｍ−Ｓ−ＰＯＤ−Ｍ、ＣＯＯＨ基、ＯＨ
基が結合した担体（酵素抗体複合体）が得られる。必要
あれば、更にメルカプトエタノールで処理して、Ｓ−Ｐ
ＯＤ−Ｍの未反応のマレイミド基をＯＨ基に転換して、
マレイミド基をブロックしてもよい。
【００４１】本発明に係わる酵素タンパク質複合体は、
上記した構造を採ることに初めて成功したものであり、
担体上の酵素が極めて多いためこれを発色させた場合、
強い発色が得られる。また担体上は多数の酵素で占有さ
れているにもかかわらず、他の物質に特異的に結合性を
示すタンパク質が酵素上に結合することができるため、
結果として多数の他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質を複合体に結合させることができ、従って他の物
質との結合の確率は極めて高くなる。
上記した構造を採ることに初めて成功したものであり、
担体上の酵素が極めて多いためこれを発色させた場合、
強い発色が得られる。また担体上は多数の酵素で占有さ
れているにもかかわらず、他の物質に特異的に結合性を
示すタンパク質が酵素上に結合することができるため、
結果として多数の他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質を複合体に結合させることができ、従って他の物
質との結合の確率は極めて高くなる。
【００４２】したがって本発明に係る酵素−タンパク質
複合体によれば、他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質が多数存在するため、微量にしか存在しない測定
対象物質であってもこれを補捉、結合することができ
る。そして該タンパク質のどれかひとつに測定対象物質
が結合した場合、この酵素−タンパク質複合体には多数
の酵素が結合しているため、非常に強い発色が得られ
る。すなわち本発明によれば、極く微量の物質であって
も、これを高感度で検出、測定することができ、正確な
測定が可能となる。したがって、本複合体を使用するこ
とにより、すぐれた測定キットを組むことができる。
複合体によれば、他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質が多数存在するため、微量にしか存在しない測定
対象物質であってもこれを補捉、結合することができ
る。そして該タンパク質のどれかひとつに測定対象物質
が結合した場合、この酵素−タンパク質複合体には多数
の酵素が結合しているため、非常に強い発色が得られ
る。すなわち本発明によれば、極く微量の物質であって
も、これを高感度で検出、測定することができ、正確な
測定が可能となる。したがって、本複合体を使用するこ
とにより、すぐれた測定キットを組むことができる。
【００４３】また、本発明においては、酵素−タンパク
質複合体を創製するに際して、既述したように、ポリリ
ジンを最初からＥＭＣＳで処理するのではなく（沈殿が
生じて使用できなくなる）、最初にＳ−アセチルメルカ
プトエチルサクシニック アンハイドライドで処理して
担体のアミノ基の一部をメルカプト化し、これにマレイ
ミド化した酵素を結合せしめた後、大過剰のＥＭＣＳで
処理することによりマレイミド化及びカルボキシル化
し、次いでチオール基結合酵素を反応させれば、最初の
酵素の結合数は少数であっても、最終的には多数の酵素
を結合させることがはじめて可能となり、しかも、沈殿
や沈降することなく、溶液状態で多数の酵素を結合させ
ることができるという著効が奏される。
質複合体を創製するに際して、既述したように、ポリリ
ジンを最初からＥＭＣＳで処理するのではなく（沈殿が
生じて使用できなくなる）、最初にＳ−アセチルメルカ
プトエチルサクシニック アンハイドライドで処理して
担体のアミノ基の一部をメルカプト化し、これにマレイ
ミド化した酵素を結合せしめた後、大過剰のＥＭＣＳで
処理することによりマレイミド化及びカルボキシル化
し、次いでチオール基結合酵素を反応させれば、最初の
酵素の結合数は少数であっても、最終的には多数の酵素
を結合させることがはじめて可能となり、しかも、沈殿
や沈降することなく、溶液状態で多数の酵素を結合させ
ることができるという著効が奏される。
【００４４】よって、本発明によれば、ごく微量の試
料、非常に希釈された試料であっても、正確にその物質
を分析することができるという著効が奏される。
料、非常に希釈された試料であっても、正確にその物質
を分析することができるという著効が奏される。
【００４５】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【００４６】
【実施例１】酵素担体複合体の製造 マレイミド基結合ペルオキシダーゼを次のように調製し
た。２．４ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶解した１００ｍｇの西洋ワサビペルオキ
シダーゼに０．６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）に溶解した２０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０
分反応させた。その後、セファデックスＧ２５（ファル
マシア製）にてゲルろ過を行い４０３ｎｍの吸光度を測
定し、そのピークを集め限外濾過にて濃縮した。
た。２．４ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）に溶解した１００ｍｇの西洋ワサビペルオキ
シダーゼに０．６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）に溶解した２０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０
分反応させた。その後、セファデックスＧ２５（ファル
マシア製）にてゲルろ過を行い４０３ｎｍの吸光度を測
定し、そのピークを集め限外濾過にて濃縮した。
【００４７】次に、チオール基結合ポリリジンを以下の
通り調製した。１ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．５）に溶解した５ｍｇのポリ−Ｌ−リジン
ハイドロブロマイド（シグマ社製、分子量３７６００）
に２０μｌのＤＭＦに溶解した６ｍｇのＳ−アセチルメ
ルカプトスクシニックアンハイドライドを加え、３０
℃、２０分間反応させた。その後、１００μｌの０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）、１０μｌのＥＤＴＡ
（ｐＨ７）、１００μｌの１Ｍハイドロキシルアミン
（ｐＨ７）を加え、３０℃、５分間反応させた。次に反
応液をセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２３０ｎ
ｍの吸光度のピークを集め、限外ろ過にて濃縮した。こ
の場合、全アミノ基をチオール化するものではない。
通り調製した。１ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ６．５）に溶解した５ｍｇのポリ−Ｌ−リジン
ハイドロブロマイド（シグマ社製、分子量３７６００）
に２０μｌのＤＭＦに溶解した６ｍｇのＳ−アセチルメ
ルカプトスクシニックアンハイドライドを加え、３０
℃、２０分間反応させた。その後、１００μｌの０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）、１０μｌのＥＤＴＡ
（ｐＨ７）、１００μｌの１Ｍハイドロキシルアミン
（ｐＨ７）を加え、３０℃、５分間反応させた。次に反
応液をセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２３０ｎ
ｍの吸光度のピークを集め、限外ろ過にて濃縮した。こ
の場合、全アミノ基をチオール化するものではない。
【００４８】マレイミド基結合ペルオキシダーゼとチオ
ール基結合ポリ−Ｌ−リジンを混合し４℃、１８時間反
応させた。０．１Ｍメルカプトエタノールを１０分の１
容加えて３０℃、２０分間反応させた後、ウルトロゲル
ＡｃＡ４４（バイオセプラ社製）にてゲルろ過し、各分
画の４０３ｎｍの吸光度を測定した。西洋ワサビペルオ
キシダーゼとポリ−Ｌ−リジンの複合体は高分子画分に
存在した。この画分を限外ろ過にて緩衝液を０．１Ｍり
ん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に交換した後、３
ｍｌまで濃縮した。複合体の西洋ワサビペルオキシダー
ゼの量は２０ｍｇであった。これを酵素担体複合体１と
した。
ール基結合ポリ−Ｌ−リジンを混合し４℃、１８時間反
応させた。０．１Ｍメルカプトエタノールを１０分の１
容加えて３０℃、２０分間反応させた後、ウルトロゲル
ＡｃＡ４４（バイオセプラ社製）にてゲルろ過し、各分
画の４０３ｎｍの吸光度を測定した。西洋ワサビペルオ
キシダーゼとポリ−Ｌ−リジンの複合体は高分子画分に
存在した。この画分を限外ろ過にて緩衝液を０．１Ｍり
ん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に交換した後、３
ｍｌまで濃縮した。複合体の西洋ワサビペルオキシダー
ゼの量は２０ｍｇであった。これを酵素担体複合体１と
した。
【００４９】上記複合体に０．７５ｍｌのＤＭＦに溶解
した５０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０分間反応さ
せた。生成物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、
４０３ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮し
た。これをマレイミド基結合酵素担体複合体１とした。
この場合、全アミノ基はマレイミド化し、チオール基は
カルボキシル基に転換される。
した５０ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３０分間反応さ
せた。生成物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、
４０３ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮し
た。これをマレイミド基結合酵素担体複合体１とした。
この場合、全アミノ基はマレイミド化し、チオール基は
カルボキシル基に転換される。
【００５０】次に、チオール基結合西洋ワサビペルオキ
シダーゼを以下のように調製した。２．５ｍｌの０．１
Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１
００ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに０．５ｍｌの
ＤＭＦに溶解した２．５ｍｇのＳ−アセチルメルカプト
チオグリコリックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＳＡＴＡ）を加え、室温で３０分間反応さ
せた。その後、１００μｌのＥＤＴＡ（ｐＨ７）、０．
５ｍｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え室温
で５分間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５に
てゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度を持つ画分を濃縮し
た。チオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼのチオ
ール基をジャーナル オブ イムノアッセイ（Journal
of Immunoassay）, 4(3) p209〜327に記載された公知の
方法で測定した。その結果、１分子の西洋ワサビペルオ
キシダーゼに存在するチオール基は１．３と計算され
た。西洋ワサビペルオキシダーゼには３以上のアミノ基
が存在する。従って、上記条件で調製されたチオール基
結合西洋ワサビペルオキシダーゼには少なくとも１以上
のアミノ基が残存することが確認された。
シダーゼを以下のように調製した。２．５ｍｌの０．１
Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した１
００ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに０．５ｍｌの
ＤＭＦに溶解した２．５ｍｇのＳ−アセチルメルカプト
チオグリコリックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＳＡＴＡ）を加え、室温で３０分間反応さ
せた。その後、１００μｌのＥＤＴＡ（ｐＨ７）、０．
５ｍｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え室温
で５分間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５に
てゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度を持つ画分を濃縮し
た。チオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼのチオ
ール基をジャーナル オブ イムノアッセイ（Journal
of Immunoassay）, 4(3) p209〜327に記載された公知の
方法で測定した。その結果、１分子の西洋ワサビペルオ
キシダーゼに存在するチオール基は１．３と計算され
た。西洋ワサビペルオキシダーゼには３以上のアミノ基
が存在する。従って、上記条件で調製されたチオール基
結合西洋ワサビペルオキシダーゼには少なくとも１以上
のアミノ基が残存することが確認された。
【００５１】マレイミド基結合酵素担体複合体とチオー
ル基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを混合し、４℃、
１８時間反応させた。生成物に０．１Ｍメルカプトエタ
ノールを１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４でゲルろ過し、４０３ｎｍ
の吸光度を測定した。複合体は高分子画分に溶出され
た。これを酵素担体複合体２とした。
ル基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを混合し、４℃、
１８時間反応させた。生成物に０．１Ｍメルカプトエタ
ノールを１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４でゲルろ過し、４０３ｎｍ
の吸光度を測定した。複合体は高分子画分に溶出され
た。これを酵素担体複合体２とした。
【００５２】また、マレイミド基結合酵素担体複合体と
チオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを混合し、
４℃、１８時間反応させたのち、０．１Ｍシステアミン
塩酸塩を１０分の１容加え、上記と同様に精製して得ら
れた複合体を酵素担体複合体３とした。酵素担体複合体
２及び酵素担体複合体３に結合した西洋ワサビペルオキ
シダーゼの量はいずれも４０ｍｇであった。
チオール基結合西洋ワサビペルオキシダーゼを混合し、
４℃、１８時間反応させたのち、０．１Ｍシステアミン
塩酸塩を１０分の１容加え、上記と同様に精製して得ら
れた複合体を酵素担体複合体３とした。酵素担体複合体
２及び酵素担体複合体３に結合した西洋ワサビペルオキ
シダーゼの量はいずれも４０ｍｇであった。
【００５３】
【実施例２】酵素第二抗体複合体の製造１ ヤギ抗マウスＩｇＧは、公知の方法により、そのF(ab')
２断片を調製した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Fab'は以下の
方法で得た。０．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧ
F(ab')２に５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した０．１Ｍシステアミ
ン塩酸塩を５５μｌ加え３７℃、１．５時間反応させ
た。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２
８０ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮し
た。
２断片を調製した。ヤギ抗マウスＩｇＧ Fab'は以下の
方法で得た。０．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのヤギ抗マウスＩｇＧ
F(ab')２に５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した０．１Ｍシステアミ
ン塩酸塩を５５μｌ加え３７℃、１．５時間反応させ
た。反応物はセファデックスＧ２５にてゲルろ過し、２
８０ｎｍの吸光度のピークを集め限外ろ過にて濃縮し
た。
【００５４】マレイミド基結合酵素担体複合体２の調製
は以下の通り行った。１．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した５ｍｇの酵素担
体複合体２に３７５μｌのＤＭＦに溶解した１０ｍｇの
ＥＭＣＳを加え、室温で３０分反応させた。反応物はセ
ファデックスＧ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光
度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。
は以下の通り行った。１．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した５ｍｇの酵素担
体複合体２に３７５μｌのＤＭＦに溶解した１０ｍｇの
ＥＭＣＳを加え、室温で３０分反応させた。反応物はセ
ファデックスＧ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光
度のピークを集め限外ろ過にて濃縮した。
【００５５】マレイミド基結合酵素担体複合体２とヤギ
抗マウスＩｇＧFab'を混合し、４℃、１８時間反応させ
た。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の
１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウル
トロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４
０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子
画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
抗マウスＩｇＧFab'を混合し、４℃、１８時間反応させ
た。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを反応液の
１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた後、ウル
トロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０ｎｍ、４
０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有する高分子
画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
【００５６】
【実施例３】酵素第二抗体複合体の製造２ マレイミド基結合酵素担体複合体３の調製は以下の通り
行った。１．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解した５ｍｇの酵素担体複合体３に
３７５μｌのＤＭＦに溶解した１０ｍｇのＥＭＣＳを加
え、室温で３０分反応させた。反応物はセファデックス
Ｇ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度のピークを
集め限外ろ過にて濃縮した。
行った。１．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解した５ｍｇの酵素担体複合体３に
３７５μｌのＤＭＦに溶解した１０ｍｇのＥＭＣＳを加
え、室温で３０分反応させた。反応物はセファデックス
Ｇ２５にてゲルろ過し、４０３ｎｍの吸光度のピークを
集め限外ろ過にて濃縮した。
【００５７】上記と同様の方法で調製したヤギ抗マウス
ＩｇＧFab'とマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合
し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメル
カプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０
℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にて
ゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定
し両方のピークを有する高分子画分が酵素−Fab'−担体
複合体であった。
ＩｇＧFab'とマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合
し、４℃、１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメル
カプトエタノールを反応液の１０分の１容加え、３０
℃、２０分反応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にて
ゲルろ過した。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定
し両方のピークを有する高分子画分が酵素−Fab'−担体
複合体であった。
【００５８】
【実施例４】酵素第一抗体複合体の製造１ ウサギ抗ｐ５３遺伝子産物抗体（ニチレイ製）を公知の
方法に従って、ペプシン消化し、ウサギ抗ｐ５３遺伝子
産物F(ab')２断片を調製した。ウサギ抗ｐ５３遺伝子産
物Fab'は以下の方法で得た。０．５ｍｌの０．１Ｍりん
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのウサ
ギ抗ｐ５３遺伝子産物F(ab')２に５ｍＭＥＤＴＡを含む
０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した
０．１Ｍシステアミン塩酸塩を５５μｌ加え３７℃、
１．５時間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５
にてゲルろ過し、２８０ｎｍの吸光度のピークを集め限
外ろ過にて濃縮した。このようにして得た、ウサギ抗ｐ
５３遺伝子産物Fab'と実施例３と同様の方法で得たマレ
イミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時
間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノール
を反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させ
た後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８
０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有
する高分子画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
方法に従って、ペプシン消化し、ウサギ抗ｐ５３遺伝子
産物F(ab')２断片を調製した。ウサギ抗ｐ５３遺伝子産
物Fab'は以下の方法で得た。０．５ｍｌの０．１Ｍりん
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した５ｍｇのウサ
ギ抗ｐ５３遺伝子産物F(ab')２に５ｍＭＥＤＴＡを含む
０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に溶解した
０．１Ｍシステアミン塩酸塩を５５μｌ加え３７℃、
１．５時間反応させた。反応物はセファデックスＧ２５
にてゲルろ過し、２８０ｎｍの吸光度のピークを集め限
外ろ過にて濃縮した。このようにして得た、ウサギ抗ｐ
５３遺伝子産物Fab'と実施例３と同様の方法で得たマレ
イミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時
間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノール
を反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させ
た後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８
０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有
する高分子画分が酵素−Fab'−担体複合体であった。
【００５９】
【実施例５】酵素第一抗体複合体の製造２ チオール基結合抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ニチレ
イ製）の調製を次のように行った。１ｍｌのＰＢＳに溶
解した５ｍｇの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体に５０μ
ｌのＤＭＦに溶解した０．１ｍｇのＳＡＴＡを加え、室
温で３０分間反応させた。その後、１０μｌの０．１Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７）、１００μｌの１Ｍヒドロキシル
アミン（ｐＨ７）を加え、室温で５分間反応させた。生
成物はセファデックスＧ２５によりゲルろ過にて精製し
た。このようにして得たチオール基結合抗ＣＤ３４モノ
クローナル抗体と、実施例３と同様の方法で得たマレイ
ミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時間
反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを
反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０
ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有す
る高分子画分が酵素−モノクローナル抗体−担体複合体
であった。
イ製）の調製を次のように行った。１ｍｌのＰＢＳに溶
解した５ｍｇの抗ＣＤ３４モノクローナル抗体に５０μ
ｌのＤＭＦに溶解した０．１ｍｇのＳＡＴＡを加え、室
温で３０分間反応させた。その後、１０μｌの０．１Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７）、１００μｌの１Ｍヒドロキシル
アミン（ｐＨ７）を加え、室温で５分間反応させた。生
成物はセファデックスＧ２５によりゲルろ過にて精製し
た。このようにして得たチオール基結合抗ＣＤ３４モノ
クローナル抗体と、実施例３と同様の方法で得たマレイ
ミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、１８時間
反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタノールを
反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反応させた
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過した。２８０
ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピークを有す
る高分子画分が酵素−モノクローナル抗体−担体複合体
であった。
【００６０】
【実施例６】酵素ストレプトアビジン複合体の製造 チオール基結合ストレプトアビジンの調製を次のように
行った。２．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解した２５ｍｇのストレプトアビジ
ンに２５０μｌのＤＭＦに溶解した０．２５ｍｇのＳＡ
ＴＡを加え、室温で３０分間反応させた。その後、５０
μｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）、２００μｌの１
Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え、室温で５分間
反応させた。生成物はセファデックスＧ２５によるゲル
ろ過にて精製した。このようにして得られたチオール基
結合ストレプトアビジンと、実施例３と同様の方法で得
たマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、
１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタ
ノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反
応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過し
た。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピ
ークを有する高分子画分が酵素−ストレプトアビジン−
担体複合体であった。
行った。２．５ｍｌの０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解した２５ｍｇのストレプトアビジ
ンに２５０μｌのＤＭＦに溶解した０．２５ｍｇのＳＡ
ＴＡを加え、室温で３０分間反応させた。その後、５０
μｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）、２００μｌの１
Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）を加え、室温で５分間
反応させた。生成物はセファデックスＧ２５によるゲル
ろ過にて精製した。このようにして得られたチオール基
結合ストレプトアビジンと、実施例３と同様の方法で得
たマレイミド基結合酵素担体複合体３を混合し、４℃、
１８時間反応させた。反応後、０．１Ｍメルカプトエタ
ノールを反応液の１０分の１容加え、３０℃、２０分反
応させた後、ウルトロゲルＡｃＡ４４にてゲルろ過し
た。２８０ｎｍ、４０３ｎｍの吸光度を測定し両方のピ
ークを有する高分子画分が酵素−ストレプトアビジン−
担体複合体であった。
【００６１】
【実施例７】免疫組織化学における実施例３で調製した
酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素標識抗体の比較
及びＳＡＢ法との比較 第一抗体として抗ＬＣＡモノクローナル抗体（ニチレイ
製）を用い、腸の組織切片の染色を行った。まず、パラ
フィン包埋された組織を薄切しスライドグラスに付着さ
せた。その後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダー
ゼ処理を行い上記第一抗体と室温で１時間反応させた。
ＰＢＳでよくすすいだ後、第二抗体を滴下した。第二抗
体は実施例３で作製したものを６μｇ／ｍｌの濃度で用
いた。また、従来法でペルオキシダーゼを直接抗体に標
識したものも同濃度で使用した。従来法の標識方法はジ
ャーナル オブ イムノアッセイ（Journal of Immunoa
ssay）, 4(3) p209〜327の方法に従い、用いた原料及び
試薬はすべて実施例３と同様のものを用いた。これらの
第二抗体とは室温で３０分間反応させた。
酵素抗体複合体と従来法で調製した酵素標識抗体の比較
及びＳＡＢ法との比較 第一抗体として抗ＬＣＡモノクローナル抗体（ニチレイ
製）を用い、腸の組織切片の染色を行った。まず、パラ
フィン包埋された組織を薄切しスライドグラスに付着さ
せた。その後、脱パラフィン処理及び脱ペルオキシダー
ゼ処理を行い上記第一抗体と室温で１時間反応させた。
ＰＢＳでよくすすいだ後、第二抗体を滴下した。第二抗
体は実施例３で作製したものを６μｇ／ｍｌの濃度で用
いた。また、従来法でペルオキシダーゼを直接抗体に標
識したものも同濃度で使用した。従来法の標識方法はジ
ャーナル オブ イムノアッセイ（Journal of Immunoa
ssay）, 4(3) p209〜327の方法に従い、用いた原料及び
試薬はすべて実施例３と同様のものを用いた。これらの
第二抗体とは室温で３０分間反応させた。
【００６２】ＳＡＢ法においては、第二抗体としてビオ
チン標識抗マウスポリクローナル抗体（ニチレイ製）を
使用した。その場合、第二抗体と１０分間反応させた
後、洗浄しペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ニチレイ製）を滴下、５分間反応させた。その後、い
ずれの場合もよく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンジジ
ン、過酸化水素）を滴下反応させ精製水で洗浄、封入を
行い顕微鏡にて検鏡した。その結果を下記表１に示し
た。実施例３で作製した酵素第二抗体複合体は従来法で
調製した酵素標識抗体と比較して、著しく優れていた。
また、増幅操作を行うＳＡＢ法よりも優れていた。
チン標識抗マウスポリクローナル抗体（ニチレイ製）を
使用した。その場合、第二抗体と１０分間反応させた
後、洗浄しペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
（ニチレイ製）を滴下、５分間反応させた。その後、い
ずれの場合もよく洗浄し、基質溶液（ジアミノベンジジ
ン、過酸化水素）を滴下反応させ精製水で洗浄、封入を
行い顕微鏡にて検鏡した。その結果を下記表１に示し
た。実施例３で作製した酵素第二抗体複合体は従来法で
調製した酵素標識抗体と比較して、著しく優れていた。
また、増幅操作を行うＳＡＢ法よりも優れていた。
【００６３】 Ａ：従来法の酵素標識抗体 Ｂ：実施例３の酵素第二抗
体複合体 Ｃ：ＳＡＢ法
体複合体 Ｃ：ＳＡＢ法
【００６４】
【実施例８】免疫組織化学における実施例４で調製した
酵素第一抗体複合体とＳＡＢ法の比較 ＳＡＢ法の第一抗体は実施例４の原料であるウサギ抗ｐ
５３ポリクローナル抗体（ニチレイ製）を用いた。ま
ず、パラフィン包埋した胃癌の組織を薄切しスライドグ
ラスに付着させた。その後、脱パラフィン処理及び脱ペ
ルオキシダーゼ処理を行い上記第一抗体と室温で１時間
反応させた。ＰＢＳでよくすすいだ後、ビオチン標識抗
ウサギポリクローナル抗体（ニチレイ製）と室温で１０
分間反応させた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレ
プトアビジンを滴下、５分間反応させた。
酵素第一抗体複合体とＳＡＢ法の比較 ＳＡＢ法の第一抗体は実施例４の原料であるウサギ抗ｐ
５３ポリクローナル抗体（ニチレイ製）を用いた。ま
ず、パラフィン包埋した胃癌の組織を薄切しスライドグ
ラスに付着させた。その後、脱パラフィン処理及び脱ペ
ルオキシダーゼ処理を行い上記第一抗体と室温で１時間
反応させた。ＰＢＳでよくすすいだ後、ビオチン標識抗
ウサギポリクローナル抗体（ニチレイ製）と室温で１０
分間反応させた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレ
プトアビジンを滴下、５分間反応させた。
【００６５】一方、実施例４で作製した酵素第一抗体複
合体は脱ペルオキシダーゼ処理した後、室温で１時間反
応させた。その際の酵素抗体複合体の濃度は２μｇ／ｍ
ｌであった。その後、いずれの場合もよく洗浄し、基質
溶液（ジアミノベンジジン、過酸化水素）を滴下し発色
させ精製水で洗浄、封入を行い顕微鏡にて検鏡した。結
果は、酵素第一抗体複合体を用いた場合、増幅操作を行
うＳＡＢ法と同等の染色強度が得られた。
合体は脱ペルオキシダーゼ処理した後、室温で１時間反
応させた。その際の酵素抗体複合体の濃度は２μｇ／ｍ
ｌであった。その後、いずれの場合もよく洗浄し、基質
溶液（ジアミノベンジジン、過酸化水素）を滴下し発色
させ精製水で洗浄、封入を行い顕微鏡にて検鏡した。結
果は、酵素第一抗体複合体を用いた場合、増幅操作を行
うＳＡＢ法と同等の染色強度が得られた。
【００６６】
【実施例９】エンザイムイムノアッセイにおける実施例
３で調製した酵素第二抗体複合体と従来法で調製した酵
素標識抗体の比較 ９６穴マイクロタイタープレートにヤギ抗マウスＩｇＧ
を１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ加え、室温で２時
間インキュベートした。生理食塩水で洗浄後、１％ウシ
血清アルブミンを２００μｌ加え２時間インキュベート
した。所定の濃度（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）のマウス
ＩｇＧを１００μｌ加え２時間インキュベートし、生理
食塩水で洗浄後、実施例３で調製した酵素第二抗体複合
体を抗体量換算で０．５μｇ／ｍｌで、従来法で調製し
た酵素標識抗体を抗体量換算で２μｇ／ｍｌの濃度で１
００μｌ加え３０分インキュベートした。さらに生理食
塩水で洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンジジン、過
酸化水素）を１００μｌ加え１５分間反応させ、１Ｎ硫
酸５０μｌ加えて反応を停止した。呈色の程度をマイク
ロプレートリーダーで測定した。結果は図１の通りで実
施例３で調製した酵素第二抗体複合体が従来法で調製し
た酵素標識抗体と比較して、より少ない抗体量で強い発
色が得られた。
３で調製した酵素第二抗体複合体と従来法で調製した酵
素標識抗体の比較 ９６穴マイクロタイタープレートにヤギ抗マウスＩｇＧ
を１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ加え、室温で２時
間インキュベートした。生理食塩水で洗浄後、１％ウシ
血清アルブミンを２００μｌ加え２時間インキュベート
した。所定の濃度（０〜１０００ｐｇ／ｍｌ）のマウス
ＩｇＧを１００μｌ加え２時間インキュベートし、生理
食塩水で洗浄後、実施例３で調製した酵素第二抗体複合
体を抗体量換算で０．５μｇ／ｍｌで、従来法で調製し
た酵素標識抗体を抗体量換算で２μｇ／ｍｌの濃度で１
００μｌ加え３０分インキュベートした。さらに生理食
塩水で洗浄し、基質溶液（テトラメチルベンジジン、過
酸化水素）を１００μｌ加え１５分間反応させ、１Ｎ硫
酸５０μｌ加えて反応を停止した。呈色の程度をマイク
ロプレートリーダーで測定した。結果は図１の通りで実
施例３で調製した酵素第二抗体複合体が従来法で調製し
た酵素標識抗体と比較して、より少ない抗体量で強い発
色が得られた。
【００６７】図１は上記の結果を示すものである。図
中、横軸はマウスＩｇＧの濃度、縦軸は４５０ｎｍの吸
光度を示すものである。●は実施例３で作製した酵素抗
体複合体、○は従来法で作製した酵素標識抗体である。
中、横軸はマウスＩｇＧの濃度、縦軸は４５０ｎｍの吸
光度を示すものである。●は実施例３で作製した酵素抗
体複合体、○は従来法で作製した酵素標識抗体である。
【００６８】
【発明の効果】本発明の酵素−タンパク質複合体は、特
に免疫組織化学、エンザイムイムノアッセイにおける酵
素標識抗体（第一抗体はもとより第二抗体としても）と
して有用であり、感度の高い免疫測定を可能にするもの
である。
に免疫組織化学、エンザイムイムノアッセイにおける酵
素標識抗体（第一抗体はもとより第二抗体としても）と
して有用であり、感度の高い免疫測定を可能にするもの
である。
【図１】本発明の実施例９の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B033 NA02 NA23 NA24 NA26 NA29 NA43 NB04 NB12 NB34 NC03 ND06 4B050 CC02 FF12E GG04 GG06 GG07 GG10 LL03 4H045 AA10 AA30 BA42 BA62 DA75 DA76 DA89 EA50 FA81 GA22
Claims (13)
- 【請求項１】 担体に２個以上の酵素が結合し、その酵
素の少なくとも１個以上に他の物質に特異的な結合性を
示すタンパク質が結合したこと、を特徴とする酵素−タ
ンパク質複合体。 - 【請求項２】 担体に２個以上の酵素が結合し、その酵
素の少なくとも１個以上に他の物質に特異的な結合性を
示すタンパク質が結合し、かつ、この担体上にも直接他
の物質に特異的な結合性を示すタンパク質が結合したこ
と、特徴とする酵素−タンパク質複合体。 - 【請求項３】 担体が５，０００〜５００，０００、好
ましくは１０，０００〜３００，０００の分子量を有す
るものであること、を特徴とする請求項１又は２に記載
の複合体。 - 【請求項４】 担体が２個以上のアミノ基を有すること
を、特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の
複合体。 - 【請求項５】 担体が、塩基性アミノ基を２個以上有す
るペプチドポリマー、あるいは、アミノ基、アルデヒド
基、ビニル基の少なくともひとつを導入した多糖類であ
ること、を特徴とする請求項１から４のいずれか１項に
記載の複合体。 - 【請求項６】 担体がポリリジンであること、を特徴と
する請求項１から５のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項７】 酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼから選ばれる少なくとも１つであ
ること、を特徴とする請求項１から６のいずれか１項に
記載の複合体。 - 【請求項８】 他の物質に特異的な結合性を示すタンパ
ク質が抗体又は抗体断片であること、を特徴とする請求
項１から７のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項９】 抗体がポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体であること、を特徴とする請求項８に記載の
複合体。 - 【請求項１０】 抗体断片がF(ab')２、Fab'、Fabc'か
ら選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする
請求項８に記載の複合体。 - 【請求項１１】 他の物質に特異的な結合性を示すタン
パク質がアビジン又はストレプトアビジンであること、
を特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の複
合体。 - 【請求項１２】 請求項１から１１のいずれか１項に記
載の複合体を含有すること、を特徴とする免疫測定用キ
ット。 - 【請求項１３】 免疫測定が免疫組織染色又は酵素免疫
測定であること、を特徴とする請求項１２に記載の免疫
測定用キット。
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