CN110632324A

CN110632324A - 用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物及其制备方法

Info

Publication number: CN110632324A
Application number: CN201910913791.XA
Authority: CN
Inventors: 谭瑞政
Original assignee: Baisheng Guangzhou Biological Products Co Ltd
Current assignee: Baisheng Guangzhou Biological Products Co Ltd
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明属于二抗检测系统技术领域，具体涉及用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物及其制备方法，其利用树枝状聚酰胺胺结构上的‑NH₂官能团与结合酶蛋白、免疫球蛋白上的‑COOH官能团进行酰胺化反应，使蛋白分子紧密结合在聚酰胺胺骨架结构上，增加单位体积蛋白的浓度，制备出了相比市面产品具有更高的检测灵敏度，更低的背景和更低成本的二抗聚合物，具有广阔的市场应用前景，实质性特点显著。

Description

用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物及其制备方法

技术领域

本发明涉及二抗检测系统技术领域，具体而言，涉及用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物及其制备方法。

背景技术

目前国内科研机构以及临床诊断机构所使用的免疫组化即用型二抗检测系统主要有两种，一种是通过卵白素-生物素或者链霉素-生物素之间的高亲和力而对检测信号进行放大的二抗检测系统(生物素检测系统)；另一种是通过在聚合物上耦联多个抗体和酶的方式而对信号进行放大的二抗检测系统(“酶-聚合物-抗体”检测系统)。生物素检测系统有时会受到待测组织的内源性生物素的干扰而产生假阳性结果，从而会影响结果的准确性，因此此种二抗检测系统在国内的应用逐渐在减少，特别是在临床辅助诊断的应用日益减少；“酶-聚合物-抗体”检测系统，不会受到待测组织内源性生物素的干扰，染色背景低，操作步骤及时间较少，集准确、方便、快捷的优点于一身，因此其在临床辅助诊断中的应用也越来越广泛。

随着肿瘤发病率逐年上升，病理科疫组化项目越发显得重要，且每年递增15％，其市场潜力巨大。

二抗使用量市场资料(包括仪器二抗)：全国约1192家三级医院(其中三甲医院779家，2018年统计)，1888家二甲医院。基本上每家三级医院、60％的二甲医院都有开展免疫组化项目，根据2018年调查的不完全资料显示，手工免疫组化染色二抗试用量平均为40ml，按照80元/ml计算，全国约为413家三级医院、1132家二甲医院，年销售额为4900万。

三甲医院基本是仪器染色，按照80元/片，每家医院年均15000张片子计算，年销售额为93亿元。

目前国内市场上供应“酶-聚合物-抗体检测系统”二抗产品的公司主要有：

Dako基因公司(Envision二抗)，约占市场份额的35％；

福建迈新(Maxvision二抗)，约占市场份额的50％；

北京中杉金桥(PV6000二抗)，约占市场份额的15％；

仪器二抗市场份额目前的分布情况：

罗氏诊断仪器约占市场份额的65％；

徕卡诊断仪器约占市场份额的20％；

其余品牌合计约占市场份额的15％；

国产销售的二抗产品大多是进口分包装，在聚合物结构设计、制备工艺上没有大的改进，具体体现在：单位体积内酶、抗体数量没有显著增加；聚合物空间位阻没有明显降低，导致国产二抗产品相对于进口产品，价格没有明显降低，灵敏度没有改善。

发明内容

为了解决目前国内使用的“酶-聚合物-抗体”检测系统(二抗)大多依赖进口，价格昂贵、使用成本高，灵敏度无法提高的问题，提供用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物及其制备方法。

用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物(即SL-PolyHRP聚合物，后文统一以该名称指代前文所述的聚酰胺胺结构多聚物)，所述聚酰胺胺结构多聚物包括树枝状聚酰胺胺2-13％，结合酶75-95％和免疫球蛋白2-13％，其结构式为：

其中，n≥1。

进一步地，所述树枝状聚酰胺胺的分子量为(1500-60000U)，其表面修饰基团为-NH₂，-NH₂基团的数量为32-128。

进一步地，所述结合酶的分子量为(25000-44000U)，RZ值为2.1-3.5。

进一步地，所述免疫球蛋白的分子量为(70000-100000U)。

进一步地，所述结合酶优选为过氧化物酶，所述免疫球蛋白优选为羊抗兔免疫球蛋白。

一种制备聚酰胺胺结构多聚物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、称取结合酶，溶解到碳酸氢钠溶液中，然后添加适量二苯基亚砜溶液，反应1小时，反应后的溶液用交联葡聚糖凝胶柱进行过滤、分析、纯化，纯化液为碳酸氢钠溶液，收集深色的过滤液；

(2)、将(1)步收集到的过滤液，进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于试管中，2-8℃冷藏备用，在浓缩液中，加入树枝状聚酰胺胺，于30℃下低速搅拌反应24小时，然后将上述的反应液，通过碳酸氢钠溶液在交联葡聚糖凝胶柱上进行过滤、分析、纯化，收集深色物质溶液；

(3)、将(2)步纯化后的深色物质溶液，进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于试管中，加入二苯基亚砜，反应4小时，然后用PBS溶液将反应溶液在交联葡聚糖凝胶柱上进行过滤、分析、纯化，收集深色物质，低温浓缩备用；

(4)、将免疫球蛋白溶解到PBS溶液中，充分搅拌均匀，加入(3)步的浓缩液，磁力搅拌均匀，孵育48小时后，加入抗原封闭剂牛血清白蛋白，充分搅拌均匀，最后合成的聚酰胺胺结构多聚物存储于2-8℃备用。

本发明的优点在于：

1、SL-PolyHRP聚合物采用了最新的制备工艺，分子充分活化，亲和力好，便于结合更多的蛋白分子。

2、利用聚酰胺胺合成提供的环状的树枝化结构，克服了传统聚合物空间位阻大的问题，SL-PolyHRP聚合物的灵敏度明显好于现有市场产品。

3、SL-PolyHRP聚合物二抗试剂在背景没有增加的情况下，其染色强度明显好于现有市场产品。

4、国内自主研发合成，产品成本低，市场竞争力强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例中树枝状聚酰胺胺的结构式；

图2为128个蛋白分子结合在具有128个-NH₂表面修饰基团的树枝状聚酰胺胺分子上的SL-PolyHRP聚合物的结构示意图；

图3为SL-PolyHRP聚合物的红外光谱图。

具体实施方式

为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例中优选采购结构式如图1所示的树枝状聚酰胺胺(可采用威海晨源分子新材料，货号:CYD-150A，产品链接：http://www.whcyd.com/product_data/19.html)；分子量为30000U的辣根过氧化物酶(参考文献：洪伟杰，张朝晖，芦国营.辣根过氧化物酶的结构与作用机制[J].生命的化学，2005，25(01))和分子量为80000U的羊抗兔免疫球蛋白进行SL-PolyHRP聚合物制备实验。

制备步骤：

(1)、选用辣根过氧化物酶(30000U，纯化)5.5g溶解到10ml碳酸氢钠(0.1M、PH＝7.0)溶液中，然后添加二苯基亚砜溶液0.5ml(取5g二苯基亚砜溶于10ml乙醇溶液，30℃震荡)，反应1小时，反应后的溶液用交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤、分析、纯化，纯化液为碳酸氢钠溶液(0.1M、PH＝7.0)，收集深色的过滤液；

(2)、将(1)步收集到的过滤液，进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于5ml试管中，2-8℃冷藏备用，在浓缩液中，加入0.2g的树枝状聚酰胺胺(G5，分析纯)，于30℃下反应24小时(低速搅拌)，然后将上述的反应液，通过碳酸氢钠溶液(0.1M、PH＝7.0)在交联葡聚糖凝胶柱(G50)上进行过滤、分析、纯化，收集深色物质，该组分即为“酶-聚酰胺-胺”分子结构。

(3)、将(2)步纯化后的“酶-聚酰胺-胺”溶液，进行低温离心浓缩，取其浓缩液装于5ml试管中，加入二苯基亚砜0.5ml(取5g二苯基亚砜溶于10ml乙醇溶液，30℃震荡)，反应4小时，然后用PH＝7.4的PBS溶液将反应溶液，经过交联葡聚糖凝胶柱(G50)进行过滤、分析、纯化，收集深色物质，低温浓缩备用；

(4)、把0.2g的羊抗兔免疫球蛋白(80000U)(纯化)溶解到1LPBS溶液中(PH＝7.4)，充分搅拌均匀，加入(3)步的浓缩液，磁力搅拌均匀，孵育48小时后，加入抗原封闭剂牛血清白蛋白1g，充分搅拌均匀，最后合成的“酶-聚胺酰-胺-抗体”聚合物(SL-PolyHRP聚合物)存储于2-8℃备用。

反应原理:

采用聚酰胺胺分子结构，开发的“酶-聚酰胺胺大分子-抗体”检测系统(SL-PolyHRP)。聚酰胺胺分子是树枝状高分子结构，其末端官能团在特定条件下能与酶蛋白分子官能团发生化学反应(参考文献：曹伟松,朱宏.树枝状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)对水杨酸增溶作用研究[J]，化工之友，2007，NO.13)，可以明显提高酶分子的单位密度。具体地，利用树枝状聚酰胺胺结构上的-NH₂官能团与结合酶蛋白、二抗蛋白上-COOH官能团进行酰胺化反应，使蛋白分子紧密结合在聚胺酰-胺骨架结构上，增加单位体积蛋白的浓度。

性能检测：

1、聚合物结构分析

如图2所示，黑色颗粒代表蛋白分子(蛋白分子包括酶和免疫球蛋白)，中间的白色颗粒为树枝状聚酰胺胺骨架分子；如一个树枝状聚酰胺胺骨架分子含有128个-NH₂官能团，理论上能结合128个蛋白分子。由于环状的空间构型，分子紧密排列、空间位阻小，蛋白分子的活性片段Fab充分暴露(参考文献：唐思远，林东强，童红飞，姚善泾.人免疫球蛋白G酶解制备Fab和Fc片段及其分离纯化[J]，化工学报，2013，5，64(5))，增加聚合物分子的渗透性和灵敏度。

为了进一步分析聚合物的化学结构，针对主要官能团进行了红外图谱分析，如图3所示。

从图上看出，聚合物在1700-1725之间没有-COOH特有的-CO伸缩振动峰，不存在自由羧基。聚合物在3270左右有-NH的伸缩振动，在1642左右有CO的振动，在1563左右还有NH变形振动和C-N的伸缩振动的复合振动峰，综合分析，酰胺化反应完全，蛋白分子(即酶和免疫球蛋白)和树枝状聚酰胺胺骨架充分结合，效果较好地合成了二抗聚合物。

2、聚合物染色性能分析

选取市场上常用的三种二抗聚合物染色试剂命名为：二抗A(上海基因科技，货号：GP016029)、二抗B(福州迈新试剂，货号：KIT-5004)、二抗C(美国赛默飞世尔科技，货号：A32731)、和自主研发的SL-PolyHRP二抗聚合物，按照如下实验设计，分别做免疫组化实验，测试一抗试剂(工作液)ki67、P63、SMA、CK7所对应的阳性片，其染色强度如下表一、染色背景度如下表二：

表一：

二抗试剂	Ki67试剂	P63试剂	SMA试剂	CK7试剂
					二抗A	+++	+++	+++	+++
二抗B	+++	++	+++	+++
					二抗C	++	++	++	++
SL-PolyHRP	+++++	+++++	+++++	+++++

注：+表示阳性，+越多阳性越强；-表示阴性

表二：

二抗试剂	Ki67试剂	P63试剂	SMA试剂	CK7试剂
					二抗A	+	-	-	-
二抗B	-	+	-	+
					二抗C	-	-	-	-
SL-PolyHRP	-	-	-	-

注：+表示有背景，+越多背景越强；-表示无背景

按照行业标准指南《免疫组织化学行业标准照片》所示，免疫组化染色结果应该满足：敏感度≥3+、背景强度＜1+或者没有背景的要求。可以看出，自主研发的“酶-聚酰胺胺-抗体”型SL-PolyHRP聚合物试剂在背景没有增加的情况下，其染色强度明显好于现有市场产品，完全具备取代能力。

综上所述，SL-PolyHRP聚合物的灵敏度，明显好于现有市场产品。其采用了最新的制备工艺，分子充分活化，亲和力好，便于结合更多的蛋白分子；环状的树枝化结构，克服了传统聚合物空间位阻大的问题。通过这些技术改进，使合成的二抗聚合物具有更高的检测灵敏度，更低的背景、更低的成本。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims

1.用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物，其特征在于，所述聚酰胺胺结构多聚物包括树枝状聚酰胺胺2-13％，结合酶75-95％和免疫球蛋白2-13％，其结构式为：

其中，n≥1。

2.根据权利要求1所述的用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物，其特征在于，所述树枝状聚酰胺胺的分子量为(1500-60000U)，其表面修饰基团为-NH₂，-NH₂基团的数量为32-128。

3.根据权利要求2所述的用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物，其特征在于，所述结合酶的分子量为(25000-44000U)，RZ值为2.1-3.5。

4.根据权利要求3所述的用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物，其特征在于，所述免疫球蛋白的分子量为(70000-100000U)。

5.根据权利要求4所述的用于二抗检测系统的聚酰胺胺结构多聚物，其特征在于，所述结合酶优选为过氧化物酶，所述免疫球蛋白优选为羊抗兔免疫球蛋白。

6.一种制备权利要求1至5任一所述的聚酰胺胺结构多聚物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)、将免疫球蛋白溶解到PBS溶液中，充分搅拌均匀，加入(3)步的浓缩液，磁力搅拌均匀，孵育48小时后，加入抗原封闭剂牛血清白蛋白，充分搅拌均匀，最后合成的聚酰胺胺结构多聚物存储于2—8℃备用。