CN114397440A - 一种基于多聚赖氨酸大分子（dgl）结构的酶标二抗制备及其方法 - Google Patents

一种基于多聚赖氨酸大分子（dgl）结构的酶标二抗制备及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，且公开了一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，包括以下步骤：S1、目标分子骨架的选择：选取多聚赖氨酸大分子DGL(D1‑D3)；S2、目标结合酶的选择：选择辣根过氧化氢酶(HRP)；S3、目标结合IgG抗体的选择：选择山羊抗兔免疫球蛋白IgG作为目标抗体；本发明制备的“HRP‑多聚赖氨酸大分子(DGL)‑IgG”聚合物的灵敏度，明显好于现有市场国产品牌，并且SD‑PolyHRP二抗采用了最新的制备工艺，分子充分活化，避免有毒试剂的使用，利于环保要求；树枝状骨架结构、小分子IgG抗体(特异性含有Fab段肽链)，解决了传统聚合物空间位阻大、灵敏度不高、非特异性染色的问题。创造性的采用多聚赖氨酸大分子(DGL)作为骨架。

Description

一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其 方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法。
背景技术
目前国内科研机构以及临床诊断机构所使用的免疫组化即用型二抗检测系统主要有两种，一种是通过卵白素－生物素或者链霉素－生物素之间的高亲和力而对检测信号进行放大的二抗检测系统(生物素检测系统)；另一种是通过在聚合物上耦联多个抗体和酶的方式而对信号进行放大的二抗检测系统(“酶－聚合物—抗体”检测系统)。生物素检测系统有时会受到待测组织的内源性生物素的干扰而产生假阳性结果，从而会影响结果的准确性，因此此种二抗检测系统在国内的应用逐渐在减少，特别是在临床辅助诊断的应用日益减少；“酶－聚合物—抗体”检测系统，不会受到待测组织内源性生物素的干扰，染色背景低，操作步骤及时间较少，集准确、方便、快捷的优点于一身，因此其在临床辅助诊断中的应用也越来越广泛。目前国内使用的“酶－聚合物—抗体”检测系统(二抗)大多依赖进口，价格昂贵、使用成本高，市场上迫切需要国产高质量的“酶－聚合物—抗体”检测系统。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，解决了上述背景技术中所存在的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，包括以下步骤：
S1、目标分子骨架的选择：选取多聚赖氨酸大分子DGL(D1-D3)；
S2、目标结合酶的选择：选择辣根过氧化氢酶(HRP)；
S3、目标结合IgG抗体的选择：选择山羊抗兔免疫球蛋白IgG作为目标抗体；
S4、检测系统(SD-PolyHRP)：多聚赖氨酸大分子(DGL)上的-NH2官能团与辣根过氧化物酶(HRP)、IgG上-COOH官能团进行酰胺化反映，使蛋白分子紧密结合在多聚赖氨酸大分子(DGL)骨架结构上，增加单位体积蛋白的浓度；
S5、试验过程：
S51、选用辣根过氧化物酶HRP 3.5g溶解到8ml、0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液中，添加二苯基亚砜溶液0.4ml于10℃低温低速搅拌1.5h，将上述的反应液在交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤，洗脱液为0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行低温离心浓缩至5ml试管中，2-8℃冷藏备用；
S52、取0.4g的多聚赖氨酸大分子(DGL)溶于6ml、0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液中，将该溶液和步骤S51液体进行混合，于10℃低温下孵育反应20h，将上述的反应液在交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤，洗脱液为0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于5ml试管中，2-8℃冷藏备用；
S53、把0.4g特异性含有Fab段肽链的羊抗兔IgG分子溶解到1L、PH＝7.4的PBS溶液中，充分搅拌均匀后加入5ml BMPS溶液，低速磁力搅拌均匀下，加入步骤S52的5ml浓缩液，搅拌5min后孵育16h，再加入抗原封闭剂牛血清白蛋白1g，充分搅拌均匀，合成的“HRP－DGL—IgG”聚合物存储于2-8℃备用。
优选的，所述步骤S1中选取的多聚赖氨酸大分子为D3代大分子，其分子式为：C103H193N31O15·16HCL，分子量为：2688，其表面拥有高密度的活性氨基高分子团。
优选的，所述步骤S2中的辣根过氧化氢酶，其RZ值＞3.0，活性＞300u/mg，CAS编号9003-99-0，其中同工酶C含量大于99.99％。
优选的，所述步骤S3中的山羊抗兔免疫球蛋白IgG的产品编号为AP132，山羊抗兔免疫球蛋白IgG分子量为160000左右，分子量比较大，可以通过采用木瓜蛋白酶的酶化学反应去除抗体上无抗原识别能力但是容易引起非特异性吸附的Fc段肽链，保留具有抗体识别能力的Fab段肽链，这样的小分子IgG可以更好的穿透细胞，提高细胞核的染色灵敏度。
优选的，所述步骤S3的具体方法为：
①、取1000mg山羊抗兔免疫球蛋白IgG、50mg木瓜蛋白酶、20ul、0.1mol/L、PH＝7.0的EDTA溶液、20ul、0.5mol/L的半胱氨酸溶液溶于100ml、0.1mol/L、PH＝7.6的磷酸盐缓冲液，于37℃恒温水浴中酶解4h后，加入0.1ml、0.2mol/L的碘乙酰胺溶液冰浴0.5h终止反应；
②、酶解产物经过Protein A亲和色谱分离，平衡液为含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L、PH＝7.5的K2HPO4-HCl缓冲液，酶解液过滤后进行色谱分离，先用0.1mol/L、PH＝5.5的HAc-NaA缓冲液洗脱未结合蛋白，再用含35mmol/L NaCl的0.1mol/L HAC溶液洗脱Fc段肽链，最后用含1mol/L NaCl的50mmol/L NaOH溶液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行超滤膜浓缩至40ml，并用超纯水透析循环多次，此液体为含Fab段肽链的酶解原液，含于2℃-8℃保存备用；
③、步骤②液体用0.1mol/L的Tris-HCl调节PH＝8.9，经DEAE阴离子色谱分离，平衡液为0.02mol/L、PH＝8.9的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含0.4mol/L NaCl的0.02mol/L、PH＝8.9的Tris-HCl缓冲液，收集洗脱液，洗脱液进行超滤膜浓缩至30ml，并用超纯水透析循环多次后，进行冻干浓缩，得特异性含有Fab段肽链的IgG冻干粉0.4g，于-20℃保存备用。
优选的，所述步骤S4中检测系统(SD-PolyHRP)的化学式为：
Figure BDA0003479205250000041
优选的，所述步骤S51中的二苯基亚砜溶液的制备过程为：取5g二苯基亚砜溶于10ml乙醇溶液中，震荡混匀后得到二苯基亚砜溶液。
优选的，所述步骤S53中的BMPS溶液的制备过程为：取5mg BMPS溶于20ml DMSO溶液中，即可得到BMPS溶液。
(三)有益效果
本发明提供了一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，具备以下有益效果：
本发明制备的“HRP-多聚赖氨酸大分子(DGL)-IgG”聚合物的灵敏度，明显好于现有市场国产品牌，并且SD-PolyHRP二抗采用了最新的制备工艺，分子充分活化，避免有毒试剂的使用，利于环保要求；树枝状骨架结构、小分子IgG抗体(特异性含有Fab段肽链)，解决了传统聚合物空间位阻大、灵敏度不高、非特异性染色的问题。创造性的采用多聚赖氨酸大分子(DGL)作为骨架，除了提高单位体积内酶的浓度外，还充分利用了DGL的抑菌功能，延长抗体的保存期限。通过这些技术改进，使合成的聚合物具有更高的检测灵敏度，更低的背景、更低的成本。
附图说明
图1为本发明中目标分子估计的分子结构示意图；
图2为本发明中“HRP-DGL-IgG”聚合物树枝状结构示意图；
图3为本发明中“HRP-DGL-IgG”聚合物主要官能团的红外图谱分析结构示意图；
图4为本发明中MSH2染色结果图；
图5为本发明中CK5/6染色结果图；
图6为本发明中CgA染色结果图；
图7为本发明中Ckpan染色结果图；
图8为本发明中TTF-1染色结果图；
图9为本发明中CK7染色结果图；
图10为本发明中CD3染色结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，包括以下步骤：
S1、目标分子骨架的选择：选取多聚赖氨酸大分子DGL(D3)，其分子式为：C103H193N31O15·16HCL，分子量为：2688，其表面拥有高密度的活性氨基高分子团，如图1所示；
S2、目标结合酶的选择：选择辣根过氧化氢酶(HRP)，其RZ值＞3.0，活性＞300u/mg，CAS编号9003-99-0，其中同工酶C含量大于99.99％；
S3、目标结合IgG抗体的选择：选择山羊抗兔免疫球蛋白IgG作为目标抗体，产品编号为AP132，山羊抗兔免疫球蛋白IgG分子量为160000左右，分子量比较大，可以通过采用木瓜蛋白酶的酶化学反应去除抗体上无抗原识别能力但是容易引起非特异性吸附的Fc段肽链，保留具有抗体识别能力的Fab段肽链，这样的小分子IgG可以更好的穿透细胞，提高细胞核的染色灵敏度
①、取1000mg山羊抗兔免疫球蛋白IgG、50mg木瓜蛋白酶、20ul、0.1mol/L、PH＝7.0的EDTA溶液、20ul、0.5mol/L的半胱氨酸溶液溶于100ml、0.1mol/L、PH＝7.6的磷酸盐缓冲液，于37℃恒温水浴中酶解4h后，加入0.1ml、0.2mol/L的碘乙酰胺溶液冰浴0.5h终止反应；
②、酶解产物经过Protein A亲和色谱分离，平衡液为含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L、PH＝7.5的K2HPO4-HCl缓冲液，酶解液过滤后进行色谱分离，先用0.1mol/L、PH＝5.5的HAc-NaA缓冲液洗脱未结合蛋白，再用含35mmol/L NaCl的0.1mol/L HAC溶液洗脱Fc段肽链，最后用含1mol/L NaCl的50mmol/L NaOH溶液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行超滤膜浓缩至40ml，并用超纯水透析循环多次，此液体为含Fab段肽链的酶解原液，含于2℃-8℃保存备用；
③、步骤②液体用0.1mol/L的Tris-HCl调节PH＝8.9，经DEAE阴离子色谱分离，平衡液为0.02mol/L、PH＝8.9的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含0.4mol/L NaCl的0.02mol/L、PH＝8.9的Tris-HCl缓冲液，收集洗脱液，洗脱液进行超滤膜浓缩至30ml，并用超纯水透析循环多次后，进行冻干浓缩，得特异性含有Fab段肽链的IgG冻干粉0.4g，于-20℃保存备用；
S4、检测系统(SD-PolyHRP)：多聚赖氨酸大分子(DGL)上的-NH2官能团与辣根过氧化物酶(HRP)、IgG上-COOH官能团进行酰胺化反映，使蛋白分子紧密结合在多聚赖氨酸大分子(DGL)骨架结构上，增加单位体积蛋白的浓度，检测系统(SD-PolyHRP)的化学式为：
Figure BDA0003479205250000061
S5、试验过程：
S51、选用辣根过氧化物酶HRP 3.5g溶解到8ml、0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液中，添加二苯基亚砜溶液(取5g二苯基亚砜溶于10ml乙醇溶液中，震荡混匀)0.4ml于10℃低温低速搅拌1.5h，将上述的反应液在交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤，洗脱液为0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行低温离心浓缩至5ml试管中，2-8℃冷藏备用；
S52、取0.4g的多聚赖氨酸大分子(DGL)溶于6ml、0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液中，将该溶液和步骤S51液体进行混合，于10℃低温下孵育反应20h，将上述的反应液在交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤，洗脱液为0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于5ml试管中，2-8℃冷藏备用；
S53、把0.4g特异性含有Fab段肽链的羊抗兔IgG分子溶解到1L、PH＝7.4的PBS溶液中，充分搅拌均匀后加入5ml BMPS溶液(取5mg BMPS溶于20ml DMSO溶液中)，低速磁力搅拌均匀下，加入步骤S52的5ml浓缩液，搅拌5min后孵育16h，再加入抗原封闭剂牛血清白蛋白1g，充分搅拌均匀，合成的“HRP－DGL—IgG”聚合物存储于2-8℃备用。
聚合物结构分析
多聚物：“HRP－DGL—IgG”属于树枝状结构，如图2所示。
深色代表含有-COOH结构的分子，中间为多聚赖氨酸大分子(DGL)骨架分子；一个DGL分子含有16个-NH2官能团，理论上能结合16个含有-COOH结构的分子。由于IgG只含有活性片段Fab段肽链，分子量小，空间位阻低，更加容易与DGL分子进行酰胺化结合，且异端双功能蛋白交联剂BMPS(N-β-马来酰亚胺丙基氧化丁二酰亚胺酯)可加剧聚合物的合成。该聚合物增加了单位体积上酶的浓度，提高聚合物分子的渗透性和灵敏度。
为了进一步分析聚合物的化学结构，针对主要官能团进行了红外图谱分析，如图3所示。
从图3中看出，聚合物在1700-1725之间没有-COOH特有的-CO伸缩振动峰，不存在自由羧基。聚合物在3270左右有-NH的伸缩振动，在1642左右有CO的振动，在1563左右还有NH变形振动和C-N的伸缩振动的复合振动峰，综合分析，酰胺化反应完全，蛋白分子和聚酰胺-胺骨架充分结合。
聚合物染色性能分析
(1)、SD-PolyHRP聚合物特异性、灵敏度测试
用合成的聚合物原液、1:3稀释后、1:7稀释后，分别测试福州迈新一抗工作液MSH2(如图4所示)、CK5/6(如图5所示)、CgA(如图6所示)所对应的的阳性片。
从上面三个抗体染色结果来看，SD-PolyHRP聚合物分别对于细胞核(MSH2)、细胞质/膜(CK5/6)、细胞质(CgA)染色，阳性定位准确，且聚合物不断稀释后，染色强度也能符合要求，说明合成的SD-PolyHRP二抗具有良好的灵敏度，经济效益明显。
(2)、与同类产品的染色对比实验
选取市场上常用的三种二抗聚合物染色试剂命名为：二抗A(进口)、二抗B(国产)、二抗C(国产)和自主研发的SD-PolyHRP二抗聚合物(1:3稀释)，分别测试福州迈新一抗工作液CKpan(如图7所示)、TTF-1(如图8所示)、CK7(如图9所示)、CD3(如图10所示)所对应的的阳性片。
Ckpan SD-PolyHRP二抗 市场上二抗A 市场上二抗B 市场上二抗C
阳性程度 3.0+ 3.0+ 2.0+ 2.0+
背景强度 - - - -
注：+表示阳性，+越多阳性越强；-表示阴性；+表示有背景，+越多背景越强；-表示无背景。
TTF-1 SD-PolyHRP二抗 市场上二抗A 市场上二抗B 市场上二抗C
阳性程度 3.0+ 3.0+ 2.0+ 2.0+
背景强度 - - + -
注：+表示阳性，+越多阳性越强；-表示阴性；+表示有背景，+越多背景越强；-表示无背景。
CK7 SD-PolyHRP二抗 市场上二抗A 市场上二抗B 市场上二抗C
阳性程度 3.0+ 2.0+ 1.0+ 1.0+
背景强度 - + + -
注：+表示阳性，+越多阳性越强；-表示阴性；+表示有背景，+越多背景越强；-表示无背景。
CD3 SD-PolyHRP二抗 市场上二抗A 市场上二抗B 市场上二抗C
阳性程度 3.0+ 3.0+ 3.0+ 2.0+
背景强度 - - - -
注：+表示阳性，+越多阳性越强；-表示阴性；+表示有背景，+越多背景越强；-表示无背景。
从表一、表二、表三、表四分析得出，针对所示四个测试抗体，其分别定位于细胞膜(CD3)、细胞质(Ckpan、CK7)、细胞核(TTF-1)，在每个抗体的同一组织、同一一抗试剂、同一操作流程的情况下，SD-PolyHRP二抗无论从阳性染色程度、定位的准确性、背景染色程度，都达到或者超过进口品牌，远好于国内品牌二抗试剂。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、目标分子骨架的选择：选取多聚赖氨酸大分子DGL(D1-D3)；
S2、目标结合酶的选择：选择辣根过氧化氢酶(HRP)；
S3、目标结合IgG抗体的选择：选择山羊抗兔免疫球蛋白IgG作为目标抗体；
S4、检测系统(SD-PolyHRP)：多聚赖氨酸大分子(DGL)上的-NH2官能团与辣根过氧化物酶(HRP)、IgG上-COOH官能团进行酰胺化反映，使蛋白分子紧密结合在多聚赖氨酸大分子(DGL)骨架结构上，增加单位体积蛋白的浓度；
S5、试验过程：
S51、选用辣根过氧化物酶HRP 3.5g溶解到8ml、0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液中，添加二苯基亚砜溶液0.4ml于10℃低温低速搅拌1.5h，将上述的反应液在交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤，洗脱液为0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行低温离心浓缩至5ml试管中，2-8℃冷藏备用；
S52、取0.4g的多聚赖氨酸大分子(DGL)溶于6ml、0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液中，将该溶液和步骤S51液体进行混合，于10℃低温下孵育反应20h，将上述的反应液在交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤，洗脱液为0.1M、PH＝7.4的磷酸氢钠溶液，收集深棕色物质并进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于5ml试管中，2-8℃冷藏备用；
S53、把0.4g特异性含有Fab段肽链的羊抗兔IgG分子溶解到1L、PH＝7.4的PBS溶液中，充分搅拌均匀后加入5ml BMPS溶液，低速磁力搅拌均匀下，加入步骤S52的5ml浓缩液，搅拌5min后孵育16h，再加入抗原封闭剂牛血清白蛋白1g，充分搅拌均匀，合成的“HRP－DGL—IgG”聚合物存储于2-8℃备用。
2.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S1中选取的多聚赖氨酸大分子为D3代大分子，其分子式为：C103H193N31O15·16HCL，分子量为：2688，其表面拥有高密度的活性氨基高分子团。
3.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S2中的辣根过氧化氢酶，其RZ值＞3.0，活性＞300u/mg，CAS编号9003-99-0，其中同工酶C含量大于99.99％。
4.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S3中的山羊抗兔免疫球蛋白IgG的产品编号为AP132，山羊抗兔免疫球蛋白IgG分子量为160000左右，分子量比较大，可以通过采用木瓜蛋白酶的酶化学反应去除抗体上无抗原识别能力但是容易引起非特异性吸附的Fc段肽链，保留具有抗体识别能力的Fab段肽链，这样的小分子IgG可以更好的穿透细胞，提高细胞核的染色灵敏度。
5.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S3的具体方法为：
①、取1000mg山羊抗兔免疫球蛋白IgG、50mg木瓜蛋白酶、20ul、0.1mol/L、PH＝7.0的EDTA溶液、20ul、0.5mol/L的半胱氨酸溶液溶于100ml、0.1mol/L、PH＝7.6的磷酸盐缓冲液，于37℃恒温水浴中酶解4h后，加入0.1ml、0.2mol/L的碘乙酰胺溶液冰浴0.5h终止反应；
②、酶解产物经过Protein A亲和色谱分离，平衡液为含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L、PH＝7.5的K2HPO4-HCl缓冲液，酶解液过滤后进行色谱分离，先用0.1mol/L、PH＝5.5的HAc-NaA缓冲液洗脱未结合蛋白，再用含35mmol/L NaCl的0.1mol/L HAC溶液洗脱Fc段肽链，最后用含1mol/L NaCl的50mmol/L NaOH溶液进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行超滤膜浓缩至40ml，并用超纯水透析循环多次，此液体为含Fab段肽链的酶解原液，含于2℃-8℃保存备用；
③、步骤②液体用0.1mol/L的Tris-HCl调节PH＝8.9，经DEAE阴离子色谱分离，平衡液为0.02mol/L、PH＝8.9的Tris-HCl缓冲液，洗脱液为含0.4mol/L NaCl的0.02mol/L、PH＝8.9的Tris-HCl缓冲液，收集洗脱液，洗脱液进行超滤膜浓缩至30ml，并用超纯水透析循环多次后，进行冻干浓缩，得特异性含有Fab段肽链的IgG冻干粉0.4g，于-20℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S4中检测系统(SD-PolyHRP)的化学式为：
Figure FDA0003479205240000031
7.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S51中的二苯基亚砜溶液的制备过程为：取5g二苯基亚砜溶于10ml乙醇溶液中，震荡混匀后得到二苯基亚砜溶液。
8.根据权利要求1所述的一种基于多聚赖氨酸大分子(DGL)结构的酶标二抗制备及其方法，其特征在于：所述步骤S53中的BMPS溶液的制备过程为：取5mg BMPS溶于20ml DMSO溶液中，即可得到BMPS溶液。
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