KR100649378B1

KR100649378B1 - 효소-단백질 복합체

Info

Publication number: KR100649378B1
Application number: KR1020000078946A
Authority: KR
Inventors: 오바야시히로까즈; 기따노유리꼬
Original assignee: 가부시키가이샤 니찌레이 바이오사이언스
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-20
Publication date: 2006-11-24
Also published as: EP1111385A2; DK1111385T3; US20010005583A1; IL140413A0; ES2342146T5; US20040002146A1; HK1037728A1; EP1111385B2; EP1111385B1; JP2001181299A; NO20006481L; US7235369B2; CN1300942A; ES2342146T3; KR20060088864A; ZA200007776B; AU778084B2; ATE468533T1; NO20006481D0; CA2328805A1

Abstract

본 발명은 아미노기 또는 다른 기를 통해 폴리리신과 같은 캐리어에 컨쥬게이트된 효소의 둘 이상의 분자, 및 효소의 상기 둘이상의 분자중 하나이상에 컨쥬게이트된 다른 물질(들)(예, 항원)에 특이적 결합능을 갖는 단백질 (예, 항체) 를 포함하는 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에 관한 것이고, 이로서 고감도로 미량의 물질의 정확한 검정이 가능하다.

Description

효소-단백질 복합체{ENZYME-PROTEIN COMPLEX}

도 1 은 실시예 9 의 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질을 캐리어에 공유결합적으로 컨쥬게이트된 효소에 컨쥬게이트시켜 제조된 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에 관한 것이며, 이 복합체는 면역조직화학 및 효소 면역학적검정과 같은 면역학적검정에 사용한다.

면역화학에서의 최근의 발전으로 인해, 항원-항체 반응을 이용하여 고감도로 미량의 물질을 검출할 수 있는 면역학적검정이 광범위하게 사용되어 왔다. 현재, 면역학적검정의 일반적 유형의 두 분야는 면역조직염색 및 효소 면역학적검정이다.

면역조직염색은 항원을 특이적으로 인식하는 항체로 조직상의 특이적 항원을 검출하는 수단이다. 통상적으로, 특이적 항원을 인식하는 항체는 조직을 고정시킨후 조직을 파라핀에 함침시켜 제조한 블록으로부터 얇게 자른 박편상에서 반응을 시켜; 반응된 항체의 존재여부를 조사하여, 항원의 존재를 조사할 수 있다. 항원과 처음에 반응하는 항체는 통상적으로 1 차 항체로 부른다. 가시적으로 또는 기구를 이용하여 검출가능한 시그널을 방출하는 물질을 1 차 항체에 컨쥬게이트시킨 경우, 시그널의 강도는 1차 항체의 양을 나타내며, 이는 또한 박편상의 항원의 양에 해당하기도 한다. 목적달성을 위한 시그널을 방출하는 물질로서는, 형광물질 및 효소를 언급할 수 있다. 면역조직염색의 초창기에서는, 형광물질은 이러한 시그널을 방출하는 물질로서 사용되었다. 이 경우, 형광현미경이 형광의 검출을 위해 필요하였다.

이어서, 효소 표식 항체방법이 나칸 등에 의해 개발되었으며, 이로는 광학현미경으로 염색된 상을 분석할 수 있다. 현재, 효소는 통상적으로 시그널을 방출하는 물질로서 사용된다. 면역조직염색을 실시하기 위해서는, 1 차 항체에 컨쥬게이트되어 있는 경우, 효소의 활성에 해당하는 색반응은 효소에 색원체 물질을 첨가하여 실시할 수 있으며, 색 반응은 항체의 양, 즉 조직상에 존재하는 항원의 양에 해당한다. 그러나, 통상적으로, 충분한 감도는 이 방법에 의해서 복구될 수 없다.

현재 가장 통상적으로 사용하는 방법은 스트렙타비딘-바이오틴법 (SAB법), 즉 항원에 결합된 1 차 항체의 시그널을 증폭하여 시그널을 검출하는 수단이다. 이 방법은 처음에 조직박편상의 특정 물질을 인식하는 1 차항체를 반응시키는 것을 포함한다. 이어서 1 차 항체에 결합하는 2 차 항체를 이것과 반응시킨다. 통상적으로 2 차 항체는 1 차 항체를 인식 및 결합하는 폴리클로날 항체이다. 따라서, 2 차항체의 복수개의 분자가 1 차 항체에 결합한다. 바이오틴의 복수개의 분자가 예비적으로 2 차 항체의 각 분자에 컨쥬게이트된다. 효소-컨쥬게이트화 스트렙타비딘(효소시약)은 1차 항체-바이오틴-컨쥬게이트화 2 차 항체 복합체와 반응한다. 스트렙타비딘은 강력하게 바이오틴에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 그러므로, 1 차 항체 - 바이오틴-컨쥬게이트화 2 차 항체 - 효소-컨쥬게이트화 스트렙타비딘의 복합체가 형성된다. 바이오틴-컨쥬게이트화 2 차 항체 컨쥬게이트의 복수의 분자는 1 차 항체의 각각의 분자에 결합하고, 효소-컨쥬게이트화 스트렙타비딘 컨쥬게이트의 복수분자는 상기 방법에 따른 바이오틴-컨규게이트화 2 차 항체 컨쥬게이트의 각각의 분자에 결합하기 때문에, 1 차 항체에 간접적으로 결합된 효소의 양은 현저히 증가될 수 있다. 그 결과, 조직 박편상의 항원은 고감도로 검출될 수 있다.

전술한 바와 같이, SAB 법은 효소의 상당히 많은 분자가 궁극적으로 항원에 결합한 1 차 항체에 결합하기 때문에 좀더 강력한 시그널을 생산할 수 있는 우수한 방법이다. 그러나, 절차의 관점에서, 세 단계의 절차, 즉 1 차 항체의 반응, 2 차 항체의 반응 및 효소 시약의 반응이 수행되어야 한다. 전술한 바와 같이, SAB 법에는 많은 단계들이 포함되고, 정확함과 동시에 신속성 및 간결성이 요구되는 임상적 실시등의 면에서 만족스러운 것으로 평가할 수 없다. 따라서, SAB 법은 개선의 여지가 있다.

통상의 면역학적검정의 다른 수단으로서, 효소 면역학적검정(EIA)가 공지되어 있다. EIA 의 전형적인 원리 및 절차는 다음과 같다. 처음에, 검정하고자 하는 물질을 인식하는 항체를 폴리스티렌 비드 또는 마이크로플레이트와 같은 캐리어상에 고정시킨다. 이어서 캐리어를 알부민과 같은 단백질로 차단시킨후, 목적하는 검정 대상으로 물질(항원)을 함유하는 용액(시료)를 첨가한다. 이후, 효소와 컨쥬게이트된 항원인식 항체(효소-표식된 항체)를 첨가한다. 즉, 두개의 항체는 항원을 사이에 위치시킨다. 이어서, 과량의 효소-표식 항체를 세정시키고; 효소의 색원체 기질을 첨가하여 발색시킨다. 항원의 양은 효소의 활성에 좌우되기 때문에, 시료내 항원의 농도는 미리 공지된 농도로 항원을 함유하는 시료의 발색과 비교하여 측정할 수 있다. 많은 인자들이 효소 면역학적검정의 감도에 관여하고, 효소 표식 항체의 질이 중요한 인자들중의 하나이다. 좀더 구체적으로는, 좀더 강력한 시그널은 효소 표식 항체가 효소의 많은 분자를 갖는 경우 수득할 수 있어, 항원이 고감도로 검정될 수 있다.

전술한 바와 같이, 효소 표식 항체의 품질은 면역학적검정에 매우 중요하고 검정 시스템의 감도 또는 절차내 포함된 단계의 수에 현저한 영향을 미친다. 후술되는 바와 같이, 고감도를 달성하는 효소 표식 항체를 수득하기 위하여 많은 시도가 있어 왔다. 이런 시도의 다수에는 효소 및 항체의 많은 분자를 캐리어에 컨쥬게이트시키는 것이 포함된다.

일본 특허출원공보 JP-A 63-503138(1988)에서는, 항체를 약제, 독소, 킬레이터 및 붕소 부가물과 같은 검출성 표식의 유도체와 컨쥬게이트된 캐리어에 컨쥬게이트시켰다. 캐리어로서, 아미노덱스트란이 사용되며; 처음에, 메토톡세이트와 같은 약제가 아미노덱스트란에 컨쥬게이트된다. 이어, 항체의 당사슬을 과요드화나트륨으로 산화시켜 발생된 알데히드기를 아미노덱스트란의 아미노기와 반응시킨후, 소듐 시아노보로히드라이드로 환원시켜 공유결합시켜, 약제, 항체 및 아미노덱스트란의 복합체를 제조하였다.

일본특허출원공보 JP-A3-158758(1991)에서는, 덱스트란을 과요오드화나트륨으로 산화시키고; 생성된 알데히드기를 알칼린 포스파타아제의 아미노기 및 항체와 반응시킨후, 소듐 보로히드라이드로 환원시켜 효소, 항체 및 덱스트란의 복합체를 제조하였다.

일본특허출원공보 제6-509167(1994)에서는, 디비닐 술폰을 덱스트란과 같은 중합체와 반응시켜 여기에 비닐기를 도입시킨후, 효소 및 항체와 반응시켜, 효소, 항체 및 덱스트란의 복합체를 제조하였다.

이러한 방법으로 제조한 모든 복합체는 두개의 물질을 중합체에 직접적으로 컨쥬게이트시켜 형성된 복합체이었다. 이러한 방법으로 제조된 모든 복합체는 캐리어의 사용없이 두개의 물질의 직접적 컨쥬게이트와 비교하여, 더 나은 성능을 보인다. 그러나, 이러한 방법은 다음의 결점을 갖는다. 좀더 구체적으로는, 두개의 물질을 캐리어에 컨쥬게이트시키고자 하는 경우에서 캐리어에 컨쥬게이트할 수 있는 물질의 양이 한정적이기 때문에, 여기에 하나의 물질의 양이 더 많이 컨쥬게이트될수록, 여기에 다른 물질의 양은 더 적게 컨쥬게이트된다. 만일 이러한 결점이 극복될 수 있다면, 더 나은 성능을 갖는 복합체가 수득될 수 있을 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 새로운 고 품질의 효소, 단백질 및 캐리어의 복합 체를 제공하는 것이며, 이로 전술한 결점을 극복될 수 있을 것이다.

본 발명자는 고 품질의 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체를 획득하기 위하여 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체를 제조하는 방법에 대하여 연구하였다. 본 발명자는 이 목적은 효소를 캐리어에 컨쥬게이트시키고, 추가로 단백질을 이 효소에 컨쥬게이트시킴으로써 달성될 수 있음을 발견하였다. 추가의 조사후, 본 발명은 최종적으로 완성되었다.

즉, 본 발명은 효소의 둘이상의 분자를 캐리어에 컨쥬게이트시키고, 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질을 효소의 하나이상의 분자에 컨쥬게이트시켜 제조된 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 추가로 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 동일한 단백질을 전술한 효소, 단백질 및 캐리어의 미리 제조된 복합체의 캐리어상에 직접적으로 컨쥬게이트시켜 제조한 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명의 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에서, 효소 및 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질에 컨쥬게이트된 동일한 효소는 각각 캐리어에 무수히 컨쥬게이트되거나;또는 효소, 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질에 컨쥬게이트된 동일한 효소 및 또한 다른 물질에 특이적 결합능을 갖는 동일한 단백질 각각은 캐리어에 무수히 컨쥬게이트된다. 본 발명은 이하에서 상술될 것이다.

본 발명은 면역조직화학 및 효소 면역학적검정의 분야에서 사용가능한 효소-단백질 복합체의 조사동안 완성되었다. 그러나, 다른 분야에 대한 본 발명의 적용도 전혀 제한되지 않는다.

본 발명에서의 캐리어는 특별한 제한이 없이, 단백질 및 폴리사카라이드를 의미한다. 그러나, 효소의 상당히 많은 분자가 캐리어에 컨쥬게이트되어 면역학적검정의 감도를 증가시키는 것이 바람직하다. 그러므로, (1) 어느 정도로 큰 분자량, 및 (2) 효소에 컨쥬게이트하기 위한 반응성 관능기의 존재 또는 이러한 반응성 관능기의 도입의 가능성 또는 능력이 필수적이다. 이러한 목적을 충족하는 캐리어의 예에는 겔 여과 크로마토그래피로 측정시, 대략적으로 평균분자량이 5,000 내지 500,000 Da, 좀더 바람직하게는 10,000 내지 300,000 Da 인 펩티드 중합체 및/또는 폴리사카라이드가 포함된다. 여기에서, 분자량의 상기 범위는 단지 단순한 목표일 뿐이고; 액체에서 침전 또는 침강의 발생이 없으면, 상기 범위보다 큰 분자량을 사용할 수 있고; 본 발명의 목적이 달성될 수 있는 한, 상기 범위보다 작은 분자량을 또한 사용할 수 있다.

본 발명에 따라, 예컨대, 결합능을 가진 둘이상의 아미노기를 함유하는 펩티드가 캐리어로서 적절히 이용된다. 예들중의 하나에는 아미노기를 가진 펩티드, 예컨대 리신, 아르기닌, 오르니틴, 글루타민 및 기타 염기성 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 1 종이상의 아미노산을 함유하는 펩티드가 포함되며, 여기에서 이러한 아미노산은 α-아미노기, ε-아미노기 및 기타 아미노기로 구성된 군으로부터 선택된 1 종이상의 아미노기를 갖는다. 더욱이, 이의 특별한 예에는 ε-아미노기를 갖는 리신의 중합체인 폴리리신이 포함되고, 리신 및 기타 아미노산(들)을 함유하는 다양한 펩티드가 포함된다. 후자의 펩티드 중합체의 예에는 리신 및 글리신의 랜덤 공중합체, 리신 및 세린의 랜덤 공중합체, 및 리신 및 글루탐산의 랜덤 공중합체가 포함되며, 이는 다양한 분자량의 랜던 공중합체로 시판되고 있다.

이와는 달리, 알데히드기, 아미노기 또는 기타 활성기가 도입된 폴리사카라이드를 또한 본 발명의 캐리어로서 사용할 수 있다. 폴리사카라이드의 예는 덱스트란, 아가로오스, 덱스트린 및 가용성 전분이다. 알데히드기를 갖는 폴리사카라이드는 폴리사카라이드를 과요오드화나트륨과 반응시켜 용이하게 제조할 수 있다. 아미노기는 공지의 방법으로 폴리사카라이드에 도입시킬 수 있다. 예컨대, 아미노기를 갖는 덱스트란은 덱스트란을 과요오드화나트륨으로 처리하여 알데히드기를 발생시키고, 이를 디아민과 반응시킨후 소듐 보로히드라이드로 환원시켜 제조할 수 있다. 폴리사카라이드로의 활성기의 도입은 공지의 방법으로 수행할 수 있다. 예컨대, 비닐기를 갖는 덱스트란은 디비닐 술폰을 덱스트란과 반응시켜 수득할 수 있다.

둘 이상의 아미노기를 갖는 임의의 모든 효소는 본 발명에 따라 사용하는 효소로 사용할 수 있고, 면역학적검정에서 통상적으로 사용하는 효소를 적당히 사용한다. 제한없이, 이의 예는 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제 및 글루코오스 옥시다아제이다.

본 발명에 따른 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질에는 (1) 단백질, (2) 단백질의 단편(들) 및 (3) 단백질 및 단백질의 단편(들)의 혼합물이 포함되고, 좀더 실제적으로는, 특정 항원에 결합할 수 있는 항체 및 특정 리간드에 결합할 수 있는 수용체, 예컨대, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체; 바이오틴에 특이적으로 결합하는 아비딘 및 스트렙타비딘; 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 A 및 단백질 G; 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴; 히알루론산에 특이적으로 결합하는 히알루론산-결합 단백질이 포함된다. 또한, 본 발명의 단백질에는 특정 물질(들)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 단편이 포함된다. 예컨대, 단백질 단편은 항체 단편 F(ab')₂, Fab' 및 Fabc' 이다.

본 발명에서 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질에는 다른 단일 물질에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질 및 다른 복수 물질에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질이 포함된다.

본 발명에 따라, 처음에는, 캐리어 및 효소의 복합체를 제조한다. 예컨대, 이에 대한 방법은 캐리어의 아미노기를 티올기로 개질시켜 생성된 캐리어를 아미노기(들)로부터 개질된 말레이미드기(들)를 갖는 효소와 혼합하는 것을 포함한다. 티올기 및 말레이미드기가 신속하게 함께 반응하여 공유결합되기 때문에, 효소와 컨쥬게이트된 캐리어를 제조할 수 있다.

티올기를 캐리어의 아미노기로 도입시키기 위해서는, S-아세틸머캅토숙신산 무수물, n-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피온에이트(SPDP), 및 S-아세틸티오글리콜산 N-히드록시숙신이미드(SATA)를 이용한 방법이 공지되어 있다. 이러한 시약은 아미노기와 반응하여, 차단된 티올기가 도입된다. 이어서, 티올기를 차단하는 보호기를, S-아세틸머캅토숙신산 무수물 또는 SATA 가 사용되는 경우, 히드록실아민으로, 또는 SPDP 를 사용하는 경우는 디티오트레이톨(DTT) 처리로 제거하 여 티올기를 발생시킨다.

말레이미드기를 효소의 아미노기로 도입시키기 위해서는, 한 분자내에 말레이미드기 및 숙신이미드 에스테르기를 가진 화합물을 사용한다. 예컨대, 한 말단에서 말레이미드기와 다른 말단에서 N-히드록시숙신이미드기를 갖는 이가 가교결합시약이 만족스럽게 사용된다. 이의 예는 N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드(EMCS) 및 N-(4-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드(GMBS)이다.

전술한 EMCS 및 GMBS 이외에, 한 분자내 말레이미드기 및 숙신이미드기를 갖는 화합물에는 제한없이 후술되는 것들이 포함된다: N-숙신이미딜-N-말레이미도아세테이트: N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도)부티레이트; N-숙신이미딜-6-(N-말레이미도)헥사노에이트; N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트: N-숙신이미딜-m-(N-말레이미도)벤조에이트; N-숙신이미딜-p-(N-말레이미도페닐)-4-부티레이트; N-술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트; N-숙신이미딜-m-(N-말레이미도)벤조에이트; N-술포숙신이미딜-p-(N-말레이미도페닐)-4-부티레이트; 등.

본 발명에서 캐리어는 다른 물질(들)과 추가적으로 컨쥬게이트될 필요가 없기 때문에, 효소 및 캐리어의 복합체를 제조하는 것이 바람직하고, 여기에 효소의 분자는 가능한 한 많이 컨쥬게이트된다. 이 목적을 달성하기위한 수단의 한 예가 후술되어 있다. 과다량의 말레이미드화 시약을 첨가하여 효소 및 캐리어의 복합체와 반응시켜 말레이미드기를 복합체상의 남아있는 거의 모든 아미노기로 도입시킨다. 복합체의 제조를 위해 사용한 동일한 효소는 하나이상의 아미노기가 효소상에 남도록하는 조건하에서 티올화시킨다. 이것은 효소상에 남아있는 아미노기(들)을 이용하여 다른 물질(들)에 특이적 결합 능력을 갖는 단백질을 후속적으로 컨쥬게이트시키기 위한 것이다. 이렇게 티올화된 효소 및 말레이미드기가 도입된 효소 및 캐리어의 복합체를 함께 반응시킨다.

이어서, 남아있는 말레이미드기를 티올기를 갖는 물질로 차단시킨다. 차단을 위해 사용하는 티올기를 갖는 물질의 예는 머캅토에탄올, 시스테아민 히드로클로라이드 및 시스테인이다. 머캅토에탄올을 차단에 사용하는 경우, 아미노기(들)은 단지 효소 및 캐리어의 복합체의 티올화 효소상에만 존재한다. 시스테아민 히드로클로라이드 또는 시스테인은 차단에 사용하는 경우, 아미노기는 효소 및 캐리어의 복합체의 티올화 효소상 및 남아있는 말레이미드기(들)을 차단하는데 사용하는 시약상에 존재한다.

전술한 바와같은 다른 물질에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질을 효소 및 캐리어의 복합체에 컨쥬게이트시키기 위해서, 말레이미드기를 갖는 티올기의 반응이 효소 및 캐리어의 복합체의 제조에서와 동일한 방식으로 만족스럽게 이용된다. 예컨대, 말레이미드기를 도입하기 위한 전술한 시약은 효소 및 캐리어의 복합체상에 존재하는 아미노기와 반응시킨다. 한편, 티올기를 도입하기 위한 전술한 시약은 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질과 반응시킨다. 이 둘을 함께 혼합하는 경우, 효소, 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질 및 캐리어의 복합체를 제조할 수 있다. 다른 물질(들)과의 결합에 전혀 관여하지 않는 S-S 결합이 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질에 존재하는 경우, S-S 결합은 티올화대신 시스테아민 히드로클로라이드 또는 DTT 에 의해 환원되어, 티올기가 발생될 수 있다.

다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질이 당사슬을 갖는 경우, 당사슬이 만족스럽게 이용될 수 있다. 예컨대, 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질의 당사슬을 과요오드화나트륨으로 산화시켜 발생시킨 알데히드기(들)를 효소 및 캐리어의 복합체상의 아미노기(들)와 반응시킨후, 환원시켜 이 둘을 함께 컨쥬게이트시키는 것이 가능하다.

완전하게 제조된 복합체는 캐리어상에 남아있는 말레이미드기(들)이 효소 및 캐리어의 복합체의 제조에서 머캅토에탄올로 최종적으로 차단되는 경우 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 가진 단백질이 효소상에만 컨쥬게이트하는 복합체이다. 다른 완전하게 제조된 복합체예는 캐리어상에 남아있는 말레이미드기(들)이 효소 및 캐리어의 복합체의 제조에서 시스테아민 히드로클로라이드 또는 시스테인으로 최종적으로 차단되는 경우 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 가진 단백질이 효소 및 캐리어 양쪽에 컨쥬게이트된 복합체이다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 캐리어로서 폴리-L-리신, 효소로서 퍼옥시다아제 및 다른 물질에 특이적 결합능을 갖는 단백질로서 항체 단편 F(ab')₂ 를 이용한 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체를 제조하는 방법이 후술되어 있다.

1. 티올기-컨쥬게이트화 캐리어의 제조

S-아세틸머캅토숙신산 무수물을 첨가하여 폴리-L-리신을 함유하는 용액과 반 응시킨후; 히드록실아민을 생성된 반응 혼합물과 반응시켜 캐리어내 티올기를 도입시킨다(캐리어-SH 의 제조). 여기에서, 캐리어는 결코 완전히 티올화되지 않고, 캐리어의 아미노기의 일부는 유리상태로 남는다.

2. 말레이미드기-컨쥬게이트화 퍼옥시다아제의 제조

EMCS 를 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제(POD)와 반응시켜, 말레이미드기-컨쥬게이트화 퍼옥시다아제 (M-POD) 를 제조한다.

3. POD-폴리-L-리신 복합체 1 의 제조

티올기-컨쥬게이트화 캐리어와 M-POD 를 함께 혼합하여 함께 반응시켜, 복합체 (캐리어-S-M-POD)를 제조한다. 반응후, 나머지 말레이미드기는 머캅토에탄올로 차단시킨다. 반응을 통해, 복수의 S-M-POD 및 SH기가 도입되고 자유 아미노기를 갖는 캐리어 (복합체)를 수득할 수 있다.

4. 말레이미드기가 컨쥬게이트된 복합체의 제조

과다량의 EMCS 용액을 첨가하여 3 에서 수득한 복합체와 반응시켜 말레이미드기를 복합체의 모든 아미노기에 도입시킨다. 반응을 통해, 복수의 S-M-POD, 말레이미드기 및 EMCS의 SH기 결합후 EMCS의 N-히드록시숙신이미드 에스테르의 가수분해로 발생한 COOH기가 도입된 캐리어(복합체)를 수득할 수 있다.

5. 티올기-컨쥬게이트화 퍼옥시다아제의 제조

티올기(들)은 S-아세틸티오글리콜산-N-히드록시숙신이미드 에스테르와 POD 를 반응시킨후 히드록실아민을 생성된 반응 혼합물과 반응시켜 POD 에 도입시킨다. 이 경우에서, 반응은 유리 아미노기(들)이 POD 에 남을 수 있는 조건하 실행 한다 (SH-POD-NH₂).

6. POD-폴리-L-리신 복합체 2 의 제조

SH-POD-NH₂와 4 에서 수득한 복합체의 반응을 통해, 티올화된 퍼옥시다아제를 캐리어에 컨쥬게이트된 말레이미드기에 도입시킨다. 이어서, 나머지 말레이미드기는 머캅토에탄올로 처리하여 나머지 말레이미드기를 OH 기로 전환시킨다. 반응을 통해, 복수의 S-M-POD, 복수의 M-S-POD-NH₂, COOH기 및 OH기가 도입된 캐리어(효소 복합체)를 수득할 수 있다.

7. 말레이미드기-컨쥬게이트화 POD 를 갖는 POD-폴리-L-리신 복합체 2 의 제조

EMCS 용액을 6 에서 수득한 효소 복합체와 반응시켜, 복합체내 POD 의 아미노기(들)을 말레이미드화시킨다. 복수의 S-M-POD, 복수의 M-S-POD-NH₂, COOH기 및 OH기와의 복합체가 제조된다.

8. 환원된 항체 단편의 제조

염소 항-마우스 IgG는 펩신으로 처리하여 이의 F(ab')₂ 단편을 수득하고; 시스테아민 히드로클로라이드를 F(ab')₂ 단편과 반응시켜 환원된 항체 단편 (SH-Fab')를 수득한다.

9. 효소, 항체 및 캐리어의 복합체의 제조

환원된 항체 단편과 7 에서 수득한 복합체를 함께 혼합하여, 항체 단편을 POD의 말레이미드기(들)에 컨쥬게이트시킨다. 반응을 통해, 도입된 복수의 S-M-POD, 복수의 M-S-POD-M-S-Fab', 복수의 M-S-POD-M, COOH기, 및 OH기와 컨쥬게이트된 캐리어 (효소-항체 복합체)를 수득할 수 있다. 필요하다면, 생성된 캐리어는 추가로 머캅토에탄올로 처리하여, M-S-POD-M의 비변화 말레이미드기(들)를 OH기(들)로 전환시켜 말레이미드기(들)을 차단시킨다.

본 발명의 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체는 전술한 구조의 실현의 첫번째 성공이고, 캐리어상의 효소의 과다량으로 인해, 효소가 색반응시 강력한 색반응이 일어날 수 있다. 추가로, 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질이 효소상에 컨쥬게이트될 수 있기 때문에, 비록 효소의 많은 분자들이 캐리어의 표면을 차지 하더라도, 결과적으로, 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질의 많은 분자는 복합체에 컨쥬게이트될 수 있어; 이의 다른 물질에 대한 이의 결합능력은 상당히 상승된다.

다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질의 많은 분자가 본 발명의 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체내 존재하기 때문에, 미량의 검정 대상 물질조차 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에 포획되어 결합될 수 있다. 검정 대상 물질은 단백질의 임의의 하나의 분자 또는 분자의 단편(들)에 컨쥬게이트되는 경우, 매우 강력한 색반응이, 효소의 많은 분자들이 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체에 컨쥬게이트됨으로 해서 발생할 수 있다. 본 발명에 있어서, 즉, 미량의 물질조차도 검출 및 고감도로 검정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 정확한 검정을 가능케한다. 따라서, 우수한 검정 키트는 복합체를 사용하여 조립될 수 있다.

본 발명에 따른 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체의 제조를 위해서는, 또한, 폴리리신을 처음에 EMCS로 처리하지 않고 (침전의 발생은 폴리리신을 이용불가능케한다), S-아세틸머캅토숙신산 무수물로 처음에 처리하여 캐리어의 일부 아미노기를 티올기로 개질시키고, 여기에 말레이미드화 효소를 컨쥬게이트시킨후, 말레이미드화 및 카르복실화를 위해 과다량의 EMCS 로 처리한후 티올기-컨쥬게이트화 효소와 반응시킴으로써, 침전 또는 침강의 발생없이, 컨쥬게이트된 효소의 분자의 수가 초기에 적은 경우에서 조차 효소의 많은 분자가 캐리어에 최종적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 효소의 많은 분자가 용액상태에서 캐리어에 컨쥬게이트될 정도로 현저한 효과가 발생할 수 있다.

따라서, 본 발명은 물질을 미량의 시료 또는 극히 희석된 시료에서 정확하게 검정할 수 있는 우수한 효과를 가져온다.

실시예

본 발명을 좀더 상술하기 위하여, 실시예를 기재하였다. 그러나 본 발명은 이러한 실시예에 국한되지 않는다.

실시예 1

효소 및 캐리어의 복합체의 제조

말레이미드기-컨쥬게이트화 퍼옥시다아제는 다음과 같이 제조하였다. 0.6 ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해된 EMCS 20 mg 을 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)의 2.4ml 에 용해된 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 100mg 에 첨가하여 주위온도에 30 분간 반응시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 세파덱스 G25 (Pharmacia Co. 제조)상에서 겔여과시켜, 수득한 여과물을 403 nm 의 흡광도에서 검정하고; 이 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다.

이어서, 티올기-컨쥬게이트화 폴리리신을 다음과 같이 제조하였다.

20㎕ 의 DMF 에 용해된 6 mg의 S-아세틸머캅토숙신산 무수물을 1 ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5) 에 용해된 5 mg 의 폴리-L-리신 히드로브로마이드 (Sigma Co. 제조;평균분자량 37,600 Da)에 첨가하여, 30℃ 에서 20 분간 반응시켰다. 이어서, 100㎕ 의 0.1M Tris-HCl 버퍼 (pH 7), 10㎕ 의 0.1M EDTA(pH 7), 100㎕ 의 1M 히드록실아민 (pH 7)를 생성된 반응 혼합물에 첨가하여 , 30℃ 에서 5 분간 반응시켰다. 이어서, 반응 용액을 세파덱스 G25상에서 겔여과시키고; 230 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다. 이 경우에서, 모든 아미노기는 티올기로 개질되지 않았다.

말레이미드기-컨쥬게이트화 퍼옥시다아제 및 티올기-컨쥬게이트화 폴리-L-리신을 함께 혼합하여 4℃에서 18 시간동안 반응시켰다. 1/10 배 부피의 0.1M 머캅토에탄올을 생성된 반응 혼합물에 첨가하여, 30℃ 에서 20 분간 반응시킨후; 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44 (Biosepla, Co. 제조)상에서 겔 여과시키고; 각 분획의 흡광도는 403nm 에서 측정하였다. 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 폴리-L-리신의 복합체는 고분자량 여과물 분획에 존재하였다. 이 분획을 버퍼를 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 7.5)로 교환시킨후 한외여과로 3ml 로 농축시켰다. 복합체내 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제의 양은 20mg이었다. 이것을 효소 및 캐리어의 복합체 1 로 나타내었다.

0.75ml의 DMF 에 용해된 50mg 의 EMCS 는 복합체에 첨가하여, 주위온도에서 30 분간 반응시켰다. 생성물을 세파덱스 G25상에서 겔여과시키고; 403 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다. 이것은 효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 1로 나타내었다. 이 경우에서, 모든 아미노기는 말레이미드기로 개질되는 반면, 티올기는 카르복실기로 전환된다.

이어서, 티올기-컨쥬게이트화 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제는 하기와같이 제조하였다.

0.5ml의 DMF 에 용해된 2.5mg 의 S-아세틸머캅토티오글리콜산-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SATA)를 2.5 ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5) 에 용해된 100mg 의 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제에 첨가하여, 주위온도에서 30 분간 반응시켰다. 이어서, 100㎕ 의 0.1M EDTA(pH 7), 0.5ml의 1M 히드록실아민 (pH 7)를 반응 혼합물에 첨가하여, 주위온도에서 5 분간 반응시켰다. 이어서, 반응 용액을 세파덱스 G25상에서 겔여과시키고; 403 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 분획을 수거하여 농축시켰다. 티올기-컨쥬게이트화 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제의 티올기의 수는 Journal of Immunoassay, 4(3),p.209-327에 기재된 공지의 방법으로 검정하였다. 계산결과, 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제의 1 분자내 존재하는 티올기의 수는 1.3 이었다. 3 개이상의 아미노기가 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제의 1 분자내에 존재하였다. 따라서, 하나이상의 아미노기가 전술한 조건하에서 상기와 같이 제조된 티올기-컨쥬게이트화 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제에 남아있는 것이 확인되었다.

효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 1 과 티올기-컨쥬게이트화 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제를 함께 혼합하여 4 ℃ 에서 18 시간동안 반응시켰다. 1/10 배 부피의 0.1M 머캅토에탄올을 생성물에 첨가하여, 30℃ 에서 20 분간 반응시킨후; 생성된 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44상에서 겔 여과시키고; 흡광도를 403nm 에서 측정하였다. 이 복합체는 고분자량 여과물 분획으로 용출되었다. 이것은 효소 및 캐리어의 복합체 2 로 나타내었다.

별도로, 효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 1 및 티올기-컨쥬게이트화 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제를 함께 혼합하여, 4 ℃ 에서 18 시간동안 반응시키고; 이어서, 1/10 배 부피의 0.1M 시스테아민 히드로클로라이드를 생성된 반응 혼합물에 첨가한후, 전술한 바와 같은 동일한 방식으로 정제시켰다. 생성된 복합체는 효소 및 캐리어의 복합체 3 으로 나타내었다. 효소 및 캐리어의 복합체 2 및 효소 및 캐리어의 복합체 3 의 컨쥬게이트된 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제의 양은 이들중 어느 것도 40 mg 이었다.

실시예 2

효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체의 제조 1

염소 항-마우스 IgG 의 F(ab')₂ 단편을 공지의 방법으로 제조하였다.

염소 항-마우스 IgG Fab' 를 다음의 방법으로 제조하였다. 5mM EDTA 를 함유하는 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6)에 용해된 55㎕ 의 0.1M 시스테아민 히드로클로라이드를 0.5ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6)에 용해된 5mg 의 염소 항-마우스 IgG F(ab')₂ 에 첨가하여, 37℃ 에서 1.5 시간동안 반응시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 세파덱스 G25상에서 겔여과시켜, 280 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다.

효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 2 는 다음과 같이 제조하였다. 375㎕ 의 DMF 에 용해된 10mg 의 EMCS 를 1.5ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 용해된 효소 및 캐리어의 복합체 2 의 5mg 에 첨가하여, 주위온도에서 30 분간 반응시켰다. 이 반응 혼합물은 세파덱스 G25상에서 겔여과시키고: 403 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다.

효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 2 및 염소 항-마우스 IgG Fab' 를 함께 혼합하여, 4℃ 에서 18 시간동안 반응시켰다. 반응후, 0.1M 머캅토에탄올을 반응용액 부피의 1/10 부피로 첨가하여 30℃ 에서 20 분간 반응시키고; 이어서, 생성된 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44상에서 겔 여과시켰다. 280nm 및 403nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 양쪽 피크를 갖는 고분자량 여과물 분획은 효소, Fab' 및 캐리어의 복합체이었다.

실시예 3

효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체의 제조 2

효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 3 을 다음과 같이 제조하였다.

375㎕ 의 DMF 에 용해된 10mg 의 EMCS 를 1.5ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 용해된 효소 및 캐리어의 복합체 3 의 5mg 에 첨가하여, 주위온도에서 30 분간 반응시켰다. 이어서, 이 반응 혼합물은 세파덱스 G25상에서 겔여과시키고; 403 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다.

전술한 바와 동일한 방법으로 제조한 염소 항-마우스 IgG Fab' 를 효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 3 과 혼합하여, 4 ℃ 에서 18 시간 반응시켰다. 반응후, 0.1M 머캅토에탄올을 반응용액 부피의 1/10 부피로 첨가하여 30℃ 에서 20 분간 반응시키고; 이어서, 생성된 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44상에서 겔 여과시켰다. 280nm 및 403nm 에서의 흡광도를 측정하고 양쪽 피크를 갖는 고분자량의 여과물 분획은 효소, Fab' 및 캐리어의 복합체이었다.

실시예 4

효소, 1 차 항체 및 캐리어의 복합체의 제조 1

공지의 방법으로, 토끼 항-p53 유전자 산물 항체(Nichirei Corp. 제조)는 펩신으로 절단하여, 토끼 항-p53 유전자 산물 F(ab')₂ 단편을 제조하였다. 토끼 항-p53 유전자 산물 Fab' 는 다음과 같이 제조하였다.

5mM EDTA 를 함유하는 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6)에 용해된 55㎕ 의 0.1M 시스테아민 히드로클로라이드를 0.5ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6)에 용해된 5mg 의 토끼 항-p53 유전자 산물 F(ab')₂ 에 첨가하여, 37℃ 에서 1.5 시 간동안 반응시켰다. 이어서, 반응 용액을 세파덱스 G25상에서 겔여과시켜, 280 nm 의 흡광도에서 피크를 갖는 여과물 분획을 수거하여 한외여과로 농축시켰다. 이렇게 제조된 토끼 항-p53 유전자 산물 Fab'과 실시예 3 에서와 동일한 방법으로 수득한 효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 3 을 함께 혼합하여, 4℃ 에서 18 시간동안 반응시켰다. 반응후, 0.1M 머캅토에탄올을 생성된 반응용액 부피의 1/10 부피로 첨가하여 30℃ 에서 20 분간 반응시키고; 이어서, 생성된 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44상에서 겔 여과시켰다. 280nm 및 403nm 에서의 흡광도를 측정하였으며; 양쪽 피크를 갖는 고분자량의 여과물 분획은 효소, Fab' 및 캐리어의 복합체이었다.

실시예 5

효소, 1 차 항체 및 캐리어의 복합체의 제조 2

티올기-컨쥬게이트화 항-CD34 모노클로날 항체 (Nichirei Corp. 제조) 를 다음과 같이 제조하였다. 50㎕의 DMF에 용해된 0.1mg 의 SATA를 1 ml의 PBS에 용해된 5mg 의 항-CD34 모노클로날 항체에 첨가하여, 주위온도에서 30 분간 반응시켰다. 이어서, 10㎕ 의 0.1M EDTA(pH 7), 100㎕의 1M 히드록실아민 (pH 7)를 생성된 반응 혼합물에 첨가하여, 주위온도에서 5 분간 반응시켰다. 이어서, 생성물을 세파덱스 G25상에서 겔여과시켜 정제시켰다. 이렇게 제조된 티올기-컨쥬게이트화 항-CD34 모노클로날 항체와 실시예 3 에서와 동일한 방법으로 수득한 효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 3 을 함께 혼합하여, 4℃ 에서 18 시간동안 반응시켰다. 반응후, 0.1M 머캅토에탄올을 생성된 반응용액 부피의 1/10 부피로 첨가하여 30℃ 에서 20 분간 반응시키고; 이어서, 생성된 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44상에서 겔 여과시켰다. 280nm 및 403nm 에서의 흡광도를 측정하였고; 양쪽 피크를 갖는 고분자량의 여과물 분획은 효소, 모노클로날 항체 및 캐리어의 복합체이었다.

실시예 6

효소 및 스트렙타비딘의 복합체의 제조

티올기-컨쥬게이트화 스트렙타비딘을 다음과 같이 제조하였다.

250㎕의 DMF 에 용해된 0.25mg 의 SATA를 2.5 ml 의 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 용해된 25mg 의 스트렙타비딘에 첨가하여, 주위온도에서 30 분간 반응시켰다. 이어서, 50㎕ 의 0.1M EDTA(pH 7), 200㎕의 1M 히드록실아민 (pH 7)를 생성된 반응 혼합물에 첨가하여, 주위온도에서 5 분간 반응시켰다. 이어서, 생성물을 세파덱스 G25상에서 겔여과시켜 정제시켰다. 이렇게 제조된 티올기-컨쥬게이트화 스트렙타비딘과 실시예 3 에서와 동일한 방법으로 수득한 효소 및 캐리어의 말레이미드기-컨쥬게이트화 복합체 3 을 함께 혼합하여, 4℃ 에서 18 시간동안 반응시켰다. 반응후, 0.1M 머캅토에탄올을 생성된 반응용액 부피의 1/10 부피로 첨가하여 30℃ 에서 20 분간 반응시키고; 이어서, 생성된 반응 혼합물을 Ultrogel AcA44상에서 겔 여과시켰다. 280nm 및 403nm 에서의 흡광도를 측정하였고; 양쪽 피크를 갖는 고분자량의 여과물 분획은 효소, 스트렙타비딘 및 캐리어의 복합체이었다

실시예 7

실시예 3 의 효소, 항체 및 캐리어의 복합체와 통상의 방법으로 제조한 효소-표식 항체 사이의 면역조직화학에 따른 비교 및 SAB 법과의 비교

1 차 항체로서 항-LCA 모노클로날 항체 (Nichirei Corp. 제조)을 이용하여, 소장 조직 박편을 염색시켰다. 처음에, 파라핀-함침 조직을 얇은 박편으로 절단하여 슬라이드 글래스상에 부착시켰다. 이어서, 파리핀 및 퍼옥시다아제를 제거하고; 이렇게 제조한 표본을 주위온도에서 1 시간동안 1 차 항체와 반응시킨후, PBS 에서 철저히 세정시켜, 1 차 항체 결합 표본을 제조하였다. 2 차 항체를 여기에 적가하였다. 2 차 항체로서, Fab' 농도로 6㎍/ml 의 농도에서, 실시예 3 에서 제조한 효소, Fab' 및 캐리어의 복합체를 사용하였다. 별도로, 2 차 항체로서, 통상의 방법으로 퍼옥시다아제가 직접적으로 표식된 Fab' 를 동일한 농도에서 사용하였다. 통상의 방법에 의한 표식방법은 Journal of Immunoassay, 4(3), p. 209-327 에 따르며, 여기에서 재료 및 시약은 모두 실시예 3 의 것들과 동일하였다. 1 차 항체-결합 표본의 1 차 항체는 전술한 두 경우의 각각에서 주위온도에서 30 분간 2 차 항체와 반응시켰다.

SAB 법에서, 바이오틴-표식된 항-마우스 폴리클로날 항체 (Nichirei Corp. 제조)를 2 차 항체로서 사용하였다. 이 경우에서, 1 차 항체-결합 표본의 1 차 항체는 2 차 항체와 10 분간 반응시킨후, 세정하고, 이어서 퍼옥시다아제 표식 스트렙타비딘 (Nichirei Corp. 제조)를 적가하여 5 분간 반응시켰다.

이어서, 전술한 3 가지 경우의 각각에서 철저한 세정을 실시하고; 생성된 표본에 기질용액 (디아미노벤지딘, 과산화수소)를 적가하여 반응시킨후, 증류수로 세 정하여, 밀봉한후 현미경으로 관찰하였다.

그 결과는 하기 표 1 에 나타내었다. 실시예 3 에서 제조한 효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체는 통상의 방법으로 제조한 효소-표식된 항체와 비교하여 월등히 우수하였다. 더욱이, 실시예 3 에서 제조한 효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체는 증폭절차를 포함하는 SAB 법과 비교하여 오히려 우수하였다.

표본	염색의 강도
A	±
B	+++
C	+
A: 통상의 방법에 의한 효소-표식 항체 B : 실시예 3 의 효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체 C : SAB 법

실시예 8

삭제

SAB 법 및 실시예 4 에서 제조한 효소, 1 차 항체 및 캐리어의 복합체 사이의 면역조직화학에 따른 비교

SAB 법을 위한 1 차 항체로서, 실시예 4 에서 사용하였던 토끼 항-p53 폴리클로날 항체 (Nichirei Corp. 제조)를 사용하였다. 처음에, 위암의 파라핀 함침 조직을 얇은 박편으로 절단하여 슬라이드 글래스에 부착시켰다. 이어서, 파라핀 및 퍼옥시다아제를 제거한후; 이렇게 제조된 표본을 1 차 항체와 주위온도에서 1 시간동안 반응시켰다. PBS 로 철저하게 세정시킨후, 1 차 항체-결합 표본을 바이오틴 표식된 항-토끼 폴리클로날 항체 (Nichirei Corp. 제조)와 주위온도에서 10 분간 반응시켰다. 세정후, 여기에 퍼옥시다아제 표식된 스트렙타비딘을 적가하여 5 분간 반응시켰다.

별도로, 실시예 4 에서 제조한 효소, 1 차 항체 및 캐리어의 복합체 (효소, Fab' 및 캐리어의 복합체)를 전술한 바와 같이 상기에서 제조된 표본과 주위온도에서 1 시간동안 반응시켰다. 효소-항체 복합체의 농도는 Fab' 농도로 2 ㎍/ml 이었다.

전술한 두 경우의 각각에서 철저히 세정한후, 생성된 표본에 색반응용 기질 용액 (디아민노벤지딘, 과산화수소)를 적가한후, 증류수로 세정하여, 밀봉한후 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 효소, 1 차 항체 및 캐리어의 복합체를 사용하는 경우에 수득되는 염색의 강도는 증폭 절차를 포함하는 SAB 법으로 수득한 강도와 동일하였다.

실시예 9

실시예 3 에서 제조한 효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체와 통상의 방법으로 제조한 효소-표식 항체사이의 효소 면역학적검정에 따른 비교

100㎕ 의 염소 항-마우스 IgG 를 10㎍/ml 의 농도로 96-웰 마이크로적정 플레이트에 첨가하여 주위온도에서 2 시간동안 인큐베이션시켰다. 마이크로적정 플레이트는 생리식염수로 세정한후, 200㎕ 의 1% 우혈청 알부민을 첨가하여 2 시간동안 인큐베이션시켰다. 100㎕ 의 마우스 IgG 를 소정의 농도 (0-1,000 pg/ml) 로 첨가하여 2 시간동안 인큐베이션시킨후 생리식염수로 세정시켰다. 이어서, 이렇게 제조된 마이크로적정 플레이트에, 항체 양에 대해 (즉, 항체 농도로서) 0.5㎍/ml의 농도에서 실시예 3 에서 제조한 효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체 100㎕ 를, 또는 항체 양에 대해 2㎍/ml의 농도에서 통상의 방법으로 제조한 효소-표식 항체 100㎕를 첨가하여, 30 분간 인큐베이션시켰다. 생성된 마이크로적정 플레이트를 추가로 생리식염수로 세정한후, 100㎕ 의 기질용액 (테트라메틸벤지딘, 과산화수소)를 첨가하여 15 분간 반응시켰다. 이 반응은 50㎕ 의 1N 황산을 첨가하여 종결시켰다. 전개된 색반응의 정도는 마이크로적정 리더로 측정하였다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, 결과는 실시예 3 에서 제조한 효소, 2 차 항체 및 캐리어의 복합체의 더 적은 부피로부터 수득한 색반응이 통상의 방법으로 제조한 효소 표식 항체의 색반응보다 더 강력함을 보여주었다.

도 1 은 전술한 결과를 보여준다. 이 도면에서, 가로좌표축은 마우스 IgG 의 농도를 나타내고; 세로좌표축은 450nm 에서의 흡광도를 나타낸다. 폐환은 실시예 3 에서 제조한 효소, 항체 및 캐리어의 복합체를 나타내는 반면, 개환은 통상의 방법으로 제조한 효소 표식 항체를 나타낸다.

본 발명의 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체는 특히 면역조직화학 및 효소 면역학적검정용 효소-표식된 항체로서 (1 차 항체 또는 2 차 항체로서) 유용하며, 고감도 면역학적검정을 가능케한다.

Claims

삭제
하기를 포함하는 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체 :

(1) 수용성 캐리어 ;

(2) 효소 (상기 효소의 둘이상의 분자는 상기 (1)의 수용성 캐리어에 컨쥬게이트됨);

(3) 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질 (상기 단백질은 (2)의 효소의 둘 이상의 분자 중 하나 이상의 분자에 컨쥬게이트됨); 및

(4) (1) 의 수용성 캐리어에 직접적으로 컨쥬게이트되는 (3) 과 동일한 단백질.
제 2 항에 있어서, 수용성 캐리어는 겔여과크로마토그래피로 측정시, 평균분자량이 5,000 내지 500,000Da 인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 3 항에 있어서, 수용성 캐리어는 겔여과크로마토그래피로 측정시, 평균분자량이 10,000 내지 300,000Da 인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 있어서, 수용성 캐리어는 둘이상의 아미노기를 갖는, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 있어서, 수용성 캐리어는 (a)둘 이상의 염기성 아미노기를 갖는 펩티드 중합체 및 (b) 도입된 활성기를 갖는 폴리사카라이드로 구성된 군에서 선택되는 캐리어이고, 활성기의 종류는 아미노기, 알데히드기 및 비닐기로 구성된 군으로부터 선택된 1 종이상인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 있어서, 수용성 캐리어는 폴리리신인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 있어서, 효소는 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제 및 글루코오스 옥시다아제로 구성된 군에서 선택되는 효소인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 있어서, 다른 물질(들)에 특이적 결합능을 갖는 단백질은 항체 및 이의 단편(들)로 구성된 군으로부터 선택된 1 종이상의 단백질인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 9 항에 있어서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날항체인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 9 항에 있어서, 단편(들)은 F(ab')₂, Fab' 및 Fabc'로 구성된 군으로부터 부터 선택된 1 종이상의 단편인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 있어서, 다른 물질(들)에 대해 특이적 결합능을 갖는 단백질은 아비딘 또는 스트렙타비딘인, 효소, 단백질 및 캐리어의 복합체.
제 2 항에 따른 복합체를 함유하는 면역학적검정 키트.
제 13 항에 있어서, 면역학적검정은 면역조직염색 또는 효소 면역학적검정인 면역학적검정 키트.